结合白细胞介素-22的核酸适配体及其制备方法及应用与流程

1.本发明涉及细胞诊断领域，尤其涉及一种结合白细胞介素-22的核酸适配体及其制备方法及应用。


背景技术：

2.白细胞介素-22(interleukin-22，简称il-22)是于2000年发现的由激活的t细胞分泌的细胞因子，是细胞因子il-10家族(还包括il-19,il-20,il-24,il-26,il-28,il-29)的成员。il-22由被激活的免疫细胞在炎症或感染反应中产生，主要通过与上皮细胞和基质细胞表面选择性表达的il-22受体结合而作用于这些细胞类型。一旦与il-22受体结合，il-22促进各种组织和器官的增殖、重塑和修复，以维持控制病原体入侵的固有宿主防御机制。il-22的表达在许多人类炎症性和感染性疾病中被检测到，例如银屑病或关节炎患者中。除了能够促进病理性炎症和组织修复，其还参与一系列编码炎症反应分子的基因的表达。最近的研究也报道il-22可以作为一种促肿瘤细胞因子，包括乳腺癌、肺癌和胃癌，并促进许多癌症的进展和转移。基于il-22在人类先天免疫系统中的表达和在疾病诊断中发挥着重要作用，实现对il-22的检测变得尤为重要。
3.核酸适配体(aptamer)是指通过指数富集的配基系统进化技术(selex)筛选分离得到的dna或者rna分子，它可以与其他靶标如蛋白质、金属离子、小分子、多肽甚至整个细胞进行高亲和力和特异性的结合，因此在生化分析，环境监测，基础医学，新药合成等方面展示广阔的前景。目前对il-22的检测主要是通过抗原抗体特异性结合的酶联免疫吸附试验法来实现，核酸适配体与抗体相比分子量小，稳定性更好，易改造修饰，无免疫原性，制作周期短，可以通过人工合成等优势，免去了动物免疫、饲养、蛋白提取和纯化等一系列耗时流程，所以利用利用核酸适配体进行il-22检测具有重要意义。


技术实现要素：

4.本发明针对上述问题，提出了一种结合白细胞介素-22的核酸适配体及其制备方法及应用。
5.本发明采取的技术方案如下：
6.一种结合白细胞介素-22的核酸适配体，核酸序列为gggaccagcacacgcataactcgccacggttgttggtccttgctggt ctgagatgcgtgttatgcgtgctaccgtg。
7.对于本种核酸适配体与白细胞介素-22结合后的检测，可以将白细胞介素-22固定在表面等离子共振仪(spr)的芯片上，加入本种核酸适配体后，通过仪器信号值的增强对白细胞介素-22进行检测。也可以将白细胞介素-22固定在酶联免疫吸附(elisa)所使用的96孔板上，加入本种核酸适配体后，通过目视颜色的变化以及仪器测定吸光度信号的变化表明两者的结合并对白细胞介素-22进行检测。
8.一种如上所述结合白细胞介素-22的核酸适配体的其制备方法，包括如下步骤，
9.羧基磁珠固定il-22和bsa步骤，
mix20μl、lib2-s1 5μl、lib2-a25μl、pfu酶4μl以及evagreen40μl。
26.可选的，每1000ul e-pcr mix包括双蒸水866μl、10*pfu酶buffer100μl、dntp mix 20μl、lib2-s1-fam 5μl、lib2-a2-ploya 5μl以及pfu酶4μl。
27.可选的，依序对文库变复性步骤、反筛步骤、e-pcr扩增步骤、扩增产物回收步骤以及单链制备步骤进行多次重复，且每一轮单链制备步骤中得到的单链作为下一轮文库变复性步骤的文库。
28.可选的，所述单链制备步骤中的凝胶电泳所采用的凝胶为尿素变性聚丙烯酰胺凝胶。
29.一种如上所述的结合白细胞介素-22的核酸适配体的应用，所述的结合白细胞介素-22的核酸适配体用于跟白细胞介素-22结合。
30.本发明的有益效果是：
附图说明：
31.图1是结合白细胞介素-22的核酸适配体的二级结构示意图，
32.图2是il-22筛选各轮保留率的结果示意图，
33.图3是spr检测文库亲和力结果示意图，
34.图4是spr检测il-22-apt-16适配体与il-22蛋白亲和力结果示意图，
35.图5是elisa实验中吸光度与蛋白浓度的函数图，
36.图6是elisa实验中吸光度与蛋白浓度的线性函数图。
具体实施方式：
37.下面结合各实施例，对本发明做详细描述。
38.实施例1
39.一种结合白细胞介素-22的核酸适配体(il-22-apt-16)，其核酸序列为
40.gggaccagcacacgcataactcgccacggttgttggtccttgctggt ctgagatgcgtgttatgcgtgctaccgtg，其二级结构如图1所示。
