评价小鼠精子抗原特异性T细胞反应的方法

评价小鼠精子抗原特异性t细胞反应的方法
技术领域
1.本发明涉及抗原特异性t细胞技术领域，具体为评价小鼠精子抗原特异性t细胞反应的方法。


背景技术：

2.抗原提呈细胞(apc)是指能摄取和在细胞内加工处理抗原，并将抗原信息提呈给t淋巴细胞的细胞。通常所指的抗原提呈细胞包括树突状细胞(dc)、巨噬细胞(mφ)、b淋巴细胞等表达mhcii类分子的细胞，也将其称为专职性抗原提呈细胞(apc)。树突状细胞(dc)是目前所知抗原提呈功能最强的apc，最大的特点是能够刺激初始型t细胞活化和增殖，而mφ、b淋巴细胞等仅能刺激已活化的t细胞或记忆性t细胞，因此，dc是特异性免疫应答的始动者。随着对不同组织来源dc研究的深入，目前已知的dc亚群包括存在于淋巴组织、血液和非淋巴组织的经典dc(cdc)，以及分泌i型干扰素的浆细胞样dc(pdc)，分别具有不同的表型及功能。其中，经典dc的主要功能是诱导针对入侵抗原的特异性免疫应答并维持自身耐受，而pdc的主要功能则是针对微生物，特别是病毒感染产生大量的i型干扰素并激活相应的t细胞。t细胞和抗原呈递细胞(apc)之间的结合对于激活抗原特异性t细胞是必不可少的，但定量精子抗原依赖性t细胞-apc结合是困难的。
3.因此，如何设计评价小鼠精子抗原特异性t细胞反应的方法是业界亟待解决的技术问题。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供评价小鼠精子抗原特异性t细胞反应的方法，旨在解决定量精子抗原依赖性t细胞-apc结合的问题。
5.本发明是这样实现的，评价小鼠精子抗原特异性t细胞反应的方法，包括以下步骤：s1、将cd4+tot-2细胞分离富集和过继转移到经过ova精子和佐剂免疫后的野生型45.1小鼠体内；s2、对小鼠的脾脏淋巴结组织进行样品收集、酶消化以及细胞染色；s3、基于流式细胞术，对经过细胞染色后的样本进行上机分析，并对检测出的数据进行记录；s4、对记录的数据结果进行分析。
6.进一步地，所述s1包括以下步骤：s11、cd4+t细胞即为载体构建，构建在精子上特异性表达异种鸡卵清蛋白抗原的转基因小鼠；s12、对cd45.1小鼠进行佐剂免疫操作。
7.进一步地，所述s11包括以下步骤：s111、根据设计方案，设计并构建转基因载体，通过酶切和测序验证载体序列的正确性；s112、将转基因载体样品进行显微注射，将转基因载体样品显微注射到c57bl/6jgpt背景的小鼠受精卵中，然后取注射后存活的受精卵移植到假孕雌鼠体内，待其怀孕产仔；s113、对f0代小鼠进行基因鉴定，受体鼠生出的f0代小仔在5-7天剪尾及剪脚趾编号，提取基因组dna进行pcr鉴定，确认基因型；s114、对结果进行记录与分析，确保成功构建精子特异性表达ova抗原小鼠。
8.进一步地，所述s12包括以下步骤：s121、在ot-2细胞转染前一天，安乐死精子特异
性表达ova的小鼠，用表达ova的精子细胞悬液和fca按照1：1混合乳化均匀后免疫同源性cd45.1小鼠的右后足垫，每个足垫注射量为20ul，操作时间为30秒/只；s122、从成年的雄性ova特异性t细胞受体转基因ot-2小鼠中分离cd4+t细胞，其中使用具有同源性cd45.1小鼠作为受体；s123、在异氟醚轻度麻醉下，将cd45.2供体ot-2细胞的5x106个细胞反向转移到1天前用ova和佐剂免疫的野生型cd45.1受体小鼠中。
9.进一步地，所述s122包括以下步骤：s1221、安乐死供体ot-2小鼠，并将脾脏和所有皮下淋巴结收集到100um的细胞过滤器中，该过滤器放置在带有2ml预冷培养基的5cm培养皿中，该所述预冷培养基为rpmi1640培养基，其中含有10％fbs；i、用3ml注射器的无菌注射器活塞将切碎的组织碎片在100um细胞过滤器的底部研磨；ii、加入2ml含有5mg/ml胶原酶d的rpmi1640消化培养基，并加入10％fbs，形成最终浓度为2.5mg/ml胶原酶d；iii、将培养皿置于5％co2培养箱中，并在37℃下培养30分钟；s1222、将脾脏和所有淋巴结用细剪刀剪成大小为1mm的碎片；s1223、按照说明书使用分选试剂盒分选cd4t细胞；s1224、洗涤分离的ot-2细胞并将其悬浮在冰冷的磷酸盐缓冲液中，其浓度为1*107cells/ml。
