一种艾纳香生长培养基、组培培养基、组培方法和应用

1.本发明属于植物栽培技术领域，具体涉及一种艾纳香生长培养基、组培培养基、组培方法和应用。


背景技术：

2.艾纳香[blumea balsamifera(l.)dc.]为菊科(compositae)艾纳香属(blumea)多年生草本植物，是中国药典中艾片(左旋龙脑)的基源植物，其新鲜叶经提取加工制成的结晶为艾片(左旋龙脑)。艾纳香是热带和亚热带亚洲的本土草本植物，已有一千多年的药用历史，作为药用植物，艾纳香含有多种化学成分，其中挥发油类，特别是左旋龙脑为艾纳香的主要化学成分。艾纳香具有祛风除湿、温中止泻、活血解毒等功效，同时有多种生理活性，例如抗炎、抗癌、抗真菌、抗微生物等。
[0003]
艾纳香中左旋龙脑具有较高市场价值，但目前艾纳香缺乏稳定遗传的良种良苗，原因在于个体性状变异丰富且易受环境影响。申请人前期从全国各地艾纳香产区收集了大量艾纳香种质资源并保存在种质资源圃中，资源评价结果显示不同种质中的左旋龙脑含量差异显著，但是由于每个种质只有一棵母株，所以无法得知这些差异是由基因差异造成的，还是由环境或病虫害对植株的影响差异造成的。此外，由于艾纳香现有繁殖方式是异花授粉所得杂合种子获得实生苗的有性生殖与孽生苗无性增殖混合的方式，导致育苗后代性状分离。这些现状对艾纳香种质评价和良种良苗的选育工作造成了障碍。
[0004]
组织培养是无性繁殖技术，在人工环境中，组培后代能排除种子繁殖的实生苗性状分离和环境因素影响，是快速繁殖种苗和保留良种优势的高效途径，对优良种质资源的保存和评价具有重要意义，同时，以组培快繁技术能够克服传统育苗方式的弊端，提高成活率和增殖效率，并为优质种苗的种质保存、快速扩繁以及后期再生研究提供充足的材料。
[0005]
随着艾纳香种质资源调查和育种研究工作的推进，我们发现现有艾纳香组培技术不能够满足现阶段研究和生产需求。这些不足主要体现在外植体和培养效果两个方面。
[0006]
在外植体方面，现有艾纳香组培技术外植体有带腋芽茎段(李利锋,2008.艾纳香的组织培养及挥发油主要化学成分的gc-ms分析.,广西大学,p.49.)、嫩茎段(具体为：3～4cm长含1～2个腋芽或顶芽的茎段，见：肖永锋.艾纳香种质资源评价及组培快繁体系研究[d].海南大学,2023.doi:10.27073/d.cnki.ghadu.2021.000970.)、叶片(严敏,刘艳,汤洪敏,2014,艾纳香的组织培养.江苏农业科学42,33-35.；中国专利cn105309315a)和根(cn114375834b一种一步诱导艾纳香根细胞分化产生不定芽的培养方法)。其中，带腋芽茎段的优点是数量多、易得、体积大、易操作、不易死亡，缺点是带腋芽茎段都是成熟茎段，具有发达的维管组织和髓部，病原微生物容易循着维管束抵达并潜伏其中，因此无法脱毒，特别是针对一些在野外或田间生长已受到病虫害影响的重要种质，其离体保存和组培一段时间后污染率高、成功率低；第二种外植体为3～4cm长含1～2个腋芽或顶芽的茎段，其中同样有发达的维管束，与第一种外植体没有本质区别，而且还失去了数量多、易得的优势；第三种外植体为叶片，其不但与前两种外植体一样存在发达维管束及其带来的问题，而且培养
必须先诱导产生愈伤组织再诱导分化出胚状体最后长成芽，这种方法不可避免的经过愈伤组织诱导阶段，有可能导致不可控的体细胞突变，可能使高含量母株的组培后代部分或全部变成了只含有低浓度左旋龙脑的植株，而且这种变异往往不能直观发现。第四种外植体为根，同样存在维管束及其带来的问题。此外，还有一种可选外植体的是茎尖，茎尖培养特指对茎尖极小范围(约2～3mm)的一小团分生组织进行分离和单独培养，其优势是脱毒效果良好，缺点是对操作人员的技术要求高，组织小、易死亡。总之，现有技术所用外植体都存在一些问题，要么是存在维管束导致污染率高，要么是组织块过小导致存活率低。本发明公开的技术根据上述问题，结合了二者的优点，选择6～20mm包含茎尖的嫩茎段为外植体，该外植体避免了前述外植体的所有缺点，一方面组织体积比茎尖分生区大，操作难度低，存活率高，另一方面，尚未发育出发达的维管组织，病原微生物尚未抵达，脱毒效果较好，污染率低。
[0007]
在培养效果方面，现有技术也存在不足：首先，现有技术并未针对特定种质进行组培技术开展研究，随着艾纳香育种技术的发展，我们发现旧技术只能支持部分种质的组培需求，而另一些种质需要进一步研究配套组培技术支持。第二，现有组培技术的艾纳香生根系数低，如中国专利cn105309315a一种胚状体途径的艾纳香组培方法，以叶为外植体诱导愈伤组织和胚状体，再诱导产生再生芽，艾纳香组培苗平均根条数为5～7条/苗。再如唐松、杨仕冠(参见“唐松,黄燕芬,孔丽,等.艾纳香种苗快繁技术研究[j].贵州师范学院学报,2015,31(03):38-40.；杨仕冠,杨美纯.艾纳香组织培养技术研究[j].现代农业科技,2012,(18):151-153.”)以茎段接种到ms和1/2ms培养基中获得了无菌苗并诱导其增殖、生根、炼苗移栽；生根系数通常在4～18条/苗，生根系数低。第三，艾纳香进行组培增殖继代的过程中，均使用植物激素且往往使用的激素浓度较高以达到最高增殖效率，或通过先诱导愈伤组织再诱导诱导愈伤组织胚性化，通过体细胞胚的途径来获得再生芽，均有可能导致不可控的体细胞突变，改变原有种质的特性。由于艾纳香是以左旋龙脑为主要功效物质的药用植物，因此组培快繁过程中产生的体细胞突变可能使高含量母株的组培后代部分或全部变成了只含有低浓度左旋龙脑的植株，而且这种变异往往不能直观发现。但是，此前所有艾纳香组培研究都仅以获得组培后代为研究目标，既没有针对特定种质，也没有考虑对苗的生根率、根长、株高等综合因素的影响，也较少考虑组培后代的化学特性与母株是否一致的问题，特别是：现有组培技术确实曾被发现组培后代挥发油中左旋龙脑相对含量为17.2％，显著低于野生株(46.7％)的情况(李利锋,2008.艾纳香的组织培养及挥发油主要化学成分的gc-ms分析.广西大学,摘要及p24-25)，更强化了研发新的能保持母株化学特性的新组培技术的迫切需求，利用本发明公开的技术所获得的艾纳香组培苗后代很好地延续的母株原有的左旋龙脑含量特性，克服了现有技术的问题。


技术实现要素：

[0008]
本发明的目的是提供一种艾纳香生长培养基，应用本发明提供的生长培养基进行艾纳香组培，组培苗的生根系数高。本发明提供一种艾纳香组培培养基和组培方法，能够获得大量的保持遗传稳定性的优质种质艾纳香组培苗。
[0009]
为了解决上述问题，本发明提供了以下技术方案：
[0010]
本发明提供了一种促进艾纳香生长培养基，所述生长培养基以ms培养基为基本培
养基，还包括：0.2～0.3mg/lnaa、0.08～0.16mg/lda-6、10～50mg/l维生素c、20～200mg/l肌醇、30g/l蔗糖和4～10g/l琼脂。
[0011]
本发明提供了上述技术方案所述的艾纳香生长培养基在提高艾纳香组培苗如下1)～3)的一种或多种中的应用，
[0012]
1)生根率；
[0013]
2)株高；
[0014]
3)根长。
[0015]
本发明提供了一种艾纳香组培培养基，包括不定芽诱导培养基、增殖和继代培养基和上述技术方案所述的生长培养基；
[0016]
所述不定芽诱导培养基以ms培养基为基本培养基，还包括：0.1～0.5mg/lnaa、1.0～3.0mg/l 6-ba、10～50mg/l维生素c、20～200mg/l肌醇、30g/l蔗糖和琼脂4～10g/l；
[0017]
