用于生产目的DNA序列的方法和克隆载体与流程

用于生产目的dna序列的方法和克隆载体
技术领域
1.本技术涉及生物工程领域，特别地，涉及用于生产目的dna序列的方法和克隆载体。


背景技术：

2.经过30多年的发展，基于基因编辑的基因疗法和细胞疗法得到了充足的发展。特别是基于核酸酶(锌指蛋白核酸酶，tal核酸酶，crispr核酸酶)的精准基因编辑和不依赖于病毒的递送方式，使得不依赖于病毒的更安全更高效的基因疗法成为可能。早期对于基因缺陷型遗传病的治疗有使用过质粒来递送和表达目的蛋白基因以进行补偿；在进行基于同源重组的大片段基因敲入时，质粒或线性化质粒片段也会被用作编辑模板。实践证明，质粒在基因编辑的应用上存在许多不足与潜在风险：1)由于含有非目的片段的多余的载体骨架序列，在进行体内或免疫细胞的递送时会引起更大的基于双链dna的细胞毒性；2)质粒上的冗余骨架序列多为复制起始位点和抗生素抗性基因，在用于基因治疗时可能将这些基因污染到人的正常菌群，而且这些细菌来源的序列通常包含cpg岛，容易在质粒复制的过程中发生甲基化，并在应用时产生很强的免疫原性；3)在同源重组修复时，采用基于pcr扩增法制备的平末端双链dna作为修复模板，有可能造成非同源重组修复的末端连接，造成编辑后的序列含有重复的同源臂区域，破坏原本的设计。
3.针对上述问题，有研究尝试从质粒上采用双酶切的方式将目的片段从质粒上分离出来，但该方法在大规模的片段分离纯化上很难实现，只能通过琼脂糖凝胶电泳进行小规模纯化，而且这种方法依赖于dna染料对dna片段进行显色，嵌入式dna染料的是否可以完全清除，也是难以验证的问题。虽然2016年slavcev等人报告了基于细菌体内重组实现的目的片段双链dna的发酵工艺，但其结果中显示由于重组效率不完全，菌体裂解后纯化出来的产物会有细菌基因组，原始质粒等dna杂质污染，仍依赖于琼脂糖凝胶电泳以分离出高纯度终产物，即该方法在工业化生产上依然存在上述难以扩大规模以及毒性dna染料的问题。
4.另一种直接获得目的片段的尝试是利用pcr扩增来大量制备双链dna,但是pcr所用的dna聚合酶在序列保真度上逊于细菌体内的dna复制系统。且在大规模制备时，采购大量高保真dna聚合酶的成本很高，在扩增大片段时，pcr的产量会有所下降并可能出现非全长片段污染。最关键的问题是，在需要毫克级双链dna纯品时，需要进行大量的pcr，将几百甚至上千个pcr反应的产物收集在一起，很难符合gmp规范。为了解决这一问题，英国的touchlight genetics公司开发了基于滚环复制(rolling circle amplification,rca)的双链dna体外恒温指数扩增方法，然而当目的产物用作基因敲入的模板时，这种体外复制方法由于缺乏细菌体内的dna复制纠错机制，会存在增加dna序列突变的风险。特别是当目的序列中含有极高比例的gc序列、发卡结构和重复序列时，依赖于dna聚合酶的体外复制很难保证高难度序列区域不会发生丢失。而且整个体外复制过程是呈指数复制且随机的，反应完成后从复合物切割释放目的序列单体的时候，产物中会有混有不完全片段产物的杂质的风险，并难以除去。
5.仍需要简便高效的制备目的dna序列的方法。


技术实现要素：

6.本技术提供了用于生产目的dna序列的方法和克隆载体。所述方法和克隆载体对于待生产的目的dna序列没有特别的限制，因而是适用于各种dna序列的通用方法和克隆载体。并且，所述方法和克隆载体可以以大规模高效生产高纯度的目的dna序列。所述方法使用包含原核端粒酶识别序列和iis型限制性内切酶和/或兆核酸酶识别序列的dna构建体，经过细胞内载体扩增过程(例如通过质粒转化和抽提方法)大量生产所述dna构建体，然后经过原核端粒酶-iis型限制性内切酶和/或兆核酸酶-dna核酸外切酶三步恒温酶反应即可获得高纯度的目的dna片段。终产物可以经过醇类(如乙醇)沉淀浓缩，易于大规模制备，且整个制备纯化过程不涉及dna染料。由于终产物来源于经宿主细胞的体内复制，序列正确度高，不会由于目的序列中含有高难度序列而造成序列错误、丢失或突变。
7.克隆载体
8.本技术提供了用于生产目的dna序列或者用于构建下文所述dna构建体的通用克隆载体，其为自主复制的载体且包含：(a)一个或更多个iis型限制性内切酶和/或兆核酸酶识别序列，和(b)多克隆位点。
9.在一些实施方式中，所述克隆载体选自：质粒、粘粒、噬菌体或病毒(例如反转录病毒、腺相关病毒、慢病毒、杆状病毒及腺病毒)。所述克隆载体可以含有复制起点。所述克隆载体可以含有用于插入外来dna序列(例如侧翼连接有原核端粒酶识别序列的目的dna序列)的一个或若干个限制性核酸内切酶识别位点或多克隆位点，和/或用于识别及选择经克隆载体转化的细胞的选择标记基因(例如抗生素抗性基因、ccdb基因等)。
10.在一些实施方式中，所述克隆载体包含两个或更多个，例如3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个iis型限制性内切酶和/或兆核酸酶识别序列。在一些实施方案中，所述克隆载体包含3个或更多个iis型限制性内切酶和/或2个或更多个兆核酸酶识别序列。在一个具体实施方案中，所述克隆载体包含5个iis型限制性内切酶和/或2个兆核酸酶识别序列。
11.本文所用的iis型限制性内切酶包括但不限于：alwi、bcci、bsmal、eari、mlyi、plei、bmri、bsai、bsmbl、faui、hpyav、mnli、sapi、bbsi、bcivi、hphi、mboii、bfuai、bspmi、sfani、hgai、bbvi、ecii、foki、bceai、bsmfi、btgzi、bpmi、bpuei、bsgi、aclwi、alw26i、bst6i、bsrdi、bstmai、eaml1041、ksp632i、ppsi、schi、bfii、bso31i、bsptni、bspqi、eco31i、esp3i、faui、smui、bfui、bpii、bpuai、bstv2i、asuhpi、acc36i、lwei、aari、bsemii、tspdti、tspgwi、bsexi、bstvli、eco57i、eco57mi、gsui、psri或mmei。在一些实施方式中，所述iis型限制性内切酶选自以下中的任一种或其任意组合：bbsi、bsai、bsmbi、bspqi、bsrdi、eari、hgai和sfani。制备和使用iis型限制性内切酶的方法是常规的，并且许多iis型限制性内切酶可从商业来源获得。“iis型限制性内切酶识别序列”是能够被相应的iis型限制性内切酶识别并切割的序列,其根据所使用的具体iis型限制性内切酶确定并且为本领域已知的。在一个实施方案中，所述iis型限制性内切酶包含bspqi，其识别序列为gctcttc。
12.本文所用的术语“兆核酸酶”(meganuclease)是具有大于12bp的双链dna靶标序列的罕见切口的核酸内切酶亚型。所述兆核酸酶通常是二聚体酶，也称为归巢内切核酸酶
(homingendonuclease，he)，根据序列和结构基序可分为五个家族：laglidadg、giy-yig、hnh、his-cys盒和to-(d/e)xk。结构数据对于每个家族的至少一个成员是可获得的。在一些实施方式中，兆核酸酶选自以下中的任一种或其任意组合：i-scei、i-crei、i-dmoi、i-onui、i-ltri、i-panmi、i-gzemii、i-hjei、i-ltrwi和i-smami。制备和使用兆核酸酶的方法是常规的，并且许多兆核酸酶可从商业来源获得。“兆核酸酶识别序列”是能够被相应的兆核酸酶识别并切割的序列，其根据所使用的具体兆核酸酶确定并且为本领域已知的。在一个实施方案中，所述兆核酸酶包含i-scei，其识别序列为tagggataacagggtaat。