41.实施例2
42.一种制备如实施例1中所示的核酸适配体的方法，首先进行准备工作，准备工作包括设计dna文库以及引物准备。
43.随机单链dna文库：5
’‑
gggaccagcacacgcataac(36n)gtgttatgcgtgctaccgtg-3’。其中，“36n”表示36个任意的核苷酸碱基连接而成的序列。该文库由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
44.引物信息如表1所示，由通用生物(安徽)股份有限公司合成。
45.表1il-22引物及其序列
[0046][0047]
其中，引物名称中的s代表正向引物，引物名称中a代表反向引物，序列中的25个a表示由25个腺苷酸(a)组成的polya尾，“spacer 18”表示18原子的六乙二醇间臂。在上述3’端引物中所用的“spacer 18”结构式如下所示。
[0048][0049]
引物分别用dpbs缓冲液(dpbs：100mm，nacl：150mm，kcl：1mm，mgcl2：1mm，cacl2：1mm；ph 7.4，25℃)配制成100μm的贮存液，于-20℃保存备用。
[0050]
s1羧基磁珠固定il-22和bsa步骤
[0051]
1)il-22偶联：取50μl磁珠用h2o洗3次后加入100μl edc(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺)和nhs(n-羟基丁二酰亚胺)混合液，室温(即25℃左右)孵育15min。结束后水洗1次，加入40μl(40μg)il-22蛋白和60μl naac(ph 5.0)混合，室温孵育40min。磁分离用dpbs洗一次，并加入100μl乙醇胺(ph 8.5)，封闭15min。磁分离，用dpbs洗4次后用dpbs定容至50μl，4℃存储备用。
[0052]
2)bsa偶联：取50μl磁珠用h2o洗3次后加入100μl edc和nhs混合液，室温孵育15min。结束后水洗1次，加入40μl(80μg)bsa蛋白和60μl naac(ph 4.5)混合，室温孵育40min。磁分离用dpbs洗一次，并加入100μl乙醇胺(ph 8.5)，封闭15min；磁分离，用dpbs洗4次后用dpbs定容至50μl，4℃存储备用。
[0053]
s2文库变复性步骤
[0054]
1od(dna质量的定义单位od表示1ml dna溶液在1cm光程的标准比色皿中，260nm波长处吸光度为1时所含的dna总量)随机单链核苷酸文库，12000rpm离心10分钟，将文库离心到管底，用dpbs缓冲液溶解至10μm，分装到pcr管进行变复性处理。处理过程如下：pcr仪设定程序95℃保持10分钟，此步骤目的是使折叠的链解开，然后4℃保持5分钟，最后在25℃保持5分钟。
[0055]
s3反筛步骤
[0056]
文库变复性后首先与偶联好bsa的磁珠混合，于垂直旋转仪上室温孵育1h，孵育结束后于磁力架上进行磁吸，收集上清，记作正筛文库。磁珠用dpbs洗四次，清洗溶液记作pool 1-，pool 2-，pool 3-，pool 4-，磁珠加200μl dpbs沸水浴10min，收集上清记作elution-。
[0057]
s4正筛步骤
[0058]
正筛文库与偶联好il-22的磁珠混合孵育45min，孵育结束后于磁力架进行磁吸，
去除上清。磁珠用dpbs洗四次，清洗溶液记作pool1+，pool2+，pool3+，pool4+，磁珠加200μl dpbs沸水浴10min，收集上清记作elution+。
[0059]
s5 q-pcr扩增
[0060]
分别取2μl pool 1-，2-，3-，4-，elution-，pool 1+，2+，3+，4+，elution+，加入30μl q-pcr mix(配方如表3所示)于八联排pcr管进行q-pcr扩增。留1管空白q-pcr mix，加入2μl筛选缓冲液作为阴性对照，盖好管盖后将样品瞬时离心混匀，开始荧光定量pcr检测。
[0061]
pcr反应参数的设置可以参考如下示例：
[0062]
step 1(起始变性):95℃2min
[0063]
step 2(变性):
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
95℃0.5min
[0064]
step 3(退火):
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
