一种PD-L1引导的特异性靶向CTC检测结合肿瘤边界区分的生物探针及其制备方法

一种pd-l1引导的特异性靶向ctc检测结合肿瘤边界区分的生物探针及其制备方法
技术领域
1.本发明属于生物探针技术领域，涉及一种pd-l1引导的特异性靶向ctc检测结合肿瘤边界区分的生物探针及其制备方法。


背景技术：

2.癌症在中晚年患者的发病率及死亡率逐年升高，化疗及手术治疗均严重降低患者的中晚年生存质量，因此，为减轻患者痛苦，对免疫治疗进行研究已成为癌症治疗的一大趋势。现有研究证明，早期诊断及准确区分肿瘤边界在恶性肿瘤的治疗及预后评估中起着重要作用，其中细胞程序性死亡配体1(programmed cell death 1ligand 1，pd-l1)扮演着独特的角色。细胞程序性死亡配体1是指可以与细胞程序性死亡受体1相互结合的细胞因子，可传导抑制性信号，抑制cd8+t细胞的增生，且可以间接调节bcl-2基因，抑制淋巴结中抗原特异性t细胞的聚集。
3.目前临床上为了明确恶性肿瘤的诊断、评估预后、制定治疗方案以及评价疗效，绝大多数情况下均须经过穿刺活检获取病理标本，但因穿刺活检为介入创伤性检查，有时可导致出血、感染，切除过多组织影响外观导致部分患者难以接受。另外，穿刺活检也难以对恶性病变的进展程度、治疗效果等进行动态评价。尤其是乳腺是人体内腺体及淋巴组织非常丰富的器官，影像检查容易出现假阴性，当临床表现以及实验室检查出现异常时，乳腺的病理改变可能已进入转移阶段而无法逆转；随着生活水平的升高，结直肠癌的发病率也日趋升高，且发现时常常出现全身转移症状。因此临床需要一种无创、敏感、患者易于接受，且能动态监测恶性肿瘤的病理改变的评价手段。


技术实现要素：

4.本发明针对现有技术出现的不足，提供一种pd-l1引导的特异性靶向ctc检测结合肿瘤边界区分的生物探针及其制备方法。
5.本发明的一个目的通过以下技术方案来实现：
6.一种pd-l1引导的特异性靶向ctc检测结合肿瘤边界区分的生物探针，包括核心、共价有机框架以及pd-l1抗体，所述核心包括超顺磁性纳米颗粒，所述共价有机框架包覆在核心表面，pd-l1抗体结合在所述共价有机框架表面。
7.作为优选，所述超顺磁性纳米颗粒为粒径≤15nm的油相超顺磁性fe3o4纳米颗粒；
8.作为优选，所述粒径≤15nm的油相超顺磁性fe3o4纳米颗粒的制备方法包括以下步骤：
9.将极性溶剂、顺式-9-十八碳烯酸和无机碱混合得到混合液，然后将硫酸亚铁铵水溶液加入上述混合液中，在100～500℃下加热1～20h，去除上清液，沉淀用非极性溶剂分散，清洗后储存在非极性溶剂中，得到油相超顺磁性fe3o4纳米颗粒。
10.作为优选，极性溶剂包括无水乙醇、甲醇、乙腈、丙酮中的一种或多种；
11.作为优选，无机碱包括氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钡、氢氧化钙、氢氧化铝、氢氧化锂、氢氧化镁、氢氧化锌、氢氧化铜中的一种或多种；
12.作为优选，非极性溶剂包括环己烷、己烷、苯、四氯化碳、二氯乙烷、二氯甲烷中的一种或多种。
13.作为优选，所述共价有机框架为tapb-btca cof，其通过包括tapb和btca的单体制备而得。
14.作为优选，共价有机框架包覆在核心表面的步骤包括：将核心、tapb和btca加入至乙腈，随后加入乙酸，室温搅拌，离心获得共价有机框架包覆核心。
15.作为优选，所述共价有机框架的厚度为1～5nm；
16.作为优选，所述pd-l1引导的特异性靶向ctc检测结合肿瘤边界区分的生物探针的粒径为5～20nm。
17.作为优选，超顺磁性纳米颗粒、共价有机框架与pd-l1抗体的物质的量之比为(250～310)：(100～150)：(50～70)。
18.作为优选，所述核心还包括拉曼信号分子，拉曼信号分子连接在超顺磁性纳米颗粒表面。
19.本发明的另一个目的通过以下技术方案来实现：
20.一种pd-l1引导的特异性靶向ctc检测结合肿瘤边界区分的生物探针的制备方法，包括以下步骤：
