一种重组慢病毒载体及其在哺乳动物T细胞中的应用的制作方法

一种重组慢病毒载体及其在哺乳动物t细胞中的应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，属于一种新型的慢病毒表达载体。将对蛋白功能研究，细胞系构建，基因与细胞疗法，药物筛选提供重要工具。


背景技术：

2.基因疗法和细胞疗法是目前国际上非常热门的机体疾病治疗手段。基因疗法主要是通过外源基因导入的方式对机体中有缺陷的基因进行补偿、取代、修复从而达到治疗疾病的目的。细胞疗法主要是通过基因工程和细胞工程的手段改造病人的免疫细胞使其更加特异性的识别靶细胞，如肿瘤细胞，从而实现特异性杀死肿瘤细胞的作用。根据基因传递方式的不同，可以将基因疗法和细胞疗法分为病毒和非病毒方式，其中病毒的方式是目前最主要的操作方式。
3.慢病毒是一类逆转录病毒，其最常见的一种自于hiv病毒。慢病毒的化学本质为单链rna病毒，其基因组包含表达外壳蛋白的gag以及表达整合酶和逆转录酶的pol。慢病毒具有广泛的侵染性，可以感染大部分哺乳动物细胞，感染细胞后可以通过逆转录得到cdna,然后随机的将基因组整合到宿主基因组上，形成稳定表达的细胞系。与此同时，不像γ逆转录病毒只能感染分裂细胞，慢病毒可以同时感染分裂和非分裂细胞，因此慢病毒已经成为基因疗法和细胞疗法的一个非常重要的工具。
4.为了不断的增加慢病毒载体的安全性，慢病毒载体从发现至今已经经历了三代。目前，比较常用的是二代慢病毒系统和三代慢病毒系统。二代慢病毒系统为三质粒系统，包括表达目的基因的表达质粒，表达tet-rev的包装质粒以及表达包膜蛋白的包膜质粒。三代慢病毒系统是在二代的基础上进一步改进，通过在5’ltr端删除u3区域，并且在上游融合了一个启动子使得三代系统不再依赖tet蛋白。另外，在3’ltr端部分去除u3降低其自我复制的能力，同时将gag-pol与rev分成两个质粒表达，进一步降低形成野生型病毒的风险。
5.目前，第三代三质粒慢病毒制备系统主要载体包括表达gag-pol和vsvg包膜蛋白的两个辅助质粒，以及包含目的基因，如gfp,luciferase，cd19 car等的表达质粒。常用的启动子有ef1a，mscv，pgk等。针对人源t淋巴细胞，ef1a效率最高，一般能检测到38％-63％的阳性率，但需要培养筛选超过15天，而且基因表达低，无法满足细胞治疗以及蛋白表达研究的需求(lentivirus-mediated gene transfer and expression in established human tumor antigen-specific cytotoxic t cells and primary unstimulated t cells,2003)。
6.为了满足市场对于高表达慢病毒载体的需求，我们研发了一种新型的慢病毒表达载体。本载体的特点在于通过增加gag蛋白长度，更换新的启动子，截短wpre以及在3’ltr下游增加终止信号等组合，可以进一步提高慢病毒载体对原代人源t淋巴细胞的感染效率进而增强目的基因的表达。该优化的载体可以更好的满足药物研发市场对于针对原代t淋巴细胞具有高表达效率的慢病毒载体的需求。


技术实现要素：

7.本发明通过各元件的改进与组合，设计了一种新的重组慢病毒载体。针对目前传统慢病毒载体对人源t淋巴细胞低表达效率的问题，本发明可以提升慢病毒载体在人源t淋巴细胞中的表达，进而满足细胞和基因治疗领域对于高效慢病毒载体的需求，从而实现目的基因的高表达，另外，也可以在相等表达量的情况下降低慢病毒的使用量进而降低药物开发成本，提升安全性。具体而言，本发明包含以下的方面：
8.1.一种基于plvx真核细胞慢病毒表达载体的重组慢病毒载体，其包含以下的元件:
9.(a)替换plvx载体中的gag元件的延长的gag元件，其位于5’ltr
10.下游，所述gag元件包含如seq id no：6所示的序列；
11.(b)替换plvx载体中的用于表达目的基因序列的启动子的鼠干细胞病毒mscv启动子，所述mscv启动子包含如seq id no：
12.3所示的序列；
