细胞中生物素连接酶BirA表达水平的检测方法及其应用与流程

细胞中生物素连接酶bir a表达水平的检测方法及其应用
技术领域
1.本技术属于生物技术领域，具体涉及细胞中生物素连接酶bir a表达水平的检测方法及其应用。


背景技术：

2.生物素-亲和素系统(biotin-avidin system，bas)是一种新型生物反应放大系统，利用生物素和亲和素之间高亲和力的牢固结合以及多级放大效应，使bas免疫标记和有关示踪分析更加灵敏，已经成为广泛用于微量抗原、抗体定性、定量检测及定位观察研究的新技术。
3.蛋白类试剂生物素化主要包括体外化学法和体内酶催化法。通过体外化学法进行生物素化是目前最常用的方法之一，其操作方便、快捷，而且生物素化标记效率高。但是体外化学法在对蛋白类试剂进行生物素化过程中，生物素化位点是随机标记的，某些位点的生物素化形成的空间位阻会对蛋白活性造成影响。体内酶催化法主要是通过生物素连接酶(biotin protein ligase)催化生物素化反应，将生物素连接到特定的氨基酸位点上，比如大肠杆菌中的bir a。bir a作为生物素-[乙酰辅酶a羧化酶]连接酶可以在atp存在下，激活生物素形成bir a-生物素-5
’‑
腺苷酸(bir a-bio-5
’‑
amp)复合物，通过共价键结合到蛋白质赖氨酸位点上。
[0004]
生物素连接酶来源于细菌等低等生物，在高等哺乳动物细胞中不表达，因此往往需要构建具有功能活性的稳定表达bir a真核细胞系。在相关技术中，比如公开号为cn113061589a的中国发明专利记载了一种稳定表达bir a细胞株的制备方法及其在重组蛋白生产体内生物素化中的应用。但是在该技术方案中，并未对细胞株能否表达bir a及其表达水平直接进行鉴定，而是通过鉴定细胞株表达的重组蛋白被生物素化而间接证明细胞株表达了bir a。在构建表达bir a细胞系过程中，bir a表达载体转染宿主细胞系后，会产生无数细胞系，需要在其中筛选表达bir a的阳性细胞株，利用上述间接法检测bir a是否表达难以满足高通量和快速筛选的要求。


技术实现要素：

[0005]
1.要解决的问题
[0006]
本技术针对直接检测细胞中bir a是否表达及其表达水平检测方面存在的空白，提供了一种细胞中生物素连接酶bir a表达水平的检测方法及其应用，通过筛选合适的抗bir a抗体和抗二抗，通过间接elisa法检测细胞中生物素连接酶bir a的表达水平，该方法能够快速检测细胞中bir a的表达及其表达水平。进一步可以将其用于表达bir a细胞系的构建，用于检测bir a表达载体转染后的候选宿主细胞系，筛选其中表达bir a的阳性细胞株，可以满足高通量和快速筛选的要求。
[0007]
2.技术方案
[0008]
为了解决上述问题，本技术所采用的技术方案如下：
[0009]
本技术提供了一种细胞中生物素连接酶bir a表达水平的检测方法，该方法包括如下步骤：
[0010]
s1，使用细胞裂解液裂解细胞；
[0011]
s2，取细胞裂解后的上清液100μl/孔，4℃过夜包被抗原板；
[0012]
s3，12～16h后洗板，然后封闭抗原板：封闭液200μl/孔，37℃，2h；
[0013]
s4，洗板，加入抗bir a抗体，100μl/孔，37
±
0.5℃，1
±
0.2h；
[0014]
s5，洗板，加入抗二抗，100μl/孔，37
±
0.5℃，1
±
0.2h；
[0015]
s6，洗板，加入tmb显色液，100μl/孔，37
±
0.5℃，15
±
2min。
[0016]
进一步地，上述抗bir a抗体包括：rabbit polyclonal(品牌：sino biological，货号：11582-t16)。
[0017]
进一步地，上述抗二抗包括：peroxidase affinipure donkey anti-rabbit igg(h+l)(品牌：jackson，货号711-035-152)。
[0018]
本技术还提供了上述一种细胞中生物素连接酶bir a表达水平的检测方法在构建表达生物素连接酶bir a的稳定细胞系中的应用。
[0019]
进一步地，上述构建表达生物素连接酶bir a的稳定细胞系包括如下步骤：
[0020]
m1，将bir a基因克隆到真核表达载体，该真核表达载体具有如下特点：bir a编码基因处于转录调控原件的控制之下，可以在哺乳动物细胞中表达；该真核表达载体具备在真核细胞中驱动外源基因表达的所有转录、翻译所需要的调控原件，包括启动子、增强子、转录起始区、polya加工和转录终止信号，以及核糖体结合区、翻译起始信号、翻译终止信号等；