21.(1)、制备超顺磁性纳米颗粒，在超顺磁性纳米颗粒表面连接拉曼信号分子；
22.(2)、将步骤(1)的产物、tapb和btca加入至乙腈，随后加入乙酸，室温搅拌，搅拌时间可列举为12～48h，离心获得共价有机框架包覆核心；
23.(3)、在共价有机框架包覆核心中加入pd-l1抗体，搅拌，离心、重悬于磷酸盐缓冲液得到pd-l1引导的特异性靶向ctc检测结合肿瘤边界区分的生物探针。
24.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
25.1、本发明提供的pd-l1引导的特异性靶向ctc检测结合肿瘤边界区分的生物探针利用特异性抗体组分pd-l1在靶向区域高浓度聚集，并利用油相超顺磁性纳米颗粒具有的拉曼信号增强特性，在靶向组织聚集形成特异性的拉曼信号图像，对肿瘤边界进行微观区分，而油相超顺磁性纳米颗粒具有磁化特性，可对pd-l1阳性的循环肿瘤细胞进行磁分离，对分离出的ctc进行拉曼检测；
26.2、本发明的pd-l1引导的以油相超顺磁性纳米颗粒为载体的特异性靶向ctc检测结合肿瘤边界区分的生物探针能够跨膜转运进入体内，顺利进入pd-l1阳性的恶性肿瘤病灶处，并进行拉曼成像，无需穿刺活检，从而避免出血、感染，甚至大出血、败血症等严重并发症，还能够对乳腺病变的进展程度、治疗效果等进行动态评价，是一种无创、敏感、患者易于接受，且能动态监测乳腺病理改变的评价手段；利用拉曼动态监测，pd-l1引导的以油相超顺磁性纳米颗粒为载体的特异性靶向ctc检测结合肿瘤边界区分的生物探针直观反映并量化评价pd-l1在三阴性乳腺癌、结直肠癌及肺癌内的沉积状态，监测恶性肿瘤的病变情况；
27.3、本发明的一种pd-l1引导的特异性靶向ctc检测结合肿瘤边界区分的生物探针的油相超顺磁性fe3o4纳米颗粒的粒径进一步优选为≤15nm，超小的粒径更有利于跨膜转
运；
28.4、本发明核心中的超顺磁性纳米颗粒为油相超顺磁性fe3o4纳米颗粒，油相的四氧化三铁颗粒的聚集效果增强了表面连接的sers信号分子的信号，sers检测更稳定；
29.5、本发明包覆在核心表面的共价有机框架为tapb-btca cof，其通过包括tapb和btca的单体制备而得；共价有机框架可溶性良好，其包覆在核心表面，cof的苯环结构能够与特异性抗体组分共价结合，从而稳定地将核心与特异性抗体组分结合到一起，提高pd-l1引导的以油相超顺磁性纳米颗粒为载体的特异性靶向ctc检测结合肿瘤边界区分的生物探针的稳定性与安全性；
30.6、本发明采用的pd-l1引导的以油相超顺磁性纳米颗粒为载体的特异性靶向ctc检测结合肿瘤边界区分的生物探针的制备方法，得到的生物探针性状稳定，大小均一，粒径大小为5～20nm，穿透力优异，能够顺利进入pd-l1阳性的肿瘤病灶处，且制作过程简单，规模化生产成本较低。
附图说明
31.图1为本发明实施例1的pd-l1引导的以油相超顺磁性纳米颗粒为载体的特异性靶向ctc检测结合肿瘤边界区分的生物探针的制备流程示意图；
32.图2为实施例1制备的油相超顺磁性纳米颗粒的tem图；
33.图3为本发明实施例1和对比例1的pd-l1引导的特异性靶向ctc检测结合肿瘤边界区分的生物探针针的hrtem对比图；
34.图4为本发明实施例1和对比例1的pd-l1引导的特异性靶向ctc检测结合肿瘤边界区分的生物探针的拉曼光谱对比图；
35.图5为本发明实施例1的pd-l1引导的特异性靶向ctc检测结合肿瘤边界区分的生物探针的荧光共聚焦图；
36.图6为本发明实施例1的pd-l1引导的特异性靶向ctc检测结合肿瘤边界区分的生物探针检测兔血中不同浓度的mda-mb-231所测得拉曼光谱图；
37.图7为本发明实施例1的pd-l1引导的特异性靶向ctc检测结合肿瘤边界区分的生物探针检测乳腺癌患者和健康人血所测得拉曼光谱图；
38.图8为是本发明实施例1的pd-l1引导的以油相超顺磁性纳米颗粒为载体的特异性靶向ctc检测结合肿瘤边界区分的生物探针用于balb/c雌性裸鼠的三阴性乳腺癌t2成像；