13.(c)替换plvx载体中的增强表达元件wpre的c端截短的wpre
14.元件，所述c端截短的wpre元件包含如seq id no：4所示的序列；
15.(d)替换plvx载体中的sv40 poly a尾的bgh poly a尾，其位于截短的wpre元件下游，所述bgh poly a尾包含如seq id
16.no：5所示的序列。
17.2.如项1所述重组慢病毒载体，其进一步包含：
18.(e)任选的目的基因序列，其位于所述mscv启动子下游。
19.3.如项1或2所述重组慢病毒载体，其通过包含以下步骤的方法构建：
20.(i)将plvx载体中的gag元件替换成延长的gag元件，所述gag元件包含如seq id no：6所示的序列；
21.(ii)用鼠干细胞病毒mscv启动子替换plvx载体中用于表达目的基因序列的启动子，所述mscv启动子包含如seq id no：
22.3所示的序列；
23.(iii)将plvx载体中的增强表达元件wpre更换成更短的c端截短的wpre，所述c端截短的wpre元件包含如seq id no：
24.4所示的序列；
25.(iv)将plvx载体中的sv40 poly a尾更换成bgh poly a尾，bghpoly a尾包含如seq id no：5所示的序列。
26.4.如项3所述重组慢病毒载体，其中，所述方法进一步包含以下的步骤：
27.(v)将任选的目的基因序列插入至所述mscv启动子下游。
28.5.如项1～4中任一项所述的重组慢病毒载体，其中，所述plvx真核细胞慢病毒表达载体包含如seq id no：1所示的序列。
29.6.如项1～5中任一项所述的重组慢病毒载体，其具有如图1所示的结构。
30.7.如项1～6中任一项所述的重组慢病毒载体，其中，所述重组慢病毒载体包含如seq id no：2所示的序列。
31.8.一种慢病毒颗粒，其包含项1～7中任一项所述的重组慢病毒载体。
32.9.如项7所述的慢病毒颗粒，其通过293t包装慢病毒系统包装。
33.10.一种重组细胞，所述重组细胞通过用项1～7中任一项所述的重组慢病毒载体转染宿主细胞而得到。
34.11.如项10所述的重组细胞，其通过对选自以下的宿主细胞进行转染而得到：原代t细胞、永生化t细胞、从肿瘤组织中分离的t
35.细胞、先天淋巴细胞(ilc)。
36.12.一种医药组合物，其包含项1～7中任一项所述的重组慢病毒载体和/或项10或11所述的重组细胞。
37.13.如项13所述的医药组合物，其进一步包含医药上允许的添加剂。
38.14.一种试剂盒，其包含项1～7中任一项所述的重组慢病毒载体和/
39.或项10或11所述的重组细胞和/或项12或13所述的医药组合物。
40.15.一种转染细胞的方法，其包含以下的步骤：
41.(1)将细胞与项1～7中任一项所述的重组慢病毒载体接触，转染细胞。
42.16.根据项15所述的方法，其中，所述细胞选自：原代t细胞、永
43.生化t细胞、从肿瘤组织中分离的t细胞、先天淋巴细胞(ilc)。
44.17.一种重组慢病毒载体的构建方法，其包括以下步骤：
45.(i)将plvx载体中的gag元件替换成延长的gag元件，所述gag元件包含如seq id no：6所示的序列；
46.(ii)用鼠干细胞病毒mscv启动子替换plvx载体中用于表达目的基因序列的启动子，所述mscv启动子包含如seq id no：
47.3所示的序列；
48.(iii)将plvx载体中的增强表达元件wpre更换成更短的c端截短的wpre，所述c端截短的wpre元件包含如seq id no：
49.4所示的序列；
50.(iv)将plvx载体中的sv40 poly a尾更换成bgh poly a尾，bghpoly a尾包含如seq id no：5所示的序列。
51.18.如项17所述的方法，其进一步包含以下的步骤：
52.(v)将任选的目的基因序列插入至所述mscv启动子下游。
附图说明
53.图1为表达载体示意图，其中a为野生型载体wt-112，图b为本发明优化后载体mut-114。
54.图2为慢病毒wt-112梯度稀释图。
55.图3为优化后慢病毒mut-114梯度稀释图。