13.在一些实施方式中，所述克隆载体中的所述iis型限制性内切酶识别序列选自以下中的任一种或其任意组合：bbsi、bsai、bsmbi、bspqi、bsrdi、eari、hgai和sfani的识别序列。
14.在一些实施方式中，所述克隆载体中的所述兆核酸酶识别序列选自以下中的任一种或其任意组合：i-scei、i-crei、i-dmoi、i-onui、i-ltri、i-panmi、i-gzemii、i-hjei、i-ltrwi和i-smami的识别序列。
15.在一些实施方案中，所述克隆载体包含复制起点和选择标记基因。选择标记基因可以选自抗生素抗性基因或ccdb基因，如卡那霉素抗性基因、氯霉素抗性基因、新霉素抗性基因等。在一些实施方式中，所述克隆载体包含乳糖操纵子序列，包含多克隆位点的β半乳糖苷酶编码基因，以及3个或更多个bspqi识别序列和/或2个或更多个i-scei识别序列。在一些实施方案中，所述乳糖操纵子序列包括lac启动子和lac操纵基因。
16.所述克隆载体可以是中/高拷贝克隆载体。在一些实施方式中，用于构建本技术的dna构建体的克隆载体衍生自：pbr322载体，puc载体，或pet载体。在一些优选实施方案中，所述用于构建本技术的dna构建体的克隆载体衍生自puc载体，如puc57载体。在一些实施方式中，所述puc载体包含seq id no:12所示的序列或为seq id no：12所示序列。
17.本文所用的术语“衍生自”是指改造自，即所述克隆载体通过改造其所衍生自的初始载体(例如pbr322载体，puc载体，或pet载体)而获得，所述改造可以包括：(i)在初始载体例如pbr322载体，puc载体，或pet载体上插入一个或更多个iis型限制性内切酶和/或兆核酸酶识别序列、(ii)在初始载体pbr322载体，puc载体，或pet载体上进行突变以产生一个或更多个iis型限制性内切酶和/或兆核酸酶识别序列，或者(i)和(ii)的组合。在一些实施方式中，为了使dna构建体或克隆载体上的iis型限制型内切酶的识别位点更多且酶切后的骨架片段更小，可以在复制起始位点和抗生素抗性基因序列上通过密码子同义突变来添加更多的iis型限制性内切酶识别序列。
18.在一些实施方式中，所述克隆载体通过对puc57载体进行以下的改造来构建：(i)在puc57载体的第1554位碱基之后和第2539位碱基之后加入bspqi识别序列且在第1501位碱基之后和第2479位碱基之后加入i-scei识别序列，和(ii)将puc57载体的第1397位碱基处的g突变为c且将第2136位和2137位两个碱基at突变为gc。在一些实施方式中，所述puc载体包含seq id no:12所示的序列或为seq id no：12所示序列。
19.在一些实施方式中，所述克隆载体的核苷酸序列包含seq id no：1所示序列或为seq id no：1所示序列。
20.dna构建体
21.本技术还提供了用于下文所述的生产目的dna序列的方法中的dna构建体，其为自主复制的且包含：(a)一个或更多个iis型限制性内切酶和/或兆核酸酶识别序列；(b)目的
dna序列；(c)在所述目的dna序列两端侧翼的原核端粒酶识别序列。所述dna构建体可以通过以下的方法构建，所述方法包括：(i)提供包含一个或更多个iis型限制性内切酶和/或兆核酸酶识别序列的克隆载体；和(ii)将两端的侧翼连接有原核端粒酶识别序列的目的dna序列插入所述克隆载体中。在一些实施方式中，所述dna构建体通过在上文所述的克隆载体的多克隆位点中插入两端的侧翼连接有原核端粒酶识别序列的目的dna序列来制备。
22.本文所述的“dna构建体”是指待引入宿主细胞或生物体中的dna片段的人工组装产物。本文所述dna构建体是自主复制的，即，其可以包含支持所述dna构建体在原核或真核宿主细胞中的自主复制的序列，例如复制起点(ori)。
23.在一些实施方式中，所述dna构建体包含两个或更多个，例如3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个核酸内切酶识别序列。
24.在一些实施方式中，所述dna构建体还包含复制起始位点和选择标记基因。
25.在一些实施方式中，所述目的dna序列与两端的原核端粒酶识别序列直接邻接，即所述目的dna序列与两端的原核端粒酶识别序列之间不存在其他序列。
26.在一些实施方式中，所述目的dna序列与两端的原核端粒酶识别序列之间还存在其他序列，例如核酸内切酶识别位点、缺刻酶(nicking enzyme)识别位点等。
27.在目的dna序列两端的两个原核端粒酶识别序列可以同向重复，也可以反向重复。
28.本文所用的术语“原核端粒酶(protelomerase)”是指能够识别原核端粒酶识别序列并进行切割，以及重新连接包含原核端粒酶识别序列的dna以产生闭合双链dna的酶。原核端粒酶通常发现于噬菌体中，例如但不限于来源于大肠杆菌n15噬菌体(即原核端粒酶teln)、克雷伯氏菌phi k02噬菌体，耶尔森式菌py54噬菌体，盐单胞菌phi hap噬菌体，弧菌vp882噬菌体，和伯氏疏螺旋体lpb31.16质粒的原核端粒酶。在一些实施方式中，原核端粒酶选自来源于大肠杆菌n15噬菌体、克雷伯氏菌phi k02噬菌体、耶尔森式菌py54噬菌体、盐单胞菌phi hap噬菌体、弧菌vp882噬菌体和伯氏疏螺旋体lpb31.16质粒的原核端粒酶或其同源物或变体。在一些实施方式中，所述原核端粒酶是来源于大肠杆菌n15噬菌体的原核端粒酶(teln)或其同源物或变体。所述同源物通常为所述原核端粒酶的功能同源物，其氨基酸序列可以与原核端粒酶的天然氨基酸序列具有至少40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或98％的同一性。所述变体可以包括相对于原核端粒酶天然氨基酸序列的截短、插入、替换和/或缺失，例如一个或若干个氨基酸的截短、插入、替换和/或缺失。制备和使用原核端粒酶的方法是常规的，并且许多原核端粒酶可从商业来源获得。
29.本文所用的术语“原核端粒酶识别序列”为能够被原核端粒酶识别的dna序列，其根据所使用的具体原核端粒酶确定并且为本领域已知的。在一些实施方式中，原核端粒酶识别序列选自来源于大肠杆菌(e.coli)n15噬菌体、克雷伯氏菌(klebsiella)phi k02噬菌体，耶尔森式菌(yersinia)py54噬菌体，盐单胞菌(halomonas)phi hap噬菌体，弧菌(vibrio)vp882噬菌体和伯氏疏螺旋体(borrelia burgdorferi)lpb31.16的原核端粒酶识别序列。在一些实施方式中，原核端粒酶识别序列来源于大肠杆菌n15噬菌体。在一些实施方式中，原核端粒酶识别序列包含seq id no:2或由其组成。
30.生产目的dna序列的方法
31.本技术提供了一种用于生产目的dna序列的方法。其中，术语“生产”可以与扩增、克隆、复制等术语互换使用。所述方法包括在宿主细胞内进行的本技术的dna构建体的扩增
和提取步骤，以及原核端粒酶-iis型限制性内切酶和/或兆核酸酶-dna核酸外切酶催化的三步恒温酶反应步骤(即第一切割反应-第二切割反应-消化反应)，以及任选的回收步骤。
32.在一些实施方式中，所述生产目的dna序列的方法包括：
33.通过培养转入了dna构建体的宿主细胞来扩增所述dna构建体，并从所述宿主细胞提取经扩增的所述dna构建体，其中所述dna构建体为自主复制的且包含：(a)一个或更多个iis型限制性内切酶和/或兆核酸酶识别序列；(b)目的dna序列；(c)在所述目的dna序列两端侧翼的原核端粒酶识别序列，
34.使原核端粒酶与经扩增和提取的所述dna构建体接触，其中所述原核端粒酶识别并切割所述dna构建体上的所述原核端粒酶识别序列，以得到第一切割反应混合物，
35.使所述第一切割反应混合物与一种或多种iis型限制性内切酶和/或兆核酸酶接触，其中所述iis型限制性内切酶和/或兆核酸酶识别并切割所述构建体上的所述iis型限制性内切酶和/或兆核酸酶识别序列，以得到第二切割反应混合物，和