所述增殖和继代培养基以ms培养基为基本培养基，还包括：0.1～0.5mg/lnaa、1.0～3.0mg/l 6-ba、10～50mg/l维生素c、20～200mg/l肌醇、30g/l蔗糖和琼脂4～10g/l。
[0018]
本发明提供了一种艾纳香组培方法，所述组培方法采用上述技术方案所述的生长培养基，包括以下步骤：
[0019]
将艾纳香外植体接种在不定芽诱导培养基上进行不定芽诱导培养，得到艾纳香无菌不定芽；
[0020]
将所述艾纳香无菌不定芽的带腋芽茎段接种于增殖和继代培养基进行继代增殖培养，得到艾纳香单芽；
[0021]
将所述艾纳香单芽接种于生长培养基中进行生根培养，得到艾纳香组培苗；
[0022]
将所述艾纳香组培苗进行炼苗和移栽培养。
[0023]
优选的，所述外植体包括如下至少一种：
[0024]
(a)带腋芽茎段；
[0025]
(b)长度6～20mm的带有茎尖的嫩茎段。
[0026]
优选的，所述不定芽诱导培养、继代增殖培养和生根培养的温度分别为24～26℃。
[0027]
优选的，所述不定芽诱导培养、继代增殖培养和生根培养均在光暗交替照条件下进行，所述光照的时间分别为11～13h/d，所述光照的强度分别为1000～1500lx。
[0028]
优选的，所述不定芽诱导培养时间为28～32d；所述继代增殖培养的时间为28～32d；所述生根培养的时间为28～32d。
[0029]
优选的，所述增殖和继代培养基以ms培养基为基本培养基，还包括：0.1～0.5mg/lnaa、1.0～3.0mg/l 6-ba、10～50mg/l维生素c、20～200mg/l肌醇、30g/l蔗糖和琼脂4～10g/l；
[0030]
所述不定芽诱导培养基以ms培养基为基本培养基，还包括：0.1～0.5mg/lnaa、1.0～3.0mg/l 6-ba、10～50mg/l维生素c、20～200mg/l肌醇、30g/l蔗糖和琼脂4～10g/l。
[0031]
本发明提供了上述技术方案所述的艾纳香组培方法在保持左旋龙脑含量遗传稳定性的艾纳香种质选育中的应用。
[0032]
本发明的有益效果：本发明提供了一种艾纳香生长培养基，所述生长培养基以ms培养基为基本培养基，还包括：0.2～0.3mg/lnaa、0.08～0.16mg/lda-6、10～50mg/l维生素c、20～200mg/l肌醇、30g/l蔗糖和4～10g/l琼脂。
[0033]
在本发明提供的生长培养基中，naa(1-萘乙酸)利于艾纳香组培苗生根和提高组培苗株高；da-6(胺鲜脂)促进艾纳香的根长和提高艾纳香再生苗的株高，提高了再生苗生根效率；da-6和naa联合应用协同提高艾纳香种质生根率。实施例结果表明：利用本发明的生长培养基获得的艾纳香组培苗生根率为26.5～30.2条/苗，生根系数高。本发明提供的生长培养基解决了艾纳香组培苗生根系数低的问题，具有广阔的应用前景。并且，本发明提供的艾纳香组培培养基和组培方法，能够获得大量的保持遗传稳定性的优质种质艾纳香组培苗。
附图说明
[0034]
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0035]
图1为艾纳香3个种质在添加不同浓度6-ba的ms培养基中不定芽诱导效率比较；
[0036]
图2为艾纳香3个种质在添加不同浓度naa的ms培养基中不定芽生根效率比较；
[0037]
图3为艾纳香3个种质在添加不同浓度da-6的ms培养基中不定芽生根效率比较；
[0038]
图4为艾纳香3个种质后代组培苗炼苗及移栽过程；
[0039]
图5为左旋龙脑对照品离子色谱图；图5中1代表水杨酸甲酯内标，2代表左旋龙脑；
[0040]
图6为艾纳香3个种质母株与后代叶提取物总离子色谱图；图6中1代表水杨酸甲酯内标，2代表左旋龙脑；
[0041]
图7为艾纳香3个种质母株左旋龙脑含量比较；
[0042]
图8为艾纳香3个种质组培后代左旋龙脑含量比较。
具体实施方式
[0043]
本发明提供了一种艾纳香生长培养基，所述生长培养基以ms培养基为基本培养基，还包括：0.2～0.3mg/lnaa、0.08～0.16mg/lda-6、10～50mg/l维生素c、20～200mg/l肌醇、30g/l蔗糖和4～10g/l琼脂。
[0044]
在本发明中，所述生长培养基以ms培养基为基本培养基，还包括：0.2～0.3mg/lnaa、0.08～0.16mg/l da-6、10～50mg/l维生素c、20～200mg/l肌醇、30g/l蔗糖和4～10g/l琼脂；优选以ms培养基为基本培养基，还仅含有0.2～0.3mg/lnaa、0.08～0.16mg/l da-6、10～50mg/l维生素c、20～200mg/l肌醇、30g/l蔗糖和4～10g/l琼脂；更优选以ms培养基为基本培养基，还仅含有：0.3mg/lnaa、0.16mg/l da-6、10mg/l维生素c、20mg/l肌醇、30g/l蔗糖和6g/l琼脂。在本发明中，所述生长培养基中da-6的浓度为0.08～0.16mg/l，优选为0.10～0.16mg/l，更优选为0.16mg/l。所述生长培养基中naa的浓度为0.2～0.3mg/l，优选为0.23～0.3mg/l，更优选为0.3mg/l。所述生长培养基中维生素c的浓度为10～50mg/l，优选为10～30mg/l，更优选为10mg/l。所述生长培养基中肌醇的浓度为20～200mg/l，优选为20～120mg/l，进一步优选为20～60mg/l，更优选为20mg/l。在本发明中，所述生长培养基中琼脂的浓度为4～10g/l，进一步优选为5～8g/l，更优选为6.0g/l。在本发明中，所述生长培养基的ph值优选为6.0～6.3，更优优选为6.2。
[0045]
本发明提供的生长培养基中naa利于艾纳香组培苗生根和提高组培苗株高，da-6促进艾纳香的根长和提高艾纳香再生苗的株高，提高了再生苗生根效率。本发明的生长培
养基中da-6和naa联合应用提高艾纳香种质生根率。并且在da-6和naa联合作用下，维生素c直接参加酶的形成和蛋白质、脂肪代谢，补充植物细胞在培养过程中不能合成足够维生素c的问题，防止褐变，肌醇有助于生成果胶和细胞壁，促进芽的形成，对组织繁殖、分化促进作用，再加之蔗糖是培养基中的必须的碳源成分，同时起到维持培养基渗透压的作用，共同促进艾纳香的芽增殖。本发明首次在艾纳香组培的生长培养基中引入植物生长调节剂da-6，在生长培养基的各个组分的共同作用下解决了现有技术中艾纳香组培苗生根系数低的问题。本发明提供的生长培养基应用效果好，可以同时获得大量的能够保持遗传稳定性组培苗，为通过无性繁殖手段选育艾纳香优良种苗提供了具有推广前景的优质候选种质和技术参考。
[0046]
本发明对naa、da-6、肌醇、维生素c、蔗糖、琼脂、ms培养基的来源没有特殊的限定，采用常规的市售产品即可。
[0047]
本发明所述生长培养基可以用于培养不定芽、植物原有的芽(植物原有的芽包括顶芽、侧芽)，不定芽、植物原有的芽均可以切下来，在生长培养基中生长和生根。
[0048]
在本发明中，对所述艾纳香的来源没有特殊限定，采用常规的艾纳香即可。在本发明实施例中，所述艾纳香优选为低左旋龙脑含量、中左旋龙脑含量、高左旋龙脑含量的3个种质的艾纳香。本发明低左旋龙脑含量为2.98～3.62mg/g，中左旋龙脑含量为4.8～5.42mg/g，高左旋龙脑含量为8.67～9.57mg/g。
[0049]
本发明提供了上述技术方案所述的艾纳香生长培养基在提高艾纳香组培苗在如下1)～3)的一种或多种中的应用，
[0050]
1)生根率；
[0051]
2)株高；
[0052]
3)根长。
[0053]
本发明提供了一种艾纳香组培培养基，包括不定芽诱导培养基、增殖和继代培养基和上述技术方案所述的生长培养基；