56.图4为t细胞病毒感染72h后luciferase检测统计图。
57.图5为t细胞病毒感染96h后luciferase检测统计图。
58.图6为本发明的通用载体的一个实施方式的载体示意图。
具体实施方式
59.除非明确指明，否则本技术的实施将采用本领域技术内的常规化学、生物化学、有机化学、分子生物学、微生物学、重组dna技术、遗传学、免疫学和细胞生物学的方法。这些方法的描述可以参见，例如，sambrook等人，molecular cloning:a laboratory manual(第3版，2001)；sambrook等人，molecular cloning:a laboratory manual(第2版，1989)；maniatis等人，molecular cloning:a laboratory manual(1982)；ausubel等人，current protocols in molecular biology(john wiley和sons，2008年7月更新)；short protocols in molecular biology:a compendium of methods from current protocols in molecular biology，greene pub.associates和wiley-interscience；glover，dna cloning:a practical approach，vol.i&ii(irl press，oxford，1985)；anand，techniques for the analysis of complex genomes，(academic press，new york，1992)；transcription and translation(b.hames&s.higgins，eds.，1984)；perbal，a practical guide to molecular cloning(1984)；harlow和lane，antibodies，(cold spring harbor laboratory press，cold spring harbor，n.y.，1998)current protocols in immunology q.e.coligan，a.m.kruisbeek，d.h.margulies，e.m.shevach和w.strober，eds.，1991)；annual review of immunology；以及期刊专著如advances in immunology。
60.除非另有定义，否则本技术中使用的所有技术和科学术语均具有与本领域一般技术人员通常所理解的含义相同的含义。为了本技术的目的，下文定义了以下术语。
61.在本发明中，术语“慢病毒载体”是指包含主要来源于慢病毒的ltr外部的结构和功能遗传元件的载体。慢病毒载体能够在体外和体内提供转基因到非分裂细胞中的有效递送、整合和长期表达。多种慢病毒载体是本领域已知的，参见naldini等(1996a，1996b和1998)；zufferey等，(1997)；dull等，1998，美国专利6,013,516号和5,994,136号。
62.在本发明中，术语“慢病毒颗粒”旨在表示包括包膜、具有慢病毒的一种或多种特征并且能够侵入靶宿主细胞的病毒颗粒。此类特征包括，例如，感染非分裂宿主细胞；转导非分裂宿主细胞；感染或转导宿主免疫细胞；含有包括gag结构多肽p7、p24和p17中的一个或多个的慢病毒病毒体；含有包括env编码的糖蛋白p41、p120和p160中的一个或多个的慢病毒包膜；含有包括作用于复制、前病毒整合或转录的一个或多个慢病毒顺式作用序列的基因组；含有编码慢病毒蛋白酶、逆转录酶或整合酶的基因组；或含有编码调控活性的基因组，诸如tat或rev。转移质粒可包含cppt序列，如描述于美国专利号8,093,042中。
63.在本发明中，术语“核苷酸”在本文中是指由糖部分(戊糖)、磷酸和含氮的杂环碱基组成的dna或rna的单体单元。碱基经由糖苷碳(戊糖的1
′