10.进一步地，所述s122步骤中从一只ot-2小鼠中获得1x108个总脾和淋巴结细胞，其中1.5
–
2.0x107个细胞通过使用试剂盒分离至纯度为90％
–
95％的cd4+ot-2细胞。
11.进一步地，所述s2包括以下步骤：s21、对小鼠的淋巴结细胞组织进行样品收集，并对样品进行酶消化；s22、对酶消化后的细胞组织进行染色，用抗体染色细胞表面标记物。
12.进一步地，所述s21包括以下步骤：s211、在对小鼠进行安乐死之前，通过在24孔板的每个孔的底部放置1*1cm2的100um尼龙网；a.每孔加入200ul培养基，该培养基为含有10％fbs的rpmi1640培养基；b.根据需要准备尽可能多的孔，以便每个孔一个小鼠皮下淋巴结，收集时，将板子放在冰上；s212、在ot-2细胞转移后7天安乐死小鼠，并收集腹股沟区引流淋巴结；s213、机械破坏皮下淋巴结；a.用细剪刀将皮下淋巴结切成小块；b.用1ml注射器的柱塞将皮下淋巴结块研磨在尼龙网上，轻轻搅拌；c.用800ulrpmi1640和10％fbs清洗剪刀和柱塞，使孔内的体积为1ml；s214、消化皮下淋巴结，每孔添加10ul0.25g/ml胶原酶d，并在37℃的5％co2培养箱中培养30分钟；s215、用1ml微量移液管轻轻地向上和向下吸移孔中的培养基，收集消化的皮下淋巴结细胞悬浮液，以便皮下淋巴结组织的任何残余物将从尼龙网上分离；s216、在1.5ml管的顶部放置1x1cm2尼龙网，并使整个消化的细胞悬浮液通过网；s217、取10ul进行细胞计数，用0.6ml冰冷磷酸盐缓冲液洗涤，并使洗涤液通过尼龙网，将细胞悬浮液放在冰上；s218、在500xg4度离心5分钟，去除上清液，并通过轻轻移液将细胞重新悬浮在200ul含10％fbs的rpmi1640中，将细胞悬浮液转移至96孔v形底板；s219、在850xg4度离心2分钟，然后将上清液倾倒到水槽或废物容器中；s2110、清洗细胞；a.轻轻旋转平板；b.通过多通道移液器加入200ul/孔不含edta的磷酸盐缓冲液来清洗细胞；c.在4℃下以450xg离心5分钟；d.将上清液倒入废液容器。
13.进一步地，所述s22包括以下步骤：s221、染色死细胞；a.通过轻轻涡旋开细胞沉淀使其成为单细胞悬液，并加入20ul/孔染料；b.轻轻旋转平板，使细胞悬浮；c.在冰上孵育培养板15
–
30分钟；d.清洗细胞；s222、染色细胞表面标记物；a.加入10ul/孔fc封闭液；b.通过轻轻涡旋悬浮细胞；c.在冰上孵育15分钟；d.在不洗涤的情况下，加入10ul/孔细胞表面染色抗体混合物；e.通过轻轻涡旋使细胞悬浮；f.在冰上放置培养板15
–
30分钟；g.清洗细胞。
14.进一步地，所述s3包括以下步骤：s31、现用现配工作液，每个反应加入100μ
lworkingsolution，充分重悬细胞后，避光4℃孵育1h，用双蒸水现用现配1
×
permeabilizationbuffer，并用此溶液配制胞内流式染色抗体混合物，其中包括转录因子和相关细胞因子抗体，反应体系为100μl，抗体按照1:200稀释，充分混匀后待用；s32、给步骤s31中固定破核的细胞悬液加入500μl1
×
permeabilizationbuffer，700
×
g、4℃离心5min，去除上清后得到细胞沉淀；s33、用100μl的抗体混合物重悬细胞，充分混匀后置于4℃避光孵育40min；s34、反应结束后清洗细胞，最后用200～300μl流式染色缓冲液重悬，通过使细胞悬浮液通过一小块尼龙网过滤细胞，并将其收集到5ml圆底聚苯乙烯管中。