[0021]
m2，将含有bir a基因的表达载体导入到宿主细胞中，经过加压筛选得到表达bir a的cell pool；
[0022]
m3，使用有限稀释法对cell pool进行单克隆筛选，利用上述细胞中生物素连接酶bir a表达水平的检测方法检测单克隆的bir a表达水平，鉴定得到高效表达bir a酶的单克隆。
[0023]
进一步地，上述真核表达载体包括pcdna3.4。
[0024]
进一步地，上述宿主细胞包括蛋白质生产常用的细胞系：例如hek 293f细胞，expi293细胞，cho-k1细胞或cho-s细胞等。更进一步地，上述宿主细胞是到expi293细胞。
[0025]
进一步地，上述表达载体导入宿主细胞的方式包括：化学方式、物理方式或生物学方式，化学方式包括但不限于liposome、lipofectamin等脂质成分为主体的微球结构介导的细胞转染；物理学方式包括但不限于利用电穿孔方式；生物学方式包括但不限于基因片段包裹入病毒颗粒，通过病毒颗粒感染哺乳动物细胞的方式导入外源基因片段。
[0026]
本技术还提供了一种表达生物素连接酶bir a的稳定细胞系的构建方法，该方法包括如下步骤：
[0027]
n1，将bir a基因克隆到真核表达载体；
[0028]
n2，将含有bir a基因的表达载体导入到宿主细胞中，经过加压筛选得到表达bir a的cell pool；
[0029]
n3，使用有限稀释法对cell pool进行单克隆筛选，利用上述细胞中生物素连接酶bir a表达水平的检测方法检测单克隆的bir a表达水平，鉴定得到高效表达bir a酶的单
克隆。
[0030]
本技术还提供了一种表达生物素连接酶bir a的稳定细胞系，通过上述一种表达生物素连接酶bir a的稳定细胞系的构建方法构建获得。
[0031]
本技术还提供了上述一种表达生物素连接酶bir a的稳定细胞系的构建方法和/或上述一种表达生物素连接酶bir a的稳定细胞系在构建表达生物素化目标蛋白的稳定细胞系中的应用。
[0032]
本技术还公开了一种表达生物素化目标蛋白的稳定细胞系的构建方法，该方法包括如下步骤：
[0033]
p1，将bir a基因克隆到真核表达载体；
[0034]
p2，将含有bir a基因的表达载体导入到宿主细胞中，经过加压筛选得到表达bir a的cell pool；
[0035]
p3，使用有限稀释法对cell pool进行单克隆筛选，利用上述细胞中生物素连接酶bir a表达水平的检测方法检测单克隆的bir a表达水平，鉴定得到高效表达bir a酶的单克隆；
[0036]
p4，构建带avi-tag标签重组蛋白表达载体，在蛋白表达载体的目的蛋白开放读码框n端或c端添加avi-tag标签，使目的蛋白与avi-tag标签融合表达，p4与p1-p3可以同时进行；avi-tag标签是一个15个氨基酸的短肽(glndifeaqkiewhe)，具有一个单生物素化赖氨酸位点，与已知天然可生物素化序列完全不同，可以加在目标蛋白的n端和c端，融合表达后，可被生物素连接酶生物素化；
[0037]
p5，将p4构建的带avi-tag标签重组蛋白表达载体导入p3得到的高效表达bir a酶的单克隆，用于生产体内定点生物素化蛋白质。
[0038]
进一步地，上述avi-tag标签包括avi-fc纯化标签。
[0039]
本技术还提供了上述一种表达生物素化目标蛋白的稳定细胞系，通过上述一种表达生物素化目标蛋白的稳定细胞系的构建方法构建获得。
[0040]
本技术还提供了上述一种表达生物素化目标蛋白的稳定细胞系的构建方法和/或上述一种表达生物素化目标蛋白的稳定细胞系在制备生物素化目标蛋白中的应用。
[0041]
本技术还提供了一种生物素化目标蛋白的制备方法，该方法包括如下步骤：
[0042]
p1，将bir a基因克隆到真核表达载体；
[0043]
p2，将含有bir a基因的表达载体导入到宿主细胞中，经过加压筛选得到表达bir a的cell pool；
[0044]
p3，使用有限稀释法对cell pool进行单克隆筛选，利用上述细胞中生物素连接酶bir a表达水平的检测方法检测单克隆的bir a表达水平，鉴定、筛选得到高效表达bir a酶的单克隆；
[0045]