碳)连接至糖部分并且碱基与糖的此组合是核苷。当核苷含有键合至戊糖的3’或5’位置的磷酸基团时，它被称为核苷酸。聚合性可操作连接核苷酸的序列通常在本文中称为“碱基序列”、“核苷酸序列”或核酸或多核苷酸“链”并且在本文中通过其从左至右方向是在5’末端至3’末端的常规方向上的化学式来表示，所述5’末端和3’末端分别是指聚合物序列的“5
’”
和“3
’”
端处的末端5’磷酸基团和末端3’羟基。
64.在本发明中，术语“寡核苷酸”、“多核苷酸”和“核酸”在本文中是指包括两个或更多个，优选地超过三个脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸的分子。它的确切大小取决于许多因素，进而取决于寡核苷酸的最终功能或用途。寡核苷酸可合成或通过克隆或从天然(例
如，基因组)来源得到。如本文使用，术语“多核苷酸”是指由以链形式共价键合的核苷酸单体组成的聚合物分子。dna(脱氧核糖核酸)和rna(核糖核酸)是多核苷酸的实例。
65.在本发明中，术语“引物”在本文中是指寡核苷酸，不论天然地发生或合成产生，其在安置于诱导与核酸链互补的引物延伸产物的合成的条件下时能够充当核酸合成的启始点，例如，在四种不同核苷酸三磷酸和聚合酶例如耐热酶存在下，在适当缓冲液(“缓冲液”包括ph、离子强度、辅助因子等)中并且在合适温度下。为了获得扩增中的最大效率，引物优选地是单链，但是可替代地是双链。如果是双链，引物首先经处理以将其链分离，然后用于制备延伸产物。优选地，引物是寡脱氧核苷酸。引物必须足够长以在聚合酶例如耐热聚合酶的存在下起动延伸产物的合成。引物的确切长度取决于许多因素，包括温度、引物来源和使用方法。举例来说，取决于目标序列的复杂性，寡核苷酸引物通常含有15-25个核苷酸，但是它可含有更多或更少的核苷酸。短引物分子总体上需要更冷温度以与模板形成足够稳定的杂交复合物。
66.如本文所用，术语“重组慢病毒载体”或“重组lv”)是指人工创造的多核苷酸载体，其由于人为干预和操纵而由lv和多个附加区段组装而成。
67.在本文中，“包含”的表述包括“包含”以及“由
…
构成”的含义。
68.以下将本技术的各个方面进行详细说明。需要说明的是以下的说明并不具有限定作用，本领域技术人员根据以下的说明可以根据本领域的技术常识，在不显著阻碍本技术技术效果的前提下，进行任意的修改替换。
69.本发明提供一种基于plvx真核细胞慢病毒表达载体的重组慢病毒载体，其特征在于使用以下的改进的元件替换plvx载体中相对应的原元件，从而得到一种能够提高在t细胞中的表达效率的重组慢病毒载体，所述改进的元件选自:(a)替换plvx载体中的gag元件的延长的gag元件，其位于5’ltr下游，所述gag元件包含如seq id no：6所示的序列；(b)替换plvx载体中的用于表达目的基因序列的启动子的鼠干细胞病毒mscv启动子，所述mscv启动子包含如seq id no：3所示的序列；(c)替换plvx载体中的增强表达元件wpre的c端截短的wpre元件，所述c端截短的wpre元件包含如seq id no：4所示的序列；(d)替换plvx载体中的sv40 poly a尾的bgh poly a尾，其位于截短的wpre元件下游，所述bgh poly a尾包含如seq id no：5所示的序列。需要说明的是，此处的“替换”是指上述改进的元件替代原元件，并不需要完全准确地将原元件的全部序列替换为改进的元件的序列，例如，在将原元件的序列去除时，只要不影响上下游元件的功能，可以多去除前后的一定长度的序列。原元件的定义和具体序列是本领域技术人员所公知的，例如，可以参考各种商业化plvx载体(例如takara公司plvx-puro载体)的说明书，该说明书通过引用的方式引入本技术说明书。在一个实施方式中，所述重组慢病毒载体是一种用于表达任意目的基因序列的通用载体工具，其可以在mscv启动子下游包含有用于插入任意目的基因序列的区域。在一个实施方式中，所述用于插入任意目的基因序列的区域具有任意个限制性酶切位点。在一个实施方式中，其进一步包含：(e)任选的目的基因序列，其位于所述mscv启动子下游，所述基因序列没有任何限制，可以根据本领域技术人员的需求选择。在一个实施方式中所述目的基因序列是编码蛋白质的基因序列。需要说明的是，所述目的基因序列以能够在所述mscv启动子的调控下，在细胞中表达的方式插入所述mscv启动子下游。在一个实施方式中，为了便于操作，在不影响表达功能的情况下，所述重组慢病毒载体可以进一步包含抗性基因序列、标记基
