软木花椒素在制备治疗类风湿关节炎的药物中的应用

1.本发明属于药物领域，具体涉及软木花椒素在制备治疗类风湿关节炎的药物中的应用。


背景技术：

2.类风湿关节炎(rheumatoidarthritis，ra)是一种以慢性、侵袭性关节炎为主要表现的自身免疫病。未经正规治疗，可导致关节畸形、功能丧失。ra分布于世界各地，不同人群中发病率亦不相同，大约为0.18%-1.07%不等。在我国，ra患病率为0.28%-0.36%。ra在各个年龄段均可发病，又以30岁-50岁最为常见，男女患病比例约为1:3。ra是风湿免疫领域的治疗难点，目前通常使用的药物存在一定的局限性，患者在服用后可能会出现药物应答不良、耐药或严重不良反应，从而不能有效改善患者预后。而另一方面相应的生物制剂由于其高昂的价格而在使用方面受到了一定的限制。
3.软木花椒素（suberosin）的分子式为c
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o3，分子量为244.29。既往研究报道软木花椒素可以通过调节nf-at和nf-κb，抑制pha-诱导的pbmc细胞增殖并捕获细胞周期g1过渡到s期，具有抗炎和抗血凝的活性；在乳腺癌中，软木花椒素可以放大放疗的治疗效果，促进癌细胞死亡。


技术实现要素：

4.为了解决现有技术存在的问题，本发明提供了一种软木花椒素在制备治疗类风湿关节炎的药物中的应用。
5.本发明还提供一种软木花椒素在制备降低炎症因子il-6和/或il-1β的药物中的应用。
6.本发明还提供一种软木花椒素在制备降低mmp13和/或mmp3的mrna表达的药物中的应用。
7.本发明还提供一种软木花椒素在制备抑制bmdm向促炎m1巨噬细胞极化的药物中的应用。
8.本发明还提供一种软木花椒素在制备促进bmdm向抑炎m2巨噬细胞极化的药物中的应用。
9.本发明还提供一种软木花椒素在制备抑制fls增殖的药物中的应用。
10.优选地，所述软木花椒素的浓度为0.1nm。
11.本发明还提供一种软木花椒素在制备抑制fls炎性表达的药物中的应用。
12.优选地，所述软木花椒素的浓度为0.1nm。
13.优选地，所述的药物是以软木花椒素为原料，加入医学上可接受的辅料或者辅助性成分，制备而成的口服制剂；和/或，所述口服制剂为片剂、胶囊剂、控释制剂和缓释制剂。
14.本发明的有益效果为：
本发明以胶原诱导的关节炎小鼠模型和小鼠骨髓来源巨噬细胞作为研究对象，观察软木花椒素对类风湿关节炎的治疗作用。实验证明：（1）口服软木花椒素（0.5mg/kg/d），能够明显抑制胶原诱导关节炎小鼠关节发生炎症；（2）软木花椒素对巨噬细胞的极化具有调节作用，促进巨噬细胞向抑炎性m2极化，抑制其向促炎性m1极化。基于以上研究结果，本发明证实了软木花椒素具有治疗类风湿关节炎的功效，可用于制备治疗类风湿关节炎等炎症性疾病的药物，从而拓宽了类风湿关节炎患者的治疗选择。
附图说明
15.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
16.图1是各组小鼠的关节红肿情况图。
17.图2是各组小鼠关节炎评分结果图。
18.图3是he染色图；其中：图3中的a为三组小鼠的膝关节he染色图；图3中的b为三组小鼠的组织评分数据图。
19.图4是各组小鼠关节组织内部分炎症因子和mmps家族的mrna表达水平结果图。
20.图5是软木花椒素干预下，inos与il-6的mrna表达结果图；其中，*代表各组与m0组进行统计学分析，#代表各组与m1组进行统计学分析，*表示p《0.05，**表示p《0.005，***表示p《0.0005；#表示p《0.05，##表示p《0.005，###表示p《0.0005。“ns”即为no significance，表示无统计学差异。
