一种苦参碱衍生物纳米颗粒及其制备方法和应用

1.本发明属于医药技术领域，尤其涉及一种苦参碱衍生物纳米颗粒及其制备方法和应用。


背景技术：

2.天然产物具有广泛的生物活性和较低的毒性，因此作为抗癌药物被广泛研究。苦参碱是从苦参根中分离得到的关键四环喹啉嗪类生物碱之一，具有多种药理作用，如镇静、抗炎、免疫调节、抗病毒、抗肿瘤。苦参碱的大规模应用包括其用于癌症的治疗。多项研究证实，苦参碱对胃癌、肝癌、白血病k-562、肺癌、宫颈癌具有抗癌活性。前期研究已证实苦参碱可以抑制hepg 2肝癌细胞增殖及迁移。此外，苦参碱对肝癌的抑制作用已经应用于临床，有体外研究认为，不同的苦参碱衍生物对不同的肝癌细胞有特异性，期间更深层的机制可能是通过细胞外调剂蛋白激酶(erk)信号通路实现。
3.但是，苦参碱在体内和体外具有明显的肝毒性和神经毒性。此外，其生物利用度比较低。纳米颗粒是将药物吸附或包裹制成的一种亚微粒给药系统，具有载药量高、稳定性好、生物可降解性等优点。大量研究表明纳米乳可明显改善药物的溶解性能、维持药物稳定、增强机体吸收，进而提高其口服生物利用度，此外，纳米制剂递送药物还存在靶向和缓释作用。可起到增效减毒的效果。纳米乳剂载药系统近年来备受药物制剂领域工作者们的青睐，作为一种极具市场潜力的新兴技术，其具有广阔的应用前景。因此，制备苦参碱类纳米药物对于抗肿瘤的研究具有重要意义。


技术实现要素：

4.针对上述现有技术中存在的问题，本发明提出了一种苦参碱衍生物纳米颗粒及其制备方法和应用。由于纳米粒子粒径均一稳定，可顺利进入细胞，抑制肿瘤细胞的增殖。
5.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
6.一种苦参碱衍生物，其结构式为：
[0007][0008]
本发明还提供一种所述的苦参碱衍生物的制备方法，包括以下步骤：
[0009]
1)将五甘醇溶解于二氯甲烷中，然后依次加入对甲苯磺酰氯和氢氧化钾粉末，反应结束后，萃取除杂，得到化合物1(3,6,9,12-四氧-1,14-二(4-甲基)苯磺酸酯基-十四烷)；
[0010]
2)在化合物1中加入叠氮化钠并进行油浴反应，得到化合物2(1,14-叠氮-3,6,9,
12-四氧十四烷)；
[0011]
3)将化合物2与三苯基膦混合，室温下反应，调节ph至14后萃取，得到化合物3(14-叠氮-3,6,9,12-四氧十四胺)；
[0012]
4)在化合物3中加入沙利度胺、n，n-二异丙基乙胺和n，n-二甲基甲酰胺，油浴反应，得到化合物4(4-((14-叠氮-3,6,9,12-四氧十四烷基)氨基)-2-(2,6-二氧代-3-哌啶基)异吲哚-1,3-二酮)；
[0013]
5)以苦参碱为原料，以二异丙基胺基锂(lda)为碱，脱掉苦参碱中酰胺的α位氢，然后直接和二苯基二硫醚发生亲核取代反应得到化合物14-苯硫基苦参碱，经过水相中邻碘酰苯甲酸(ibx)氧化得到化合物14-苯亚磺酰基苦参碱，在碳酸钾的作用下消去苯次磺酸得化合物5(槐果碱)；
[0014]
将化合物5和甘氨酸溶解于水中，加热反应，重结晶，得到化合物6(15-胺基乙酸基苦参碱)；
[0015]
将boc-l-酪氨酸甲酯、n，n-二甲基甲酰胺溶液和碳酸钾混合，室温下搅拌，加入炔丙基溴，室温下反应，反应结束后进行萃取，得到化合物7(2-((叔丁氧基羰基)胺基)-3-(4-(2-丙炔基-1-氧基)苯基)丙酸甲酯)；
[0016]
将化合物7置于盐酸乙酸乙酯溶液，室温下搅拌过夜，反应完成后除去溶剂，得到化合物8(2-氨基-3-(4-(2-丙炔基-1-氧基)苯基)丙酸甲酯)；
