一种抑郁症早期诊断生物标志物的筛查方法

1.本发明涉及生物医药领域，特别是涉及一种抑郁症早期诊断生物标志物的筛查方法。


背景技术：

2.抑郁症被称作“精神感冒”，在全世界范围内被认为是致残的主要原因。2008年，世卫组织将重度抑郁症列为全球疾病负担的第三大原因，并预测到2030年该病将排名第一。抑郁症的生化改变表现之一是中枢神经系统中单胺物质(5-羟色胺、去甲肾上腺素和/或多巴胺，即5-ht、ne、da)水平的紊乱。抑郁症与中枢神经的单胺神经递质(5-ht、ne、da)水平降低有密切关系。全世界有数百万人患有抑郁症，尽管药物治疗取得了进展，但许多患者即使在使用多种药物治疗后也没有症状缓解或治疗反应，因此，迫切需要确定生物标志物。生物标志物鉴定仍是一项正在进行的工作，事实上，迄今为止，还没有生物标志物充分证明其特异性、敏感性和可重复性可用于临床环境。目前，关于抑郁症早期诊断指标的相关研究仍然缺乏大量的研究，主要存在以下局限：(1)由于其伦理，缺乏合适的动物模型，采样的难度以及样本数量有限。(2)仍然缺乏对抑郁症早期单胺物质的直接连续动态监测。