21.m0为m0型巨噬细胞，是巨噬细胞未受激活的、不成熟的状态，m0巨噬细胞是炎症反应的起始点。
22.m1为m1型巨噬细胞，是促炎型巨噬细胞。
23.图6是软木花椒素干预下，arg-1与cd206的mrna表达结果图；其中，其中，*代表各组与m0组进行统计学分析，#代表各组与m2组进行统计学分析，*表示p《0.05，**表示p《0.005，***表示p《0.0005；#表示p《0.05，##表示p《0.005，###表示p《0.0005。
24.m0为m0型巨噬细胞，是巨噬细胞未受激活的、不成熟的状态，m0巨噬细胞是炎症反应的起始点。
25.m2为m2型巨噬细胞，是抗炎型巨噬细胞。
26.图7是软木花椒素抑制tnf-a导致的fls增殖结果图；其中，*代表各组与blank进行统计学分析，#代表各组与tnf-a组进行统计学分析，*表示p《0.05，**表示p《0.005，***表示p《0.0005，****表示p《0.0001；#表示p《0.05，##表示p《0.005，###表示p《0.0005，####表示p《0.0001。
27.图8是软木花椒素抑制tnf-a导致的fls炎性表达结果图；其中，*代表各组与blank进行统计学分析，#代表各组与tnf-a组进行统计学分析，*表示p《0.05，**表示p《0.005，***表示p《0.0005，****表示p《0.0001；#表示p《0.05，##表示p《0.005，###表示p《0.0005，####表示p《0.0001。
具体实施方式
28.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
29.实施例1：软木花椒素对cia小鼠的影响（1）动物造模：健康dba/1j小鼠，雄性，spf级，8~10周龄，适应性饲养7d，进行造模：第0天(初次免疫)于小鼠尾根部皮内注射鸡ii型胶原和完全弗氏佐剂组成的乳化剂100ul/只。在冰浴环境中，取2.5ml混匀的完全弗式佐剂(含结核杆菌5mg/ml)于8ml玻璃瓶中，开启电磁搅拌器（150r/min）将鸡ii型胶原缓慢滴入完全弗式佐剂，乳化30~60分钟，乳化至乳化液滴入水中不散开即可。小鼠腹腔注射100μl 0.3%戊巴比妥钠，待小鼠麻醉成功后，从小鼠尾部皮下距尾巴根部1.5~2cm处注射100μl乳化剂，注意不能流出来。初次免疫后的第21天对小鼠进行加强免疫。将鸡ii型胶原按照上述步骤与不完全弗式佐剂乳化成功，然后在小鼠的尾根部皮下注入100μl乳化剂。
30.（2）分组与给药：将dba/1j小鼠随机分成正常组、模型组、软木花椒素（suberosin）治疗组 (0.5mg /kg/d），每组6~7只，从初次免疫后的第21天开始给药，连续给药21d，软木花椒素灌胃给药，给药体积为0.1ml/20g；正常组和模型组每天灌等体积溶剂，给药体积均为0.1ml/20g。
31.（3）取材：给药结束后小鼠眼球取血，收集小鼠血浆，离心后取上清为血清，-80℃保存，用于后续检测；取各组小鼠右侧膝、踝关节，剔除周围软组织，于4%多聚甲醛固定48h后，置于10%edta脱钙液中脱钙。取各组小鼠左侧踝关节一分为二，分别提取rna和蛋白，用于后续检测。
32.（4）药效指标检测：（4-1）关节炎指数：造模成功后，每2天记录一次关节炎评分。关节炎评分标准：0=正常，1=踝/腕关节或者1个指头红肿轻度肿胀，2=由踝/腕关节至手/足掌或超过2个指头轻度肿胀，3=从踝/腕关节至手/足掌和手指中度肿胀，4=整个踝/腕关节，手/足掌和手指肿胀。