[0054]
所述不定芽诱导培养基以ms为基本培养基，还包括：0.1～0.5mg/lnaa、1.0～3.0mg/l6-ba、10～50mg/l维生素c、20～200mg/l肌醇、30g/l蔗糖和琼脂4～10g/l；
[0055]
所述增殖和继代培养基以ms培养基为基本培养基，还包括：0.1～0.5mg/lnaa、1.0～3.0mg/l 6-ba、10～50mg/l维生素c、20～200mg/l肌醇、30g/l蔗糖和琼脂4～10g/l。
[0056]
在本发明中，所述不定芽诱导培养基优选以ms为基本培养基，还包括：0.1～0.5mg/lnaa、1.0～3.0mg/l 6-ba、10～50mg/l维生素c、20～200mg/l肌醇、30g/l蔗糖和琼脂4～10g/l；更优选为以ms为基本培养基，还仅含有：0.1～0.5mg/lnaa、1.0～3.0mg/l 6-ba、10～50mg/l维生素c、20～200mg/l肌醇、30g/l蔗糖和琼脂4～10g/l。在本发明中，所述不定芽诱导培养基中6-ba的浓度为1.0～3.0mg/l，优选为1.3～2.5mg/l，更优选为2.0mg/l。本发明所述不定芽诱导培养基中naa的浓度为0.1～0.5mg/l，优选为0.3mg/l。本发明所述不定芽诱导培养基中维生素c的浓度为10～50mg/l，优选为10mg/l。本发明所述不定芽诱导培养基中肌醇的浓度为20～200mg/l，优选为20mg/l。在本发明中，所述不定芽诱导培养基中琼脂的浓度为4～10g/l，优选为6.0～6.5g/l，更优选为6.0g/l。在本发明中，所述不定芽诱导培养基的ph值优选为6.0～6.3，更优优选为6.2。
[0057]
在本发明中，所述增殖和继代培养基以ms培养基为基本培养基，还包括：0.1～
0.5mg/lnaa、1.0～3.0mg/l 6-ba、10～50mg/l维生素c、20～200mg/l肌醇、30g/l蔗糖和琼脂4～10g/l；更优选以ms培养基为基本培养基，还仅含有：0.1～0.5mg/lnaa、1.0～3.0mg/l 6-ba、10～50mg/l维生素c、20～200mg/l肌醇、30g/l蔗糖和琼脂4～10g/l。
[0058]
在本发明中，所述增殖和继代培养基中6-ba的浓度为1.0～3.0mg/l，优选为1.3～2.0mg/l，更优选为1.5mg/l。本发明所述增殖和继代培养基中naa的浓度为0.1～0.5mg/l，优选为0.3mg/l。本发明所述增殖和继代培养基中维生素c的浓度为10～50mg/l，优选为10mg/l。本发明所述增殖和继代培养基中肌醇的浓度为20～200mg/l，优选为20mg/l。
[0059]
在本发明中，所述增殖和继代培养基中琼脂的浓度为4～10g/l，优选为6.0～6.5g/l，更优选为6.0g/l。
[0060]
在本发明中，所述增殖和继代培养基的ph值优选为6.0～6.3，更优优选为6.2。
[0061]
本发明提供的增殖和继代培养基中含有6-ba和naa，6-ba和naa共同作用促进艾纳香的芽增殖。并且在6-ba和naa联合作用下，维生素c直接参加酶的形成和蛋白质、脂肪代谢，补充植物细胞在培养过程中不能合成足够维生素c的问题，防止褐变，肌醇有助于生成果胶和细胞壁，促进芽的形成，对组织繁殖、分化促进作用，再加之蔗糖是培养基中的必须的碳源成分，同时起到维持培养基渗透压的作用，共同促进艾纳香的芽增殖。
[0062]
本发明提供了一种艾纳香组培方法，所述组培方法采用上述技术方案所述的生长培养基，包括以下步骤：
[0063]
将艾纳香外植体接种在不定芽诱导培养基上进行不定芽诱导培养，得到艾纳香无菌不定芽；
[0064]
将所述艾纳香无菌不定芽的带腋芽茎段接种于增殖和继代培养基进行继代增殖培养，得到艾纳香单芽；
[0065]
将所述艾纳香单芽接种于生长培养基中进行生根培养，得到艾纳香组培苗；
[0066]
将所述艾纳香组培苗进行炼苗和移栽培养。
[0067]
本发明将艾纳香外植体接种在不定芽诱导培养基上进行不定芽诱导培养，得到艾纳香无菌不定芽。本发明所述外植体优选包括如下至少一种：
[0068]
(a)带腋芽茎段；
[0069]
(b)长度0.6～2cm的带有茎尖的嫩茎段。
[0070]
本发明艾纳香的带腋芽茎段的长度优选为1～3cm，更优选为1.5cm。本发明所述艾纳香的带腋芽茎段优选通过艾纳香带腋芽枝条切除侧叶得到。之所以选择艾纳香带腋芽茎段是由于带腋芽茎段易生长获得芽。
[0071]
本发明将艾纳香带芽枝条剪切成外植体带腋芽茎段之前优选进行清洗和消毒。本发明所述清洗优选包括洗涤剂清洗和流水冲洗，本发明所述洗涤剂清洗时间优选为15～25min，更优选为20min；所述流水冲洗时间优选为15～25min，更优选为20min。本发明对所述洗涤剂没有特殊限定，采用常规的产品即可。本发明对所述流水冲洗时应用的水没有特殊限定，采用常规的自来水即可。
[0072]
本发明所述消毒的方式优选包括：清洗后，用质量浓度为1％次氯酸钠溶液浸泡14～16min，用无菌水冲洗4～6次。本发明所述0.1％次氯酸钠溶液浸泡时加入2～3滴吐温20，以吐温20 作为表面活性剂，增强次氯酸钠灭菌的效果。本发明用1％次氯酸钠溶液浸泡时间优选为14～16min，更优选为15min。本发明所述1％次氯酸钠溶液浸泡后，优选用无菌水
冲洗4～6次，更优选为5次。
[0073]
本发明所述艾纳香带芽嫩枝清洗和消毒之后制备外植体带腋芽茎段，得到艾纳香带腋芽茎段作为外植体。本发明优选将消毒后的艾纳香带腋芽茎段接种到不定芽诱导培养基上进行不定芽诱导培养，得到艾纳香无菌不定芽。
[0074]
本发明所述艾纳香带芽嫩枝清洗和消毒之后制备长度0.6～2cm的带有茎尖的嫩茎段作为外植体。本发明所述带有茎尖的嫩茎段的长度优选为0.6～2cm，进一步优选为1.0～1.5cm，更优选为1.5cm。部分现有技术中将茎尖作为外植体，虽然可以达到脱毒的效果，但是茎尖培养所使用的组织很小，一般小于3mm，组织成活率低，对实验员的技术要求比较高，不易于推广。本发明使用茎尖及其下大约10～15mm范围的嫩茎组织作为外植体，这个区域尚未形成发达的维管束，因此也能达到脱毒效果，此外，组织块体积较大，操作时对实验员的技术要求较低，培养成活率较高，具有一定优势。带有茎尖的嫩茎段作为外植体可以有效提高单位外植体芽数，降低污染率和死亡率，提高成活率。本发明所述艾纳香带芽嫩枝清洗和消毒方式如上文所述，在此不再赘述。
[0075]
得到长度0.6～2cm的消毒后的带有茎尖的嫩茎段后，本发明将带腋芽茎段或长度0.6～2cm的带有茎尖的嫩茎段作为艾纳香外植体接种在不定芽诱导培养基上进行不定芽诱导培养，得到艾纳香无菌不定芽。
[0076]
在本发明中，所述不定芽诱导培养的温度优选为24～26℃，更优选为25℃。本发明所述不定芽诱导培养优选包括黑暗培养和光照培养阶段，每天光照培养的时间优选为11～13d，更优选为12h。本发明所述光照培养的光照强度优选为1000～1500lx，进一步优选为1100～1400lx，更优选为1300lx。本发明所述不定芽诱导培养时间优选为28～32d，更优选为30d。本发明所述不定芽诱导培养使艾纳香带腋芽茎段或带有茎尖的嫩茎段进一步生长繁殖得到艾纳香不定芽。不定芽诱导培养基的组成同上文所述的艾纳香组培培养基中的不定芽诱导培养基，在此不再概述。
[0077]
得到艾纳香无菌不定芽后，本发明优选将所述艾纳香无菌不定芽继续生长获得的再生芽组培苗切成带腋芽茎段后接种于增殖和继代培养基进行继代增殖培养，得到艾纳香单芽。本发明接种于增殖和继代培养基中的带腋芽茎段的长度优选为1～2cm，更优选为1.5cm，本发明接种于增殖和继代培养基中的每个带腋芽茎段优选含一个芽。本发明所述不定芽是相对定芽而言的，定芽为植物原本就有的芽，包括顶芽、侧芽(即腋芽)；不定芽为植物原来不存在的芽，经过脱分化产生的芽。