p4，构建带avi-tag标签重组蛋白表达载体，在蛋白表达载体的目的蛋白开放读码框n端或c端添加avi-tag标签，使目的蛋白与avi-tag标签融合表达，p4与p1-p3可以同时进行；avi-tag标签是一个15个氨基酸的短肽(glndifeaqkiewhe)，具有一个单生物素化赖氨酸位点，与已知天然可生物素化序列完全不同，可以加在目标蛋白的n端和c端，融合表达后，可被生物素连接酶生物素化；
[0046]
p5，将p4构建的带avi-tag标签重组蛋白表达载体导入p3得到的；
[0047]
p6，培养p5得到高效表达bir a酶的单克隆，离心收上清，过滤得上清，通过亲和纯化，得到定点生物素化蛋白。
[0048]
3.有益效果
[0049]
本技术与现有技术相比，其有益效果在于：
[0050]
(1)本技术提供的一种细胞中生物素连接酶bir a表达水平的检测方法及其应用，通过筛选合适的抗bir a抗体和抗二抗，可以通过间接elisa法直接检测细胞中生物素连接酶bir a的表达水平，该方法能够高通量、快速检测细胞中bir a的表达及其表达水平。其用于表达bir a细胞系的构建，用于检测bir a表达载体转染后的候选宿主细胞系，筛选其中表达bir a的阳性细胞株，可以满足高通量和快速筛选的要求。
[0051]
(2)本技术提供的一种表达生物素连接酶bir a的稳定细胞系的构建方法，通过间接elisa法直接检测细胞中生物素连接酶bir a的表达水平，无须通过目标蛋白生物素化来间接鉴定，缩短了表达生物素连接酶bir a的稳定细胞系的筛选时间，提高了筛选效率，节约成本。
[0052]
(3)本技术提供的一种表达生物素连接酶bir a的稳定细胞系的构建方法，通过有限稀释法对细胞株进行单克隆化得到稳定表达bir a的单克隆，从而解决了细胞系不稳定的问题，减少了生产中的批次差异。
附图说明
[0053]
图1是bir a真核表达质粒：pcdna3.4多克隆位点中插入bir a基因编码序列，由cmv启动子及其基因转录调控元件驱动bir a表达。
[0054]
图2是构建的重组真核表达载体pcdna3.4-bir a的电泳图，1是质粒，2是使用bamhi和smai酶切后的质粒，m是kb ladder。
[0055]
图3是体内定点生物素化标记的重组蛋白检测标准曲线。
具体实施方式
[0056]
下面结合具体实施例对本技术进一步进行描述。
[0057]
需要说明的是，本说明书中所引用的如“上”、“下”、“左”、“右”、“中间”等用语，亦仅为便于叙述的明了，而非用以限定可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容下，当亦视为本技术可实施的范畴。
[0058]
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本技术的技术领域的技术人员通常理解的含义相同；本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
[0059]
实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
[0060]
如本文所使用，术语“约”用于提供与给定术语、度量或值相关联的灵活性和不精确性。本领域技术人员可以容易地确定具体变量的灵活性程度。
[0061]
如本文所使用，术语“......中的至少一个”旨在与“......中的一个或多个”同义。例如，“a、b和c中的至少一个”明确包括仅a、仅b、仅c以及它们各自的组合。
[0062]
浓度、量和其他数值数据可以在本文中以范围格式呈现。应当理解，这样的范围格
式仅是为了方便和简洁而使用，并且应当灵活地解释为不仅包括明确叙述为范围极限的数值，而且还包括涵盖在所述范围内的所有单独的数值或子范围，就如同每个数值和子范围都被明确叙述一样。例如，约1至约4.5的数值范围应当被解释为不仅包括明确叙述的1至约4.5的极限值，而且还包括单独的数字(诸如2、3、4)和子范围(诸如1至3、2至4等)。相同的原理适用于仅叙述一个数值的范围，诸如“小于约4.5”，应当将其解释为包括所有上述的值和范围。此外，无论所描述的范围或特征的广度如何，都应当适用这种解释。
[0063]
实施例1
[0064]
本实施例提供重组真核表达载体pcdna3.4-bir a的构建。
[0065]