[0017]
将化合物6和化合物8溶于无水二氯甲烷中，依次加入edci、hobt和dipea，室温下反应完成后进行萃取除杂，得到化合物9(15-((2-(2-胺基乙酸基)胺基)-3-(4-(2-丙炔基-1-氧基)苯基)丙酸甲酯基)苦参碱)；
[0018]
6)将化合物4和化合物9溶于四氢呋喃溶液中，室温下搅拌，得到反应液；
[0019]
将硫酸铜和抗坏血酸钠溶解在水中，震荡摇匀后溶液颜色变成棕色；
[0020]
将棕色水溶液滴加到反应液中，室温下搅拌，得到苦参碱衍生物lst-4。
[0021]
本发明还提供一种苦参碱衍生物纳米颗粒，利用所述的苦参碱衍生物自组装形成球状纳米分子，即苦参碱衍生物纳米颗粒。
[0022]
本发明还提供一种苦参碱衍生物纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：将苦参碱衍生物溶解于乙腈中，得到的溶液注入超纯水中，在氮气氛围下超声处理，得到苦参碱衍生物纳米颗粒。
[0023]
本发明还提供一种所述的苦参碱衍生物纳米颗粒在制备抗肿瘤药物方面的应用。
[0024]
与现有技术相比，本发明具有如下优点和技术效果：
[0025]
本发明反应条件温和，纳米粒子粒径均一稳定。所述材料苦参碱衍生物纳米颗粒lst-4nps可顺利进入细胞，抑制肿瘤细胞的增殖。lst-4nps进入细胞后，聚集在溶酶体，提高了药物的生物利用度；lst-4nps与lst-4相比，增强了epr效应，在肿瘤治疗方面，lst-4nps具有更好的治疗效果。
附图说明
[0026]
构成本技术的一部分的附图用来提供对本技术的进一步理解，本技术的示意性实施例及其说明用于解释本技术，并不构成对本技术的不当限定。在附图中：
[0027]
图1为lst-4的紫外可见分光光谱分析；
[0028]
图2为lst-4在250到350nm波段中最大吸收波长(λ
max
)处不同浓度的吸光度随浓度变化的线形关系图；
[0029]
图3为lst-4的荧光光谱分析；
[0030]
图4为lst-4在发射波长(λ
em
)处不同浓度的荧光强度随浓度变化的线形关系图；
[0031]
图5为lst-4nps在体外的可视化荧光成像图；
[0032]
图6为lst-4nps在不同浓度处的相对荧光强度；
[0033]
图7为lst-4nps的tem分析；
[0034]
图8为lst-4nps的粒径分析；
[0035]
图9为lst-4nps的电位分析；
[0036]
图10为lst-4的细胞毒性；
[0037]
图11为lst-4nps的细胞毒性；
[0038]
图12为lst-4nps的细胞摄取；
[0039]
图13为lst-4nps的亚细胞定位；
[0040]
图14为lst-4nps的纳米自组装示意图。
具体实施方式
[0041]
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
[0042]
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
[0043]
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
[0044]
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本技术说明书和实施例仅是示例性的。
[0045]
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
[0046]
本发明中所述的“室温”如无特别说明，均按25