15.与现有技术相比，本发明提供的评价小鼠精子抗原特异性t细胞反应的方法，具有以下有益效果：
16.本发明具有以下有益效果：通过构建精子特异性表达卵清蛋白(ova)抗原的转基因小鼠和应用细胞过继转移构建了一种基于流式细胞术的简单方案，用于定量分析ova免疫的小鼠的精子抗原引流淋巴结和脾脏中的抗原特异性cd4+t细胞体内反应，该方案量化了过继转移的ova特异性tcr转基因cd4t(ot-2)细胞的分化，这种方法也可以应用于树突状细胞(dc)亚群之间的结合，以及t细胞和其它抗原提呈细胞(apc)亚群之间的其他类型的细胞间相互作用。
附图说明
17.图1为本发明评价小鼠精子抗原特异性t细胞反应方法的流程图；
18.图2为本发明细胞转移以及佐剂免疫的方法流程图；
19.图3为本发明构建精子特异性表达ova抗原小鼠的方法流程图；
20.图4为本发明对野生型cd45.1小鼠进行佐剂免疫的方法流程图；
21.图5为本发明对转基因ot-2小鼠中cd4+t细胞进行分离的方法流程图；
22.图6为本发明对小鼠淋巴结细胞进行收集染色的方法流程图；
23.图7为本发明对小鼠淋巴结细胞样品进行收集以及酶消化的方法流程图；
24.图8为本发明对细胞进行染色操作的方法流程图；
25.图9为本发明对经过染色后的细胞样本进行上机分析的方法流程图。
具体实施方式
26.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
27.以下结合具体实施例对本发明的实现进行详细的描述。
28.本实施例的附图中相同或相似的标号对应相同或相似的部件；在本发明的描述中，需要理解的是，若有术语“上”、“下”、“左”、“右”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此附图中描述位置关系的用语仅用于示例性说明，不能理解为对本专利的限制，对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语的具体含义。
29.参照图1-9所示，为本发明提供的较佳实施例。
30.评价小鼠精子抗原特异性t细胞反应的方法，包括以下步骤：s1、将cd4+tot-2细胞分离富集和过继转移到经过ova精子和佐剂免疫后的野生型45.1小鼠体内；s2、对小鼠的脾脏淋巴结组织进行样品收集、酶消化以及细胞染色；s3、基于流式细胞术，对经过细胞染色后的样本进行上机分析，并对检测出的数据进行记录；s4、对记录的数据结果进行分析。
31.具体地，s1包括以下步骤：s11、cd4+t细胞即为载体构建，构建在精子上特异性表达异种鸡卵清蛋白抗原的转基因小鼠；s12、对cd45.1小鼠进行佐剂免疫操作。
32.本实施方案中，准备cd45.2ot-2小鼠以及cd45.1小鼠，ot-2小鼠cd4+t细胞受体特异性识别ova323-339肽段，ot-2小鼠cd4/cd8外周血t细胞比例增加了4倍，淋巴结t细胞对特定的卵清蛋白配体表现出剂量依赖的增殖反应，小鼠cd45的等位变异cd45.1和cd45.2分别表达于不同的小鼠谱系，多数小鼠谱系表达cd45.2，而cd45.1只在少数小鼠谱系中表达，cd45.1和cd45.2常被用于追踪骨髓移植后小鼠造血细胞的来源，是区分淋巴瘤白血病和非造血组织肿瘤的特异性标记物，用于对后续所需的在精子上特异性表达异种鸡卵清蛋白抗原的转基因小鼠进行构建。
33.具体地，s11包括以下步骤：s111、根据设计方案，设计并构建转基因载体，通过酶切和测序验证载体序列的正确性；s112、将转基因载体样品进行显微注射，将转基因载体样品显微注射到c57bl/6jgpt背景的小鼠受精卵中，然后取注射后存活的受精卵移植到假孕雌鼠体内，待其怀孕产仔；s113、对f0代小鼠进行基因鉴定，受体鼠生出的f0代小仔在5-7天剪尾及剪脚趾编号，提取基因组dna进行pcr鉴定，确认基因型；s114、对结果进行记录与分析，确保成功构建精子特异性表达ova抗原小鼠。