60℃0.5min
[0065]
step 4(延伸):
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
72℃0.5min
[0066]
step 5(循环):
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
重复step 2 25次。
[0067]
依据q-pcr结果判断文库的富集程度和筛选情况，如果需要文库的标准曲线，需要在做筛选前对此文库进行标准曲线实验。
[0068]
表2q-pcr mix配方
[0069][0070]
s6 e-pcr扩增步骤
[0071]
将2ml e-pcr mix(配方如表3所示)融解离心，加入到50ml离心管中，再将步骤4中获得的elution+加入，轻摇离心管充分混匀。加入8ml(e-pcr mix体积的4倍)e-pcr微液滴生成油，使用大功率涡旋仪涡旋1～2min，静置1～3min，未出现分层透明液体，将涡旋后的乳浊液平均分装到12排8联排pcr管中，进行pcr扩增。
[0072]
pcr反应参数的设置可以参考如下示例，pcr反应的设置是根据lib2的模板、引物、pcr产物的长度和gc含量等条件设定的。
[0073]
step 1(起始变性):95℃1min
[0074]
step 2(变性):95℃1min
→
60℃1min
→
72℃1min
[0075]
step 3(循环):重复step 2 25次
[0076]
step 4(最终延伸):72℃5min
[0077]
step 5(临时保存):4℃保存
[0078]
表3 e-pcr mix配方
[0079]
试剂总体积1000μlddh2o866μl10*pfu酶buffer100μldntp mix(10mm)20μl正向引物lib2-s1-fam(100μm)5μl反向引物lib2-a2-ploya(100μm)5μlpfu酶4μl(500u)
[0080]
s7扩增产物回收步骤
[0081]
收集所有的e-pcr产物均分至2个15ml离心管中，再分别补加50～100μl超纯水，再各加8ml正丁醇，盖好管盖上下颠倒10次左右充分混匀，7500g离心10分钟。离心结束后，溶液澄清并分层。吸除上层的清澈液体和中层的油状乳浊液，将最下层的pcr扩增产物转移到1.5ml离心管中，若此时体积大于150μl，建议补加5倍左右体积的正丁醇并颠倒混匀，直至液体出现微浑浊状态(不可使溶液出现澄清状态)，12000rpm离心2min，吸除上层溶液正丁醇，直至将底部pcr产物浓缩至100μl左右。
[0082]
s8单链制备步骤
[0083]
将浓缩的pcr扩增产物，按体积比1:1加入tbe/尿素变性缓冲液，煮沸变性15分钟，随后冰浴1分钟，将所有的样品进行尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，300v电压下电泳至溴酚蓝到达胶底部，使加长的fam标记的链与反向的链分开,7m尿素变性聚丙烯酰胺凝胶配方如表4。
[0084]
表4变性聚丙烯酰胺凝胶配方
[0085]
成分用量尿素3.78g40％聚丙烯酰胺1.8ml5*tbe1.8mlddh2o2.25ml10％aps60μltemed15μl
[0086]
电泳结束后，将凝胶取出放在塑料膜上，ex：495nm，em：517nm检测需要的带有fam标记的ssdna；用干净的刀片将目的条带直接切下，将胶条转移至1.5ml离心管中并捣碎，加入1ml ddh2o后沸水浴10分钟将胶中的ssdna转移至溶液中，离心去除胶的碎片，留上清。上清用正丁醇纯化，方法与步骤7相同。得到dna单链用3kd的透析袋透析过夜，即可作为下一轮筛选的文库。
[0087]
磁珠法重复筛选7轮，每次操作均以前一次操作中得到的次级文库为起始核酸文库。磁珠法重复筛选7轮，每次依次进行s2至s7每次操作均以前一次操作中得到的次级文库为起始核酸文库。一共进行8轮筛选，每一轮筛选的条件如表5所示。
[0088]
表5il-22适配体筛选流程
[0089][0090]
所述筛选方法中，可逐轮增加筛选压力，以增进筛选核酸适配体的富集程度，缩短筛选进程。所述增加筛选压力包括减少投入的单链dna文库的量、靶标小分子的用量和两者的孵育时间，增加清洗时间，清洗次数以及加大反筛磁珠的用量等。
[0091]
迭代循环8轮筛选之后整理筛选数据进行处理分析，得到各轮筛选保留率如图2所示.