±
2℃计。
[0047]
本发明以下实施例所用原料均为市售所得。
[0048]
一种苦参碱衍生物，其结构式为：
[0049][0050]
苦参碱衍生物lst-4按以下反应路线制备：
[0051]
[0052][0053]
具体lst-4的合成路线为：
[0054]
1)在0℃冰浴条件下，将五甘醇(3.57g，15mmol，1eq)溶解于二氯甲烷(100ml)中，充分溶解后加入对甲苯磺酰氯(5.72g，30mmol，2eq)，搅拌均匀，然后加入粉末状氢氧化钾(6.72g，120mmol，8eq)，反应3h。反应结束后，向体系中加(100ml)冰水，再加入二氯甲烷进行萃取，有机层用无水硫酸钠干燥。静置后，使用旋转蒸发仪蒸干溶剂，得到化合物1。
[0055]
2)将化合物1(5.64g，10mmol，1eq)溶解于20ml的dmf中，搅拌至完全溶解，加入叠氮化钠(1.43g，22mmol，2.2eq)，在60℃的油浴下反应4h。tlc监测反应完成后，加入20ml水淬灭，用乙酸乙酯萃取反应混合物，有机层用饱和食盐水洗涤一次，然后加入无水硫酸钠干燥，静置过夜。使用旋转蒸发仪蒸干溶剂，得到化合物2。
[0056]
3)向化合物2(2.30g，8mmol，1eq)中加入无水乙醚∶四氢呋喃∶1mol/l盐酸(10ml∶8ml∶2ml)溶液，然后称取三苯基膦(2.14g，8mmol，1eq)并缓慢加入其中，搅拌，室温下反应12h。tlc监测反应完成后，加入4mol/l盐酸至溶液呈酸性(ph＝6)。用乙酸乙酯洗涤反应混合物，向水层中加入氢氧化钠至ph＝14，然后再用二氯甲烷萃取化合物，有机层用饱和食盐水洗涤一次。然后加入无水硫酸钠干燥，静置过夜。使用旋转蒸发仪蒸干溶剂，得到化合物3。
[0057]
4)向化合物3(0.79g，3mmol，1eq)中加入沙利度胺(0.83g，3mmol，1eq)、n，n-二异丙基乙胺(0.66g，5.1mmol，1.7eq)以及8ml的n，n-二甲基甲酰胺，搅拌，在90℃的油浴锅中反应4h。tlc监测反应完成后，加入8ml水淬灭，用乙酸乙酯萃取反应混合物，有机层用饱和食盐水洗涤一次，然后加入无水硫酸钠干燥，静置过夜。使用旋转蒸发仪蒸干溶剂，浓缩后用硅胶柱层析纯化，洗脱剂为石油醚和乙酸乙酯，二者体积比为：6∶1，得到化合物4。
[0058]
5)向烧瓶中加入70ml四氢呋喃、5.0ml二异丙胺、16.1ml(38.9mmol)正丁基锂的正己烷溶液(2.4mol/l)，体系在氩气保护下，温度为-78℃，搅拌15min后向烧瓶中加入4.0g(16.1mmol)苦参碱和3.6g(16.4mmol)二苯二硫醚的四氢呋喃溶液(30ml)，升至室温，搅拌2h后，向体系中加入50ml饱和碳酸钠溶液，分液，水相用乙酸乙酯萃取，有机相用饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，除去溶剂，得到化合物5。
[0059]
6)将化合物5(0.31g，1.25mmol，1eq)和甘氨酸(0.19g，2.5mmol，2eq)溶解于水中
(2.0ml)中，搅拌，80℃反应12h，tlc监测反应完成后，减压蒸干溶剂。用乙醇-水体系进行重结晶，得到化合物6。
[0060]
7)将boc-l-酪氨酸甲酯(5.90g，20mmol，1eq)溶于15ml的n，n-二甲基甲酰胺溶液中，溶解后加入碳酸钾(5.53g，40mmol，2eq)，室温搅拌10min后，加入炔丙基溴(4.76g，40mmol，2eq)，室温下反应6h。tlc监测反应结束后，用200ml饱和氯化钠溶液和200ml乙酸乙酯溶液进行萃取，有机层用无水硫酸钠干燥，静置浓缩后采用硅胶柱层析纯化，洗脱剂为石油醚和乙酸乙酯，二者体积比为：5∶1，得到化合物7。
