一种高活性高稳定性发酵剂及其应用的制作方法

1.本发明涉及生物发酵技术领域，特别是涉及一种高活性高稳定性发酵剂及其应用。


背景技术：

2.羊奶是一种优良的完全蛋白质食品。梁代陶弘景云：“乳实为补润，故北人食之多肥健。”现在已知，羊奶较之牛奶，其营养价值和医疗价值有过之而无不及。羊奶的营养价值高，其含有200多种营养和生物活性物质，包括乳酸64种、氨基酸20种、维生素20种和矿物质25种。羊奶的蛋白质、脂肪、钙、维生素c等成分的含量均比牛奶高；蛋白质中不易消化的酪蛋白较牛奶低；脂肪球小而均匀也利于人体吸收；含钙量约为人乳的5倍，比牛奶多15％。有学者研究指出，山羊奶除含多种维生素外，还含有抗癌的活性物质，并且其在防治肺炎及其他呼吸道疾病方面也具有一定疗效。可见，羊奶比牛奶更适宜作为幼儿、老人及病弱者的营养品。然而羊奶中的膻味限制了羊奶制品的应用推广。
3.发酵食品是利用微生物的作用制取的食品。通过微生物作用，可制取符合人们口味和喜好的食品。人们发现，将羊奶通过微生物发酵制备成酸奶，可以在一定程度上脱膻，但作用十分有限。为了拓展羊奶的应用范围，本发明尝试开发一种高活性高稳定性发酵剂，应用于酸奶发酵生产，以提高羊奶的脱膻效果，进而提高羊奶制品的适口性。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种高活性高稳定性发酵剂及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，该发酵剂可以提高羊酸奶制品的适口性，并改善其风味，对于羊奶的推广应用具有重要的意义。
5.为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
6.本发明提供一种高活性高稳定性发酵剂，包括动物双歧杆菌乳亚种(bifidobacterium animalis subsp.lactis)nj241、德氏乳杆菌保加利亚亚种(lactobacillus delbrueckii subspecies bulgaricus)nj441和嗜热链球菌(streptococcus thermophiles)t3的冻干菌粉；
7.所述动物双歧杆菌乳亚种nj241于2020年9月24日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.20816；
8.所述德氏乳杆菌保加利亚亚种nj441于2014年6月9日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：m2014249；
9.所述嗜热链球菌t3于2019年7月4日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：m2019524。
10.本发明还提供一种上述的高活性高稳定性发酵剂的制备方法，包括以下步骤：
11.s1.将动物双歧杆菌乳亚种nj241、德氏乳杆菌保加利亚亚种nj441和嗜热链球菌t3分别进行发酵培养和菌体分离，得到动物双歧杆菌乳亚种nj241菌体、德氏乳杆菌保加利
亚亚种nj441菌体和嗜热链球菌t3菌体；再将冷冻保护液分别加入到所述动物双歧杆菌乳亚种nj241菌体、所述德氏乳杆菌保加利亚亚种nj441菌体和所述嗜热链球菌t3菌体中，混合均匀后进行冷冻干燥处理，分别得到动物双歧杆菌乳亚种nj241冻干菌粉、德氏乳杆菌保加利亚亚种nj441冻干菌粉和嗜热链球菌t3冻干菌粉；
12.s2.将所述动物双歧杆菌乳亚种nj241冻干菌粉、所述德氏乳杆菌保加利亚亚种nj441冻干菌粉和所述嗜热链球菌t3冻干菌粉混合均匀，即得所述高活性高稳定性发酵剂；
13.在步骤s1中，所述冷冻保护液包括脯氨酸、酪蛋白酸钠和抗坏血酸钠。
14.进一步地，在步骤s1中，所述动物双歧杆菌乳亚种nj241的发酵培养温度为37℃，时间为16h；所述德氏乳杆菌保加利亚亚种nj441的发酵培养温度为37℃，时间为15h；所述嗜热链球菌t3的发酵培养温度为37℃，时间为16h。
15.进一步地，在步骤s2中，所述动物双歧杆菌乳亚种nj241冻干菌粉和所述德氏乳杆菌保加利亚亚种nj441冻干菌粉、所述嗜热链球菌t3冻干菌粉的质量比为1:100:100。