39.图9为本发明实施例1的pd-l1引导的以油相超顺磁性纳米颗粒为载体的特异性靶向ctc检测结合肿瘤边界区分的生物探针用于balb/c雌性裸鼠的三阴性乳腺癌肿瘤边界区分；
40.图10为图9的边界选点所测得的拉曼光谱图。
具体实施方式
41.在下文中，针对本发明的pd-l1引导的特异性靶向ctc检测结合肿瘤边界区分的生物探针及其制备方法将详细地描述实施方式，然而，这些实施方式是示例性的，本发明公开内容不限于此。
42.下面详细介绍本发明的pd-l1引导的特异性靶向ctc检测结合肿瘤边界区分的生
物探针。
43.在本发明的一些实施方式中，pd-l1引导的特异性靶向ctc检测结合肿瘤边界区分的生物探针包括核心、共价有机框架(covalent organic framework，cof)以及pd-l1抗体，所述核心包括超顺磁性纳米颗粒，所述共价有机框架包覆在所述核心表面，pd-l1抗体结合在所述共价有机框架表面。
44.本发明选取三阴性乳腺癌病灶高表达而正常乳腺无表达和其它乳腺癌低表达的细胞程序性死亡配体1做为成像靶点，合成了一种pd-l1引导的以超顺磁性纳米颗粒为载体的特异性靶向ctc检测结合肿瘤边界区分的生物探针。该特异性靶向ctc检测结合肿瘤边界区分的生物探针利用特异性抗体组分pd-l1在靶向区域高浓度聚集，并利用超顺磁性纳米颗粒具有的拉曼信号特性，使靶向组织形成特异性的拉曼信号图像，对肿瘤边界进行微观区分，而超顺磁性纳米颗粒具有磁化特性、可以实现对ctc进行磁分离，用作拉曼检测。
45.所述超顺磁性纳米颗粒是指具有磁响应性的纳米级粒子，优选为超顺磁性fe2o3纳米颗粒、超顺磁性fe3o4纳米颗粒中的一种或多种。
46.所述超顺磁性纳米颗粒的粒径优选为≤15nm，可以为2、5、9、10、11、12、13、14、15nm中的任意一个值或者任意两个值之间的范围值，可选为7～15nm。≤15nm的超顺磁性纳米颗粒更容易跨膜转运。
47.作为优选，所述超顺磁性纳米颗粒为粒径≤15nm的油相超顺磁性fe3o4纳米颗粒。油相超顺磁性纳米颗粒更容易聚集在一起，本发明采用pd-l1引导的以油相超顺磁性纳米颗粒为载体的特异性靶向ctc检测结合肿瘤边界区分的生物探针产生的拉曼光谱信号更强且更稳定。
48.作为优选，所述粒径≤15nm的油相超顺磁性fe3o4纳米颗粒的制备方法包括以下步骤：
49.将极性溶剂、顺式-9-十八碳烯酸和无机碱混合得到混合液，然后将硫酸亚铁铵水溶液加入上述混合液中，在100～500℃下加热1～20h，去除上清液，沉淀用非极性溶剂分散，清洗后储存在非极性溶剂中，得到油相超顺磁性fe3o4纳米颗粒。
50.上述粒径≤15nm的油相超顺磁性fe3o4纳米颗粒的制备方法中，所述极性溶剂包括无水乙醇、甲醇、乙腈、丙酮等中的一种或多种。
51.上述粒径≤15nm的油相超顺磁性fe3o4纳米颗粒的制备方法中，所述无机碱包括氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钡、氢氧化钙、氢氧化铝、氢氧化锂、氢氧化镁、氢氧化锌、氢氧化铜等中的一种或多种。
52.上述粒径≤15nm的油相超顺磁性fe3o4纳米颗粒的制备方法中，所述非极性溶剂包括环己烷、己烷、苯、四氯化碳、二氯乙烷、二氯甲烷等中的一种或多种。
53.上述粒径≤15nm的油相超顺磁性fe3o4纳米颗粒的制备方法中，采用极性溶剂如无水乙醇对沉淀进行清洗。
54.上述粒径≤15nm的油相超顺磁性fe3o4纳米颗粒的制备方法中，极性溶剂和顺式-9-十八碳烯酸的体积比为0.8～1.2：1；无机碱和硫酸亚铁铵的质量比为1：0.4～1。
55.所述共价有机框架包覆在所述核心表面，厚度优选为1～5nm。根据该优选方案，特异性靶向ctc检测结合肿瘤边界区分的生物探针穿透力强，能够顺利到达pd-l1高表达的肿瘤处并进行ctc检测及拉曼成像。
56.所述共价有机框架为tapb-btca cof，其通过包括tapb(1,3,5-三(4-氨基苯基)苯，化学式为c
24h21