[0078]
在本发明中，所述继代增殖培养的温度优选为24～26℃，更优选为25℃。本发明所述继代增殖培养优选进行黑暗培养和光照培养，每天光照培养的时间优选为11～13h，更优选为12h。本发明所述光照培养的光照强度优选为1000～1500lx，进一步优选为1100～1400lx，更优选为1300lx。本发明所述继代增殖培养的时间优选为28～32d，更优选为30d。本发明所述继代增殖培养包括一次继代培养。本发明所述继代培养为更换继代增殖培养的培养基。本发明所述继代培养的时间为增殖和继代培养基的第14～16d，更优选为第15d。本发明所述继代增殖培养的作用是促进带芽茎段的进一步增殖得到更多再生芽和枝条，剪切所述再生芽和枝条得到艾纳香单芽。本发明所述单芽的长度优选为2cm。本发明所述的增殖和继代培养基的组成同上文所述的艾纳香组培培养基中的增殖和继代培养基，在此不再概述。
[0079]
得到艾纳香单芽，本发明将所述艾纳香单芽接种于生长培养基中进行生根培养，得到艾纳香组培苗。本发明所述接种优选为艾纳香单芽基部朝下竖直接种。本发明每个生根培养瓶中优选接种1个单芽。在本发明中，所述生根培养的温度优选为24～26℃，更优选为25℃。本发明所述生根培养优选进行交替黑暗培养和光照培养，每天光照培养的时间优选为11～13h，更优选为12h。本发明所述生根培养的光照强度优选为1000～1500lx，进一步优选为1100～1300lx，更优选为1200lx。本发明所述生根培养的时间优选为28～32d，更优选为30d。本发明所述的生长培养基的组成同上文所述，在此不再概述。
[0080]
本发明所述生根培养后得到组培苗，所述组培苗满足株高达到4cm，有2～4片真叶，有健康发达根系后进行炼苗和移栽培养，提高组培苗的成活率。本发明将艾纳香组培苗进行炼苗和移栽培养。
[0081]
本发明所述炼苗优选在人工气候箱完成，所述炼苗的温度优选为符合艾纳香生长的温度需求即可。本发明所述炼苗的白天温度优选为≥20℃，更优选为23℃；所述炼苗的夜间温度优选为18～20℃，更优选为18℃。
[0082]
本发明所述炼苗的时间优选为3～15d，更优选为7d。
[0083]
在本发明中，所述移栽培养优选在人工气候箱完成，所述移栽培养时优选将炼苗后的组培苗洗净根部后移栽至穴盘培养，组培苗继续生长换盆时移栽至大盆中培养；所述穴盘中的基质优选为小颗粒草炭，大盆中的基质体积比优选为草炭和沙子为1:1。移栽培养前，本发明优选对所述基质进行消毒，本发明对所述消毒的方式没有特殊限定，采用常规方法即可。
[0084]
本发明对所述移栽培养时应用的种植盆的来源和规格没有特殊限定，采用常规产品即可。本发明优选每个种植盆中栽1株炼苗后的艾纳香组培苗。
[0085]
现有技术中艾纳香种质基因型杂合，有性繁殖具有遗传不定性的特点，本发明以艾纳香带腋芽茎段作为外植体进行组织培养快繁育苗，解决了现有技术中利用艾纳香常规育苗时种质退化的技术问题，本发明得到的艾纳香组培苗左旋龙脑含量高，能够实现艾纳香稳定遗传的良种良苗。
[0086]
本发明提供了上述技术方案所述的艾纳香组培方法在保持左旋龙脑含量遗传稳定性的艾纳香种质选育中的应用。
[0087]
本发明的实施例证明，母株高种质左旋龙脑含量(9.12
±
0.45
a mg/g)显著高于中种质(5.11
±
0.31
b mg/g)和低种质(3.30
±
0.0.32
c mg/g)，组培苗后代高种质左旋龙脑含量(7.28
±
0.34
a mg/g)显著高于中种质(5.71
±
0.38
b mg/g)和低种质(4.41
±
0.40
c mg/g)，可见，本发明获得的艾纳香组培苗后代的叶片与艾纳香3个种质母株叶片的左旋龙脑含量均有趋势一致的显著差异，由此可知，经过本发明技术获得的艾纳香组培苗后代仍呈现出高左旋龙脑含量特性，长势好；组培可以解决艾纳香常规培养种质退化的问题。
[0088]
本技术人前期研究收集了分布我国多个省市地区的235份艾纳香种质，经过数年的农艺性状和化学分析比较，发现左旋龙脑含量差异大，研究中发现高含量种质多长势差。本发明选择不同左旋龙脑含量的种质母株开展研究，其中左旋龙脑含量在2.98～3.62mg/g的记为低种质(l)，左旋龙脑含量为4.8～5.42mg/g的记为中种质(m)，左旋龙脑含量为8.67～9.57mg/g的记为高种质(h)。具体的先离体保存，然后扩繁并比较组培特性差异，得到组培后代经炼苗、移栽后，利用gc-ms技术对母株和对应的组培苗进行化学特性检测，以同步
培养定植的低含量种质为对照，调查特选种质是否保持了母株的高含量的化学特性。在验证其高含量特性得以存续后，有望对种质和配套组培技术进行示范扩增、栽培与推广，达到促进产业发展的目的。
[0089]
本发明针对不同左旋龙脑含量的种质开展组培研究，提高了培养效果的同时，通过化学检测技术确定该技术所得组培后代保持了母株的化学特性，利用本技术可确定所选母株的化学特性不是由于环境、生物胁迫等影响而产生的偶然表现，而是由遗传因素决定的，具有一定稳定性，可通过本技术进行复制。本发明建立了高效的种苗克隆技术体系，能够获得大量的保持遗传稳定性的优质种质艾纳香组培苗，为通过无性繁殖手段选育艾纳香优良种苗提供了具有推广前景的优质候选种质和技术参考。
[0090]
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
[0091]
实施例中应用的试验材料与试剂如下：
[0092]
1试剂
[0093]
ms培养基；6-ba；naa；胺鲜酯(da-6)；肌醇；维生素c；l-borneol(左旋龙脑)标准品；乙酸乙酯和水杨酸甲酯常规色谱纯产品即可，来源没有特殊限定。
[0094]
2试验材料
[0095]
艾纳香3个种质二年生母株露天保存在海南省儋州市中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所艾纳香种质资源圃中，经于福来研究员鉴定为菊科艾纳香属艾纳香(blumea balsamifera(l.)dc.)，统一水肥管理。
[0096]
基于前期研究(肖永锋,黄梅,于福来,等.艾纳香种质资源表型性状遗传多样性分析[j].福建农业学报,2021,36(02):157-167.)可知，艾纳香种质之间的差异较大。本发明将艾纳香左旋龙脑含量在2.98～3.62mg/g的记为低种质(l)，左旋龙脑含量为4.8～5.42mg/g的记为中种质(m)，左旋龙脑含量为8.67～9.57mg/g的记为高种质(h)。剪取健壮的3个种质艾纳香带芽枝条用于实施例1～3和对比例1～2中的组培。
[0097]
实施例1
[0098]
(1)外植体的消毒
[0099]
剪取健壮的3个种质艾纳香带芽枝条，用清水进行第一次清洗，用2g/l的洗衣粉溶液浸泡20min，流水冲洗20min。在超净工作台下，在1％次氯酸钠溶液中添加2～3滴吐温20，混合后浸泡15min，无菌水冲洗5次，之后用灭菌的解剖刀和镊子切除侧叶，把枝条分段为3～4cm的带腋芽茎段，作为诱导艾纳香组培苗的外植体。
[0100]
(2)初代诱导—不定芽诱导培养
[0101]
将得到的3个种质的艾纳香外植体切成1.5cm的带腋芽茎段，分别接种到培养基中启动诱导，以ms为基本培养基，添加6-ba2.0 mg/l、naa0.3 mg/l、肌醇20mg/l、维生素c10mg/l、蔗糖30g/l、琼脂6g/l，ph 6.2，培养30d，由此获得无菌再生芽组培苗。培养条件：温度25℃，12h光周期，光照强度1000～1500lx(以下组培试验培养条件一致)。