16.进一步地，在步骤s1中，所述脯氨酸、所述酪蛋白酸钠和所述抗坏血酸钠在所述冷冻保护液中的浓度分别为20-40g/l、15-40g/l和4-6g/l。
17.进一步地，在步骤s1中，所述脯氨酸、所述酪蛋白酸钠和所述抗坏血酸钠在所述冷冻保护液中的浓度分别为30g/l、20g/l和5g/l。
18.本发明还提供一种根据上述的制备方法制备得到的高活性高稳定性发酵剂。
19.本发明还提供上述的高活性高稳定性发酵剂在酸奶发酵生产中的应用。
20.进一步地，所述酸奶为羊酸奶。
21.进一步地，所述应用为降低所述羊酸奶的膻味。
22.本发明还提供一种降低羊酸奶膻味的方法，包括利用上述的高活性高稳定性发酵剂对生羊乳进行厌氧发酵的步骤。
23.本发明公开了以下技术效果：
24.本发明将动物双歧杆菌乳亚种nj241、德氏乳杆菌保加利亚亚种nj441和嗜热链球菌t3组合，制备得到了一种高活性高稳定性发酵剂，利用该发酵剂对生羊乳进行厌氧发酵，可以降低羊酸奶中与膻味相关的游离脂肪酸的含量，提高主要挥发性风味物质2,3-丁二酮、3-羟基-2-丁酮、5-羟甲基-2-呋喃甲醛和二氢-4-羟基-2(3h)-呋喃酮的含量，从而可以有效降低羊酸奶的膻味，提高羊酸奶制品的适口性，并改善其风味，这对于羊奶的推广应用具有重要的意义。
具体实施方式
25.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
26.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
27.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规
技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
28.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
29.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
30.以下实施例中使用的微生物菌株的信息如下：
31.动物双歧杆菌乳亚种(bifidobacterium animalis subsp.lactis)nj241，已于2020年9月24日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为cgmcc no.20816。
32.德氏乳杆菌保加利亚亚种(lactobacillus delbrueckii subspecies bulgaricus)nj441，已于2014年6月9日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为cctcc no：m2014249。
33.嗜热链球菌(streptococcus thermophiles)t3，已于2019年7月4日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为cctcc no：m2019524。
34.实施例1
35.一种发酵剂的制备方法：
36.(1)在100ml蒸馏水中加入脯氨酸3g、酪蛋白酸钠2g和抗坏血酸钠0.5g混合均匀，得到冷冻保护液。
37.(2)取出冷冻保存的动物双歧杆菌乳亚种nj241，在mrs平板上划线活化两次，再接种于mrs液体培养基，在37℃条件下活化16h，之后按照5％的接种量接种于mrs液体培养基，37℃，厌氧发酵培养16h，得到发酵液，离心收集得到菌体1；取100g菌体1加入2ml冷冻保护液混合均匀，之后真空冷冻干燥，得到冻干菌粉1。
38.(3)取出冷冻保存的德氏乳杆菌保加利亚亚种nj441，在mrs平板上划线活化两次，再接种于mrs液体培养基，在37℃条件下活化15h，之后按照5％的接种量接种于mrs液体培养基，37℃，厌氧发酵培养15h，得到发酵液，离心收集得到菌体2；取100g菌体2加入2ml冷冻保护液混合均匀，之后真空冷冻干燥，得到冻干菌粉2。
39.(4)取出冷冻保存的嗜热链球菌t3，在mrs平板上划线活化两次，再接种于mrs液体培养基，在37℃条件下活化16h，之后按照5％的接种量接种于mrs液体培养基，37℃，厌氧发酵培养16h，得到发酵液，离心收集得到菌体3；取100g菌体1加入2ml冷冻保护液混合均匀，之后真空冷冻干燥，得到冻干菌粉3。