33.（4-2）膝关节he染色：将拍照的图片采用下述评分标准进行统计分析，每只小鼠的最终得分是以下四个方面的总和，总分为12分。（i）炎性细胞浸润：0分=无；1分=1个白细胞聚集物或较少分散的白细胞浸润；2分=2个及以上的白细胞聚集物；3分=白细胞融合、分散浸润明显。（ii）滑膜细胞增殖：0分=无；1分=2~4层滑膜细胞；2分=4层以上滑膜细胞；3分=侵袭软骨和骨，关节间隙消失。（iii）血管翳：0分=无改变；1分=2个部位出现；2分=4个部位出现血管翳伴软骨表面侵蚀；3分=4个以上部位或2个部位出现大范围。（iv）骨质侵蚀：0分=正常；1分=1~2个小的浅部位；2分=1~4个中等大小和深度部位；3分=5个以上，局部侵蚀到骨皮质。
34.（4-3）qrt-pcr检测小鼠关节中炎症因子和mmps家族的mrna表达水平：将小鼠踝关节组织从液氮中取出置于冰上，在研磨管中加入研磨珠和1 ml trizol 试剂，将组织剪碎装入研磨管中在4℃条件下进行组织匀浆。将研磨好的组织液在4℃条件下12000 g/分离心5分钟，将上清转移至无酶1.5 ml ep管中置于冰上，加入200 μl氯仿，混匀后冰上放置5分
钟，4℃条件下12000 g/分离心15分钟，将上清液转移至新的无酶ep管中，加入等量的异丙醇，混匀后冰上放置10分钟，4℃条件下12000 g/分离心10分钟，弃上清，加入75%乙醇吹起沉淀，4℃条件下12000 g/分离心5分钟后，弃上清，超净台中晾3-5分钟至无液体，加入一定量的rnanase free水重悬rna，置于冰上，检测rna浓度。随后进行逆转录和qrt-pcr检测il-1β、il-6、il-8、mmp
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1、mmp-3、mmp-9、mmp-13的mrna表达水平。
35.本实施例通过建立胶原诱导关节炎小鼠经典模型（cia小鼠模型），给予软木花椒素治疗，评价软木花椒素对cia小鼠模型的药效作用。结果发现：（i）软木花椒素可减轻cia模型小鼠的关节红肿表现：在二次免疫后的1w（即1 week，1周，下同），cia小鼠足爪出现肿胀，日常活动减少；在二次免疫后的2w（2周），cia小鼠足爪达到肿胀高峰，足爪以及踝关节肿胀明显。与模型组比较，suberosin干预后小鼠关节肿胀程度明显减轻，具体如图1所示。
36.（ii）软木花椒素对cia模型小鼠关节炎评分的影响：与正常对照组（正常组关节不肿胀，评分均为0）相比，cia模型组小鼠的关节炎评分明显升高，与模型对照组比较，suberosin治疗组可显著降低cia模型小鼠关节炎评分，具体如图2所示。同时，如图3所示，在he染色中可以发现suberosin可以减少炎细胞浸润、滑膜细胞增殖、骨侵蚀和血管翳生成，更具体的：图3中的a为三组小鼠的膝关节he染色，与正常组相比，模型组中小鼠的滑膜增厚，关节面骨侵蚀，有大量炎细胞浸润和血管翳生成；而软木花椒素治疗组中cia小鼠的滑膜未增厚，炎细胞浸润和血管翳减少，关节面侵蚀显著缓解。结合图3中的b可知，通过组织评分定量分析显示软木花椒素治疗cia小鼠有效。
37.（iii）软木花椒素对cia模型小鼠关节组织内部分炎症因子和mmps家族的mrna表达水平的影响：与正常对照组相比，cia模型组小鼠的关节组织内炎症因子和mmps家族的mrna表达水平明显升高，与模型对照组比较，suberosin治疗组可显著降低cia模型小鼠关节组织内部分炎症因子（il-6和il-1β）和mmps家族（mmp13和mmp3）的mrna表达水平，具体如图4所示。