[0102]
(3)继代增殖培养
[0103]
将不定芽诱导培养得到的3个种质的再生芽组培苗，切成1.5cm的带腋芽茎段，每个茎段含1个腋芽，带腋芽茎段按芽的生长方向竖直接种到增殖和继代培养基中进行继代增殖培养。再生芽组培苗要求健壮、生长一致。继代增殖培养后得到三个种质(种质l、种质
m、种质h)的继代增殖培养组培苗。
[0104]
增殖和继代培养基以ms为基本培养基，仅含有naa 0.3mg/l、肌醇20mg/l、维生素c 10mg/l、6-ba 1.5mg/l、蔗糖30g/l和琼脂6g/l，增殖和继代培养基ph值为6.2。培养第15d进行继代培养，更换一次增殖和继代培养基。共培养30d后统计单位外植体芽数、芽长。
[0105]
实施例2
[0106]
同实施例1，唯一的区别在于继代增殖培养中，增殖和继代培养基中6-ba为1.0mg/l。
[0107]
实施例3
[0108]
同实施例1，唯一的区别在于继代增殖培养中，增殖和继代培养基中6-ba为2.0mg/l。
[0109]
对比例1
[0110]
同实施例1，唯一的区别在于继代增殖培养中，增殖和继代培养基未添加6-ba。
[0111]
对比例2
[0112]
同实施例1，唯一的区别在于继代增殖培养中，增殖和继代培养基中6-ba为3.0mg/l。
[0113]
对实施例1～3和对比例1～2的单位外植体芽数进行统计，公式为：单位外植体芽数＝总芽数/总外植体数，结果见表1和图1。
[0114]
表1艾纳香3个种质在不同浓度6-ba的ms培养基中不定芽诱导效率比较
[0115][0116][0117]
注：采用duncan's法完成不同组间的多重比较，显著水平为p＜0.05，同一列末尾标注不同字母者表示在同种质的不同组间存在显著差异(下表2～表6同)。
[0118]
根据表1和图1可知，添加不同浓度的6-ba对艾纳香3个种质的芽增殖有显著影响。首先，从单位外植体芽数来看，当6-ba浓度为1.5mg/l时，3个种质单位外植体芽数(l：4.54
±
0.67a，m：4.41
±
0.71a，h：4.00
±
0.65a)均显著高于其他4组，在最佳培养基条件下，3个种质的单位外植体数l最高，m居中，h最低，但是组间差异不显著；当6-ba浓度为0mg/l时，该浓度下单位外植体芽数(l：0.94
±
0.12e，m：0.97
±
0.08d，h：0.95
±
0.10e)最低，虽然不添加6-ba时，原有的芽点仍可以继续生长，但不会增殖出新的芽，对于艾纳香芽增殖没有促进作用，因此，适量添加细胞分裂素6-ba对于艾纳香芽的增殖是必须的；当6-ba浓度为1.0～3.0mg/l时，对艾纳香芽增殖有一定促进作用；随着6-ba浓度的增加，单位外植体芽数呈现先增加后降低的趋势，在浓度为1.5mg/l时达到峰值，在3.0mg/l时显著降低，说明当6-ba浓度过高时，反而会抑制艾纳香芽增殖。
[0119]
其次，从芽长方面来看，当6-ba浓度为1.5mg/l时，3个种质芽长(l：2.02
±
0.22
a cm，m：2.07
±
0.12
a cm，h：1.88
±
0.12
a cm)均显著高于其他3组；其次为6-ba浓度0、1.0mg/l，两组芽长没有显著差异；当6-ba浓度为2.0mg/l甚至更高时，两组的芽长随着6-ba浓度的增高逐渐降低，在浓度为3mg/l时芽长降至最低(l：0.49
±
0.10
d cm，m：0.41
±
0.13
d cm，h：0.39
±
0.10
e cm)。当芽长均低于1cm时，芽生长受到高浓度激素抑制，这样的芽不适用于继代生根，继代转移到新培养基中时，随着培养时间推移，芽不长高，不生根，且逐渐死亡，因此，选择适合艾纳香组培苗增殖的激素浓度是十分有必要的。
[0120]
综合来看，当6-ba浓度为1.5mg/l时，艾纳香3个种质组培苗单位外植体芽数及平均芽长均达到最高，且该浓度下植株外观鲜绿、茁壮。
[0121]
实施例1经继代增殖培养后得到三个种质(种质l、种质m、种质h)的继代增殖培养组培苗。每个种质选择11棵长势健康、整齐的继代增殖培养组培苗，三个种质共选取33棵，用于制备下一步诱导生根的试验培养所需的外植体(芽)。三个种质的继代增殖培养组培苗切成2cm长的单芽，随机分配，进行如下实施例4-1～4-3和对比例4-1～4-2的实验。
[0122]
实施例4-1
[0123]
单芽接种到生长培养基中进行生根培养。生长培养基以ms为基本培养基，还仅含有naa 0.3mg/l、肌醇20mg/l、维生素c10mg/l、蔗糖30g/l、琼脂6g/l，ph值为6.2，进行生根培养。每个种质接种20瓶，每瓶接种1个单芽，培养30d后统计生根率、根长、株高。培养条件：温度25℃，12h光周期，光照强度1000～1500lx。
[0124]
实施例4-2
[0125]
同实施例4-1，唯一的区别在于生长培养基中的naa浓度为0.2mg/l。
[0126]
实施例4-3
[0127]
同实施例4-1，唯一的区别在于生长培养基中的naa浓度为0.4mg/l。
[0128]
对比例4-1
[0129]
同实施例4-1，唯一的区别在于生长培养基中的naa浓度为0mg/l。
[0130]
对比例4-2
[0131]
同实施例4-1，唯一的区别在于生长培养基中的naa浓度为0.5mg/l。
[0132]
对实施例4-1～4-3和对比例4-1～4-2的生根率、根长和株高的结果见表2和图2。
[0133]
表2艾纳香3个种质在添加不同浓度naa的ms培养基中生长效果比较
[0134][0135]
在植物组织培养中，生长素的主要作用是促进细胞分裂与伸长，不同的生长素浓度对植物的生长发育有不同的影响。结合表2和图2可以看出，不同浓度naa对艾纳香3个种质组培苗生根情况有显著影响。首先，从生根率上来看，当naa浓度为0.3mg/l时，3个种质生根率(l：25.25
±
4.39a条/苗，m：28.60
±
1.64a条/苗，h：20.55
±
2.07a条/苗)均显著高于其他四组，在最佳培养基条件下，3个种质的生根率m最高，l居中，h最低；当naa浓度在0.2～0.5mg/l范围时，能显著增加艾纳香3个种质组培苗生根率，并且随着naa浓度的升高，生根率呈现逐渐上升后下降的趋势，在0.3mg/l时达到最高，0.5mg/l时显著降低，因此，选择合适浓度的naa有利于艾纳香组培苗生根，浓度过高对生根率有一定的抑制作用；当naa浓度为0mg/l时，3个种质生根率(l：3.45
±
0.94d条/苗，m：3.85
±
1.14e条/苗，h：4.10
±
1.02e条/苗)显著低于其他四组，虽然在不添加naa的情况下同样可以萌发出根，但根的数量少，生根率低的情况下，植株炼苗、移栽阶段生长均会受到抑制，后期难存活，因此，在艾纳香生长培养基中，生长素naa的存在是必须的。
[0136]
从根长方面来看，当naa浓度为0mg/l时，艾纳香3个种质根长(l：4.86
±
0.23
a cm，m：4.65
±
0.37
a cm，h：4.06
±
0.23
a cm)显著高于其他四组；其次为0.3mg/l时，根长在其余四组中最高，还可以发现的是，当naa添加浓度在0.2～0.5mg/l范围时，根长随着naa浓度的增加逐渐升高后降低，在0.5mg/l时降至最低，该浓度下3个种质根长分别为(l：1.25
±
0.21
d cm，m：1.18
±
0.18
e cm，h：1.01
±
0.14
d cm)。
[0137]