40.(5)将冻干菌粉1、冻干菌粉2和冻干菌粉3按照质量比1:100:100混合均匀，即得发酵剂。
41.实施例2
42.一种发酵剂的制备方法：
43.(1)在100ml蒸馏水中加入脯氨酸4g、酪蛋白酸钠4g和抗坏血酸钠0.4g混合均匀，
得到冷冻保护液。
44.(2)取出冷冻保存的动物双歧杆菌乳亚种nj241，在mrs平板上划线活化两次，再接种于mrs液体培养基，在37℃条件下活化16h，之后按照5％的接种量接种于mrs液体培养基，37℃，厌氧发酵培养16h，得到发酵液，离心收集得到菌体1；取100g菌体1加入2ml冷冻保护液混合均匀，之后真空冷冻干燥，得到冻干菌粉1。
45.(3)取出冷冻保存的德氏乳杆菌保加利亚亚种nj441，在mrs平板上划线活化两次，再接种于mrs液体培养基，在37℃条件下活化15h，之后按照5％的接种量接种于mrs液体培养基，37℃，厌氧发酵培养15h，得到发酵液，离心收集得到菌体2；取100g菌体2加入2ml冷冻保护液混合均匀，之后真空冷冻干燥，得到冻干菌粉2。
46.(4)取出冷冻保存的嗜热链球菌t3，在mrs平板上划线活化两次，再接种于mrs液体培养基，在37℃条件下活化16h，之后按照5％的接种量接种于mrs液体培养基，37℃，厌氧发酵培养16h，得到发酵液，离心收集得到菌体3；取100g菌体1加入2ml冷冻保护液混合均匀，之后真空冷冻干燥，得到冻干菌粉3。
47.(5)将冻干菌粉1、冻干菌粉2和冻干菌粉3按照质量比1:100:100混合均匀，即得发酵剂。实施例3
48.一种发酵剂的制备方法：
49.(1)在100ml蒸馏水中加入脯氨酸2g、酪蛋白酸钠1.5g和抗坏血酸钠0.6g混合均匀，得到冷冻保护液。
50.(2)取出冷冻保存的动物双歧杆菌乳亚种nj241，在mrs平板上划线活化两次，再接种于mrs液体培养基，在37℃条件下活化16h，之后按照5％的接种量接种于mrs液体培养基，37℃，厌氧发酵培养16h，得到发酵液，离心收集得到菌体1；取100g菌体1加入2ml冷冻保护液混合均匀，之后真空冷冻干燥，得到冻干菌粉1。
51.(3)取出冷冻保存的德氏乳杆菌保加利亚亚种nj441，在mrs平板上划线活化两次，再接种于mrs液体培养基，在37℃条件下活化15h，之后按照5％的接种量接种于mrs液体培养基，37℃，厌氧发酵培养15h，得到发酵液，离心收集得到菌体2；取100g菌体2加入2ml冷冻保护液混合均匀，之后真空冷冻干燥，得到冻干菌粉2。
52.(4)取出冷冻保存的嗜热链球菌t3，在mrs平板上划线活化两次，再接种于mrs液体培养基，在37℃条件下活化16h，之后按照5％的接种量接种于mrs液体培养基，37℃，厌氧发酵培养16h，得到发酵液，离心收集得到菌体3；取100g菌体1加入2ml冷冻保护液混合均匀，之后真空冷冻干燥，得到冻干菌粉3。
53.(5)将冻干菌粉1、冻干菌粉2和冻干菌粉3按照质量比1:100:100混合均匀，即得发酵剂。
54.对比例1
55.同实施例1，区别仅在于，将脯氨酸替换为甘氨酸。
56.对比例2
57.同实施例1，区别仅在于，将脯氨酸替换为组氨酸。
58.对比例3
59.同实施例1，区别仅在于，在步骤(1)中，不添加脯氨酸。
60.对比例4
61.同实施例1，区别仅在于，在步骤(1)中，不添加抗坏血酸钠。
62.效果验证
63.1.测试不同发酵剂的活菌含量
64.分别检测实施例1-3和对比例1-4冷冻干燥前后的动物双歧杆菌乳亚种nj241、德氏乳杆菌保加利亚亚种nj441和嗜热链球菌t3的活菌数(冷冻干燥前和冷冻干燥后分别记为q0和q1)，并计算冷冻干燥存活率，结果见表1，冷冻干燥存活率＝q1/q0×
100％。
65.实施例1-3和对比例1-4的发酵剂制备完成后，立即置于4℃冰箱保存，之后分别于0，7，30和90d用无菌生理盐水复溶，检测活菌数，结果如表2所示。
66.表1
[0067][0068]
表2
[0069][0070]