技术实现要素：

3.本发明的目的是提供一种抑郁症早期诊断生物标志物的筛查方法，以解决上述现有技术存在的问题，通过筛查和验证确认单胺类物质可作为早期诊断抑郁症的生物标志物，为抑郁症提供了适合的动物模型以及长期直接动态监测抑郁症发展的方法。
4.为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
5.本发明提供一种抑郁症早期诊断生物标志物的筛查方法，包括以下步骤：
6.(1)提供猕猴脑脊液作为实验样品，所述猕猴脑脊液样品来自具有抑郁症核心行为表型的猕猴；
7.(2)对所述猕猴脑脊液进行预处理，并对所述猕猴脑脊液进行相关指标检测，以获取实验样品和对照样品之间的具有显著差异指标，确定为潜在生物标志物；
8.(3)基于步骤(2)确定的潜在生物标志物，以具有患抑郁症的高风险猕猴作为检测对象，连续动态定量监测具有患抑郁症的高风险猕猴的脑脊液中所述潜在生物标志物的水平，确定具有患抑郁症的高风险猕猴脑脊液潜在生物标志物与猕猴抑郁症表型的关系，从而确定所述潜在生物标志物与猕猴抑郁症相关的差异标志物，所得的差异标志物即为抑郁症早期诊断生物标志物。
9.优选的是，步骤(1)中，所述抑郁症核心行为表型为：经历慢性应激后表现出蜷缩。
10.优选的是，所述慢性应激包括空间限制、恐吓、长时间照明以及禁食。
11.优选的是，步骤(2)中，所述对照样品为经历慢性应激前，所测量的猕猴脑脊液中相关指标值，所述实验样品为受到慢性应激后，所测量的脑脊液中相关指标值。
12.优选的是，步骤(2)中，所述猕猴脑脊液的预处理方法为：
13.(1)将采集的脑脊液在液氮中冻存，在使用前，将冻存的脑脊液在冰上解冻；
14.(2)解冻后，将脑脊液和高氯酸溶液按照体积比1:1混合后，离心，取上清液；
15.(3)将所述上清液利用高效液相色谱法检测相关指标的含量。
16.优选的是，所述相关指标包括单胺类物质。
17.优选的是，相比对照猕猴脑脊液中的单胺类物质，随着时间延长，具有患抑郁症的高风险猕猴脑脊液中单胺类物质含量持续下降。
18.本发明还提供脑脊液中单胺类物质在制备抑郁症早期诊断分子标志物中的应用，所述脑脊液单胺类物质包括5-羟色胺、去甲肾上腺素以及多巴胺。
19.本发明公开了以下技术效果：
20.本发明提供了选取抑郁症早期标志物的思路，以及猕猴脑脊液样本采集具体步骤，单胺类物质检测成熟的实验方法。同时，通过对猕猴的脑脊液单胺类物质水平变化进行长期连续动态监测，明确回答猕猴脑脊液中单胺类物质能否作为早期诊断猕猴抑郁症标志物的问题，这为抑郁症研究提供了合适的动物模型，并为抑郁症早期单胺类物质的直接连续动态监测奠定理论基础。
附图说明
21.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
22.图1为筛选猕猴抑郁症模型早期脑脊液单胺类标志物的流程图；
23.图2为为高效液相色谱仪测定猕猴脑脊液单胺类物质含量流程图；
24.图3为猕猴脑脊液单胺类物质含量变化趋势图预测。
具体实施方式
25.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
26.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
27.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
28.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实
施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
29.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
30.实施例1
31.1、早期生物标志物选取思路以及文献筛选过程
32.1.1选取抑郁症早期生物标志物思路
33.(1)根据不同的分组，正常对照组和确诊抑郁症的病患组，比较组间各个指标的差异，差异显著的则作为抑郁症早期标志物的候选标志物；该生物标志物具有一定的特异性，只针对于抑郁症疾病而言。若在其他疾病中存在类似的变化，则该标志物则不能作为抑郁症的潜在早期标志物。
34.(2)获得候选标志物后，通过两种途径来进一步确定候选标志物能否作为最终的早期标志物预测抑郁症的发病：第一种途径是对人类的大规模研究，在发育的不同阶段，定时定量监测候选标志物的水平变化，如果候选标志物能够预测抑郁症相关表型，并且候选标志物的变化程度和表型相关性很强，那么就可以作为最终抑郁症早期标志物；第二种途径是对非人灵长类动物模型的建立过程中，定时定量监测候选标志物的水平变化，如果候选标志物能够预测抑郁症相关表型，那么就可以作为最终抑郁症早期标志物，这种途径用到的样本较少，8-30只就能满足实验需求。
35.1.2文献选取过程
36.研究人员系统检索web of science、pubmed数据库，从数据库中检索到的论文的发表日期包括从1975年6月到2022年6月，检索的论文仅包括同行评审的英文论文。
37.使用以下检索词：(depression、mdd、depression disorder、major depression disorder)和(marker、biomarker、early diagnosis、early indicators、early marker、diagnostic marker、cerebrospinal fluid marker、csf)。纳入具有抑郁症的患者或者有抑郁症高风险患者、正常对照组患者以及有生物标志物或早期标志物数据的文章。
38.如果出现以下情况，则排除选取：
39.(1)没有足够的数据；
40.(2)未从人类样本中评估潜在的生物标志物；
41.(3)无正常对照组；
42.(4)研究使用相同的样本队列；
43.(5)文章被撤回；
44.(6)在《3项研究中评估了单个标志物。
45.1.3抑郁症潜在早期脑脊液生物标志物
46.关于抑郁症的潜在早期生物标志物主要通过采集脑脊液样本，进行相关分析。提取具有标准偏差(sd)、样本量和p值的潜在生物标志物。此外，还需要记录纳入文章研究的儿童国家(纬度)、性别、年龄、数量、采样来源及方法、结果、文章出版年份、检测类型和诊断信息。
47.脑脊液：主要检测单胺物质浓度水平(5-ht、ne、da)。记录脑脊液采样量，方法，时间，样本处理，测量方法以及相应的检测结果，筛选与对照组相比具有显著差异的物质，作为潜在早期标志物的可能。