n3)和btca(1,3,5-苯甲醛，化学式为c9h6o3)的单体制备而得。根据该优选方案，共价有机框架(cof)可溶性良好，其包覆在核心表面，cof的苯环结构能够与特异性抗体pd-l1共价结合，从而稳定地将核心与特异性抗体pd-l1结合到一起，提高pd-l1引导的特异性靶向ctc检测结合肿瘤边界区分的生物探针的稳定性与安全性。
57.共价有机框架包覆在核心表面的步骤可以列举包括：将核心、tapb和btca加入至乙腈，随后加入乙酸，室温搅拌，离心获得共价有机框架包覆核心。室温搅拌时间可列举为12～48h。
58.tapb和btca的摩尔比可列举为0.9～1.2：1。
59.所述pd-l1抗体优选为单克隆pd-l1抗体。使用单克隆pd-l1抗体，优点在于高特异性、高均一性与高重复性，有利于使用带有pd-l1抗体的特异性靶向ctc检测结合肿瘤边界区分的生物探针进行拉曼成像及ctc检测。
60.超顺磁性纳米颗粒、共价有机框架与pd-l1抗体的物质的量之比优选为(250～310)：(100～150)：(50～70)。本文中，括号内的数值包括端点值。按照上述物质的量比例形成的pd-l1引导的特异性靶向ctc检测结合肿瘤边界区分的生物探针，具有更加优异的稳定性，共价有机框架能够将核心与特异性抗体组分良好地结合在一起，同时，pd-l1引导的以油相超顺磁性纳米粒子为载体的特异性靶向ctc检测结合肿瘤边界区分的生物探针能够对疾病细胞等作出精确定位，准确定性及疗效检测。
61.所述pd-l1引导的特异性靶向ctc检测结合肿瘤边界区分的生物探针的粒径优选为5～20nm。根据该优选方案，pd-l1引导的特异性靶向ctc检测结合肿瘤边界区分的生物探针颗粒的粒径适中，穿透力优异，能够实现跨膜转运，顺利进入pd-l1高表达的恶性肿瘤病灶处，并进行拉曼成像。
62.在本发明的一些实施方式中，所述核心还包括拉曼信号分子，拉曼信号分子连接在超顺磁性纳米颗粒表面。拉曼信号分子为在拉曼光谱中具有共轭振动的有机物，包括但不限于茜素红(ar)、巯基吡啶、4-巯基苯胺、巯基萘、对氟硫酚、罗丹明、结晶紫、4-巯基苯甲酸(4-mba)、耐尔蓝等中的一种或多种。
63.下面详细介绍本发明的pd-l1引导的特异性靶向ctc检测结合肿瘤边界区分的生物探针的制备方法。
64.在本发明的一些实施方式中，pd-l1引导的特异性靶向ctc检测结合肿瘤边界区分的生物探针的制备方法包括以下步骤：
65.(1)、制备超顺磁性纳米颗粒，在超顺磁性纳米颗粒表面连接拉曼信号分子；
66.(2)、将步骤(1)的产物、tapb和btca加入至乙腈，随后加入乙酸，室温搅拌，搅拌时间可列举为12～48h，离心获得共价有机框架包覆核心；
67.(3)、在共价有机框架包覆核心中加入pd-l1抗体，搅拌，搅拌时间可列举为3～30h，离心、重悬于磷酸盐缓冲液得到pd-l1引导的特异性靶向ctc检测结合肿瘤边界区分的生物探针。
68.步骤(1)中的超顺磁性纳米颗粒优选为油相超顺磁性fe3o4纳米颗粒，进一步优选为粒径≤15nm的油相超顺磁性fe3o4纳米颗粒，粒径≤15nm的油相超顺磁性fe3o4纳米颗粒的制备方法优选为包括以下步骤：将极性溶剂、顺式-9-十八碳烯酸和无机碱混合得到混合
液，然后将硫酸亚铁铵(fe(nh4)2(so4)2·
6h2o)水溶液加入上述混合液中，在100～500℃下加热1～20h，去除上清液，沉淀用非极性溶剂分散，清洗后储存在非极性溶剂中，得到油相超顺磁性fe3o4纳米颗粒。
69.步骤(1)中在超顺磁性纳米颗粒表面连接拉曼信号分子的步骤包括：将超顺磁性纳米颗粒加入拉曼信号分子溶液中，搅拌反应。拉曼信号分子溶液为拉曼信号分子溶于溶剂中形成，但凡能溶解拉曼信号分子的溶剂均可，如水、乙醇、四氢呋喃等，拉曼信号分子溶液浓度不作限制；搅拌反应的温度为5～40℃，优选为室温条件下进行，搅拌反应的反应时间为5～60min。
70.步骤(3)中，磷酸盐缓冲液的ph为7.0～7.5。