本发明通过在冷冻干燥过程中使用一种特殊的冷冻保护剂来提升了菌体的冷冻干燥存活率。该冷冻保护剂由脯氨酸、抗坏血酸钠和酪蛋白酸钠组成，其中酪蛋白酸钠能够能与水密切作用使干粉保留适量的水分，满足微生物维持生命的最低需求；脯氨酸透过细胞膜进入细胞内，与细胞内水氢键结合抑制低温下冰晶形成，同时可与细胞内水结合减少细胞内水流失，保护细胞内蛋白质的结构和功能；抗坏血酸钠具有抗氧化作用，并且与脯氨酸结合使用能够增强菌体对温度的敏感度，增大细胞膜的渗透性，使得菌体内的非结合水份能够快速除去，进而有效抑制细胞内冰晶的形成，有效降低冷冻干燥对菌体细胞的损伤。
[0071]
根据表2可以看出，实施例1-3制备得到发酵剂的活菌数较高，并且在经过90d的保存后，活菌数仍在109cfu/g以上，说明本发明制备的发酵剂的稳定性高，货架期能够得到有
效延长。此外，本发明将脯氨酸和抗坏血酸钠结合使用，使菌体冷冻干燥存活率得到了大幅提高(表1)。
[0072]
2.测试不同发酵剂对酸奶发酵的影响
[0073]
在生羊乳中加入白砂糖(生羊乳和白砂糖的质量比为9:1)，溶解后进行灭菌处理，再分别按照表3所示将实施例1制备得到的冻干菌粉1、冻干菌粉2和/或冻干菌粉3接种入灭菌后的生羊乳中，在40℃的条件下进行厌氧发酵，ph达到4.5后结束发酵，再经均质处理后，得到a-d四种酸奶。利用静态顶空-固相微萃取-气相色谱-质谱联用(hs-spme-gc-ms)技术对该四种酸奶的挥发性风味组分进行测定，结果见表4。
[0074]
随机选择测试人员40人(男性和女性各20人)对上述四种酸奶的风味和口感进行盲测，盲测标准和结果分别见表5和表6。
[0075]
表3
[0076]
分组冻干菌粉及其在生羊乳中的接种量a冻干菌粉10.01g/l+冻干菌粉21g/l+冻干菌粉31g/lb冻干菌粉10.01g/l+冻干菌粉31g/lc冻干菌粉21g/l+冻干菌粉31g/ld冻干菌粉10.01g/l+冻干菌粉21g/l
[0077]
表4
[0078]
[0079][0080]
注：表中
“‑”
表示未检出。
[0081]
表5
[0082][0083]
表6
[0084][0085]
研究发现羊奶膻味主要由其游离脂肪酸(ffa)引起，其中己酸、辛酸和癸酸是引起羊奶膻味的主要游离脂肪酸，这几种脂肪酸本身并没有膻味，并且在奶脂肪中的含量也并不高，但是它们会在奶中相互作用(尤其己酸和辛酸之间)，在一定条件下，结合成一种较稳定的络合物，或者以相互结合的形式(通过氢键)存在，从而形成典型的羊奶膻味。因此，降低酸奶中与膻味相关的游离脂肪酸的含量，是提高酸奶风味的技术手段之一。
[0086]
根据表4可以看出，利用实施例1的发酵剂进行生羊乳厌氧发酵生产的酸奶没有产生辛酸和正葵酸，正己酸的含量也得到明显降低，而使用动物双歧杆菌乳亚种nj241+德氏乳杆菌保加利亚亚种nj441、动物双歧杆菌乳亚种nj241+嗜热链球菌t3以及德氏乳杆菌保加利亚亚种nj441+嗜热链球菌t3进行发酵都没有达到上述效果，并且德氏乳杆菌保加利亚亚种nj441+嗜热链球菌t3发酵组的游离脂肪酸的含量最高，本发明推测动物双歧杆菌乳亚种nj241+德氏乳杆菌保加利亚亚种nj441+嗜热链球菌t3的组合有一定的特殊性，并且动物双歧杆菌乳亚种nj241在该组合中发挥了重要作用，三者相结合从而实现了对与膻味相关游离脂肪酸含量的降低，进而可以降低羊酸奶的膻味，提高羊酸奶适口性。此外，结合表4和表6还可以看出，利用实施例1的发酵剂进行生羊乳厌氧发酵，还提升了酸奶主要挥发性风味物质2,3-丁二酮、3-羟基-2-丁酮、5-羟甲基-2-呋喃甲醛和二氢-4-羟基-2(3h)-呋喃酮的含量。
[0087]
综上所述，本发明将动物双歧杆菌乳亚种nj241、德氏乳杆菌保加利亚亚种nj441和嗜热链球菌t3组合制备得到的发酵剂，可以有效降低羊酸奶的膻味，提高主要风味物质的含量，进而提高羊酸奶制品的适口性，改善其风味，这对于羊奶的推广应用具有重要的意义。
[0088]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

技术特征：