在真核表达载体pcdna3.4多克隆位点中插入bir a：bir a基因翻译成氨基酸的序列为：mkdntvplkliallangefhsgeqlgetlgmsraainkhiqtlrdwgvdvftvpgkgyslpepiqllnakqilgqldggsvavlpvidstnqylldrigelksgdaciaeyqqagrgrrgrkwfspfganlylsmfwrleqgpaaaiglslvigivmaevlrklgadkvrvkwpndlylqdrklagilveltgktgdaaqivigaginmamrrveesvvnqgwitlqeaginldrntlaamlirelraalelfeqeglapylsrwekldnfinrpvkliigdkeifgisrgidkqgallleqdgiikpwmggeislrsaekgstsgsggskdel(seq id no.1)；开放读码框(orf)中由cmv启动子及其基因转录调控元件驱动bir a表达，如图1所示。bir a基因经通用生物(安徽)股份有限公司进行密码子优化后人工合成，并将合成的bir a基因片段和pcdna3.4载体利用无缝克隆(seamless cloning/in-fusion cloning)构建重组真核表达载体pcdna3.4-bir a，构建的质粒电泳图如图2。
[0066]
实施例2
[0067]
本实施例提供表达生物素连接酶bir a的稳定细胞系及其构建方法，包括将bir a基因克隆到真核表达载体；将含有bir a基因的表达载体导入到宿主细胞中，经过加压筛选得到表达bir a的cell pool；使用有限稀释法对cell pool进行单克隆筛选，利用细胞中生物素连接酶bir a表达水平的检测方法检测单克隆的bir a表达水平，鉴定得到高效表达bir a酶的单克隆。具体为：
[0068]
expi293细胞采用奥浦迈(opm-cd05，81075-001)培养液培养，按常规传代培养，采用10％ dmso培养液冻存细胞，1.2
×
107cells/ml/vial；
[0069]
pcdna3.4-bir a转染expi293细胞：转染前3天接种0.3
×
106cells/ml细胞至125ml摇瓶内；72小时后d0转染细胞：参考celetrix_le+使用说明书，取1
×
107cells细胞悬液离心弃上清，加入50μl电转液和10μg pcdna3.4-bir a质粒混合均匀后加入电击杯中，设置电击电压520v进行电转；电转后将细胞转移至10cm dish中(含有10ml cd05培养基)继续培养；
[0070]
稳定表达expi293-bir a细胞系的建立：d1，细胞传代，使用200μg/ml g418加压筛选；后续每3～6天对细胞进行传代培养直至细胞活率恢复》90％后按常规传代、扩增培养、液氮保存备用；
[0071]
稳定表达expi293-bir a细胞系的单克隆筛选：用单克隆培养基bm02(多宁)，采用有限稀释法将表达bir a的cell pool按0.5cells/well铺进96孔板进行单克隆筛选，将生长出的单克隆进行扩增传代培养并用elisa的方法检测bir a的表达量，挑选出表达量较高的单克隆；后续单克隆按常规传代、扩增培养、液氮保存备用。其中：elisa检测方法如下：
[0072]
(a)细胞裂解
[0073]
通过细胞计数，确定培养液中的细胞数，在ep管中加入一定量的细胞，然后再加入细胞裂解液，用枪头反复吹打，然后取少量的上清之显微镜下观察，确定细胞完全裂解；然后12000g/min，离心2min；取上清，准备包板；
[0074]
(b)间接elisa检测
[0075]
取细胞裂解后的上清液100μl/孔，4℃过夜包被抗原板；
[0076]
12～16h洗板，然后封闭抗原板：封闭液200μl/孔，37℃，2h；
[0077]
洗板，加入抗bir a抗体rabbit polyclonal(品牌：sino biological，货号：11582-t16)，100μl/孔，37℃，1h；
[0078]
洗板，加入抗二抗peroxidase affinipure donkey anti-rabbit igg(h+l)(品牌：jackson，货号711-035-152)，100μl/孔，37℃，1h；
[0079]
洗板，加入tmb显色液，100μl/孔，37℃，15min；
[0080]
读板，450nm处读板。
[0081]
部分单克隆bir a酶稳定细胞株检测结果如表1所示，从表1可以看出，样本的od值明显高于nc(对照)的od值，bir a酶稳定细胞株构建成功。
[0082]
表1
[0083][0084]
实施例3
[0085]
本实施例提供带avi-tag标签重组蛋白表达载体及其构建方法。
[0086]