71.下面通过具体实施例和附图，对本发明的技术方案作进一步描述说明，应当理解的是，此处所描述的具体实施例仅用于帮助理解本发明，不用于本发明的具体限制。且本文中所使用的附图，仅仅是为了更好地说明本发明所公开内容，对保护范围并不具有限制作用。如果无特殊说明，本发明的实施例中所采用的原料均为本领域常用的原料，实施例中所采用的方法，均为本领域的常规方法。
72.实施例1
73.本实施例的pd-l1引导的以油相超顺磁性纳米颗粒为载体的特异性靶向ctc检测结合肿瘤边界区分的生物探针的制备流程示意图如图1所示，具体包括以下步骤：
74.(1)具备sers功能的油相超顺磁性fe3o4纳米颗粒的制备
75.各取10ml无水乙醇和顺式-9-十八碳烯酸加至50ml烧杯，加入1g naoh，600rpm进行搅拌至溶解，得到混合液；再取0.78g fe(nh4)2(so4)2·
6h2o溶解于20ml的水中，用滴管缓慢加入混合液中，待完全溶解后转移至反应釜，以230℃加热10h；之后吸取上清液，沉淀用环己烷分散，并用乙醇醇洗3次，储存在10ml环己烷中。
76.(2)连接有拉曼信号分子的油相fe3o4(fe3o4@ar)的制备
77.将茜素红溶解于水中以得到1*10-3
m的茜素红(ar)溶液，取10ml，加至10ml油相fe3o4中，搅拌16h，10000rpm、15min离心洗涤3次，得到油相fe3o4@ar纳米颗粒。
78.(3)共价有机框架材料的包覆
79.取步骤(2)所得油相fe3o4@ar 0.0299mmol(按铁含量计算)，加入17ml乙腈，加入0.006mmol的btca和0.006mmol的tapb，加入2ml乙酸，室温搅拌24h，12000rpm、20min离心取沉淀重悬于1ml tris-hcl缓冲液得到油相fe3o4@ar@cof。
80.(7)表面抗体的偶联
81.取10μl、1.095mg/ml的单克隆pd-l1抗体加入步骤(3)的产物中，搅拌12小时，10000rpm、10min离心3次，沉淀重悬于ph 7.4pbs缓冲液里，得到最终的pd-l1引导的以油相超顺磁性纳米颗粒为载体的特异性靶向ctc检测结合肿瘤边界区分的生物探针。
82.对比例1
83.对比例1与实施例1的区别在于，对比例1的步骤(1)制备水相超顺磁性fe3o4纳米颗粒，步骤(1)的具体步骤为：
84.各取10ml无水乙醇和顺式-9-十八碳烯酸加至50ml烧杯，加入1g naoh，600rpm进行搅拌至溶解，得到混合液；再取0.78g fe(nh4)2(so4)2·
6h2o溶解于20ml的水中，用滴管缓慢加入混合液中，待完全溶解后转移至反应釜，以230℃加热10h；之后吸取上清液，沉淀用
环己烷分散，并用乙醇醇洗3次，储存在10ml环己烷中。然后将油相fe3o4转为水相，将上述溶液加入细长玻璃瓶中，然后加入0.2g柠檬酸、5ml dmf和5ml的氯仿，封口膜密封超声6h，之后醇洗3次，最后将fe3o4溶于10ml去离子水中。后续步骤同实施例1，制备得到pd-l1引导的以水相超顺磁性纳米颗粒为载体的特异性靶向ctc检测结合肿瘤边界区分的生物探针。
85.图2为实施例1制备的油相超顺磁性纳米颗粒的tem图，见其粒径约为8～12nm；图3(1)为实施例1的pd-l1引导的以油相超顺磁性纳米颗粒为载体的特异性靶向ctc检测结合肿瘤边界区分的生物探针的hrtem图，从图中可以看出，pd-l1引导的以油相超顺磁性纳米颗粒为载体的特异性靶向ctc检测结合肿瘤边界区分的生物探针的粒径大小约10～18nm，图3(2)为对比例1的pd-l1引导的以水相超顺磁性纳米颗粒为载体的特异性靶向ctc检测结合肿瘤边界区分的生物探针的hrtem图，通过比较图3(1)和图3(2)可知，油相超顺磁性纳米颗粒更容易聚集在一起。图4(1)为实施例1的pd-l1引导的以油相超顺磁性纳米颗粒为载体的特异性靶向ctc检测结合肿瘤边界区分的生物探针的拉曼光谱图，图4(2)为对比例1的pd-l1引导的以水相超顺磁性纳米颗粒为载体的特异性靶向ctc检测结合肿瘤边界区分的生物探针的拉曼光谱图，通过比较图4(1)和图4(2)可知，pd-l1引导的以油相超顺磁性纳米颗粒为载体的特异性靶向ctc检测结合肿瘤边界区分的生物探针对应的拉曼光谱信号更强且更稳定。