1.一种高活性高稳定性发酵剂，其特征在于，包括动物双歧杆菌乳亚种(bifidobacterium animalis subsp.lactis)nj241、德氏乳杆菌保加利亚亚种(lactobacillus delbrueckii subspecies bulgaricus)nj441和嗜热链球菌(streptococcus thermophiles)t3的冻干菌粉；所述动物双歧杆菌乳亚种nj241于2020年9月24日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.20816；所述德氏乳杆菌保加利亚亚种nj441于2014年6月9日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：m2014249；所述嗜热链球菌t3于2019年7月4日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：m2019524。2.一种如权利要求1所述的高活性高稳定性发酵剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：s1.将动物双歧杆菌乳亚种nj241、德氏乳杆菌保加利亚亚种nj441和嗜热链球菌t3分别进行发酵培养和菌体分离，得到动物双歧杆菌乳亚种nj241菌体、德氏乳杆菌保加利亚亚种nj441菌体和嗜热链球菌t3菌体；再将冷冻保护液分别加入到所述动物双歧杆菌乳亚种nj241菌体、所述德氏乳杆菌保加利亚亚种nj441菌体和所述嗜热链球菌t3菌体中，混合均匀后进行冷冻干燥处理，分别得到动物双歧杆菌乳亚种nj241冻干菌粉、德氏乳杆菌保加利亚亚种nj441冻干菌粉和嗜热链球菌t3冻干菌粉；s2.将所述动物双歧杆菌乳亚种nj241冻干菌粉、所述德氏乳杆菌保加利亚亚种nj441冻干菌粉和所述嗜热链球菌t3冻干菌粉混合均匀，即得所述高活性高稳定性发酵剂；在步骤s1中，所述冷冻保护液包括脯氨酸、酪蛋白酸钠和抗坏血酸钠。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，在步骤s1中，所述动物双歧杆菌乳亚种nj241的发酵培养温度为37℃，时间为16h；所述德氏乳杆菌保加利亚亚种nj441的发酵培养温度为37℃，时间为15h；所述嗜热链球菌t3的发酵培养温度为37℃，时间为16h。4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，在步骤s2中，所述动物双歧杆菌乳亚种nj241冻干菌粉和所述德氏乳杆菌保加利亚亚种nj441冻干菌粉、所述嗜热链球菌t3冻干菌粉的质量比为1:100:100。5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，在步骤s1中，所述脯氨酸、所述酪蛋白酸钠和所述抗坏血酸钠在所述冷冻保护液中的浓度分别为20-40g/l、15-40g/l和4-6g/l。6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，在步骤s1中，所述脯氨酸、所述酪蛋白酸钠和所述抗坏血酸钠在所述冷冻保护液中的浓度分别为30g/l、20g/l和5g/l。7.一种如权利要求1所述的高活性高稳定性发酵剂在酸奶发酵生产中的应用。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述酸奶为羊酸奶。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用为降低所述羊酸奶的膻味。10.一种降低羊酸奶膻味的方法，其特征在于，包括利用权利要求1所述的高活性高稳定性发酵剂对生羊乳进行厌氧发酵的步骤。

技术总结
本发明公开了一种高活性高稳定性发酵剂及其应用，涉及生物发酵技术领域。该高活性高稳定性发酵剂包括动物双歧杆菌乳亚种NJ241、德氏乳杆菌保加利亚亚种NJ441和嗜热链球菌T3的冻干菌粉的冻干菌粉。本发明将动物双歧杆菌乳亚种NJ241、德氏乳杆菌保加利亚亚种NJ441和嗜热链球菌T3组合，制备得到了一种高活性高稳定性发酵剂，利用该发酵剂对生羊乳进行厌氧发酵，可以降低羊酸奶中与膻味相关的游离脂肪酸的含量，提高主要挥发性风味物质的含量，从而可以有效降低羊酸奶的膻味，提高羊酸奶制品的适口性，并改善其风味，这对于羊奶的推广应用具有重要的意义。具有重要的意义。


技术研发人员：马新 喻扬 郁雪平
受保护的技术使用者：安徽善和生物科技有限公司
技术研发日：2023.08.09
技术公布日：2023/10/8