[0061]
8)将化合物7置于盐酸乙酸乙酯溶液(体积比为1：1)，室温搅拌下过夜，去除boc基团。采用薄层色谱法检测反应结果。当反应完成后，除去溶剂，得到化合物8，为白色固体，直接用于下一步反应。
[0062]
9)在0℃的条件下，将化合物6(0.32g，1mmol，1eq)和化合物8(0.23g，1mmol，1eq)溶于50ml无水二氯甲烷中，溶解后，依次加入edci(0.23g，1.2mmol，1.2eq)、hobt(0.16g，1.2mmol，1.2eq)和dipea(0.16g，1.2mmol，1eq)。20min后，将反应置于室温条件下搅拌过夜。采用薄层色谱法检测反应结果。反应完成后，向反应液中加入50ml二氯甲烷和50ml饱和碳酸氢钠水溶液，进行萃取并除去杂质。有机相用50ml饱和氯化钠水溶液洗涤，有机层用无水硫酸钠干燥。静置后，用旋转蒸发器除去溶剂。用硅胶柱层析纯化，洗脱剂为二氯甲烷和甲醇，体积比为20∶1，得到相应的酰胺产物，为化合物9。
[0063]
10)将化合物4(0.26g，0.5mmol，1eq)和化合物9(0.27g，0.5mmol，1eq)溶于2ml的四氢呋喃溶液中，在室温下搅拌反应混合物。将硫酸铜(0.15g，0.5mmol，1eq)和抗坏血酸钠(0.20g，1mmol，2eq)溶解在0.5ml水中，震荡摇匀后溶液颜色变成棕色，将棕色水溶液滴加到含有四氢呋喃反应液中，室温下搅拌10h。采用薄层色谱法检测反应结果。反应完成后，用旋转蒸发器去除溶剂。用硅胶柱层析纯化，洗脱剂为二氯甲烷和甲醇，体积比为：15∶1，得到黄色固体，即产物苦参碱衍生物lst-4。
[0064]
本发明还提供一种苦参碱衍生物纳米颗粒，利用所述的苦参碱衍生物自组装形成球状纳米分子，即苦参碱衍生物纳米颗粒lst-4nps。
[0065]
上述lst-4和lst-4nps对hepg 2细胞产生细胞毒性作用，并发现lst-4nps可显著增强对hepg 2的毒性作用。
[0066]
本发明还提供一种苦参碱衍生物纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：将苦参碱衍生物溶解于乙腈中作为母液，通过移液枪将母液缓慢地注入超纯水中，在氮气氛围下超声处理，得到苦参碱衍生物纳米颗粒。
[0067]
本发明还提供一种所述的苦参碱衍生物纳米颗粒在制备抗肿瘤药物方面的应用。
[0068]
以下实施例作为本发明技术方案的进一步说明。
[0069]
实施例1
[0070]
lst-4的合成：
[0071]
1)在0℃冰浴条件下，将五甘醇(3.57g，15mmol，1eq)溶解于二氯甲烷(100ml)中，充分溶解后加入对甲苯磺酰氯(5.72g，30mmol，2eq)，搅拌均匀，然后加入粉末状氢氧化钾(6.72g，120mmol，8eq)，反应3h。反应结束后，向体系中加100ml冰水，再加入二氯甲烷进行萃取，有机层用无水硫酸钠干燥。静置后，使用旋转蒸发仪蒸干溶剂，得到化合物1。
[0072]
2)将化合物1(5.64g，10mmol，1eq)溶解于20ml的dmf中，搅拌至完全溶解，加入叠
氮化钠(1.43g，22mmol，2.2eq)，在60℃的油浴下反应4h。tlc监测反应完成后，加入20ml水淬灭，用乙酸乙酯萃取反应混合物，有机层用饱和食盐水洗涤一次，然后加入无水硫酸钠干燥，静置过夜。使用旋转蒸发仪蒸干溶剂，得到化合物2。
[0073]