38.实施例2：软木花椒素对骨髓来源的巨噬细胞（bmdm）极化的影响（1）小鼠骨髓来源的巨噬细胞（bmdm）的提取：取8-10周c57bl/6小鼠，0.3%戊巴比妥钠麻醉后断头法处死，取出双后肢。去掉皮肤和从踝关节处分离去掉后爪后，放于装有无菌pbs的50ml离心管中，将离心管放于无菌操作台中并在无菌环境中剥离肌肉组织和筋膜，取出完整的股骨和胫骨。将股骨和胫骨的两端剪开，将一个股骨和一个胫骨放于一个底部扎有小孔的200μl无菌pcr管中，再将pcr管放入无菌的1.5ml的ep管中，向pcr管中加入200μl的pbs，盖好盖子后使用封口胶缠紧，10000rpm离心1分钟。收集1.5ml大离心管中的细胞沉渣，用pbs重悬吹散，过70μm筛。1000rpm离心3分钟。弃上清。加入5ml红细胞裂解液，室温放置4-5分钟.加入5ml pbs，1000rpm离心3分钟。弃上清，用含有20ng/ml m-csf的dmem完全培养基重悬并种板。种板当天为第1天，第5天更换新鲜含有m-csf(20ng/ml)的dmem完全培养基。换液后第3天bmdm分化完成，用于实验。
39.（2）分组与给药：分组如下：m0组、m1极化组、m2极化组、m1极化+不同浓度suberosin组(0.1nm、1nm)、m2极化+不同浓度suberosin组(0.1nm、1nm)。
40.更具体的：m0组不加任何干预因素，m1极化组给予250ng/ml的lps和25ng/ml的ifn-γ；m2极化组给予20ng/ml的il-4；m1极化+不同浓度suberosin组同时加入250ng/ml的
lps和25ng/ml的ifn-γ以及不同浓度的suberosin；m2极化+不同浓度suberosin组同时加入20ng/ml的il-4以及不同浓度的suberosin。刺激24小时后提取细胞rna逆转录后进行rt-qpcr。
41.（3）rt-qpcr检测bmdm细胞极化指标的表达：各组细胞经干预后，使用试剂盒提取细胞总rna，接着使用紫外分光光度计检测rna的纯度及浓度。按逆转录试剂盒进行逆转录，获得cdna后，采用rt-qpcr仪检测m1极化指标il-6、inos，m2极化指标arg、cd206，管家基因gapdh的表达水平。以gapdh为内参，结果以目的基因与gapdh的比值表示。
42.本实施例的结果显示：（i）suberosin显著抑制bmdm向m1极化：本试验通过构建lps和ifn-γ诱导促炎m1巨噬细胞模型，给予不同浓度的suberosin，检测m1巨噬细胞相关指标il-6、inos在mrna水平的表达。结果发现：不同浓度的suberosin都可以降低bmdm向促炎m1巨噬细胞极化，具体如图5所示。
43.（ii）suberosin显著促进bmdm向m2极化：本试验通过构建il-4诱导抑炎m2巨噬细胞模型，给予不同浓度的suberosin，检测m2巨噬细胞相关指标arg、cd206在mrna水平的表达。结果发现：不同浓度的suberosin都可以促进bmdm向抑炎m2巨噬细胞极化，具体如图6所示。
44.实施例3：软木花椒素对成纤维样滑膜细胞（fls）增殖和炎性表达的影响（1）fls增殖实验：取对数期生长的ra患者来源的fls种于96孔板，每孔5000个细胞，12小时后，细胞贴壁，更换培养基，分别加入dmem完全培养基、25ng/ml tnf-a+dmem完全培养基、25ng/ml tnf-a+dmem完全培养基+0.01nm suberosin、25ng/ml tnf-a+dmem完全培养基+0.1nm suberosin、25ng/ml tnf-a+dmem完全培养基+1nm suberosin、25ng/ml tnf-a+dmem完全培养基+10nm suberosin，每孔100μl。在24、48和72h三个时间点分别取出96孔培养板，弃上清，每孔避光加入90μl dmem完全培养基+10μl cck8试剂，细胞培养箱中孵育2小时后在450nm处进行读板。