34.本实施方案中，通过显微注射，用于将存活的受精卵移植到假孕雌鼠体内，使其受孕产出精子特异性表达ova抗原小鼠，pcr是聚合酶链式反应的简称，是体外酶促合成特异dna片段的一种方法，由高温变性、低温退火、适温延伸等反应组成1个周期，循环进行，使目的dna得以迅速扩增，可用于基因分离克隆和核酸序列分析等基础研究，以及疾病的诊断和任何有dna和rna的地方。
35.具体地，s12包括以下步骤：s121、在ot-2细胞转染前一天，安乐死精子特异性表达ova的小鼠，用表达ova的精子细胞悬液和fca按照1：1混合乳化均匀后免疫同源性cd45.1小鼠的右后足垫，每个足垫注射量为20ul，操作时间为30秒/只；s122、从成年的雄性ova特异性t细胞受体转基因ot-2小鼠中分离cd4+t细胞，其中使用具有同源性cd45.1小鼠作为受体；s123、在异氟醚轻度麻醉下，将cd45.2供体ot-2细胞的5x106个细胞反向转移到1天前用ova和佐剂免疫的野生型cd45.1受体小鼠中。
36.本实施方案中，fca为弗氏佐剂中的弗氏完全佐剂，弗氏佐剂通常被认为是目前动物实验中最常用的免疫佐剂，常用于动物免疫制备抗体，弗氏佐剂可以使抗原持续缓释，同时又能非特异性地增强机体对抗原的特异性免疫应答，增强相应抗原的免疫原性或改变免疫反应类型，其本质是一种含非代谢油、表面活性剂或含灭活细菌的混合物，通过等体积混合水溶性抗原溶液形成油包水的乳剂，抗原乳剂不仅提高体内抗原的分布范围从而增强与相关细胞的相互作用，而且使得抗原在机体内缓慢释放，延长抗原刺激和增强局部免疫应答，弗氏佐剂分为弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂；同源性cd45.1小鼠背景为b6.sjl-ptprcapep3b/boyj。
37.具体地，s122包括以下步骤：s1221、安乐死供体ot-2小鼠，并将脾脏和所有皮下淋
巴结收集到100um的细胞过滤器中，该过滤器放置在带有2ml预冷培养基的5cm培养皿中，该预冷培养基为rpmi1640培养基，其中含有10％fbs；i、用3ml注射器的无菌注射器活塞将切碎的组织碎片在100um细胞过滤器的底部研磨；ii、加入2ml含有5mg/ml胶原酶d的rpmi1640消化培养基，并加入10％fbs，形成最终浓度为2.5mg/ml胶原酶d；iii、将培养皿置于5％co2培养箱中，并在37℃下培养30分钟；s1222、将脾脏和所有淋巴结用细剪刀剪成大小为1mm的碎片；s1223、按照说明书使用分选试剂盒分选cd4t细胞；s1224、洗涤分离的ot-2细胞并将其悬浮在冰冷的磷酸盐缓冲液中，其浓度为1*107cells/ml。
38.本实施方案中，fbs是胎牛血清，一般细胞培养中加入10％的fbs有助于细胞生长，按体积比例加，胎牛血清长期以来一直是哺乳动物细胞培养补充剂的黄金标准，广泛应用于细胞生物学；rpmi1640细胞培养基是一种经典的培养基，可用于淋巴细胞以及各种细胞的培养。
39.具体地，s122步骤中从一只ot-2小鼠中获得1x108个总脾和淋巴结细胞，其中1.5
–
2.0x107个细胞通过使用试剂盒分离至纯度为90％
–
95％的cd4+ot-2细胞。
40.本实施方案中，使用的试剂盒为bd或stemcell的试剂盒，用于对细胞进行分离以及培养。
41.具体地，s2包括以下步骤：s21、对小鼠的淋巴结细胞组织进行样品收集，并对样品进行酶消化；s22、对酶消化后的细胞组织进行染色，用抗体染色细胞表面标记物。
42.本实施方案中，采用酶消化的目的是暴露抗原，增加细胞和组织的通透性，以利于抗体与抗原最大限度地结合，通过对小鼠的淋巴结细胞组织进行收集、酶消化并染色，即可进行后续的样本上机分析，步骤s21的操作时间为1h。