因序列等需要的元件，所述需要的元件对于本领域技术人员而言，可以根据实际情况进行选择。例如，所述抗性基因序列可以举出：嘌呤霉素。在本发明中，“plvx真核细胞慢病毒表达载体”或“plvx载体”是指本领域常用的一种慢病毒表达载体类型，该载体类型具有通用的骨架，是本领域所公知的，例如可以参考takara公司plvx-puro载体的说明书，该说明书通过引用的方式引入本说明书。在一个实施方式中，所述通用的骨架具有以下的特征：1，在5
‘
ltr区域包含rsv或者cmv启动子，5’ltr下游为截短的gag序列连接慢病毒包装信号hiv-1ψ；2，接着下游为rev响应序列rre，具有促进外源基因表达的作用，后面连接cppt/cts序列，提升转导效率并促进转基因表达；3，后续任选连接有用于表达目的基因的启动子(通常为哺乳动物启动子，如ef1a等)以及任选的目的基因；4，在所述启动子和目的基因下游具有全长wpre序列；5，wpre下游为去除部分u3区域的ltr，同时包含一段sv40终止序列。“plvx真核细胞慢病毒表达载体”或“plvx载体”包含衍生自所述骨架的任何系列载体，例如：来自addgene的plvx-m-puro(plasmid#125839)，novopro公司plvx-puro载体(v010426#)等。在一个实施方式中，所述plvx真核细胞慢病毒表达载体包含如seq id no：1所示的序列。在一个实施方式中，所述重组慢病毒载体具有如图1所示的结构。在一个优选的实施方式中，所述重组慢病毒载体包含如seq id no：2所示的序列。
70.在一个方面，本发明还提供一种慢病毒颗粒，其包含本发明的重组慢病毒载体。所述慢病毒颗粒可以通过任意慢病毒包装系统进行包装而没有特别的限制，本领域技术人员可以根据需要进行选择。在一个实施方式中，所述包装系统例如可以为293t包装系统，用pmd2.g和pspax2辅助质粒进行包装或者其他三代辅助质粒。
71.在一个方面，本发明提供一种重组细胞，所述重组细胞通过使用本发明的重组慢病毒载体转染宿主细胞而得到。所述宿主细胞没有特别的限制，可以使用来源于各种生物的任何细胞。从已验证的本发明的重组慢病毒载体的技术效果的观点触达，优选所述宿主细胞是t细胞。在一个实施方式中，所述重组细胞通过对选自以下的细胞进行感染而得到：原代t细胞、永生化t细胞、从肿瘤组织中分离的t细胞、先天淋巴细胞(ilc)。此处，原代t细胞是指：从动物组织分离的t细胞，没有经过任何基因编辑的原始细胞，在体外无法无限增殖；本文的是实施例就用的此类细胞；永生化t细胞是指：在体外通过病毒转导或者其他方式对原代t细胞进行改造，使其获得体外无限增殖能力的细胞；从肿瘤组织分离出来的t细胞是指：将肿瘤组织在体外进行培养，让t细胞进行增殖，在通过pbmc等滋养层进行快速扩增获得的t细胞；先天淋巴细胞是指：也被称作固有免疫细胞，是一类不同于t细胞和b细胞的淋巴细胞亚群，位于肠道粘膜表面中，增强免疫反应，维持粘膜完整性和促进淋巴器官形成。
72.在一个方面，本发明还提供一种转染细胞的方法，其包含以下的步骤：将细胞与本发明的重组慢病毒载体接触，从而转染细胞。对于本领域技术人员而言，其他具体转染方法是公知的，可以根据需要任意选择。
73.在一个方面，本发明还提供一种医药组合物，其包含本发明的重组慢病毒载体和/或本发明的细胞。在一个实施方式中，所述医药组合物可以进一步包含医药上允许的添加剂。在一个实施方式中，本技术提供了一种组合物，其可包含本发明的重组慢病毒载体和/或本发明的细胞，以及药学上可接受的添加剂。所述药学上可接受的添加剂可以包括缓冲剂、抗氧化剂、防腐剂、低分子量多肽、蛋白质、亲水聚合物、氨基酸、糖、螯合剂、反离子、金
属复合物和、或非离子表面活性剂等。在本技术的一个实施方式中，所述药物组合物可被配制用于口服给药，静脉内给药(例如，静脉注射，i.v.)，肌肉内给药(例如，肌肉注射，i.m.)，在肿瘤部位的原位给药，吸入，直肠给药，阴道给药，经皮给药或通过皮下储存库给药。