在真核表达载体中插入信号肽、重组蛋白基因和avi-fc标签序列。avi重组蛋白基因序列翻译成氨基酸序列为：gpfpkptlwaepgsviswgspvtiwcqgsqeaqeyrlhkegspep ldrnnplepknkarfsipsmtehhagryrchyyssagwsepsdplemvmtgayskptlsalpspvvasggnmtlrcgsqkgyhhfvlmkegehqlprtldsqqlhsrgfqalfpvgpvtpshrwrftcyyyytntpwvwshpsdpleilpsgvsrkpslltlqgpvlapgqsltlqcgsdvgynrfvlykegerdflqrpgqqpqaglsqanftlgpvspsnggqyrcygahnlssewsapsdplnilmagqiydtvslsaqpgptvasgenvtllcqswwqfdtflltkegaahpplrlrsmygahkyqaefpmspvtsahagtyrcygsyssnphllshpseplelvvsghsggsslpptgppstpglgryleiegrmdpkssdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgkglndifeaqkiewhe(seq id no.2)。经通用生物(安徽)股份有限公司进行密码子优化后人工合成，并将合成的biotinylated lilrb3/cd85a/lit5 fc&avi tag,human基因片段和pcdna3.4载体利用无缝克隆(seamless cloning/in-fusion cloning)构建质粒。
[0087]
实施例4
[0088]
本实施例提供一种表达生物素化目标蛋白的稳定细胞系、其构建方法及在制备生物素化目标蛋白中的应用。
[0089]
分子名称：biotinylated lilrb3/cd85a/lit5 fc&avi tag,human
[0090]
实施例2制备的表达expi293-bir a的单克隆稳定细胞株：24clone，种子细胞按照0.4
×
106个/ml，接种传代，72h传代一次，细胞密度基本可以长到(3～4)
×
106个/ml，活率
95％以上。
[0091]
待expi293-bir a单克隆稳定细胞株细胞密度长到(3～4)
×
106个/ml，活率95％以上时，按照2.0
×
106个/ml准备细胞，此时时间记为day-1。
[0092]
到day0时，细胞密度达到(3.9～4.1)
×
106个/ml时，瞬转。实施例3制备的带avi-tag标签重组蛋白表达质粒用量1.2mg/l。pei用量4.0mg/l。质粒和pei均用传达培养基稀释，稀释后体积为40ml/l。然后将pei稀释液加入到dna稀释液中，静置15min。15min后将dna与pei复合物加入准备好的细胞中。
[0093]
细胞长至day6时，收样。1400g/min，离心10min。收上清，然后0.22μm过滤，得上清，通过亲和纯化，得到蛋白。
[0094]
实施例5
[0095]
本实施例提供实施例4制备的蛋白的生物素标记率的检测。
[0096]
采用试剂盒(thermo，46610)检测重组蛋白生物素化效率：
[0097]
根据本次实验所需1
×
pbs的量，将试剂盒中20
×
pbs用超纯水稀释成1
×
pbs；
[0098]
用1
×
pbs样品稀释样品；
[0099]
标准品稀释：如表2所示，现配现用；
[0100]
表2
[0101]
vial1
×
pbs(μl)标准品(μl)final biocytin concentration(pmol/10μl)a991(μl)biocytin contro100b416μl of vial a80c812μl of vial a60d128μl of vial a40e164μl of vial a20f182μl of vial a10g191μl of vial a5h2000
[0102]
dwr准备：稀释比例：14:1(14份的1
×
pbs：1份dylight
tm
reporter，体积比)，现配现用；
[0103]
在黑色酶标板中，先加入10μl样品，然后再加入90μl dwr；
[0104]
室温静置5min；
[0105]
(20min内读板)荧光板读数仪(激494nm；发射520nm)。
[0106]
实验结果：
[0107]
蛋白浓度0.23mg/ml。响应值：1382337。生物素标记率：93％。生物素标记率检测标准曲线见图3。