36.使所述第二切割反应混合物与一种或多种核酸外切酶接触，以消化除所述目的dna序列之外的其他序列。
37.1.dna构建体的扩增和提取步骤
38.本技术的用于生产目的dna序列的方法包括本技术的dna构建体的扩增和提取步骤，其中dna构建体的扩增在宿主细胞中进行。
39.在一些实施方式中，所述dna构建体的扩增和提取步骤包括：通过培养转入了所述dna构建体的宿主细胞来扩增所述dna构建体，并从所述宿主细胞提取经扩增的所述dna构建体。在一些实施方式中，所述dna构建体的扩增和提取步骤为本领域公知的利用宿主细胞的质粒扩增和抽提步骤。
40.本文所用的术语“宿主细胞”涵盖能够被转化以引入载体或构建体且支持所述载体或构建体在其中的复制的任何细胞。宿主细胞可以是原核细胞(例如细菌细胞，例如大肠杆菌细胞)或真核细胞(例如酵母、昆虫、两栖动物或哺乳动物细胞)。
41.可以使用本领域已知的任何方法将所述dna构建体转入宿主细胞中，所述方法包括但不限于通过化学转化或电转转化使dna构建体进入合适的感受态细胞，例如大肠杆菌感受态细胞，包括但不限于top10化学感受态细胞(invitrogen
tm
，产品目录号：c404010)，dh5α化学感受态细胞(invitrogen
tm
，产品目录号：18265017)，dh10b化学感受态细胞(invitrogen
tm
，产品目录号：12331013)等。
42.所述dna构建体在宿主细胞中的扩增通过在适合dna构建体的扩增的条件下培养所述宿主细胞进行。在一些实施方案中，所述dna构建体，如克隆载体转染至宿主细胞如大肠杆菌细胞后，在适合的液体培养基(如包含抗性基因的lb培养基)中发酵培养。所述dna载体在发酵累积的宿主细胞中也进行了扩增。
43.经扩增的所述dna构建体的提取可以通过本领域公知的提取方法进行，包括但不限于使用碱裂解法，或使用商业化质粒抽提试剂盒(例如qiaprep spin miniprep kit,qiagen等)。
44.2.第一切割反应
45.本技术的用于生产目的dna序列的方法还包括在上述dna构建体的扩增和提取步骤之后的第一切割反应步骤。所述第一切割反应步骤可以包括：使原核端粒酶与经扩增和
提取的所述dna构建体接触，其中所述原核端粒酶识别并切割所述dna构建体上的所述原核端粒酶识别序列，以得到第一切割反应混合物。
46.所述第一切割反应可以为在适宜原核端粒酶活性的温度下的恒温反应。所述适宜的温度为本领域已知的，可以为例如20-40℃，例如25-35℃，例如30℃。第一切割反应的时间可以为10分钟至24小时，例如30分钟至12小时，例如40分钟、50分钟、1小时、2小时或4小时。
47.在一些实施方式中，所述用于生产目的dna序列的方法包括在第一切割反应后将所述原核端粒酶灭活的步骤。该灭活步骤可以包括：加热原核端粒酶到高于其灭活温度(例如高于60℃，高于70℃，例如75℃)并保持合适的时间(例如2分钟至1小时，例如5分钟、10分钟或20分钟)。
48.3.第二切割反应
49.本技术的用于生产目的dna序列的方法还包括在上述第一切割反应步骤之后的第二切割反应步骤。所述第二切割反应可以包括：使所述第一切割反应混合物与一种或多种iis型限制性内切酶和/或兆核酸酶接触，其中所述iis型限制性内切酶和/或兆核酸酶识别并切割所述构建体上的所述iis型限制性内切酶和/或兆核酸酶识别序列，以得到第二切割反应混合物。
50.所述第二切割反应可以为在适宜所用iis型限制性内切酶和/或兆核酸酶的温度下的恒温反应。所述适宜的温度为本领域已知的，可以为例如20-55℃，例如30-50℃，例如37℃。第二切割反应的时间可以为10分钟至24小时，例如30分钟至12小时，例如40分钟、50分钟、1小时、2小时或4小时。
51.在一些实施方式中，所述用于生产目的dna序列的方法包括在第二切割反应后将所述iis型限制性内切酶和/或兆核酸酶灭活的步骤。该灭活步骤可以包括：加热iis型限制性内切酶和/或兆核酸酶到高于其灭活温度(例如高于60℃，高于65℃，例如65℃或70℃)并保持一定时间(例如2分钟至1小时，例如10分钟、20分钟或25分钟)。
52.4.消化反应
53.本技术的用于生产目的dna序列的方法还包括在上述第二切割反应步骤之后的消化反应步骤。所述消化反应步骤包括：使所述第二切割反应混合物与一种或多种核酸外切酶接触，以消化除所述目的dna序列之外的其他序列，优选地消化除所述目的dna序列之外的全部其他核酸序列。
54.所述核酸外切酶可以为本领域已知的任何核酸外切酶，包括但不限于，噬菌体t5核酸外切酶(噬菌体t5基因d15产物)、噬菌体λ核酸外切酶、rac原噬菌体的rece、来自大肠杆菌的核酸外切酶viii、噬菌体t7核酸外切酶(噬菌体t7基因6产物)。在本发明的一些实施方式中，核酸外切酶是t5核酸外切酶或λ核酸外切酶。制备和使用核酸外切酶的方法是常规的，并且许多核酸外切酶可从商业来源获得。
55.所述消化反应可以为在适宜所用核酸外切酶的温度下的恒温反应。所述适宜的温度为本领域已知的，可以为例如20-55℃，例如30-50℃，例如37℃。消化反应的时间可以为10分钟至24小时，例如30分钟至12小时，例如1小时、2小时、3小时、4小时、5小时或6小时。
56.在一些实施方式中，所述用于生产目的dna序列的方法包括在消化反应后将所述核酸外切酶灭活的步骤。该灭活步骤可以包括：加热核酸外切酶到高于其灭活温度(例如高于60℃，高于65℃，例如70℃，75℃或80℃)并保持一定时间(例如2分钟至1小时，例如5分
钟、10分钟或20分钟)。
57.本所述第一切割反应完成后和所述第二切割反应完成后均不包括额外的纯化步骤。本领域技术人员可以理解的是，本技术的所有酶切反应，包括利用原核端粒酶的第一切割反应和利用iis型限制性内切酶和/或兆核酸的第二切割反应并不切割目的dna序列。
58.在一些实施方式中，本技术的用于生产目的dna序列的方法还可以包括在上述消化反应步骤之后的任选的回收目的dna序列步骤。所述回收步骤可以通过以下中的任一种或其任意组合进行：将所述消化步骤的产物经过酚氯仿抽提、dna吸附离心柱回收，异丙醇/乙醇沉淀，或高效液相色谱法支持的分子筛色谱法进行反应体系中蛋白酶和盐分的去除。当所得的目的dna序列用于哺乳动物细胞或动物实验时，还可以进行内毒素去除和/或进行无菌过滤处理。
59.所述消化反应的产物为闭合线性双链dna。在一些实施方式中，本技术的用于生产目的dna序列的方法所生产的目的dna序列为闭合线性双链dna。
60.本技术的用于生产目的dna序列的方法可以在没有任何纯化步骤的情况下实现目的dna序列的高纯度(例如产物纯度为100％)生产。在一些实施方式中，所述用于生产目的dna序列的方法不包括任何纯化目的dna序列的步骤，例如不包括在消化反应后纯化目的dna序列的步骤，不包括在第二切割反应后纯化产物dna序列的步骤，和/或不包括在第一切割反应后纯化产物dna序列的步骤。在一些实施方式中，本技术的用于生产目的dna序列的方法所生产的目的dna序列的纯度为大于95％、大于98％、大于99％或为100％。
61.本技术的用于生产目的dna序列的方法可以进行大规模的目的dna序列生产。在一些实施方式中，所述转入了所述dna构建体的宿主细胞的发酵培养体系可以达1l以上，例如5l或10l以上。在一些实施方式中，经扩增的所述dna构建体的提取可以为从1l以上、5l以上或10l以上的发酵培养体系中提取经扩增的所述dna构建体。在一些实施方式中，所生产的目的dna序列达1mg以上、5mg以上或10mg以上。
62.5.另一些实施方式