43.具体地，s21包括以下步骤：s211、在对小鼠进行安乐死之前，通过在24孔板的每个孔的底部放置1*1cm2的100um尼龙网；a.每孔加入200ul培养基，该培养基为含有10％fbs的rpmi1640培养基；b.根据需要准备尽可能多的孔，以便每个孔一个小鼠皮下淋巴结，收集时，将板子放在冰上；s212、在ot-2细胞转移后7天安乐死小鼠，并收集腹股沟区引流淋巴结；s213、机械破坏皮下淋巴结；a.用细剪刀将皮下淋巴结切成小块；b.用1ml注射器的柱塞将皮下淋巴结块研磨在尼龙网上，轻轻搅拌；c.用800ulrpmi1640和10％fbs清洗剪刀和柱塞，使孔内的体积为1ml；s214、消化皮下淋巴结，每孔添加10ul0.25g/ml胶原酶d，并在37℃的5％co2培养箱中培养30分钟；s215、用1ml微量移液管轻轻地向上和向下吸移孔中的培养基，收集消化的皮下淋巴结细胞悬浮液，以便皮下淋巴结组织的任何残余物将从尼龙网上分离；s216、在1.5ml管的顶部放置1x1cm2尼龙网，并使整个消化的细胞悬浮液通过网；s217、取10ul进行细胞计数，用0.6ml冰冷磷酸盐缓冲液洗涤，并使洗涤液通过尼龙网，将细胞悬浮液放在冰上；s218、在500xg4度离心5分钟，去除上清液，并通过轻轻移液将细胞重新悬浮在200ul含10％fbs的rpmi1640中，将细胞悬浮液转移至96孔v形底板；s219、在850xg4度离心2分钟，然后将上清液倾倒到水槽或废物容器中；s2110、清洗细胞；a.轻轻旋转平板；b.通过多通道移液器加入200ul/孔不含edta的磷酸盐缓冲液来清洗细胞；c.在4℃下以450xg离心5分钟；d.将上清液倒入废液容器。
44.本实施方案中，850xg表示离心力大小，g是重力加速度的倍数，x表示g值的大小，因此，可以根据公式g＝1.118x10^-5xrxn^2来计算出离心机的转速；磷酸盐缓冲液由磷酸一氢钠和磷酸二氢钠的混合溶液组成，其中磷酸一氢钠是呈碱性的，而磷酸二氢钠是呈酸
性的.由于磷酸不是强酸，所以磷酸一氢根和磷酸二氢根中氢离子都不能完全电离出来，当向混合溶液中加入酸时，磷酸一氢钠就会吸收溶液中的氢离子变成磷酸二氢钠，使溶液的ph值下降很少，同理，当向溶液中加入碱时磷酸二氢根就会吸收一氢氧根离子形成磷酸一氢根，这样溶液的ph值上升就会很少，其为缓冲溶液，缓冲溶液可以条件变化的情况下保护溶液，使溶液的ph值的变化尽量的小，故缓冲溶液又可以称为保护液；edta为消化液中的一种，在组织细胞的体外培养和原代细胞培养中的组织细胞分散以及传代细胞培养中，贴壁生长细胞的消化分散均要使用组织细胞消化液。其功能主要是使细胞间的蛋白质水解，使组织或贴壁细胞分散成单个细胞，制成细胞悬液用于进一步的实验。
45.具体地，s22包括以下步骤：s221、染色死细胞；a.通过轻轻涡旋开细胞沉淀使其成为单细胞悬液，并加入20ul/孔染料；b.轻轻旋转平板，使细胞悬浮；c.在冰上孵育培养板15
–
30分钟；d.清洗细胞；s222、染色细胞表面标记物；a.加入10ul/孔fc封闭液；b.通过轻轻涡旋悬浮细胞；c.在冰上孵育15分钟；d.在不洗涤的情况下，加入10ul/孔细胞表面染色抗体混合物；e.通过轻轻涡旋使细胞悬浮；f.在冰上放置培养板15
–
30分钟；g.清洗细胞。
46.本实施方案中，染料为zombieuv或zombieaqua，在盐酸缓冲溶液中稀释1:1000后使用，zombieuv以及zombieaquazombie均为僵尸紫外线，是一种胺反应性荧光染料，对活细胞不渗透，但对膜受损的细胞具有渗透性，因此，它可用于评估哺乳动物细胞的存活状态与死亡状态，zombieuv是一种极性水溶性染料，提供紫色荧光，使其适用于多色检测，zombie染料的原理对于坏死的细胞而言，由于细胞膜通透性的改变，这种染料可以和细胞表面以及膜内的游离胺结合，发出高强度的荧光信号，zombieaqua是一种极性水溶性染料，提供非常明亮的绿色荧光，使其适用于多色检测；其中清洗细胞的操作与步骤s2110中的操作相同。