45.（2）fls炎性表达实验：将fls种于6孔板，待细胞密度达到70%时，更换dmem完全培养基，除空白组，每孔依次加入25ng/ml tnf-a、25ng/ml tnf-a+0.01nm suberosin、25ng/ml tnf-a+0.1nm suberosin、25ng/ml tnf-a+1nm suberosin、25ng/ml tnf-a+10nm suberosin，24小时后收集细胞，提取rna，逆转录为cdna，进行qrt-pcr检测il-6、tnf-a、mmp-1、mmp-3、mmp-9、mmp-13的mrna水平表达情况。
46.本实施例的结果显示：（i）软木花椒素抑制tnf-a导致的fls增殖：本实施例通过构建tnf-a诱导fls细胞模型，给予不同浓度的suberosin，检测fls在不同时间点的增殖效应。结果发现：不同浓度的suberosin都可抑制fls的增殖，尤其是在0.1nm浓度时，具体如图7所示。
47.（ii）软木花椒素抑制tnf-a导致的fls炎性表达：本试验通过构建tnf-a诱导fls细胞模型，给予不同浓度的suberosin，检测fls表达tnf-a、il-6、mmp-1、mmp-3、mmp-9和mmp-13的表达情况。结果发现：不同浓度的suberosin都可抑制fls的炎性表达，尤其是在0.1nm浓度时，具体如图8所示。
48.以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵
盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

技术特征：
1.软木花椒素在制备治疗类风湿关节炎的药物中的应用。2.软木花椒素在制备降低炎症因子il-6和/或il-1β的药物中的应用。3.软木花椒素在制备降低mmp13和/或mmp3的mrna表达的药物中的应用。4.软木花椒素在制备抑制bmdm向促炎m1巨噬细胞极化的药物中的应用。5.软木花椒素在制备促进bmdm向抑炎m2巨噬细胞极化的药物中的应用。6.软木花椒素在制备抑制fls增殖的药物中的应用。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述软木花椒素的浓度为0.1nm。8.软木花椒素在制备抑制fls炎性表达的药物中的应用。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述软木花椒素的浓度为0.1nm。10.根据权利要求1~9任一项所述的应用，其特征在于，所述的药物是以软木花椒素为原料，加入医学上可接受的辅料或者辅助性成分，制备而成的口服制剂；和/或，所述口服制剂为片剂、胶囊剂、控释制剂和缓释制剂。

技术总结
本发明属于药物领域，具体涉及软木花椒素在制备治疗类风湿关节炎的药物中的应用。本发明通过饲管给药法来研究软木花椒素对鸡II型胶原诱导的小鼠关节炎(CIA)模型的治疗作用，通过比较各组动物关节肿胀程度、病理变化以及关节组织中各炎症因子的表达情况评价软木花椒素对CIA小鼠的治疗作用。此外通过体外滑膜细胞炎症模型，观测软木花椒素对致炎细胞因子表达水平的作用，以及软木花椒素对骨髓来源的巨噬细胞极化的影响，从而证实软木花椒素对类风湿关节炎具有明显的治疗作用，亦拓宽了类风湿关节炎患者的治疗选择。湿关节炎患者的治疗选择。湿关节炎患者的治疗选择。


技术研发人员：刘欢 李芊蔚 谢其冰 尹耕
受保护的技术使用者：四川大学华西医院
技术研发日：2023.09.04
技术公布日：2023/10/11