63.在一些实施方式中，本技术的dna构建体在目的dna序列和原核端粒酶识别序列之间还包含额外的限制性内切酶识别序列，且本技术的用于生产目的dna序列的方法在消化反应步骤(即“使所述第二切割反应混合物与一种或多种核酸外切酶接触，以消化除所述目的dna序列之外的其他序列”的步骤)之后还包括使限制性内切酶接触消化反应产物(即闭合线性双链dna)以识别并切割所述额外的限制性内切酶识别序列的步骤，从而去除闭合线性双链dna的两个末端，以制备两端非闭合的(带有平末端或粘末端)的双链目的dna片段。
64.在一些实施方式中，本技术的dna构建体在目的dna序列和原核端粒酶识别序列之间还包含额外的缺刻酶识别序列，且本技术的用于生产目的dna序列的方法在消化反应步骤(即“使所述第二切割反应混合物与一种或多种核酸外切酶接触，以消化除所述目的dna序列之外的其他序列”的步骤)之后还包括使缺刻酶接触消化反应产物(即闭合线性双链dna)以识别并切割所述额外的缺刻酶识别序列的步骤，从而去除双链dna的正义链或反义链中的一条链，形成两端为共价闭合结构且局部为双链dna而中间目的片段区域为单链dna的dna序列。
65.本文所用的术语“缺刻酶”包括但不限于nb.bbvci、nb.bsmi、nb.bsrdi、nb.bsssi、nb.btsi、nt.alwi、nt.bbvci、nt.bsmai、nt.bspqi、nt.bstnbi和nt.cvipi。制备和使用缺刻
酶的方法是常规的，并且许多缺刻酶可从商业来源获得(例如new england biolabs)。“缺刻酶识别序列”是能够被相应的缺刻酶识别并切割的序列，其根据所使用的具体缺刻酶确定并且为本领域已知的。
66.本技术的用于生产目的dna序列的方法所生产的目的dna序列可以通过化学或物理递送方式导入到细胞或动物体内，进行外源基因的瞬时表达或将外源dna序列整合入基因组中。
67.在一些实施方式中，本技术的用于生产目的dna序列的方法所生产的目的dna序列可以包含蛋白质编码序列，以用于蛋白质的表达。例如，所述目的dna序列包含启动子、目的基因和poly(a)尾。
68.因此，本技术还提供了一种用于表达目的蛋白质的方法，所述方法包括：
69.执行本技术所述的用于生产目的dna序列的方法，其中所述目的dna序列包含编码目的蛋白质的dna序列，
70.将所得的目的dna序列转入原核细胞或真核细胞中，
71.在适合于所述蛋白质表达的条件下孵育所述原核细胞或真核细胞。
72.在一些实施方式中，本技术的用于生产目的dna序列的方法所生产的目的dna序列可以用于目标基因组的遗传改造，例如基于crispr的遗传改造。
73.因此，本技术还提供了一种用于将目的dna序列整合入目标基因组的目的整合位点的方法，所述方法包括：
74.执行本技术所述的用于生产目的dna序列的方法，所述目的dna序列包含目的整合位点两端的同源臂序列和中间目的敲入片段，
75.将所得的目的dna序列、cas9蛋白和基于目的dna序列设计的sgrna一起转入原核细胞或真核细胞中，
76.孵育所述原核细胞或真核细胞以将目的dna序列整合入目标基因组中。
77.其中，基于目的dna序列，通过现有的sgrna设计网站如，https://www.genscript.com/grna-design-tool.html，设计出最优的sgrna序列。
78.所述目的整合位点两端的同源臂序列可以是目的整合基因位点两端的约300bp，约310bp，约320bp，约330bp，约350bp的序列。如所述目的整合基因为trac基因或rab11a基因，所述目的整合位点两端的同源臂序列为trac基因或rab11a基因左右两端300bp左右的序列。
79.本技术将目的dna序列整合入目标基因组的目的整合位点的方法可以实现整合的目的dna序列在目标基因组中稳定持续的表达，如稳定表达7天以上。
80.试剂盒
81.本技术还提供了一种用于生产目的dna序列的试剂盒，其用于执行本技术所述的生产目的dna序列的方法。所述试剂盒包含：所述克隆载体，原核端粒酶，一个或更多个iis型限制性内切酶和/或兆核酸酶，以及一种或多种核酸外切酶。所述试剂盒还可以包含记载本技术所述方法的使用说明书。
82.本技术的提供的生产目的dna序列的方法适用于工业上的大规模生产目的dna序列。在一些实施方式中，所述生产目的dna序列的方法在1l以上、5l以上、10l以上或20l以上的发酵罐中进行。
83.本技术的方法实现了例如以下的有益效果：
84.一、本技术的方法对任何序列都简单通用，无需对每一条序列进行特殊的设计，也无需对每一条序列采用不同的制备工艺；
85.二、由于本技术方法的关键原料为大抽质粒，且每一步的酶切反应均为恒温，所以易于规模扩大；
86.三、本技术方法所选取的酶对反应条件的兼容性非常高，无需每一步酶切反应后将酶切产物进行纯化再制备下一步的酶切反应体系，而是可以在第一步酶切时就将酶切体系设立好，对于后续的每一步酶切反应，只需将上一步反应的酶灭活后，直接向反应体系加入新的酶进行反应即可；
87.四、本技术的方法无需任何依赖于电泳的dna条带分选或基于高效液相色谱的dna片段分离，就可大量制备出高纯度的目的dna序列，非常适合于经济高效的大规模合规性制备用于精准编辑的基因编辑模板。
88.五、本技术的方法，特别是用于在工业上大规模生产目的dna序列时易于实现质量控制，适于gmp生产。
附图说明
89.参考以下附图更详细地描述本发明：
90.图1显示了本技术的一个实施例中通用构建体的功能元件和限制性内切酶酶切位点布局。
91.图2显示了本技术的一个实施方式的目的dna序列的生产流程。
92.图3显示了本技术的一个实施例中琼脂糖凝胶电泳检测稳定双链dna中间产物和最终产物的结果。泳道m为3000bp双链dna marker；泳道1为纯化的制备载体经teln酶切后的产物，泳道2为泳道1产物经i-scei酶切后的产物，泳道3为泳道2产物经λ核酸外切酶消化后的产物。
93.图4显示了本技术的一个实施例中终产物目的序列1采用agilent bioanalyzer 2100的纯度验证。
94.图5显示了本技术的一个实施例中琼脂糖凝胶电泳检测稳定双链dna中间产物和最终产物的结果。泳道m为3000bp双链dna marker；泳道1为纯化的制备载体经teln酶切后的产物；泳道2为泳道1产物经bspqi酶切后的产物；泳道3为泳道2产物经λ核酸外切酶消化后的产物。
95.图6显示了本技术的一个实施例中终产物目的序列2采用agilent bioanalyzer 2100的纯度验证。
96.图7显示了本技术的一个实施例中电转入根据本技术方法制备的目的序列2后细胞活率的检测。
97.图8显示了本技术的一个实施例中电转入根据本技术方法制备的目的序列2的48小时后细胞的绿色荧光蛋白表达检测。
98.图9显示了本技术的一个实施例中电转入根据本技术方法制备的目的序列2后细胞活率的检测。
99.图10显示了本技术的一个实施例中电转入根据本技术方法制备的目的序列2的7天后细胞的绿色荧光蛋白表达检测。
具体实施方式
100.除非另有说明，本发明所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术员通常所理解的含义。
101.下面通过实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步详细的说明。除非另有说明，下文描述的实施例的方法和材料均为可以通过市场购买获得的常规产品。本发明所属领域技术员将会理解，下文描述的方法和材料，仅是示例性的，而不应视为限定本发明的范围。
102.实施例1：通用构建体的设计和构建