74.在一个方式，本发明还提供一种试剂盒，其包含本发明的重组慢病毒载体和/或本发明的重组细胞和/或本发明的医药组合物。
75.在一个方面，本发明还提供所述本发明的重组慢病毒载体的构建方法，其包括以下步骤：
76.(i)将plvx载体中的gag元件替换成延长的gag元件，所述gag元件包含如seq id no：6所示的序列；
77.(ii)用鼠干细胞病毒mscv启动子替换plvx载体中用于表达目的基因序列的启动子，所述mscv启动子包含如seq id no：3所示的序列；
78.(iii)将plvx载体中的增强表达元件wpre更换成更短的c端截短的wpre，所述c端截短的wpre元件包含如seq id no：4所示的序列；
79.(iv)将plvx载体中的sv40 poly a尾更换成bgh poly a尾，bgh poly a尾包含如seq id no：5所示的序列。
80.在一个实施方式中，所述构建方法进一步包含以下的步骤：
81.(v)将任选的目的基因序列插入至所述mscv启动子下游。
82.需要说明的是，上述方法可以是序列设计方法或对现有载体进行改造的方法。各个步骤之间没有必须的顺序限制，可以根据需要任意排列。
83.实施例
84.实施例中所使用的材料如下：
85.实验物料
[0086][0087]
2.2实验设备：
[0088][0089][0090]
实施例1：载体构建
[0091]
wt-112载体构建：
[0092]
采用合适的表达载体是成功表达外源基因的关键，作为能够进行高表达适合工业规模化应用的哺乳动物细胞表达载体必须具备：强的启动子和高效的转录终止序列；增强表达的内含子或者元件。本发明对照载体拟将设计的基因luciferase(荧光素酶)克隆到通用的plvx真核细胞慢病毒表达载体(如seq id no：1所示，购买自苏州博腾生物制药有限公司)上，得到如seq id no：7所示的wt-112载体。
[0093]
mut-114载体构建
[0094]
为了获得一种能够进行高表达适合工业规模化应用的哺乳动物细胞表达载体，本发明的发明人对上述载体进行了改造。本发明的载体对上述的对照慢病毒载体进行了改造，本载体的技术特征如下：
[0095]
(a)替换plvx-wt-112中的gag元件的延长的gag元件，其位于5’ltr下游，所述gag元件包含如seq id no：6所示的序列；
[0096]
(b)替换plvx-wt-112中的人延长生长因子启动子ef1a的鼠干细胞病毒mscv启动子，所述mscv启动子包含如seq id no：
[0097]
3所示的序列；
[0098]
(c)替换plvx-wt-112中的增强表达元件wpre的c端截短的wpre元件，所述c端截短的wpre元件包含如seq id no：
[0099]
4所示的序列；
[0100]
(d)替换plvx-wt-112中的sv40 poly a尾的含有bgh poly a尾，其位于截短的wpre元件下游，所述bgh poly a尾包含如seqid no：5所示的序列。
[0101]
所述载体mut-114图谱见图1b，所述载体mut-114的序列如seq id no：8所示(图6表示未插入luciferase的mut-114的一个实施方式的图谱，其一个实施方式的序列如seq id no：2所示)。所述载体使用全基因化学合成，根据设计的序列委托苏州博腾生物制药有限公司全基因化学合成，并经过测序验证正确。
[0102]
病毒制备及滴度检测
[0103]
病毒制备，纯化及滴度检测委托苏州博腾生物制药有限公司进行。
[0104]
实施例2：病毒感染t细胞的制备
[0105]
cd3t细胞复苏及激活
[0106]
cd3t细胞(妙顺，pb03-n-2c)购自妙顺(上海)生物科技有限公司。
[0107]
提前将水浴锅打开，调整温度为37℃预热。
[0108]
将2支cd3t细胞从液氮罐取出，转移至含有干冰的泡沫盒中，消毒后传入细胞间传递窗。
[0109]