47.具体地，s3包括以下步骤：s31、现用现配工作液，每个反应加入100μlworkingsolution，充分重悬细胞后，避光4℃孵育1h，用双蒸水现用现配1
×
permeabilizationbuffer，并用此溶液配制胞内流式染色抗体混合物，其中包括转录因子和相关细胞因子抗体，反应体系为100μl，抗体按照1:200稀释，充分混匀后待用；s32、给步骤s31中固定破核的细胞悬液加入500μl1
×
permeabilizationbuffer，700
×
g、4℃离心5min，去除上清后得到细胞沉淀；s33、用100μl的抗体混合物重悬细胞，充分混匀后置于4℃避光孵育40min；s34、反应结束后清洗细胞，最后用200～300μl流式染色缓冲液重悬，通过使细胞悬浮液通过一小块尼龙网过滤细胞，并将其收集到5ml圆底聚苯乙烯管中。
48.本实施方案中，工作液为foxp3fixation/permeabilization工作液(用双蒸水稀释，10倍稀释，10
×
permeabilizationbuffer，现配现用)，foxp3fixation/permeabilization工作液即为foxp3固定/透化缓冲液的英文名称，permeabilizationbuffer为渗透缓冲液的英文名称，将其稀释10倍后，即为后续使用的workingsolution，workingsolution为工作液的英文名称，孵育过程中，固定破膜时间最多不超过18h，步骤s3与步骤s22的操作时间为2h，该步骤中，清洗细胞的操作与步骤s2110中的操作相同。
49.上述本技术实施例中的技术方案，至少具有如下的技术效果或优点：
50.通过构建精子特异性表达卵清蛋白(ova)抗原的转基因小鼠和应用细胞过继转移构建了一种基于流式细胞术的简单方案，用于定量分析ova免疫的小鼠的精子抗原引流淋
巴结和脾脏中的抗原特异性cd4+t细胞体内反应，该方案量化了过继转移的ova特异性tcr转基因cd4t(ot-2)细胞的分化，这种方法也可以应用于树突状细胞(dc)亚群之间的结合，以及t细胞和其它抗原提呈细胞(apc)亚群之间的其他类型的细胞间相互作用；由于该方案旨在检测皮肤引流淋巴结中细胞过继转移供体ot-2细胞和精子抗原之间的细胞分化情况，因此细胞制备程序针对淋巴结脾脏中转移的ot-2cd4t细胞进行了优化，这种基于流式细胞术的方法对于定量分析ot-2细胞的分化虽然高效，但可能需要其他基于成像的方法，如免疫组织细胞化学和成像流式细胞仪来充分验证和解释数据。例如，结合该方案的免疫细胞化学分析可提供对ot-2活化的情况进行更好地呈现。此外，该方案可以与单细胞rna测序的结合为分析特定条件下的抗原特异性t细胞相互作用细胞的分子特征提供了强大的工具。
51.以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.评价小鼠精子抗原特异性t细胞反应的方法，包括以下步骤：s1、将cd4+tot-2细胞分离富集和过继转移到经过ova精子和佐剂免疫后的野生型45.1小鼠体内；s2、对小鼠的脾脏淋巴结组织进行样品收集、酶消化以及细胞染色；s3、基于流式细胞术，对经过细胞染色后的样本进行上机分析，并对检测出的数据进行记录；s4、对记录的数据结果进行分析。2.根据权利要求1所述的评价小鼠精子抗原特异性t细胞反应的方法，其特征在于，所述s1包括以下步骤：s11、cd4+t细胞即为载体构建，构建在精子上特异性表达异种鸡卵清蛋白抗原的转基因小鼠；s12、对cd45.1小鼠进行佐剂免疫操作。3.