图5(1)为实施例1的pd-l1引导的特异性靶向ctc检测结合肿瘤边界区分的生物探针荧光共聚焦图(其中，左图为mda-mb-231乳腺癌细胞的细胞核，中间图为pd-l1引导的特异性靶向ctc检测结合肿瘤边界区分的生物探针，右图为pd-l1引导的特异性靶向ctc检测结合肿瘤边界区分的生物探针结合mda-mb-231乳腺癌细胞的细胞核merge图)；结合图5(2)(其中，左图为mcf-7乳腺癌细胞的细胞核，中间图为pd-l1引导的特异性靶向ctc检测结合肿瘤边界区分的生物探针，右图为pd-l1引导的特异性靶向ctc检测结合肿瘤边界区分的生物探针结合mcf-7乳腺癌细胞的细胞核merge图)可以看出，pd-l1高表达的mda-mb-231对该探针的摄取高于pd-l1低表达的mcf-7。
86.应用实施例1
87.兔血ctc检测
88.将实施例1制备的pd-l1引导的以油相超顺磁性纳米颗粒为载体的特异性靶向ctc检测结合肿瘤边界区分的生物探针用ph7.4磷酸盐缓冲液配制成300μg/ml溶液。
89.从健康兔耳缘静脉取血7ml，置于真空抗凝管震荡3分钟以防凝血。分别取1ml分散于pbs中的不同浓度(500cells/ml，200cells/ml，100cells/ml，50cells/ml，10cells/ml)的mda-mb-231乳腺癌细胞，分别与1ml新鲜兔血混匀，缓慢滴入到1ml淋巴细胞分离液中，此时样品分为两层，上层为含肿瘤细胞的兔血，下层为淋巴细胞分离液。1500rpm离心25min，根据细胞密度的不同分为四层(上层为血浆、中上层为淋巴细胞和单核细胞、中下层为透明的淋巴细胞分离液、下层为红细胞)，循环肿瘤细胞位于淋巴细胞层。用移液枪取出淋巴细胞层加入2ml pbs混匀，1500rpm、5min离心洗涤3次。最后分散在200μldmem完全培养液(10％fbs，1％ps)中，加入200μl、300μg/ml的纳米探针，置于37℃培养箱中孵育30min，孵育完后1000rpm、5min，离心洗涤3次，去除多余的未与癌细胞结合的探针。将离心洗涤后的样品滴在洁净的载玻片上进行拉曼测试，不同浓度的的循环肿瘤细胞的检测(ctc检测)如图6所示，从中可以看出，本发明的纳米探针可以与ctc结合，并有效检测ctc。
90.三阴性乳腺癌(tnbc)患者的ctc检测
91.2名三阴性乳腺癌患者和两名健康人各取血1ml，置于真空抗凝管震荡3分钟以防凝血。缓慢滴入到1ml淋巴细胞分离液中，此时样品分为两层，上层为人血，下层为淋巴细胞分离液。1500rpm、25min离心，根据细胞密度的不同分为四层(上层为血浆，中上层为淋巴细胞和单核细胞，中下层为透明的淋巴细胞分离液，下层为红细胞)，循环肿瘤细胞位于淋巴细胞层。用移液枪取出淋巴细胞层加入2ml pbs混匀，1500rpm、5min离心洗涤3次。最后分散在200μl dmem完全培养液(10％fbs，1％ps)中，加入200μl、300μg/ml的纳米探针，置于37℃培养箱中孵育30min，孵育完后1000rpm、5min，离心洗涤3次，去除多余的未与癌细胞结合的探针。将离心洗涤后的样品滴在洁净的载玻片上进行拉曼测试，三阴性乳腺癌患者和健康人血的ctc检测结果以拉曼光谱结果呈现，如图7所示。
92.balb/c雌性裸鼠三阴性乳腺癌模型的边界区分
93.将实施例1制备的pd-l1引导的以油相超顺磁性纳米颗粒为载体的特异性靶向ctc检测结合肿瘤边界区分的生物探针用ph7.4磷酸盐缓冲液配制成300μg/ml溶液，然后注射待测对象，用量通常为60μg/kg。