48.2、实验设计以及对象
49.探究抑郁症早期生物标志的流程图见图1，具体操作如下：
50.选取8只刚出生的雄性猕猴(macaca mulatta)，随机分为两组：母猴分离(ms,n＝4)和母猴抚养(mr,n＝4)。ms新生儿出生时与母猴分离，在保温箱中单独抚养一个月。mr猴自出生以来已经和它们的母亲生活了7个月。之后，将ms和mr猴子转移到室内(2.61
×
2.46
×
2.58m)-室外(2.67
×
2.66
×
2.67m)饲养的连接群落中。这八只猴子在遭受慢性应激之前已经在一起饲养了四年，然后它们分别被放进一个单独的笼子里单独饲养。在一个月的适应期后，随机进行几种不可预测的慢性应激(空间限制、恐吓、长时间照明和禁食)。在施加慢性不可预测应激之前(6月)，测量猕猴脑脊液中单胺类物质的基线值，直到慢性不可预测应激结束(8月)，并在整个过程中动态监测猕猴脑脊液中单胺类物质的浓度，从增加慢性压力到完全结束给压，动态严格定量确定脑脊液中单胺类物质的浓度。
51.ms组猕猴在经历后期的慢性压力后，出现了抑郁症的核心症状-hudding up(蜷缩行为)，这也说明该组猕猴已经患抑郁症，但mr组猕猴在经历了慢性应激之后，仍然没有出现抑郁症的核心症状。因此，我们从最初经历了ms后，就开始连续定量观察其猕猴的脑脊液单胺物质水平，看单胺物质水平是否能够判断患病，并与对照组存在显著性差异。
52.3、脑脊液样本收集以及单胺物质水平的监测
53.3.1样本的收集
54.首先麻醉实验动物，麻醉剂为surate麻醉剂(zoletil 50)，剂量为0.08ml/kg。一般在腰椎穿刺前，猴宝宝需要禁食2小时，喝水2小时，防止麻醉引起胃内容物反流。穿刺部位一般在猴腰椎第4棘突的上或下椎间隙(即第3～4或第4～5腰椎间隙)，选择7号腰椎穿刺针。用无菌低温保存管对脑脊液取样，将脑脊液备份成2-3份，然后转移到-80℃冰箱中保存。然后在测量前将样品放在冰上解冻。待样品解冻后，取50μl脑脊液加入1.5ml ep管中，加入50μl 0.1mol/l高氯酸溶液，置于4℃离心机中，以16000g速度离心15min。取50μl上清液放入注射管，放入注射盘进行注射。值得注意的是，采集的脑脊液必须清晰、无血色、浑浊、发黄，采集脑脊液时需要避光。收集到的脑脊液应迅速冷冻并储存在液氮中。样品在储存过程中不能反复冷冻和解冻，样品在整个过程中应避免光照。
55.3.2脑脊液单胺物质水平测量
56.检测流程图见图2，具体操作步骤如下：
57.采用高效液相色谱仪对csf 5-ht、ne、da进行电化学检测。首先制备所需的色谱柱和溶液：(1)准备pfspe色谱柱：将1-2mgpce-ps纳米纤维分成5-6等分试样，并使用直径为0.5mm的细钢棒将它们有序压缩到体积为200μl的移液器吸头的末端；(2)通过称取2.427克尿素，0.034克尿酸，0.09克肌酐，0.297克柠檬酸三钠，0.634克氯化钠，0.45克氯化钾，0.161克氯化铵，0.089克氯化钙二水合物，0.1克七水硫酸镁，0.034克碳酸氢钠，0.003克草酸钠，0.258克硫酸钠，0.1克磷酸二氢钠，和0.011克磷酸氢二钠，并将上述化学物质溶解到200毫升去离子水中；(3)通过将2mg化合物溶解到2ml蒸馏水中，制备1mg/ml二苯基硼酸盐(dpba)溶液储备溶液，将溶液储存在4℃的无光环境中。准备流动相：(1)准备一个干净的瓶子，至少1升。流动相由柠檬酸、乙二胺四乙酸(edta)二钠盐、单金属正磷酸钠、1-庚烷磺酸钠盐等物质组成随后将乙腈加入蒸馏水中，搅拌并超声振动15分钟，直到溶液中的物质全部溶解；(2)使用带玻璃电极的ph计，用饱和氢氧化钠溶液将流动相的ph值调节至4.21；(3)
用0.45μm聚偏氟乙烯微孔膜和真空抽吸装置过滤流动相以除去杂质；(4)每次使用前使用超声波振动15分钟对流动相进行脱气。高效液相色谱分析：(1)激活纳米纤维。使用100ml注射器以缓慢、滴加的方式将100μl甲醇和5μl水依次按入pfspe色谱柱；(2)将样品与100μl 2mg/ml dpba溶液和30μl 100ng/ml dhba溶液(is，内标)在0.5ml ep管中混合，然后将混合溶液转移到pfspe色谱柱中。利用气压的作用，用5ml气密塑料注射器将混合的样品溶液按压通过pfspe柱；(3)将100μl dpba溶液(2mg/ml)加载到spe色谱柱中，浸出色谱柱5次，并使用2mg/ml气密塑料注射器以气压将溶液缓慢推入柱中；(4)将50μl洗脱液加载到pfspe色谱柱上，然后将其推入色谱柱，用0.5ml ep管收集洗脱液；(5)打开hlpc脱气器对系统中的空气进行脱气。在进行样品分析之前，系统应使用流动相运行0.5小时以上，以平衡并降低基线噪声；(6)hplc的具体设置参数：流动相4％乙腈和离子物质，柠檬酸35mmol/l，乙二胺四乙酸(edta)二钠盐0.25mmol/l，正磷酸单金属钠乙酸钠45mmol/l，1-庚烷磺酸钠盐2mmol/l，加入饱和氢氧化钠溶液调节ph 4.21，流动相流速1.0ml/min，柱型为inertsil ods-3 5μm 4.6
×
150mm柱，dikma，立柱长度150mm，内径4.6mm，柱温30℃，探测器温度30℃，分析物的电压设置0.67v，注射量为20μl；(7)使用自动进样器对20μl洗脱液进行采样，然后将其注入hplc-ecd系统；(8)运行完成后，使用检测器接口关闭检测器。请勿使用探测器背面的开关关闭电池，因为这可能会损坏仪器；(9)手动将流动相组成更改为10％甲醇和90％水，至少运行30分钟。然后，手动将流动相更换为hplc级甲醇。运行约15分钟以保护系统在甲醇中，闭流量，然后关闭脱气器。
58.最后，将处理好的待测样品放入样品托盘中。色谱结果出来后，计算样品中待测物质的含量，并出具报告。
59.3.3猕猴脑脊液单胺类物质含量变化趋势图预测
60.分别对实验组(4只)与对照组(4只)的猕猴进行脑脊液单胺类物质长期(几个月)连续动态检测，随后对两组的数据进行统计，观察对照组与实验组猕猴在抑郁症发病早期脑脊液单胺类物质含量变化趋势。
61.结果如图3所示，其为猕猴脑脊液单胺类物质(以da为例)含量变化趋势图预测，结果显示：实验组猕猴脑脊液中单胺类物质含量明显低于对照组，并且随着时间延长，单胺类物质含量呈下降趋势。
62.以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