根据权利要求2所述的评价小鼠精子抗原特异性t细胞反应的方法，其特征在于，所述s11包括以下步骤：s111、根据设计方案，设计并构建转基因载体，通过酶切和测序验证载体序列的正确性；s112、将转基因载体样品进行显微注射，将转基因载体样品显微注射到c57bl/6jgpt背景的小鼠受精卵中，然后取注射后存活的受精卵移植到假孕雌鼠体内，待其怀孕产仔；s113、对f0代小鼠进行基因鉴定，受体鼠生出的f0代小仔在5-7天剪尾及剪脚趾编号，提取基因组dna进行pcr鉴定，确认基因型；s114、对结果进行记录与分析，确保成功构建精子特异性表达ova抗原小鼠。4.根据权利要求2所述的评价小鼠精子抗原特异性t细胞反应的方法，其特征在于，所述s12包括以下步骤：s121、在ot-2细胞转染前一天，安乐死精子特异性表达ova的小鼠，用表达ova的精子细胞悬液和fca按照1：1混合乳化均匀后免疫同源性cd45.1小鼠的右后足垫，每个足垫注射量为20ul，操作时间为30秒/只；s122、从成年的雄性ova特异性t细胞受体转基因ot-2小鼠中分离cd4+t细胞，其中使用具有同源性cd45.1小鼠作为受体；s123、在异氟醚轻度麻醉下，将cd45.2供体ot-2细胞的5x106个细胞反向转移到1天前用ova和佐剂免疫的野生型cd45.1受体小鼠中。5.根据权利要求4所述的评价小鼠精子抗原特异性t细胞反应的方法，其特征在于，所述s122包括以下步骤：s1221、安乐死供体ot-2小鼠，并将脾脏和所有皮下淋巴结收集到100um的细胞过滤器中，该过滤器放置在带有2ml预冷培养基的5cm培养皿中，该所述预冷培养基为rpmi1640培养基，其中含有10％fbs；i、用3ml注射器的无菌注射器活塞将切碎的组织碎片在100um细胞过滤器的底部研磨；ii、加入2ml含有5mg/ml胶原酶d的rpmi1640消化培养基，并加入10％fbs，形成最终浓度为2.5mg/ml胶原酶d；iii、将培养皿置于5％co2培养箱中，并在37℃下培养30分钟；
s1222、将脾脏和所有淋巴结用细剪刀剪成大小为1mm的碎片；s1223、按照说明书使用分选试剂盒分选cd4t细胞；s1224、洗涤分离的ot-2细胞并将其悬浮在冰冷的磷酸盐缓冲液中，其浓度为1*107cells/ml。6.根据权利要求5所述的评价小鼠精子抗原特异性t细胞反应的方法，其特征在于：所述s122步骤中从一只ot-2小鼠中获得1x108个总脾和淋巴结细胞，其中1.5
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2.0x107个细胞通过使用试剂盒分离至纯度为90％
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95％的cd4+ot-2细胞。7.根据权利要求1所述的评价小鼠精子抗原特异性t细胞反应的方法，其特征在于，所述s2包括以下步骤：s21、对小鼠的淋巴结细胞组织进行样品收集，并对样品进行酶消化；s22、对酶消化后的细胞组织进行染色，用抗体染色细胞表面标记物。8.根据权利要求7所述的评价小鼠精子抗原特异性t细胞反应的方法，其特征在于，所述s21包括以下步骤：s211、在对小鼠进行安乐死之前，通过在24孔板的每个孔的底部放置1*1cm2的100um尼龙网；a.每孔加入200ul培养基，该培养基为含有10％fbs的rpmi1640培养基；b.根据需要准备尽可能多的孔，以便每个孔一个小鼠皮下淋巴结，收集时，将板子放在冰上；s212、在ot-2细胞转移后7天安乐死小鼠，并收集腹股沟区引流淋巴结；s213、机械破坏皮下淋巴结；a.用细剪刀将皮下淋巴结切成小块；b.用1ml注射器的柱塞将皮下淋巴结块研磨在尼龙网上，轻轻搅拌；c.