从株高方面来看，当naa浓度为0.3mg/l时，其中两个种质株高(l：3.22
±
0.43
a cm，h：3.08
±
0.17
a cm)显著高于其他各组，中种质在浓度分别为0mg/l(株高：2.95
±
0.25
a cm)、0.3mg/l(株高：3.02
±
0.17
a cm)时没有显著差异，但总的来看，naa浓度为0.3mg/l对株高促进作用最为明显；可以发现的是当naa浓度在0～0.3mg/l范围内时，均能显著提升植株株高，说明添加较低浓度的naa在生长培养基中更适合艾纳香3个种质；当naa浓度在
0.5mg/l时，3个种质株高(l：1.41
±
0.19
d cm，m：1.38
±
0.20
d cm，h：1.20
±
0.16
e cm)显著降低，表明较高浓度的naa对株高方面有明显的抑制作用。
[0138]
综合生根率、根长、株高3个方面来看，当naa浓度在0.2～0.5mg/l范围时，对艾纳香3个种质生根均有促进作用，其中，浓度为0.3mg/l时生根率最高，在不添加naa的情况下，根长相对其他组较长，但此浓度下生根率低，当naa浓度在0～0.3mg/l范围内时，3个种质株高似乎没有太大差别，该浓度范围内均能使植株增高，但浓度为0.3mg/l时，3个种质株高显著提升，因此选择添加naa浓度为0.3mg/l时，为最适合艾纳香3个种质生长的浓度。
[0139]
实施例1经不定芽诱导培养和继代增殖培养后，得到三个种质(种质l、种质m、种质h)的继代增殖培养组培苗，将继代增殖培养组培苗切成长2cm的单芽用于实施例5-1～5-2和对比例5-1～对比例5-2的实验。实施例5-1～5-2和对比例5-1～对比例5-2为同批次实验。继代增殖培养组培苗要求生长一致、健康。
[0140]
实施例5-1
[0141]
单芽按芽的基部朝下竖直接种到含有da-6的生长培养基中进行生根培养。
[0142]
生长培养基的组成为：以ms为基本培养基，还仅含有肌醇20mg/l、维生素c10mg/l、蔗糖30g/l、琼脂6g/l、naa 0.3mg/l、0.16mg/l da-6。培养条件：温度25℃，12h光周期，光照强度1000～1500lx。
[0143]
实施例5-2
[0144]
同实施例5-1，唯一的区别在于生长培养基中的da-6浓度为0.08mg/l。
[0145]
对比例5-1
[0146]
同实施例5-1，唯一的区别在于生长培养基中的da-6浓度为0mg/l。
[0147]
对比例5-2
[0148]
同实施例5-1，唯一的区别在于生长培养基中的da-6浓度为0.32mg/l。
[0149]
对实施例5-1～5-2和对比例5-1～5-2的生根率比较，结果见表3和图3。
[0150]
实施例5-1～5-2和对比例5-1～5-2的生长培养基中naa浓度均为0.3mg/l，添加不同浓度的da-6对艾纳香各种质生根均有一定的影响，结果见表3和图3。
[0151]
表3添加不同浓度da-6的ms培养基中艾纳香生长效果比较
[0152][0153]
根据表3和图3可知，添加不同浓度的da-6可以提高植株根率、根长度及株高。首先，从生根率上来看，当da-6浓度为0.16mg/l时，3个种质生根率(l：29.8
±
2.80a条/苗，m：30.2
±
2.03a条/苗，h：29.9
±
2.30a条/苗)均显著高于其他三组；其次为0.08mg/l时，3个种质生根率随着da-6添加浓度的升高呈现先升高后下降的趋势，在浓度为0.32mg/l时降至最低，其生根率(l：15.6
±
3.56d条/苗，m：17.5
±
3.15d条/苗，h：16.25
±
3.35d条/苗)显著低于其他组；当da-6浓度为0mg/l，生根率较0.08mg/l、0.16mg/l时显著较低，也就是说，当添加一定浓度的da-6和naa时3个种质生根率要比只添加naa的效果更好。
[0154]
从根长方面来看，当da-6浓度为0.16mg/l时，3个种质根长(l：2.41
±
0.20
a cm，m：2.33
±
0.16
a cm，h：2.24
±
0.20
a cm)均显著高于其他三组；当da-6浓度为0、0.8mg/l时，3个种质根长没有显著差异，这可能是由于da-6浓度较低，生根效果不如较高浓度的；3个种质根长随着da-6浓度添加逐渐升高后降低，在浓度为0.32mg/l时降至最低，此时根长(l：1.27
±
0.17
c cm，m：1.01
±
0.10
c cm，h：1.26
±
0.19
c cm)显著低于其他组，结果表明适当添加一定浓度的da-6可以提高艾纳香的根长。
[0155]
从株高方面来看，当da-6浓度为0.16mg/l时，其中两个种质株高(l：3.46
±
0.27
a cm，m：3.17
±
0.21
a cm)显著高于其他各组，高种质在浓度分别为0.08mg/l(株高：2.91
±
0.23
a cm)、0.16mg/l(株高：3.03
±
0.19
a cm)时没有显著差异，但总的来看，da-6浓度为0.16mg/l时对株高促进作用最为明显；可以发现的是，当不添加da-6时，3个种质的株高显著低于添加da-6的，因此da-6在艾纳香生长培养基中是十分必要的；当浓度达到0.32mg/l时，3个种质株高(l：1.95
±
0.24
d cm，m：2.34
±
0.23
d cm，h：2.22
±
0.18
c cm)显著降低，说明较高浓度的da-6对株高方面有明显的抑制作用。
[0156]
综上，当da-6浓度在0.08～0.16mg/l范围内时，能显著提升植株生根效果，但当添加0.16mg/l da-6时生长效果最佳，此浓度下植株的生根率、根长以及株高均显著增加。
[0157]
实施例1经过外植体的消毒和不定芽诱导培养得到的再生芽组培苗，将再生芽组培苗切成1～2cm的带腋芽茎段，每个茎段含1个腋芽，接种在增殖和继代培养基中进行继代增殖培养。实施例1-1、对比例5-3、对比例5-4、对比例5-5为同一批次实施。
[0158]
对比例5-3
[0159]
诱导和增殖培养基中没有维生素c和肌醇。增殖和继代培养基组成为：以ms为基本培养基，仅含有naa0.3 mg/l、6-ba 1.5mg/l、蔗糖30g/l和琼脂6g/l。继代增殖培养的其他条件同实施例1。
[0160]
对比例5-4
[0161]
诱导和增殖培养基中没有肌醇。增殖和继代培养基组成为：以ms为基本培养基，仅含有naa0.3 mg/l、维生素c10mg/l，6-ba 1.5mg/l、蔗糖30g/l和琼脂6g/l。继代增殖培养的其他条件同实施例1。
[0162]
对比例5-5
[0163]
诱导和增殖培养基中无维生素。增殖和继代培养基组成为：以ms为基本培养基，仅含有naa0.3 mg/l、肌醇20mg/l，6-ba 1.5mg/l、蔗糖30g/l和琼脂6g/l。继代增殖培养的其他条件同实施例1。
[0164]
实施例1-1
[0165]
实施例1-1的增殖和继代培养基和继代增殖培养条件完全同实施例1。
[0166]
实施例1-1和对比例5-3～对比例5-5的单芽在肌醇和维生素c浓度不同的生长培养基中的不定芽增殖率结果见表4。
[0167]
表4添加肌醇和维生素c的ms培养基中不定芽增殖效率比较
[0168][0169][0170]
根据表4可知，添加适当浓度的肌醇和维生素c可以提高植株不定芽的增殖效率。首先，从单位外植体芽数上看，3个种质同时添加肌醇和维生素c的处理组(l：3.95
±
0.94a，m：3.68
±
0.83a，h：3.80
±