103.选用puc57卡那霉素抗性载体作为改造载体，如图1所示，在原来只有714碱基处存在一个bspqi酶切识别位点的基础上，又分别在功能元件之间的1554位g碱基后和2539位a碱基后加入两个bspqi酶切识别位点(序列：gctcttc)。在1501位a碱基之后和2479位a碱基之后敲入两个原来不存在的兆核酸酶i-scei酶切识别序列(序列：tagggataacagggtaat)。另外，也通过点突变在1397碱基处将g变为c以实现密码子同义突变，这样在保证ori功能不变的情况下在其编码基因上加入一个bspqi酶切识别位点；同样，通过同义突变(at到gc)，在2136位和2137位碱基at突变为gc，在卡纳霉素抗性基因的编码基因中增加一个bspqi酶切识别位点。上述提到的序列插入和点突变，均在puc57-kanr质粒载体(南京金斯瑞生物科技有限公司，序列信息见：https://www.addgene.org/vector-database/6258/,seq id no:12)的基础上，由南京金斯瑞生物科技有限公司进行定点突变服务(https://www.genscript.com.cn/mutagenesis.html)，获得如图1所示的通用制备构建体。该通用构建体的功能元件由左至右包括puc57-kanr载体已有的用于蓝白斑筛选的乳糖操纵子序列，包括lac启动子，lac操作基因，和包含多克隆位点(multiple cloning site,mcs)的β半乳糖苷酶编码基因laczα；质粒复制起始位点序列ori；卡纳霉素抗性基因kanr；以及添加进去的bspqi识别序列gctcttc和i-scei酶切识别序列tagggataacagggtaat。设计的通用构建体的序列如seq id no:1所示。
104.实施例2：目的序列1用于在rab11a基因敲入gfp基因
105.2.1目的序列1的设计
106.敲入的gfp序列位点两端的序列分别取自人基因组rab11a(ras相关蛋白rab-11a)基因敲入位点左/右300bp的序列(作为rab11a同源臂序列)，分别如seq id no:4和seq id no：5所示。设计的目的序列1(1356bp稳定双链dna)的原始序列如seq id no:3所示，在目的dna序列1两端添加上大肠杆菌n15噬菌体来源的原核端粒酶teln识别序列tatcagcacacaattgcccattatacgcgcgtataatggactattgtgtgct gata(seq id no:2)，目的序列1两端添加完原核端粒酶teln酶识别序列后的序列如seq id no:6所示。终序列在设计好之后，由南京金斯瑞生物科技有限公司进行全序列基因合成(https://www.genscript.com.cn/gene_synthesis.html)。
107.2.2制备dna构建体与大规模质粒制备
108.将步骤2.1合成好的两端添加了teln酶识别序列的目的序列1(seq id no:6)用t4连接酶(thermo scientific
tm
,产品目录号:el0011)平连进经过限制性内切酶ecorv(new england biolabs,catalog#r3195l)单酶切线性化的通用载体puc57-kan-v6(实施例1制备的通用载体)的酶切位点。将连接产物电转化方法转化大肠杆菌感受态细胞，将经转化的大
肠杆菌涂布在具有卡纳霉素的lb平板培养基，并放置于37℃过夜培养。第二天挑10个单菌落分别到3ml含有50μg/ml卡那霉素的lb液体培养基进行液体培养，并进行质粒抽提。将每个质粒通过sanger测序手段进行鉴定，并确定序列全部正确的质粒。质粒抽提和测序由南京金斯瑞生物科技公司完成(https://www.genscript.com.cn/custom-plasmid-preparation.html)。将挑选出的含有序列正确的质粒的大肠杆菌菌株进行划线保存。将保存的大肠杆菌菌株接种制备种子液(od值约0.8)，然后将种子液1％接种到1l的大肠杆菌培养体系，以进行10l的大规模的质粒抽提。
109.2.3含有目的序列1的稳定双链dna制备
110.将大规模抽提的质粒制备载体进行三步恒温酶切反应以获得含有目的序列1的线性闭合双链dna。第一步是用teln酶(new england biolabs,catalog#m0651s,每300fmol teln识别位点加入1μl 5u/μl的酶)将环状的制备载体0.8mg切割成分别含有目的序列1和载体骨架的两个两端闭合的双链dna线性片段，30℃孵育1小时，然后75℃加热10分钟以灭活teln酶，反应完成后用琼脂糖电泳方法检测反应是否进行完全，即制备载体是否完全由超螺旋环状质粒变为两条线性化双链dna,且条带位置应分别为目的片段和制备载体骨架大小(约为2.6kb)；第二步，由于该目的序列1中含有bspqi识别序列gctcttc，所以采用目的序列1中不含有i-scei酶识别序列的i-scei酶进行，使目的序列1保持不变，而载体骨架序列会被i-scei酶(new england biolabs,catalog#r0694l)切成多段含有双链断裂的dna片段，反应条件为37℃反应1小时进行灭活,反应完成后用琼脂糖电泳方法检测反应是否进行完全；第三步，使用dna核酸外切酶，将切碎的载体骨架dna片段消化完全。第二步反应之后在反应体系中加入核酸外切酶λ核酸外切酶(new england biolabs,catalog#m0262l)或t5核酸外切酶(new england biolabs,catalog#m0663l),37℃反应2小时，然后进行热灭活。具体的反应条件请见以下表1至表3，反应后采用琼脂糖凝胶电泳来检测目的产物纯度，产物为仅有目的条带的单一产物(见图3)。终产物稳定双链目的序列1采用agilent bioanalyzer 2100纯度验证，无需采用任何额外的dna分子片段分选或纯化步骤，即可获得100％纯度的、仅含有目的片段的dna纯品(见图4)。
111.表1：teln酶切反应体系和反应条件
[0112][0113][0114]
30℃,1h
[0115]
75℃,5min
[0116]
4℃,直至下一步
[0117]
表2：i-scei酶切反应体系和反应条件
[0118][0119]
37℃,60min
[0120]
65℃,20min
[0121]
4℃直至下一步
[0122]
表3：dna核酸外切酶反应体系和反应条件
[0123][0124]
37℃,3h
[0125]
添加0.4ml 0.25m
[0126]
edta至终浓度为
[0127]
10mm
[0128]
75℃,10min
[0129]
4℃直至下一步
[0130]
如图3所示，泳道m为3000bp双链dna marker；泳道1为纯化的制备载体经teln酶切后的产物，包括一条1kb的目的条带双链dna和一条2kb的载体骨架双链dna；泳道2为泳道1产物经i-scei酶切后的产物，包括1kb的目的条带双链dna和被切成两段的载体骨架双链dna；泳道3为泳道2产物经lambda exo核酸外切酶消化后的产物，终产物只有1kb目的条带双链dna。
[0131]
如图4所示，终产物采用安捷伦bioanalyzer毛细管电泳和dna 12000检测芯片进行纯度检测。其中50bp和17,000bp的峰为芯片检测的内参峰，整个检测范围内只有目的序列的物质峰，纯度为100％。
[0132]
2.4含有目的序列1的稳定双链dna的终纯化
[0133]
上述反应产物可经过酚氯仿抽提(invitrogen
tm
,产品目录号:15593031)，特殊材质的dna吸附离心柱(qiagen-tip 100,qiagen,产品目录号:10043)回收，再用异丙醇(国药集团化学试剂有限公司，编号80109218)/乙醇(国药集团化学试剂总公司，编号10009257)沉淀将仅含有目的序列的dna分子进行回收。本实施例采用的异丙醇/乙醇沉淀法，具体步骤为：1)加入0.7倍体积的常温异丙醇(例如1毫升待浓缩稳定双链dna中加入0.7毫升异丙醇)，混匀后1,2000-14,000rpm 4℃离心10分钟，小心吸去上清液，避免触及沉淀；2)加入1毫升常温70％乙醇溶液，轻轻悬起质粒沉淀以充分洗涤，12,000-14,000rpm 4℃离心5-10分钟，小心吸去上清液，避免触及沉淀；3)5,000-10,000rpm 4℃离心5-10秒，用20微升或200微升移液器小心吸净残留液体，避免触及沉淀；4)肉眼观察无明显液体后(吸净液体后通常在1分钟内即可完成干燥)，加入适当体积的溶液(如溶液v、10mm tris-cl ph8.5或milli-q级纯水)溶解dna。