3)向化合物2(2.30g，8mmol，1eq)中加入无水乙醚∶四氢呋喃∶1mol/l盐酸(10ml∶8ml∶2ml)溶液，然后称取三苯基膦(2.14g，8mmol，1eq)并缓慢加入其中，搅拌，室温下反应12h。tlc监测反应完成后，加入4mol/l盐酸至溶液呈酸性(ph＝6)。用乙酸乙酯洗涤反应混合物，向水层中加入氢氧化钠至ph＝14，然后再用二氯甲烷萃取化合物，有机层用饱和食盐水洗涤一次。然后加入无水硫酸钠干燥，静置过夜。使用旋转蒸发仪蒸干溶剂，得到化合物3。
[0074]
4)向化合物3(0.79g，3mmol，1eq)中加入沙利度胺(0.83g，3mmol，1eq)、n，n-二异丙基乙胺(0.66g，5.1mmol，1.7eq)以及8ml的n，n-二甲基甲酰胺，搅拌，在90℃的油浴锅中反应4h。tlc监测反应完成后，加入8ml水淬灭，用乙酸乙酯萃取反应混合物，有机层用饱和食盐水洗涤一次，然后加入无水硫酸钠干燥，静置过夜。使用旋转蒸发仪蒸干溶剂，浓缩后用硅胶柱层析纯化，洗脱剂为石油醚和乙酸乙酯，体积比为：6∶1，得到化合物4。
[0075]
5)向烧瓶中加入70ml四氢呋喃、5.0ml二异丙胺、16.1ml(38.9mmol)正丁基锂的正己烷溶液(2.4mol/l)，体系在氩气保护下，温度为-78℃，搅拌15min后向烧瓶中加入4.0g(16.1mmol)苦参碱和3.6g(16.4mmol)二苯二硫醚的四氢呋喃溶液(30ml)，升至室温，搅拌2h后，向体系中加入50ml饱和碳酸钠溶液，分液，水相用乙酸乙酯萃取，有机相用饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，除去溶剂，得到化合物5。
[0076]
6)将化合物5(0.31g，1.25mmol，1eq)和甘氨酸(0.19g，2.5mmol，2eq)溶解于水中(2.0ml)中，搅拌，80℃反应12h，tlc监测反应完成后，减压蒸干溶剂。用乙醇-水体系进行重结晶，得到化合物6。
[0077]
7)将boc-l-酪氨酸甲酯(5.90g，20mmol，1eq)溶于15ml的n，n-二甲基甲酰胺溶液中，溶解后加入碳酸钾(5.53g，40mmol，2eq)，室温搅拌10min后，加入炔丙基溴(4.76g，40mmol，2eq)，室温下反应6h。tlc监测反应结束后，用200ml饱和氯化钠溶液和200ml乙酸乙酯溶液进行萃取，有机层用无水硫酸钠干燥，静置浓缩后采用硅胶柱层析纯化，洗脱剂为石油醚和乙酸乙酯,体积比为：5∶1，得到化合物7。
[0078]
8)将化合物7置于盐酸乙酸乙酯溶液(体积比为1：1)，室温搅拌下过夜，去除boc基团。采用薄层色谱法检测反应结果。当反应完成后，除去溶剂，得到化合物8，为白色固体，直接用于下一步反应。
[0079]
9)在0℃的条件下，将化合物6(0.32g，1mmol，1eq)和化合物8(0.23g，1mmol，1eq)溶于50ml无水二氯甲烷中，溶解后，依次加入edci(0.23g，1.2mmol，1.2eq)、hobt(0.16g，1.2mmol，1.2eq)和dipea(0.16g，1.2mmol，1eq)。20min后，将反应置于室温条件下搅拌过夜。采用薄层色谱法检测反应结果。反应完成后，向反应液中加入50ml二氯甲烷和50ml饱和碳酸氢钠水溶液，进行萃取并除去杂质。有机相用50ml饱和氯化钠水溶液洗涤，有机层用无水硫酸钠干燥。静置后，用旋转蒸发器除去溶剂。用硅胶柱层析纯化，洗脱剂为二氯甲烷和甲醇，体积比为20：1，得到相应的酰胺产物，为化合物9。
[0080]