0.77a)均显著高于未添加二者的；其次，单独添加肌醇和维生素c的组单位外植体芽数明显高于未添加二者的；当同时不添加肌醇和维生素c时，3个种质显著低于各组。综合看，添加适量的肌醇和维生素c能够促进3个种质不定芽增殖，但当两者同时添加时，发挥的作用最佳。
[0171]
实施例5-3和对比例5-6～对比例5-8为同批次实验。将实施例1继代增殖培养后得到的继代增殖培养组培苗切成2cm长的单芽，所得单芽用于实施例5-3和对比例5-6～对比
例5-8的实验。继代增殖培养组培苗要求生长一致、健康。
[0172]
对比例5-6
[0173]
生长培养基的组成为：以ms为基本培养基，还仅含有蔗糖30g/l、琼脂6g/l、naa0.3mg/l、0.16mg/lda-6。生根培养的其他条件同实施例5-1。
[0174]
对比例5-7
[0175]
生长培养基的组成为：以ms为基本培养基，还仅含有维生素c10mg/l、蔗糖30g/l、琼脂6g/l、naa0.3 mg/l、0.16mg/l da-6。生根培养的其他条件同实施例5-1。
[0176]
对比例5-8
[0177]
生长培养基的组成为：以ms为基本培养基，还仅含有肌醇20mg/l、蔗糖30g/l、琼脂6g/l、naa0.3 mg/l、0.16mg/lda-6。生根培养的其他条件同实施例5-1。
[0178]
实施例5-3
[0179]
实施例5-3的生根培养的条件完全同实施例5-1。
[0180]
表5添加肌醇和维生素c的ms培养基中不定芽生长效果比较
[0181][0182][0183]
根据表5可以看出，添加适当浓度的肌醇和维生素c可以显著提高植株不定芽的生长效果。首先，从生根率上方面来看，当二者同时添加时，3个种质生根率(l：30.05
±
3.41a条/苗，m：28.95
±
3.10a条/苗，h：31.00
±
2.88a条/苗)均显著高于其他组；单独添加肌醇和维生素c的组生根率均明显高于未添加二者组，说明添加适量的肌醇和维生素c可以促进3个种质的生根率，但当二者同时添加时效果最佳。
[0184]
从根长方面来看，当二者同时添加时，3个种质根长(l：1.17
±
0.09
a cm，m：1.21
±
0.14
a cm，h：1.31
±
0.11
a cm)均显著高于其他组；单独添加肌醇和维生素c的组生根率均明显高于未添加二者组，但当二者同时加时效果达到最佳。
[0185]
从株高方面来看，当二者同时添加时，只有l种质株高(2.64
±
0.21
a cm)显著高于未添加二者组；在m、h种质中，四组没有显著差异，说明添加肌醇和维生素c对于株高方面可能没有明显的促进作用，但也没有负面影响。
[0186]
综合来看，当同时添加适量肌醇和维生素c时，艾纳香3个种质生长有显著促进作
用，表明肌醇和维生素c在艾纳香生长培养基中是必要的。
[0187]
实施例6-1
[0188]
外植体为长度1.5cm的带有茎尖的嫩茎段，外植体的消毒、初代诱导培养条件同实施例1。
[0189]
对比例6-1
[0190]
外植体为长度为2mm的茎尖，外植体的消毒、初代诱导培养培养条件同实施例1。
[0191]
对比例6-2
[0192]
外植体为长度为1.5cm的带腋芽茎段，外植体的消毒、初代诱导培养条件同实施例1。
[0193]
实施例6-1和对比例6-1～6-2的外植体诱导效率结果见表6。
[0194]
表6不同外植体诱导效率比较
[0195][0196][0197]
根据表6可知，首先从污染率、死亡率上看，当3个种质外植体为长度1.5cm的带有茎尖的嫩茎段时，污染率、死亡率均明显低于其他组；其次从成活率上看，长度1.5cm的带有茎尖的嫩茎段明显高于其他组；最后从单位外植体芽数上看，当外植体为长度1cm的带有茎尖的嫩茎段时，3个种质(l：5.74
±
2.60a，m：5.69
±
2.80a，h：6.34
±
2.72a)均显著高于其他组；其中，长度为1.5cm的带腋芽茎段污染率死亡率最高，茎尖和长度为1.5cm含茎尖的嫩茎段作为外植体时污染率相差不大，这可能是由于二者维管束均还未完全分化，病原体暂未顺着发达的维管束抵达顶端分生组织，而长度1.5cm的带腋芽茎段已形成发达维管束，病原体抑郁蛰伏于维管束中，随着培养而生长，所以前二者的污染率显著低于长度1.5cm的带腋芽茎段。综合看，选择含茎尖的1.5cm芽作为外植体，可兼顾低污染率、高成活率、高诱导效率，培养效果最好。
[0198]
实施例7炼苗及移栽
[0199]
实施例5-1获得的艾纳香各种质均长出茁壮健康的根的含有组培苗的培养瓶，放到人工气候箱中进行炼苗。人工气候箱培养条件：白天23℃，夜晚18℃，12h光周期，光照强度29000lx。艾纳香3个种质后代组培苗炼苗及移栽过程见图4。移栽培养在人工气候箱完成，移栽培养用基质的组成为草炭和沙子的混合物；所述基质的体积比为1:1。
[0200]
上述各种质经离体保存后取得无菌苗，经组培扩繁得到3个种质克隆后代群体，炼苗、移栽后种植在花盆中，在人工气候箱中培养，统一光温水肥管理。
[0201]
实施例8艾纳香3个种质母株与后代组培苗左旋龙脑含量比较
[0202]
艾纳香3个种质母株：采健康无病虫害的艾纳香3个种质低(l)、中(m)、高(h)母株，于同一位置各摘取9片功能叶，设置9个平行实验，全部功能叶阴干7天后保存在-80℃冰箱中待测。
[0203]
艾纳香3个种质组培苗：实施例7炼苗338天后，每个种质选9株长势一致、健康无病虫害的植物，于同一位置摘取1片功能叶，阴干7天后保存在-80℃冰箱中待测。
[0204]
左旋龙脑含量测定方法参照(庞玉新,黄梅,于福来,等.黔琼产艾纳香中主要化学成分含量差异分析[j].广东药学院学报,2014,30(04):448-452.)，并做细微调整。左旋龙脑含量的测定方法具体如下：
[0205]
(1)供试品溶液的制备
[0206]
取艾纳香叶片，液氮快速研磨，精密称定粉末(过20目筛)0.2g，加入乙酸乙酯2.5ml，称定质量m1；在频率40khz、功率420w的条件下超声提取30min。放冷，称定质量m2；用乙酸乙酯补足质量至m1，之后摇匀，滤过，取1ml续滤液置10ml容量瓶中，加入内标溶液1ml，用乙酸乙酯定容，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，即得。
[0207]
(2)对照品溶液的制备
[0208]
精密称取左旋龙脑对照品适量，加入乙酸乙酯溶解并定容，制成质量浓度为0.998mg/ml对照品储备液。
[0209]
(3)内标溶液的制备
[0210]
精密称取水杨酸甲酯100mg，置100ml容量瓶中，加入乙酸乙酯定容，摇匀，制成质量浓度为1.016mg/ml的内标溶液。
[0211]
(4)标准曲线的绘制
[0212]
精密量取对照品溶液0.1、0.2、0.5、0.7、1、2ml，分别置10ml容量瓶中，加入1ml内标溶液，用乙酸乙酯定容，摇匀，0.45μm微孔滤膜滤过，以对照品质量浓度为横坐标(x)，对照品与内标物水杨酸甲酯的峰面积比为纵坐标(y)绘制标准曲线。得到线性回归方程y＝61.586x+0.8878，r2＝0.9992，线性范围为0.0101～0.202mg/m l。
[0213]
(5)gc-ms分析条件
[0214]
色谱柱为安捷伦cyclosil-b(30m
×
0.250mm
×
0.25μm)毛细管柱，质谱条件：ei源，溶剂延迟6min，离子源温度230℃，进样口温度220℃，扫描范围45～500amu。质谱条件：ei源，溶剂延迟6min，离子源温度230℃，进样口温度220℃，扫描范围45～500amu。
[0215]