将cd3t细胞迅速在预热的37℃水浴锅融化，后转移至一个干净的含有10ml t细胞完全培养基()的15ml离心管中，混匀。
[0110]
室温离心，400g，10min。
[0111]
弃上清，将细胞沉淀用8ml t细胞完全培养基重悬，计数。
[0112]
用t细胞完全培养基，将细胞密度调整为1x106个/ml。
[0113]
按照1e6/ml加5μl激活磁珠(金斯瑞，l00899)，轻轻混匀，将细胞铺在6孔板中，每孔5.0ml。
[0114]
将细胞置于37℃，5％ co2的培养箱培养48h。
[0115]
慢病毒感染t细胞
[0116]
细胞计数，收集细胞于15ml离心管中，离心500g，6min；
[0117]
分别调整细胞密度为2e6 cells/ml，加入polybrene，调整终浓度为8μg/ml，每个孔加200μl细胞悬液(4e5 cells/孔)，共计5组*6梯度*2时间点+4＝64孔；
[0118]
按照moi＝2，moi＝5，moi＝10，moi＝20，moi＝30分别感染cd3t细胞，病毒梯度稀释见图2,图3；
[0119]
每孔添加200μl病毒稀释液；
[0120]
32℃离心，1500rpm，90min；
[0121]
离心结束后，将细胞置于37℃，5％ co2的培养箱培养。
[0122]
病毒感染24h换液
[0123]
病毒感染24h后，将感染病毒的细胞平板离心，400g，6min；
[0124]
用移液器轻轻吸取300μl上清，弃掉；
[0125]
每孔补液500μl t细胞完全培养基。
[0126]
将细胞置于37℃，5％ co2的培养箱培养。
[0127]
luciferase检测
[0128]
对每组细胞进行计数，每组取5.5e5细胞至新的96孔板中，用t细胞完全培养基将细胞密度调整为一致；
[0129]
分别在病毒感染后72h，96h对细胞进行luciferase检测，每组细胞取1.5e5细胞至白板中，每组3个重复，加等体积的bio-glo，室温避光孵育10min，多功能酶标仪(thermo，varioskan lux)进行检测。luciferase值高低代表病毒感染cd3t细胞能力的强弱。moi＝0的组作为非病毒感染对照组。72h，96hluciferase检测实验结果分别见图4，图5。
[0130]
从实验结果可以得出结论，本发明的改造的mutant(突变)慢病毒载体在原代人源t淋巴细胞中具有更高的目的基因表达量。
[0131]
本发明中使用的序列如下:
[0132]
seq id no：1
[0133]
agcttaatgtagtcttatgcaatactcttgtagtcttgcaacatggtaacgatgagttagcaacatgc
[0134]
cttacaaggagagaaaaagcaccgtgcatgccgattggtggaagtaaggtggtacgatcgtgccttatt
[0135]
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[0136]
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技术特征：
1.一种基于plvx真核细胞慢病毒表达载体的重组慢病毒载体，其包含以下的元件:(a)替换plvx载体中的gag元件的延长的gag元件，其位于5’ltr下游，所述gag元件包含如seq id no：6所示的序列；(b)替换plvx载体中的用于表达目的基因序列的启动子的鼠干细胞病毒mscv启动子，所述mscv启动子包含如seq id no：3所示的序列；(c)替换plvx载体中的增强表达元件wpre的c端截短的wpre元件，所述c端截短的wpre元件包含如seq id no：4所示的序列；(d)替换plvx载体中的sv40 poly a尾的bgh poly a尾，其位于截短的wpre元件下游，所述bgh poly a尾包含如seq id no：5所示的序列。2.如权利要求1所述重组慢病毒载体，其进一步包含：(e)任选的目的基因序列，其位于所述mscv启动子下游。3.