用800ulrpmi1640和10％fbs清洗剪刀和柱塞，使孔内的体积为1ml；s214、消化皮下淋巴结，每孔添加10ul0.25g/ml胶原酶d，并在37℃的5％co2培养箱中培养30分钟；s215、用1ml微量移液管轻轻地向上和向下吸移孔中的培养基，收集消化的皮下淋巴结细胞悬浮液，以便皮下淋巴结组织的任何残余物将从尼龙网上分离；s216、在1.5ml管的顶部放置1x1cm2尼龙网，并使整个消化的细胞悬浮液通过网；s217、取10ul进行细胞计数，用0.6ml冰冷磷酸盐缓冲液洗涤，并使洗涤液通过尼龙网，将细胞悬浮液放在冰上；s218、在500xg4度离心5分钟，去除上清液，并通过轻轻移液将细胞重新悬浮在200ul含10％fbs的rpmi1640中，将细胞悬浮液转移至96孔v形底板；s219、在850xg4度离心2分钟，然后将上清液倾倒到水槽或废物容器中；s2110、清洗细胞；a.轻轻旋转平板；b.通过多通道移液器加入200ul/孔不含edta的磷酸盐缓冲液来清洗细胞；c.在4℃下以450xg离心5分钟；d.将上清液倒入废液容器。9.根据权利要求7所述的评价小鼠精子抗原特异性t细胞反应的方法，其特征在于，所
述s22包括以下步骤：s221、染色死细胞；a.通过轻轻涡旋开细胞沉淀使其成为单细胞悬液，并加入20ul/孔染料；b.轻轻旋转平板，使细胞悬浮；c.在冰上孵育培养板15
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30分钟；d.清洗细胞；s222、染色细胞表面标记物；a.加入10ul/孔fc封闭液；b.通过轻轻涡旋悬浮细胞；c.在冰上孵育15分钟；d.在不洗涤的情况下，加入10ul/孔细胞表面染色抗体混合物；e.通过轻轻涡旋使细胞悬浮；f.在冰上放置培养板15
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30分钟；g.清洗细胞。10.根据权利要求1所述的评价小鼠精子抗原特异性t细胞反应的方法，其特征在于，所述s3包括以下步骤：s31、现用现配工作液，每个反应加入100μlworkingsolution，充分重悬细胞后，避光4℃孵育1h，用双蒸水现用现配1
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permeabilizationbuffer，并用此溶液配制胞内流式染色抗体混合物，其中包括转录因子和相关细胞因子抗体，反应体系为100μl，抗体按照1:200稀释，充分混匀后待用；s32、给步骤s31中固定破核的细胞悬液加入500μl1
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permeabilization buffer，700
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g、4℃离心5min，去除上清后得到细胞沉淀；s33、用100μl的抗体混合物重悬细胞，充分混匀后置于4℃避光孵育40min；s34、反应结束后清洗细胞，最后用200～300μl流式染色缓冲液重悬，通过使细胞悬浮液通过一小块尼龙网过滤细胞，并将其收集到5ml圆底聚苯乙烯管中。

技术总结
本发明公开了评价小鼠精子抗原特异性T细胞反应的方法，涉及抗原特异性T细胞技术领域。该评价小鼠精子抗原特异性T细胞反应的方法，通过构建精子特异性表达卵清蛋白(OVA)抗原的转基因小鼠和应用细胞过继转移构建了一种基于流式细胞术的简单方案，用于定量分析OVA免疫的小鼠的精子抗原引流淋巴结和脾脏中的抗原特异性CD4+T细胞体内反应，该方案量化了过继转移的OVA特异性TCR转基因CD4T(OT-2)细胞的分化，这种方法也可以应用于树突状细胞(DC)亚群之间的结合，以及T细胞和其它抗原提呈细胞(APC)亚群之间的其他类型的细胞间相互作用。用。用。


技术研发人员：段永刚 曾群雄 杨宸 刘金川
受保护的技术使用者：香港大学深圳医院
技术研发日：2023.07.25
技术公布日：2023/10/11