左旋龙脑对照品离子色谱图(图5)，艾纳香3个种质母株与后代组培苗叶提取物总离子叠加色谱图(图6)，从图中可以看出3个种质内标溶液和左旋龙脑出峰的保留时间与对照品一致，经计算后得到艾纳香3个种质母株与组培苗后代叶片左旋龙脑含量比较(图7和
图8)，结果显示：3个种质间母株与组培后代左旋龙脑含量均有显著差异，母株高种质左旋龙脑含量(9.12
±
0.45
a mg/g)显著高于m(5.11
±
0.31
b mg/g)和l(3.30
±
0.0.32
c mg/g)，组培苗后代高种质左旋龙脑含量(7.28
±
0.34
a mg/g)显著高于m(5.71
±
0.38
b mg/g)和l(4.41
±
0.40
c mg/g)。本发明所述的组培方案可以使艾纳香高种质左旋龙脑高含量得以存续。图7和图8对应的原始数据见表7。
[0216]
表7艾纳香3个种质母株与组培苗后代叶片左旋龙脑含量原始数据
[0217][0218]
注：采用duncan's法完成不同组间的多重比较，显著水平为p＜0.05，同一列末尾标注不同字母者表示在母株的不同种质间或后代的不同种质间存在显著差异。
[0219]
综上所述，最适合艾纳香3个种质增殖的培养基为ms+naa 0.3mg/l+6-ba 1.5mg/l+维生素c10mg/l+肌醇20mg/l+蔗糖30g/l+琼脂6g/l。最适合艾纳香3个种质生根的培养基为ms+naa0.3 mg/l+da-60.16mg/l+维生素c10mg/l+肌醇20mg/l+蔗糖30g/l+琼脂6g/l。
[0220]
本发明在常规艾纳香离体保存和组培技术的基础上，完善培养基并获得克隆苗后代群体，再通过gc-ms分析技术分别对艾纳香3个种质母株单株、克隆后代群体进行化学特性检测，以同时培养的低含量种质(l)为对照，调查另外2个种质(m和h)母株的高含量的化学特性是否由遗传因素决定，筛除可能因生物胁迫等外因导致左旋龙脑含量升高、高左旋龙脑含量特性不能通过组培而延续的母株单株。结果显示：艾纳香3个种质母株单株的左旋龙脑含量差异显著，分别为(l：3.30
±
0.32
c mg/g；m：5.11
±
0.31
b mg/g；h：9.12
±
0.45
a mg/g)，通过组培克隆(即初代培养)、增殖、诱导生根、炼苗、移栽后的3个种质的组培苗后代左旋龙脑含量也呈现一致的低、中、高显著差异，分别为(l：4.41
±
0.40
c mg/g)、(m：5.71
±
0.38
b mg/g)、(h：7.28
±
0.34
a mg/g)，与母株左旋龙脑含量高低差异规律一致，即确定了通过本方案所获得的3个种质组培后代延续了3个种质母株的左旋龙脑含量高低差异规律。
[0221]
该结果不仅可验证3棵母株的左旋龙脑含量高低差异是由遗传因素决定的，而且该遗传特性在本发明提供的方案培养过程中没有引起突变或其他因素而导致后代左旋龙脑含量高低差异发生改变。各种质母株及其组培后代之间无可比性。原因有二：首先，二者生长状态不同，前者受到环境差异和病虫害影响，左旋龙脑合成可能被促进或抑制，后者在培养箱中生长环境更均一，且无病虫害；其次，二者株龄不同，已有研究证明不同株龄艾纳香中左旋龙脑含量差异显著，苗期含量低。可见只有如本实施例所述比较不同种质在同生长状态且同株龄的植株的差异才能更真实地反映种质间的差异。总而言之，本发明所述的组培方案可以使左旋龙脑高含量的艾纳香种质的性状得以存续。
[0222]
本发明得到了具有推广前景的艾纳香左旋龙脑高含量的优良种质，可通过无性繁殖获得优良种苗和保持遗传优势，并建立了能够保持种质优良品质遗传稳定性的配套高效组培技术，后期有望对种质及其配套组培技术进行推广，具有良好的产业前景。
[0223]
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

技术特征：
1.一种艾纳香生长培养基，其特征在于，所述生长培养基以ms培养基为基本培养基，还包括：0.2～0.3mg/lnaa、0.08～0.16mg/lda-6、10～50mg/l维生素c、20～200mg/l肌醇、30g/l蔗糖和4～10g/l琼脂。2.权利要求1所述的艾纳香生长培养基在提高艾纳香组培苗如下1)～3)的一种或多种中的应用，1)生根率；2)株高；3)根长。3.一种艾纳香组培培养基，其特征在于，包括不定芽诱导培养基、增殖和继代培养基和权利要求1所述的生长培养基；所述不定芽诱导培养基以ms培养基为基本培养基，还包括：0.1～0.5mg/lnaa、1.0～3.0mg/l 6-ba、10～50mg/l维生素c、20～200mg/l肌醇、30g/l蔗糖和琼脂4～10g/l；所述增殖和继代培养基以ms培养基为基本培养基，还包括：0.1～0.5mg/lnaa、1.0～3.0mg/l 6-ba、10～50mg/l维生素c、20～200mg/l肌醇、30g/l蔗糖和琼脂4～10g/l。4.一种艾纳香组培方法，其特征在于，所述组培方法采用权利要求1所述的生长培养基，包括以下步骤：将艾纳香外植体接种在不定芽诱导培养基上进行不定芽诱导培养，得到艾纳香无菌不定芽；将所述艾纳香无菌不定芽的带腋芽茎段接种于增殖和继代培养基进行继代增殖培养，得到艾纳香单芽；将所述艾纳香单芽接种于生长培养基中进行生根培养，得到艾纳香组培苗；将所述艾纳香组培苗进行炼苗和移栽培养。5.根据权利要求4所述的组培方法，其特征在于，所述外植体包括如下至少一种：(a)带腋芽茎段；(b)长度6～20mm的带有茎尖的嫩茎段。6.根据权利要求4所述的组培方法，其特征在于，所述不定芽诱导培养、继代增殖培养和生根培养的温度分别为24～26℃。7.根据权利要求4所述的组培方法，其特征在于，所述不定芽诱导培养、继代增殖培养和生根培养均在光暗交替照条件下进行，所述光照的时间分别为11～13h/d，所述光照的强度分别为1000～1500lx。8.根据权利要求4～7任一项所述的组培方法，其特征在于，所述不定芽诱导培养时间为28～32d；所述继代增殖培养的时间为28～32d；所述生根培养的时间为28～32d。9.根据权利要求4所述的组培方法，其特征在于，所述增殖和继代培养基以ms培养基为基本培养基，还包括：0.1～0.5mg/lnaa、1.0～3.0mg/l 6-ba、10～50mg/l维生素c、20～200mg/l肌醇、30g/l蔗糖和琼脂4～10g/l；所述不定芽诱导培养基以ms培养基为基本培养基，还包括：0.1～0.5mg/lnaa、1.0～3.0mg/l 6-ba、10～50mg/l维生素c、20～200mg/l肌醇、30g/l蔗糖和琼脂4～10g/l。10.权利要求4～9任一项所述的艾纳香组培方法在保持左旋龙脑含量遗传稳定性的艾纳香种质选育中的应用。

技术总结
本发明属于植物栽培技术领域，具体涉及一种艾纳香生长培养基、组培培养基、组培方法和应用。本发明的艾纳香生长培养基以MS培养基为基本培养基，还包括：0.2～0.3mg/LNAA、0.08～0.16mg/LDA-6、10mg/L维生素C、20mg/L肌醇、30g/L蔗糖和6g/L琼脂。DA-6和NAA联合应用提高艾纳香的生根效率、根长度和株高。本发明以左旋龙脑含量高的艾纳香种质带腋芽茎段或长度6～20mm的带有茎尖的嫩茎段作为外植体进行组织培养育苗，艾纳香组培苗左旋龙脑含量高，能够实现生产艾纳香稳定遗传的良种良苗。够实现生产艾纳香稳定遗传的良种良苗。够实现生产艾纳香稳定遗传的良种良苗。


技术研发人员：陈晓鹭 谌婉赟 陈振夏 于福来 黎行飞 罗雪婷 黄梅 肖永锋 黎玉兰
受保护的技术使用者：中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所
技术研发日：2023.08.22
技术公布日：2023/10/8