[0134]
本实施例采用了0.8mg的纯化的包含目的序列的制备载体，其中目的序列的长度占整个制备载体的35％，即理论的稳定双链dna产物应该有0.28mg,经异丙醇沉淀纯化后，获得纯品的仅含目的序列的稳定双链dna经o.d.260紫外吸收测定(nanodrop one,thermofisher)为0.18mg,产率为64.73％。通过放大反应体系，一次性投入4.5mg纯化的包含目的序列的制备载体，以保证一次性获得1mg终产物。纯化1mg以上的质粒采用高效液相色谱法(explorer 100,cytiva)支持的分子筛色谱法(层析柱填料：sepharose 6fast flow,cytiva)进行反应体系中蛋白酶和盐分的去除。
[0135]
实施例3：目的序列2用于在trac基因敲入带有cmv启动子的gfp的基因编辑模板
[0136]
3.1目的序列2的设计
[0137]
敲入的带有cmv启动子的gfp序列位点两端的序列，分别取自人基因组trac(t细胞受体α链编码基因)基因敲入位点左/右约300bp的序列(作为trac左右同源臂序列)，分别如seq id no:7和seq id no:8所示。目的序列2(1885bp稳定双链dna)的原始序列如seq id no:9所示，在目的dna序列2两端添加上大肠杆菌n15噬菌体来源的原核端粒酶teln识别序列tatcagcacacaattgcccattatacgcgcgtataatggactattgtgtgct gata(seq id no:2)，目的序列2两端添加完原核端粒酶teln酶识别序列后的序列为如seq id no:10所示。终序列在设计好之后，由南京金斯瑞生物科技有限公司进行全序列基因合成(https://www.genscript.com.cn/gene_synthesis.html)。
[0138]
3.2制备dna构建体与大规模质粒制备
[0139]
同实施例2，将3.1合成好的两端添加了teln酶识别序列的目的序列2用t4连接酶(thermo scientific
tm
,产品目录号:el0011)平连进经过限制性内切酶ecorv(new england biolabs,catalog#r3195l)单酶切线性化的puc57-kan-v6(实施例1制备的通用载体)。将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，将经转化的大肠杆菌涂布在具有卡纳霉素的lb平板培养基，并放置于37℃过夜培养。第二天挑10个单菌落分别到3ml含有50ug/ml卡那霉素的lb液体培养基进行液体培养，并进行质粒抽提。质粒抽提由南京金斯瑞生物科技公司完成(https://www.genscript.com.cn/custom-plasmid-preparation.html)。将每个质粒通过测序手段进行鉴定，并确定序列全部正确的质粒。将含有序列正确的质粒的大肠杆菌菌株进行划线保存，并通过制备种子液，然后将种子液接种到1l的大肠杆菌培养体系，以进行
10l的大规模的质粒抽提。
[0140]
3.3含有目的序列2的稳定双链dna制备
[0141]
如实施例2.3的操作步骤，将大规模抽提的质粒制备载体进行三步恒温酶切反应以获得含有目的序列的闭合双链dna。第一步是用teln酶(new england biolabs,catalog#m0651s,每300fmol teln识别位点加入1μl 5u/μl的酶)将实施例3.2中得到的环状的制备载体切割成分别含有目的序列2和载体骨架的两个两端闭合的双链dna线性片段，具体反应条件见表4，反应完成后用琼脂糖电泳方法检测反应是否进行完全；第二步，目的序列2可以采用实施例一中使用的i-scei进行酶切，但由于该目的序列中不含有bspqi识别序列，所以可以采用通用载体上酶切位点更多的bspqi进行酶切，使目的片段保持不变，而载体骨架序列会被bspqi酶切成多段含有双链断裂的dna片段，具体反应条件见表5，反应完成后用琼脂糖电泳方法检测反应是否进行完全；第三步，使用dna核酸外切酶，将切碎的载体骨架dna片段消化完全。在第二步反应之后在反应体系中加入λ核酸外切酶(new england biolabs,catalog#m0262l)或t5核酸外切酶(new england biolabs,catalog#m0663l),37℃反应2小时，然后进行热灭活，具体的反应条件见表6。反应后采用琼脂糖凝胶电泳检测目的产物纯度，产物为仅有目的条带的单一产物(见图5)。终产物稳定双链目的序列2采用agilent bioanalyzer 2100纯度验证，如图6所示，其中50bp和17,000bp的峰为芯片检测的内参峰，整个检测范围内只有目的序列的物质峰，纯度为100％，无需采用任何额外的dna分子片段分选或纯化步骤，即可获得100％纯度的、仅含有目的片段的dna纯品。
[0142]
表4：teln酶切反应体系和反应条件
[0143][0144][0145]
30℃,1h
[0146]
75℃,5min
[0147]
4℃,直至下一步
[0148]
表5：bspqi酶切反应体系和反应条件
[0149][0150]
50℃,60min
[0151]
80℃,20min
[0152]
4℃,直至下一步
[0153]
表6：dna核酸外切酶反应体系和反应条件
[0154][0155]
37℃,3h
[0156]
加0.48ml 0.25m edta至终浓度
[0157]
10mm
[0158]
75℃,10min
[0159]
4℃,直至下一步
[0160]
如图5所示，泳道m为3000 bp双链dna marker；泳道1为纯化的制备载
[0161]
体经teln酶切后的产物，包括一条1.8kb的目的条带双链dna和一条2kb的载体骨架双链dna；泳道2为泳道1产物经bspqi酶切后的产物，包括1.8kb的目的条带双链dna和被切成五段的载体骨架双链dna；泳道3为泳道2产物经λ核酸外切酶消化后的产物，终产物只有1.8kb目的条带双链dna。
[0162]
如图6所示，终产物采用安捷伦bioanalyzer毛细管电泳和dna 12000检测芯片进行纯度检测。其中50bp和17,000bp的峰为芯片检测的内参峰，整个检测范围内只有目的序列的物质峰，纯度为100％。
[0163]
3.4含有目的序列2的稳定双链dna的终纯化
[0164]
上述反应产物可经过酚氯仿抽提(invitrogen
tm
,产品目录号:15593031)，特殊材质的dna吸附离心柱(qiagen-tip 100,qiagen,产品目录号:10043)回收，再用异丙醇(国药集团化学试剂有限公司，编号80109218)/乙醇(国药集团化学试剂总公司，编号10009257)
沉淀。本实施例采用异丙醇/乙醇沉淀法，具体步骤为：1)加入0.7倍体积的常温异丙醇(例如1毫升待浓缩稳定双链dna中加入0.7毫升异丙醇)，混匀后1,2000-14,000rpm 4℃离心10分钟，小心吸去上清液，避免触及沉淀；2)加入1毫升常温70％乙醇溶液，轻轻悬起质粒沉淀以充分洗涤，12,000-14,000rpm 4℃离心5-10分钟，小心吸去上清液，避免触及沉淀；3)5,000-10,000rpm 4℃离心5-10秒，用20微升或200微升移液器小心吸净残留液体，避免触及沉淀；4)肉眼观察无明显液体后(吸净液体后通常在1分钟内即可完成干燥)，加入适当体积的溶液(如溶液v、10mm tris-cl ph8.5或milli-q级纯水)溶解dna。
[0165]