10)将化合物4(0.26g，0.5mmol，1eq)和化合物9(0.27g，0.5mmol，1eq)溶于2ml的四氢呋喃溶液中，在室温下搅拌反应混合物。将硫酸铜(0.15g，0.5mmol，1eq)和抗坏血酸钠
(0.20g，1mmol，2eq)溶解在0.5ml水中，震荡摇匀后溶液颜色变成棕色，将棕色水溶液滴加到含有四氢呋喃反应液中，室温下搅拌10h。采用薄层色谱法检测反应结果。反应完成后，用旋转蒸发器去除溶剂。用硅胶柱层析纯化，洗脱剂为二氯甲烷和甲醇，体积比为15∶1，得到黄色固体，即产物苦参碱衍生物lst-4。
[0081]
用核磁共振氢谱和质谱对lst-4进行结构表征，结果如下：1h-nmr(600mhz,dmso-d6)δ11.09(s,1h),8.16(d,j＝3.1hz,1h),7.57(dd,j＝8.5,7.1hz,1h),7.14
–
7.10(m,3h),7.04(d,j＝7.0hz,1h),6.95
–
6.91(m,2h),6.59(t,j＝5.8hz,1h),5.75(s,1h),5.07(d,j＝1.4hz,3h),4.54
–
4.47(m,3h),4.16
–
4.10(m,1h),3.80(t,j＝5.2hz,2h),3.62
–
3.43(m,21h),3.17
–
3.05(m,2h),3.01
–
2.85(m,4h),2.72(d,j＝38.3hz,2h),2.63
–
2.52(m,2h),2.40
–
2.29(m,1h),2.08
–
2.00(m,2h),1.89(dd,j＝16.2,11.8hz,2h),1.77(d,j＝13.8hz,2h),1.63
–
1.46(m,6h),1.43
–
1.22(m,6h).hrms(esi):m/z calcd.for c
53h71n10o13
[m+h]
+
1055.5202,found 1055.5202.
[0082]
实施例2
[0083]
lst-4nps的合成：
[0084]
将实施例1制备的lst-4溶解在浓度为2mg/ml的乙腈中，作为母液。然后用移液枪将母液(500μl)缓慢注入超纯水(5ml)中，持续0.5h，并超声2h。在超声过程中，用氮气以恒定的速率去除乙腈(制备过程如图14所示)。
[0085]
性能测试：
[0086]
一、lst-4和lst-4nps的光物理性质测试
[0087]
1、以甲醇为溶剂，将实施例1制备的lst-4采用逐步稀释法制备6种试验浓度(10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、60μg/ml、80μg/ml、100μg/ml)溶液。以甲醇作为空白参比，用uv-2450测定了lst-4在甲醇中的紫外-可见吸收光谱(如图1)。可以看出，lst-4具有特殊的吸收峰，并且不同浓度的lst-4甲醇溶液在最大吸收峰处具有良好的线性关系和拟合度，体现了lst-4良好的浓度依赖性(如图2)。
[0088]
2、以甲醇为溶剂，将实施例1制备的lst-4逐步稀释法制备6种试验浓度(2.5μm、2.0μm、1.5μm、1.0μm、0.5μm和0.25μm)溶液。以甲醇为空白溶剂，用荧光分光光度计测定了lst-4在甲醇中的荧光发射光谱(如图3)。可以看出，lst-4具有一定的荧光作用，荧光强度和浓度呈一定的线性关系(如图4)，表明lst-4的荧光强度和浓度存在浓度依赖性。
[0089]