94.在进行拉曼成像前需要对药物在小鼠体内的聚集时间进行探索，由于本探针核心为超顺磁性四氧化三铁，因此进行mr成像以摸索时间点。balb/c雌性裸鼠乳腺癌模型选用国际普遍采用的原位注射手段，造模过程如下：经balb/c雌性裸鼠右腿前上皮下原位注射mda-mb-231乳腺癌细胞，第7天模型制作成功；随后模型用于在体mr成像。mr成像系统为德国semens 3.0tmr，水平扫描架内径16cm，使用38mm大鼠头线圈。采用4％异氟烷麻醉后把小鼠置于有机玻璃扫描床内，利用牙套及耳杆固定鼠脑。以1.5％异氟烷：空气混合气体维持麻醉状态，并监护心率、呼吸。扫描范围覆盖小鼠乳腺癌皮下瘤。扫描采用俯卧位t2－pd双回波msme(mμlti slices mμlti echo)自旋回波序列，扫描参数：tr 4000ms，te 90ms；层厚2mm，层间距0，层数25层，fov 60mm
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48mm，采集次数3，矩阵256
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256，空间最小分辨998μm
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98μm，扫描时间约为30min。小鼠经尾静脉注射实施例1制备的pd-l1引导的以油相超顺磁性纳米颗粒为载体的特异性靶向ctc检测结合肿瘤边界区分的生物探针缓冲液，注射用量为60μg/kg体重。在体成像实验结果显示，注射后带pd-l1靶向抗体的纳米探针2h后，小鼠乳腺癌病灶t2信号明显减弱，如图8所示。因此在探针聚集最浓的时间(2h)将小鼠脊柱处死后，解剖肿瘤做拉曼mapping成像，如图9所示上下两组图分别为乳腺癌mda-mb-231和结直肠癌ht-29的肿瘤及小鼠正常组织的拉曼明场及mapping图，虚线为其边界区分。图10为图9的边界选点所测得的拉曼光谱图。
95.实施例2
96.实施例2与实施例1的区别在于，将实施例1的拉曼信号分子改为4-mba，其余步骤同实施例1。能制备得到一种pd-l1引导的特异性靶向ctc检测结合肿瘤边界区分的生物探针。
97.实施例3
98.实施例3与实施例1的区别在于，将实施例1的拉曼信号分子改为罗丹明，其余步骤同实施例1。能制备得到一种pd-l1引导的特异性靶向ctc检测结合肿瘤边界区分的生物探针。
99.实施例4
100.实施例4与实施例1的区别在于，实施例4的步骤(1)具备sers功能的油相超顺磁性
fe3o4纳米颗粒的制备方法为：
101.各取15ml无水乙醇和顺式-9-十八碳烯酸加至100ml烧杯，加入2g naoh，800rpm进行搅拌至溶解，得到混合液；再取1.25g fe(nh4)2(so4)2·
6h2o溶解于30ml的水中，用滴管缓慢加入混合液中，待完全溶解后转移至反应釜，以200℃加热14h；之后吸取上清液，沉淀用环己烷分散，并用乙醇醇洗3次，储存在10ml环己烷中。其余步骤同实施例1。能制备得到一种pd-l1引导的特异性靶向ctc检测结合肿瘤边界区分的生物探针。
102.本发明的各方面、实施例、特征应视为在所有方面为说明性的且不限制本发明，本发明的范围仅由权利要求书界定。在不背离所主张的本发明的精神及范围的情况下，所属领域的技术人员将明了其它实施例、修改及使用。
103.在本发明的制备方法中，各步骤的次序并不限于所列举的次序，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，对各步骤的先后变化也在本发明的保护范围之内。此外，可同时进行两个或两个以上步骤或动作。
104.最后应说明的是，本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明作举例说明，而并非对本发明的实施方式进行限定。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，这里无需也无法对所有的实施方式予以全例。而这些属于本发明的实质精神所引申出的显而易见的变化或变动仍属于本发明的保护范围，把它们解释成任何一种附加的限制都是与本发明精神相违背的。

技术特征：