本实施例采用了1.2mg的纯化的包含目的序列的制备载体，其中目的序列的长度占整个制备载体的42.5％，即理论的稳定双链dna产物应该有0.51mg,经异丙醇沉淀纯化后，获得纯品的仅含目的序列的稳定双链dna经o.d.260紫外吸收测定(nanodrop one,thermofisher)为0.26mg,产率为50.98％。通过放大反应体系，一次性投入4.62毫克纯化的包含目的序列的制备载体，以保证一次性获得1mg终产物。纯化1mg以上的质粒采用高效液相色谱法(explorer 100,cytiva)支持的分子筛色谱法(层析柱填料：sepharose 6fast flow,cytiva)进行反应体系中蛋白酶和盐分的去除。
[0166]
实施例4：将实施例3制备的目的序列2电转入hek293t细胞系用于绿色荧光蛋白的表达
[0167]
4.1hek293t哺乳动物细胞系的培养与准备：从4℃冰箱取出培养基(dmem low-glucose,gibco
tm
,catalog number:11885084)，室温放置于超净台，将hek293t细胞(crl-3216
tm
)冻存管于37℃下手持晃动使其融化，在5ml培养基中加1ml细胞冻存液去除dmso，离心，弃上清；加入5ml新鲜培养基，于6cm平皿中培养，将1*10^6个细胞/瓶添加至10cm培养皿，培养48h。
[0168]
4.2 dna电转至hek293t细胞系
[0169]
1.细胞计数得1.96*10^6个/ml，共5ml
[0170]
2.10μl电转液+1μg/μl编码绿色荧光蛋白基因的目的序列2或实施例3.2抽提的质粒样品2μl；
[0171]
3.取步骤1获得的细胞1ml，进行低速离心，弃上清，然后加入10μl电转液进行重悬；
[0172]
4.将步骤2中的目的序列2或质粒样品和步骤3中的细胞分别室温孵育10min；
[0173]
5.将步骤4中的孵育后的样品和细胞混匀，再室温孵育10min；
[0174]
6.采用celetrix ctx-1500le电转仪进行电转，电压为420v，每种样品测试三组；
[0175]
7.将细胞于培养皿培养；
[0176]
8.细胞培养48小时后用流式细胞仪(cytoflex，beckman coulter)观察活细胞比例和有绿色荧光蛋白表达的细胞群比例。
[0177]
4.3测试结果
[0178]
如图7所示，活率检测经流式细胞仪选取正常形态的细胞群统计确定，电转入2μg稳定双链dna目的序列2的细胞样品与转2μg质粒和不转任何dna的空白对照组在活率上相近。
[0179]
如图8所示，绿色荧光蛋白表达水平检测经流式细胞仪在鉴定的活细胞群中选取绿色荧光蛋白表达阳性的细胞并统计百分比，电转入2μg稳定双链dna的细胞样品的gfp表
达率平均值为18.21％，转2μg质粒的gfp表达率平均值为35.70％，而不转任何dna的空白对照组的gfp表达率平均值为0.36％。这表明转入的稳定双链dna能够在细胞内表达。转2μg质粒的hek293细胞的gfp表达率为转2μg稳定双链dna的细胞的两倍，这可能是由于质粒的超螺旋结构使其更容易进入到细胞质进行瞬时转染表达。
[0180]
实施例5：将实施例3制备的目的序列2和crispr-cas9 rnp复合物共同电转入hek293t细胞系用于gfp表达基因的基因组定点敲入
[0181]
5.1hek293t哺乳动物细胞系的培养与准备：同实施例4.1的方法复苏hek293t细胞。
[0182]
5.2 dna电转至hek293t细胞系
[0183]
1.细胞计数得1.96*10^6个/ml，共5ml
[0184]
2.10μl电转液+1μg/μl编码绿色荧光蛋白基因的稳定双链dna目的序列2或实施例3.2抽提的质粒样品2μl，添加50pmol cas9蛋白(gencrispr cas9-n-nls nuclease，genscript,cat.no.z03388)0.5μl+200pmol sgrna(序列：agagucucucagcugguacaguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguc cguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu，seq id no:11，基于目的dna序列在设计网站https://www.genscript.com/grna-design-tool.html中设计后，由南京金斯瑞合成)1μl(基因敲入实验组)，以不添加cas9蛋白和sgrna作为空白对照组，室温孵育10min
[0185]
3.取步骤1获得的细胞1ml,进行低速离心，弃上清，然后加入10μl电转液进行重悬，然后室温孵育10min；
[0186]
4.将2与3混匀，再室温孵育10min，然后将混合物转入电转杯；
[0187]
5.采用celetrix ctx-1500le电转仪进行电转，电压为420v，每种样品测试三组；
[0188]
6.将细胞于培养皿培养；
[0189]
7.细胞培养7天后用流式细胞仪观察活细胞比例和有绿色荧光蛋白表达的细胞群比例。
[0190]
5.3.测试结果
[0191]
如图9所示，活率检测经流式细胞仪选取正常形态的细胞群统计确定，无论加cas9蛋白和sgrna复合物(rnp，核糖核蛋白)与否，电转入2μg稳定双链dna的细胞样品与转2μg质粒和不转任何dna的空白对照组在活率上相近。
[0192]
绿色荧光蛋白表达水平检测经流式细胞仪在鉴定的活细胞群中选取绿色荧光蛋白表达阳性的细胞并统计百分比。如图10所示，无论添加cas9蛋白和sgrna复合物(rnp)与否，不转任何dna的空白对照组的gfp表达率平均值均约等于0；转2μg质粒的gfp表达率平均值非常接近，分别为5.51％和5.91％，说明加入cas9和sgrna rnp复合物的实验组没有大量发生gfp基因片段在hek293t细胞基因组上的敲入，而是质粒模板残留造成的gfp背景表达；电转入2μg稳定双链dna的细胞样品的gfp表达率平均值分别为13.35％和4.92％，与无rnp的对照组相比，稳定双链dna在电转入hek293t细胞系7天后的gfp表达依然有13.35％，说明发生了基于基因编辑的gfp编码基因的敲入，稳定双链dna更有利于基于crispr介导的定点敲入，而模板残留比质粒更低。(绿色荧光蛋白的表达背景比质粒略低，但能显著提高基于crispr介导的定点敲入)。
[0193]
本发明的实施方式并不限于上述实施例所述，在不偏离本发明的精神和范围的情
况下，本领域普通技术人员可以在形式和细节上对本发明做出各种改变和改进，而这些均被认为落入了本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种生产目的dna序列的方法，所述方法包括：dna构建体的扩增和提取步骤，所述步骤包括：通过培养转入了dna构建体的宿主细胞来扩增所述dna构建体，并从所述宿主细胞提取经扩增的所述dna构建体，其中所述dna构建体为自主复制的且包含：(a)一个或更多个iis型限制性内切酶和/或兆核酸酶识别序列；(b)目的dna序列；(c)在所述目的dna序列两端侧翼的原核端粒酶识别序列，第一切割反应步骤，所述步骤包括：使原核端粒酶与经扩增和提取的所述dna构建体接触，其中所述原核端粒酶识别并切割所述dna构建体上的所述原核端粒酶识别序列，以得到第一切割反应混合物，第二切割反应步骤，所述步骤包括：使所述第一切割反应混合物与一种或多种iis型限制性内切酶和/或兆核酸酶接触，其中所述iis型限制性内切酶和/或兆核酸酶识别并切割所述构建体上的所述iis型限制性内切酶和/或兆核酸酶识别序列，以得到第二切割反应混合物，和消化反应步骤，所述步骤包括：使所述第二切割反应混合物与一种或多种核酸外切酶接触，以消化除所述目的dna序列之外的其他序列。