如权利要求1或2所述重组慢病毒载体，其通过包含以下步骤的方法构建：(i)将plvx载体中的gag元件替换成延长的gag元件，所述gag元件包含如seq id no：6所示的序列；(ii)用鼠干细胞病毒mscv启动子替换plvx载体中用于表达目的基因序列的启动子，所述mscv启动子包含如seq id no：3所示的序列；(iii)将plvx载体中的增强表达元件wpre更换成更短的c端截短的wpre，所述c端截短的wpre元件包含如seq id no：4所示的序列；(iv)将plvx载体中的sv40 poly a尾更换成bgh poly a尾，bghpoly a尾包含如seq id no：5所示的序列。4.如权利要求3所述重组慢病毒载体，其中，所述方法进一步包含以下的步骤：(v)将任选的目的基因序列插入至所述mscv启动子下游。5.如权利要求1～4中任一项所述的重组慢病毒载体，其中，所述plvx真核细胞慢病毒表达载体包含如seq id no：1所示的序列。6.如权利要求1～5中任一项所述的重组慢病毒载体，其具有如图1所示的结构。7.如权利要求1～6中任一项所述的重组慢病毒载体，其中，所述重组慢病毒载体包含如seq id no：2所示的序列。8.一种慢病毒颗粒，其包含权利要求1～7中任一项所述的重组慢病毒载体。9.如权利要求7所述的慢病毒颗粒，其通过293t包装慢病毒系统包装。10.一种重组细胞，所述重组细胞通过用权利要求1～7中任一项所述的重组慢病毒载体转染宿主细胞而得到。11.如权利要求10所述的重组细胞，其通过对选自以下的宿主细胞进行转染而得到：原代t细胞、永生化t细胞、从肿瘤组织中分离的t细胞、先天淋巴细胞(ilc)。12.一种医药组合物，其包含权利要求1～7中任一项所述的重组慢病毒载体和/或权利要求10或11所述的重组细胞。13.如权利要求13所述的医药组合物，其进一步包含医药上允许的添加剂。14.一种试剂盒，其包含权利要求1～7中任一项所述的重组慢病毒载体和/或权利要求10或11所述的重组细胞和/或权利要求12或13所述的医药组合物。15.一种转染细胞的方法，其包含以下的步骤：
(1)将细胞与权利要求1～7中任一项所述的重组慢病毒载体接触，转染细胞。16.根据权利要求15所述的方法，其中，所述细胞选自：原代t细胞、永生化t细胞、从肿瘤组织中分离的t细胞、先天淋巴细胞(ilc)。17.一种重组慢病毒载体的构建方法，其包括以下步骤：(i)将plvx载体中的gag元件替换成延长的gag元件，所述gag元件包含如seq id no：6所示的序列；(ii)用鼠干细胞病毒mscv启动子替换plvx载体中用于表达目的基因序列的启动子，所述mscv启动子包含如seq id no：3所示的序列；(iii)将plvx载体中的增强表达元件wpre更换成更短的c端截短的wpre，所述c端截短的wpre元件包含如seq id no：4所示的序列；(iv)将plvx载体中的sv40 poly a尾更换成bgh poly a尾，bghpoly a尾包含如seq id no：5所示的序列。18.如权利要求17所述的方法，其进一步包含以下的步骤：(v)将任选的目的基因序列插入至所述mscv启动子下游。

技术总结
本发明提供一种基于plvx真核细胞慢病毒表达载体的重组慢病毒载体，其包含以下的元件:(a)替换plvx载体中的Gag元件的延长的Gag元件，其位于5’LTR下游，所述Gag元件包含如SEQ ID NO：6所示的序列；(b)替换plvx载体中的用于表达目的基因序列的启动子的鼠干细胞病毒MSCV启动子，所述MSCV启动子包含如SEQ ID NO：3所示的序列；(c)替换plvx载体中的增强表达元件WPRE的C端截短的WPRE元件，所述C端截短的WPRE元件包含如SEQ ID NO：4所示的序列；(d)替换plvx载体中的SV40poly A尾的bGH poly A尾，其位于截短的WPRE元件下游，所述bGH poly A尾包含如SEQ ID NO：5所示的序列。5所示的序列。5所示的序列。


技术研发人员：邹江波 李洪霞 张松梅 龚剑
受保护的技术使用者：毕诺济（上海）生物技术有限公司
技术研发日：2023.05.17
技术公布日：2023/9/23