技术特征：
1.一种细胞中生物素连接酶bir a表达水平的检测方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：s1，使用细胞裂解液裂解细胞；s2，取细胞裂解后的上清液100μl/孔，4℃过夜包被抗原板；s3，12～16h后洗板，然后封闭抗原板：封闭液200μl/孔，37℃，2h；s4，洗板，加入抗bir a抗体，100μl/孔，37
±
0.5℃，1
±
0.2h；s5，洗板，加入抗二抗，100μl/孔，37
±
0.5℃，1
±
0.2h；s6，洗板，加入tmb显色液，100μl/孔，37
±
0.5℃，15
±
2min。2.根据权利要求1所述的一种细胞中生物素连接酶bir a表达水平的检测方法，其特征在于，所述抗bir a抗体为rabbit polyclonal；所述抗二抗为peroxidase affinipure donkey anti-rabbit igg(h+l)。3.权利要求1或2所述的一种细胞中生物素连接酶bir a表达水平的检测方法在构建表达生物素连接酶bir a的稳定细胞系中的应用。4.一种表达生物素连接酶bir a的稳定细胞系的构建方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：n1，将bir a基因克隆到真核表达载体；n2，将含有bir a基因的表达载体导入到宿主细胞中，经过加压筛选得到表达bir a的cellpool；n3，使用有限稀释法对cellpool进行单克隆筛选，利用权利要求1或2所述的一种细胞中生物素连接酶bir a表达水平的检测方法检测单克隆的bir a表达水平，鉴定、筛选得到高效表达bir a酶的单克隆。5.根据权利要求4所述的一种表达生物素连接酶bir a的稳定细胞系的构建方法，其特征在于，所述真核表达载体包括pcdna3.4；所述宿主细胞包括hek 293f细胞、expi293细胞、cho-k1细胞或cho-s细胞。6.一种表达生物素连接酶bir a的稳定细胞系，其特征在于，通过权利要求4或5所述的一种表达生物素连接酶bir a的稳定细胞系的构建方法构建获得。7.权利要求4或5所述的一种表达生物素连接酶bir a的稳定细胞系的构建方法、或权利要求6所述的一种表达生物素连接酶bir a的稳定细胞系在构建表达生物素化目标蛋白的稳定细胞系中的应用。8.一种表达生物素化目标蛋白的稳定细胞系的构建方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：p1，将bir a基因克隆到真核表达载体；p2，将含有bir a基因的表达载体导入到宿主细胞中，经过加压筛选得到表达bir a的cellpool；p3，使用有限稀释法对cellpool进行单克隆筛选，利用权利要求1或2所述的细胞中生物素连接酶bir a表达水平的检测方法检测单克隆的bir a表达水平，鉴定、筛选得到高效表达bir a酶的单克隆；p4，构建带avi-tag标签重组蛋白表达载体，在蛋白表达载体的目的蛋白开放读码框n端或c端添加avi-tag标签；
p5，将p4构建的带avi-tag标签重组蛋白表达载体导入p3得到的高效表达bir a酶的单克隆，获得表达生物素化目标蛋白的稳定细胞系。9.一种表达生物素化目标蛋白的稳定细胞系，其特征在于，通过权利要求8所述一种表达生物素化目标蛋白的稳定细胞系的构建方法构建获得。10.权利要求8所述的一种表达生物素化目标蛋白的稳定细胞系的构建方法和/或权利要求9所述的一种表达生物素化目标蛋白的稳定细胞系在制备生物素化目标蛋白中的应用。

技术总结
本申请公开了一种细胞中生物素连接酶Bir A表达水平的检测方法及其应用，属于生物技术领域。通过筛选合适的抗Bir A抗体和抗二抗，通过间接ELISA法检测细胞中生物素连接酶Bir A的表达水平，该方法能够快速检测细胞中Bir A的表达及其表达水平。进一步可以将其用于表达Bir A细胞系的构建，用于检测Bir A表达载体转染后的候选宿主细胞系，筛选其中表达Bir A的阳性细胞株，可以满足高通量和快速筛选的要求。表达Bir A的阳性细胞株可以用于构建表达生物素化目标蛋白的稳定细胞系，并进一步制备表达生物素化目标蛋白。表达生物素化目标蛋白。表达生物素化目标蛋白。


技术研发人员：钱静 王珊珊 王元 崔志辉 刘航
受保护的技术使用者：南京优爱生物科技研发有限公司
技术研发日：2023.06.02
技术公布日：2023/9/23