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述原核端粒酶选自来源于大肠杆菌n15噬菌体、克雷伯氏菌phi k02噬菌体、耶尔森式菌py54噬菌体、盐单胞菌phi hap噬菌体、弧菌vp882噬菌体和伯氏疏螺旋体lpb31.16质粒的原核端粒酶或其同源物或变体。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述dna构建体包含两个或更多个，例如3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个iis型限制性内切酶和/或兆核酸酶识别序列。4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述iis型限制性内切酶选自以下中的任一种或其任意组合：bbsi、bsai、bsmbi、bspqi、bsrdi、eari、hgai和sfani。5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述兆核酸酶选自以下中的任一种或其任意组合：i-scei、i-crei、i-dmoi、i-onui、i-ltri、i-panmi、i-gzemii、i-hjei、i-ltrwi和i-smami。6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述核酸外切酶是t5核酸外切酶或λ核酸外切酶。7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述dna构建体包含复制起点和选择标记基因。8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述第一切割反应完成后和所述第二切割反应完成后均不包括额外的纯化步骤。9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述第一切割反应步骤在适宜所述原核端粒酶活性的温度下恒温进行，所述第二切割反应步骤在适宜所述iis型限制性内切酶和/或兆核酸酶的温度下恒温进行，和/或所述消化反应步骤在适宜所述核酸外切酶的温度下的恒温进行。10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述方法还包括在第一切割反应后将所述原核端粒酶灭活的步骤、在第二切割反应后将所述iis型限制性内切酶和/或兆核酸酶灭活的步骤，和/或在消化反应后将所述核酸外切酶灭活的步骤。11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述dna构建体通过以下方法构建，所述方法包括：(i)提供包含一个或更多个iis型限制性内切酶和/或兆核酸酶识别序列的
克隆载体；和(ii)将两端的侧翼连接有原核端粒酶识别序列的目的dna序列插入所述克隆载体中。12.根据权利要求11所述的方法，其中所述克隆载体为质粒。13.根据权利要求12所述的方法，其中所述克隆载体衍生自：pbr322载体，puc载体，或pet载体。14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞为大肠杆菌细胞。15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述dna构建体在目的dna序列和原核端粒酶识别序列之间还包含额外的限制性内切酶识别序列，且所述方法在消化反应步骤之后还包括以下步骤：使限制性内切酶接触消化反应产物以识别并切割所述额外的限制性内切酶识别序列，以制备带有平末端或粘末端的双链dna片段。16.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述dna构建体在目的dna序列和原核端粒酶识别序列之间还包含额外的缺刻酶识别序列，且所述方法在消化反应步骤之后还包括以下步骤：使缺刻酶接触消化反应产物以识别并切割所述额外的缺刻酶识别序列，以制备两端为末端闭合的双链dna而中间为单链dna的dna序列。17.一种用于表达目的蛋白质的方法，所述方法包括：执行权利要求1-16中任一项所述的生产目的dna序列的方法，其中所述目的dna序列包含编码目的蛋白质的dna序列，将所得的目的dna序列转入原核细胞或真核细胞中，在适合于所述蛋白质表达的条件下孵育所述原核细胞或真核细胞。18.一种用于将目的dna序列整合入目标基因组的目的整合位点的方法，所述方法包括：执行权利要求1-16中任一项所述的生产目的dna序列的方法，其中所述目的dna序列包含目的整合位点两端的同源臂序列和中间目的敲入片段，将所得的目的dna序列，以及cas9蛋白和基于目的dna序列设计的sgrna一起转入原核细胞或真核细胞中，孵育所述原核细胞或真核细胞以将目的dna序列整合入目标基因组中。19.一种克隆载体，其为自主复制的载体且包含：(a)一个或更多个iis型限制性内切酶和/或兆核酸酶识别序列和(b)多克隆位点。20.根据权利要求19所述的克隆载体，其中所述克隆载体衍生自：pbr322载体，puc载体，或pet载体。21.根据权利要求19或20所述的克隆载体，其包含两个或更多个，例如3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个iis型限制性内切酶和/或兆核酸酶识别序列。22.根据权利要求19-21中任一项所述的克隆载体，其中所述iis型限制性内切酶识别序列选自以下中的任一种或其任意组合：bbsi、bsai、bsmbi、bspqi、bsrdi、eari、hgai和sfani的识别序列。23.根据权利要求19-22中任一项所述的克隆载体，其中所述兆核酸酶识别序列选自以下中的任一种或其任意组合：i-scei、i-crei、i-dmoi、i-onui、i-ltri、i-panmi、i-gzemii、i-hjei、i-ltrwi和i-smami的识别序列。24.根据权利要求19-23中任一项所述的克隆载体，其包含复制起点和选择标记基因。
25.根据权利要求19-24中任一项所述的克隆载体，其包含乳糖操纵子序列，包含多克隆位点的β半乳糖苷酶编码基因序列，以及3个或更多个bspqi识别序列和/或2个或更多个i-scei识别序列。26.根据权利要求25所述的克隆载体，其中所述克隆载体衍生自puc载体。27.根据权利要求26所述的克隆载体，其中所述克隆载体衍生自puc57载体。28.根据权利要求26或27所述的克隆载体，其通过对puc57载体进行以下的改造来构建：(i)在puc57载体的第1554位碱基之后和第2539位碱基之后加入bspqi识别序列且在第1501位碱基之后和第2479位碱基之后加入i-scei识别序列，和(ii)将puc57载体的第1397位碱基处的g突变为c且将第2136位和2137位两个碱基at突变为gc。29.根据权利要求19-27中任一项所述的克隆载体，其核苷酸序列包含seq id no：1所示的序列。30.一种用于生产目的dna序列的试剂盒，所述试剂盒包含：权利要求19-29中任一项所述的克隆载体，原核端粒酶，一个或更多个iis型限制性内切酶和/或兆核酸酶，以及一种或多种核酸外切酶。

技术总结
提供一种用于生产目的DNA序列的方法和克隆载体。所述方法包括在宿主细胞内进行的DNA构建体的扩增和提取步骤，以及原核端粒酶-IIS型限制性内切酶和/或兆核酸酶-DNA核酸外切酶催化的三步恒温酶反应步骤，其中所述构建体为自主复制的且包含：(a)一个或更多个IIS型限制性内切酶和/或兆核酸酶识别序列；(b)目的DNA序列；(c)在所述目的DNA序列两端侧翼的原核端粒酶识别序列。粒酶识别序列。粒酶识别序列。


技术研发人员：叶露萌 孙海烨 高倩 陈娟
受保护的技术使用者：南京金斯瑞生物科技有限公司
技术研发日：2021.08.06
技术公布日：2023/10/7