3、以水为溶剂，将实施例2制备的lst-4nps逐步稀释法制备5种试验浓度(20μg/ml、40μg/ml、60μg/ml、80μg/ml、100μg/ml)溶液。以水为空白溶剂，用小动物荧光活体成像仪测定了lst-4nps的可视化荧光成像(如图5)。可以看出，lst-4nps同样具有一定的荧光信号。进而通过仪器的半定量分析，表明lst-4nps的荧光强度和浓度同样存在依赖性(如图6)。
[0090]
二、lst-4nps的表征：
[0091]
1、采用透射电镜对合成得到的lst-4nps的形貌大小进行分析表征，如图7所示，可以看出，其呈球形纳米结构，并均匀分散。
[0092]
2、图8为lst-4nps的粒径分析，lst-4nps的粒经大小约为146nm左右，反映较好的epr效应。
[0093]
3、图9为lst-4nps的电位分析，从电位分析结果可以看出，电位呈现负值，绝对值
大于40，说明lst-4nps具有良好的稳定性。
[0094]
三、lst-4单体和lst-4nps的体外抑制hepg 2细胞的效应
[0095]
1、用cck-8法检测细胞毒性，将hepg 2细胞以6个复孔为单位组接种于96孔板，用dmem培养基培养过夜，再加lst-4nps，孵育过夜。测得lst-4nps的ic
50
为60.58μg/ml。用同样的方法测得lst-4的ic
50
为309.0μg/ml。说明lst-4和lst-4nps对hepg 2细胞具有细胞毒性作用，并且纳米颗粒lst-4nps可显著增强对hepg 2的毒性作用(如图10、图11)。
[0096]
2、细胞摄取：lst-4nps和hoechst 33342(商用细胞核染料)的荧光发射分别为525nm、455nm。以细胞核为参比，分析hepg 2细胞与lst-4nps不同孵育时间下的hepg 2细胞对lst-4nps的摄取(如图12)。从图12中可以看出，在0.5h时，细胞内出现微弱的lst-4nps的绿色荧光，表明lst-4nps在0.5h已经进入细胞；随着孵育时间的延长，绿色荧光逐渐增大，在2h时，可发现明显的点状荧光(疑似细胞内溶酶体)；4h时，细胞中明显出现绿色荧光，说明此时lst-4nps充分进入细胞。
[0097]
3、亚细胞定位：将hepg 2(1
×
104)细胞接种于共聚焦培养皿中，加入lst-4nps(20μg/ml)孵育4h。孵育后，细胞用lysotracker red、mitotracker deepred、hoechst 33342三种染料组合染色15min。用pbs洗涤两次，用空白培养基洗涤一次后进行细胞荧光成像，以去除额外的染料和纳米颗粒。使用蔡司axio observer7倒置荧光显微镜的63倍油镜进行细胞的荧光成像，并使用软件zen 2012(carl zeiss)进行分析(结果如图13)。hoechst 33342、lysotracker red、mitotracker deep red的荧光发射量分别为455nm、512nm、589nm。从图13中可以看出，lst-4nps不仅能够顺利进入细胞，并且纳米颗粒聚集在溶酶体内。
[0098]
综上，本发明基于苦参碱进行结构改造，合成了一种新的苦参碱衍生物(lst-4)。在此基础上，进一步自组装制备纳米颗粒(lst-4nps)。lst-4具有新的荧光特性，其紫外最大吸收波长为409nm，其荧光激发/发射波长为416nm/503nm。测定了lst-4和lst-4nps对hepg 2细胞的细胞毒性作用，发现lst-4nps相比与lst-4，可显著增强对hepg 2的毒性作用。此外，进行了lst-4nps的细胞摄取实验和亚细胞共定位实验，发现4h内lst-4nps可以被细胞摄取，并且可以聚集到溶酶体中，表明lst-4nps具有良好的高通透性和滞留效应(epr)。据此，lst-4nps预计在肿瘤的诊疗一体化方面有良好的应用价值。