技术特征：
1.一种抑郁症早期诊断生物标志物的筛查方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)提供猕猴脑脊液作为实验样品，所述猕猴脑脊液样品来自具有抑郁症核心行为表型的猕猴；(2)对所述猕猴脑脊液进行预处理，并对所述猕猴脑脊液进行相关指标检测，以获取实验样品和对照样品之间的具有显著差异指标，确定为潜在生物标志物；(3)基于步骤(2)确定的潜在生物标志物，以具有患抑郁症的高风险猕猴作为检测对象，连续动态定量监测具有患抑郁症的高风险猕猴的脑脊液中所述潜在生物标志物的水平，确定具有患抑郁症的高风险猕猴脑脊液潜在生物标志物与猕猴抑郁症表型的关系，从而确定所述潜在生物标志物与猕猴抑郁症相关的差异标志物，所得的差异标志物即为抑郁症早期诊断生物标志物。2.根据权利要求1所述的筛查方法，其特征在于，步骤(1)中，所述抑郁症核心行为表型为：经历慢性应激后表现出蜷缩。3.根据权利要求2所述的筛查方法，其特征在于，所述慢性应激包括空间限制、恐吓、长时间照明以及禁食。4.根据权利要求1所述的筛查方法，其特征在于，步骤(2)中，所述对照样品为经历慢性应激前，所测量的猕猴脑脊液中相关指标值，所述实验样品为受到慢性应激后，所测量的脑脊液中相关指标值。5.根据权利要求1所述的筛查方法，其特征在于，步骤(2)中，所述猕猴脑脊液的预处理方法为：(1)将采集的脑脊液在液氮中冻存，在使用前，将冻存的脑脊液在冰上解冻；(2)解冻后，将脑脊液和高氯酸溶液按照体积比1:1混合后，离心，取上清液；(3)将所述上清液利用高效液相色谱法检测相关指标的含量。6.根据权利要求5所述的筛查方法，其特征在于，所述相关指标包括单胺类物质。7.根据权利要求1所述的筛查方法，其特征在于，相比对照猕猴脑脊液中的单胺类物质，随着时间延长，具有患抑郁症的高风险猕猴脑脊液中单胺类物质含量持续下降。8.脑脊液中单胺类物质在制备抑郁症早期诊断分子标志物中的应用，其特征在于，所述脑脊液单胺类物质包括5-羟色胺、去甲肾上腺素以及多巴胺。

技术总结
本发明公开了一种抑郁症早期诊断生物标志物的筛查方法，属于生物医药领域。本发明构建了完整的对于猕猴抑郁症的早期脑脊液标志物的筛查方法，提供了脑脊液单胺类标志物提取以及测定实验方法。该方法解决了现有技术筛选抑郁症脑脊液单胺类标志物的限制：(1)由于其伦理，缺乏合适的动物模型，采样的难度大，样本数量有限。(2)仍然缺乏对抑郁症早期单胺物质的直接连续动态监测。因此，本发明为抑郁症研究提供了合适的动物模型，并且为长期直接动态监测抑郁症的发展提供了合适的标志物并奠定了理论基础。了理论基础。了理论基础。


技术研发人员：冯晓丽 黎思雨 周仪
受保护的技术使用者：昆明医科大学
技术研发日：2023.07.11
技术公布日：2023/10/15