1.一种pd-l1引导的特异性靶向ctc检测结合肿瘤边界区分的生物探针，其特征在于，包括核心、共价有机框架以及pd-l1抗体，所述核心包括超顺磁性纳米颗粒，所述共价有机框架包覆在核心表面，pd-l1抗体结合在所述共价有机框架表面。2.根据权利要求1所述的一种pd-l1引导的特异性靶向ctc检测结合肿瘤边界区分的生物探针，其特征在于，所述超顺磁性纳米颗粒为粒径≤15nm的油相超顺磁性fe3o4纳米颗粒。3.根据权利要求2所述的一种pd-l1引导的特异性靶向ctc检测结合肿瘤边界区分的生物探针，其特征在于，所述粒径≤15nm的油相超顺磁性fe3o4纳米颗粒的制备方法包括以下步骤：将极性溶剂、顺式-9-十八碳烯酸和无机碱混合得到混合液，然后将硫酸亚铁铵水溶液加入上述混合液中，在100～500℃下加热1～20h，去除上清液，沉淀用非极性溶剂分散，清洗后储存在非极性溶剂中，得到油相超顺磁性fe3o4纳米颗粒。4.根据权利要求3所述的一种pd-l1引导的特异性靶向ctc检测结合肿瘤边界区分的生物探针，其特征在于，极性溶剂包括无水乙醇、甲醇、乙腈、丙酮中的一种或多种；和或，无机碱包括氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钡、氢氧化钙、氢氧化铝、氢氧化锂、氢氧化镁、氢氧化锌、氢氧化铜中的一种或多种；和或，非极性溶剂包括环己烷、己烷、苯、四氯化碳、二氯乙烷、二氯甲烷中的一种或多种。5.根据权利要求1所述的一种pd-l1引导的特异性靶向ctc检测结合肿瘤边界区分的生物探针，其特征在于，所述共价有机框架为tapb-btca cof，其通过包括tapb和btca的单体制备而得。6.根据权利要求1或5所述的一种pd-l1引导的特异性靶向ctc检测结合肿瘤边界区分的生物探针，其特征在于，共价有机框架包覆在核心表面的步骤包括：将核心、tapb和btca加入至乙腈，随后加入乙酸，室温搅拌，离心获得共价有机框架包覆核心。7.根据权利要求1所述的一种pd-l1引导的特异性靶向ctc检测结合肿瘤边界区分的生物探针，其特征在于，所述共价有机框架的厚度为1～5nm；和或，所述pd-l1引导的特异性靶向ctc检测结合肿瘤边界区分的生物探针的粒径为5～20nm。8.根据权利要求1所述的一种pd-l1引导的特异性靶向ctc检测结合肿瘤边界区分的生物探针，其特征在于，超顺磁性纳米颗粒、共价有机框架与pd-l1抗体的物质的量之比为(250～310)：(100～150)：(50～70)。9.根据权利要求1所述的一种pd-l1引导的特异性靶向ctc检测结合肿瘤边界区分的生物探针，其特征在于，所述核心还包括拉曼信号分子，拉曼信号分子连接在超顺磁性纳米颗粒表面。10.如权利要求1所述的一种pd-l1引导的特异性靶向ctc检测结合肿瘤边界区分的生物探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)、制备超顺磁性纳米颗粒，在超顺磁性纳米颗粒表面连接拉曼信号分子；(2)、将步骤(1)的产物、tapb和btca加入至乙腈，随后加入乙酸，室温搅拌，搅拌时间可列举为12～48h，离心获得共价有机框架包覆核心；(3)、在共价有机框架包覆核心中加入pd-l1抗体，搅拌，离心、重悬于磷酸盐缓冲液得
到pd-l1引导的特异性靶向ctc检测结合肿瘤边界区分的生物探针。

技术总结
本发明属于生物探针技术领域，涉及一种PD-L1引导的特异性靶向CTC检测结合肿瘤边界区分的生物探针及其制备方法。所述PD-L1引导的特异性靶向CTC检测结合肿瘤边界区分的生物探针，包括核心、共价有机框架以及PD-L1抗体，所述核心包括超顺磁性纳米颗粒，所述共价有机框架包覆在核心表面，PD-L1抗体结合在所述共价有机框架表面。本发明制备的PD-L1引导的特异性靶向CTC检测结合肿瘤边界区分的生物探针能够跨膜转运进入体内，顺利进入PD-L1阳性的恶性肿瘤病灶处，并进行拉曼成像，对肿瘤边界进行微观区分。进行微观区分。进行微观区分。


技术研发人员：邵国良 潘婷 林杰 武小侠 吴爱国 张定虎 李顺祥 何璐璐
受保护的技术使用者：中国科学院宁波材料技术与工程研究所 宁波慈溪生物医学工程研究所
技术研发日：2023.05.25
技术公布日：2023/9/23