[0099]
以上，仅为本技术较佳的具体实施方式，但本技术的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本技术揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本技术的保护范围之内。因此，本技术的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。

技术特征：
1.一种苦参碱衍生物，其特征在于，所述苦参碱衍生物的结构式为：2.一种如权利要求1所述的苦参碱衍生物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)将五甘醇溶解于二氯甲烷中，然后依次加入对甲苯磺酰氯和氢氧化钾粉末，反应结束后，萃取除杂，得到化合物1；2)在化合物1中加入叠氮化钠并进行油浴反应，得到化合物2；3)将化合物2与三苯基膦混合，室温下反应，调节ph至14后萃取，得到化合物3；4)在化合物3中加入沙利度胺、n，n-二异丙基乙胺和n，n-二甲基甲酰胺，油浴反应，得到化合物4；5)以苦参碱为原料，以二异丙基胺基锂为碱，添加二苯基二硫醚发生亲核取代反应得到化合物14-苯硫基苦参碱；再将14-苯硫基苦参碱与邻碘酰苯甲酸混合进行反应，得到化合物14-苯亚磺酰基苦参碱，在碳酸钾的作用下消去苯次磺酸得化合物5；将化合物5和甘氨酸溶解于水中，加热反应，重结晶，得到化合物6；将boc-l-酪氨酸甲酯、n，n-二甲基甲酰胺溶液和碳酸钾混合，室温下搅拌，加入炔丙基溴，室温下反应，反应结束后进行萃取，得到化合物7；将化合物7置于盐酸乙酸乙酯溶液中，室温下搅拌过夜，反应完成后除去溶剂，得到化合物8；将化合物6和化合物8溶于无水二氯甲烷中，依次加入edci、hobt和dipea，室温下反应完成后进行萃取除杂，得到化合物9；6)将化合物4和化合物9溶于四氢呋喃溶液中，室温下搅拌，得到反应液；将硫酸铜和抗坏血酸钠溶解在水中，震荡摇匀后溶液颜色变成棕色；将棕色水溶液滴加到反应液中，室温下搅拌，得到苦参碱衍生物lst-4。3.一种苦参碱衍生物纳米颗粒，其特征在于，利用权利要求1所述的苦参碱衍生物自组装形成球状纳米分子，即苦参碱衍生物纳米颗粒。4.一种苦参碱衍生物纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将苦参碱衍生物溶解于乙腈中，得到的溶液注入超纯水中，在氮气氛围下超声处理，得到苦参碱衍生物纳米颗粒。5.一种如权利要求3所述的苦参碱衍生物纳米颗粒在制备抗肿瘤药物方面的应用。

技术总结
本发明公开了一种苦参碱衍生物纳米颗粒及其制备方法和应用，属于医药技术领域。本发明基于苦参碱进行结构改造，合成了一种新的苦参碱衍生物(LST-4)。在此基础上，进一步自组装制备纳米颗粒(LST-4NPs)。本发明反应条件温和，纳米粒子粒径均一稳定。所述材料苦参碱衍生物纳米颗粒LST-4NPs可顺利进入细胞，抑制肿瘤细胞的增殖。LST-4NPs进入细胞后，聚集在溶酶体，提高了药物的生物利用度；LST-4NPs与LST-4相比，增强了EPR效应，在肿瘤治疗方面，LST-4NPs具有更好的治疗效果。4NPs具有更好的治疗效果。4NPs具有更好的治疗效果。


技术研发人员：王立升 来思彤 李繁 刘旭 江俊 吴黎川 袁明清
受保护的技术使用者：广西大学
技术研发日：2023.07.12
技术公布日：2023/10/15