[0092]
完成上述富集之后再经克隆测序分析后，挑选若干条序列进行合成，而合成之后进行亲和性筛选，筛选完成之后挑选的得到实施1中所示的结合白细胞介素-22的核酸适配体(il-22-apt-16)。
[0093]
实施例3
[0094]
本实施例提供了一种表面等离子共振(spr)检测核酸适配体文库与il-22蛋白亲和力试验方法。
[0095]
实验方法，
[0096]
1)取一张cm5芯片(购买自ge公司，货号br100530)，芯片用1％sds naoh清洗芯片两次，流速为30μl/min，时间180s，400μl 50mm naoh清洗一次，流速为30μl/min，时间180s；
[0097]
2)芯片活化，偶联，封闭。(fc1-1活化后偶联bsa蛋白，fc1-2活化后偶联il-22蛋白)；
[0098]
3)用0.1m nhs与0.4m edc的混合试剂(1:1)活化1通道，时间600s，流速5μl/min；
[0099]
4)ph 4.0的醋酸钠溶液将bsa稀释，按照1:10的比例稀释，进样fc1-1通道，时间600s，流速5μl/min，连到芯片表面的值有3800ru。用ph 4.5的醋酸钠溶液将il-22蛋白稀释，按照1:20的比例稀释，进样fc1-2通道，时间600s，流速5μl/min，连到芯片表面的值有3100ru。
[0100]
5)ph 8.5乙醇胺溶液封闭1通道，时间600s，流速5μl/min；
[0101]
6)亲和力检测：将筛选所得文库用dpbs稀释至500nm*200μl进样，设定程序：通道为1；进样240s，流速为30μl/min，解离时间60s；1m nacl进行再生，再生条件为：进样时间60s，流速为30μl/min。
[0102]
实验结果：如图3所示，随筛选进行，每轮文库亲和递增，筛选效果良好，且与对照蛋白没有结合，特异性良好。
[0103]
实施例4
[0104]
本实施例提供一种表面等离子共振(spr)检测核酸适配体与il-22蛋白亲和力。
[0105]
实验方法如下：
[0106]
委托安徽通用生物合成核酸适配体il-22-apt-16，用dpbs缓冲液稀释成：25、50、100、200、400nm。
[0107]
将il-22蛋白偶联到cm5芯片表面：先用50mm naoh清洗芯片，进样20μl，流速10μl/min，然后用将等体积的edc水溶液和nhs水溶液混合后进样50μl活化芯片，流速5μl/min。将il-22蛋白用ph 4.5的10mm醋酸钠稀释至终浓度为50μg/ml后进样，进样体积50μl，流速5μl/min，il-22蛋白偶联量为6600ru。进样完成后，进乙醇胺封闭芯片，流速5μl/min，进样50μl。
[0108]
检测：使用表面等离子共振仪(ge healthcare，型号：biacore 8000)设定动力学检测参数，进样30μl/min*3min，解离30μl/min*5min，再生1m nacl 30μl/min*0.5min，将稀释好各个浓度的核酸适配体il-22-apt-16进样。
[0109]
核酸适配体il-22-apt-16与il-22蛋白的亲和力检测结果如图4所示，可以看出，随适配体浓度的不断升高，适配体结合蛋白的值也不断升高，且具有良好的线性关系，这些数据说明spr仪均检测到il-22-apt-16与il-22蛋白有很强的结合，经过系统的拟合，最终给出的kd值为21.5nm。
[0110]
实施例5
[0111]
本实施例公开了一种elisa验证il-22-apt-16核酸适配体与il-22蛋白亲和力的方法。
[0112]
实验方法如下：
[0113]
1.取一块新的酶标板，a1-a8孔包被不同浓度的il-22蛋白(ph 9.6包被缓冲液稀释，0.05m na2co3/nahco3缓冲液ph 9.6)，蛋白浓度分别为：1.6ng/ml、0.8ng/ml、0.4ng/ml、0.2ng/ml、0.1ng/ml、0.05ng/ml、0.01ng/ml和0ng/ml；每孔100μl，包被过夜。
[0114]
2.蛋白包被完成后，用1
×
ph 9.6碳酸盐包被液将bsa蛋白稀释至10mg/ml，每孔加入150μl，封闭板上多余的位点，时间为24h，去上清，dpbs(含0.05％吐温20)清洗1遍，甩干。
[0115]
3.a1-a8孔加入100μl 1nm的il-22-apt-16单克隆(生物素修饰)，室温孵育1h。孵育结束后用dpbs(含0.05％吐温20)清洗3遍，清洗时放置在摇床上，每次10分钟，每次清洗结束，甩干。
[0116]
4.加入sa-hrp(购自碧云天，货号a0303)用dpbs按照1:25000(v/v)配制，室温摇床孵育30分钟。用dpbs(含0.05％吐温20)清洗3遍，清洗时放置在摇床上，每次10分钟，每次清洗结束，甩干。
[0117]
5.每孔加入100μl tmb显色液，在室温显色1分钟，肉眼观察颜色变化。
[0118]
6.结果随着蛋白浓度的降低，颜色越来越淡，且从图5的函数图可以看到吸光度依
次降低，蛋白浓度与吸光度成正相关。如图6所示蛋白浓度在0.2ng/ml-1.6ng/ml范围内，浓度与吸光度线性关系较好，说明il-22-apt-16单克隆与il-22蛋白具有较好的亲和力。
[0119]
以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此即限制本发明的专利保护范围，凡是运用本发明说明书内容所作的等效变换，直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的保护范围内。

技术特征：
1.一种结合白细胞介素-22的核酸适配体，其特征在于，包括核酸序列gggaccagcacacgcataactcgccacggttgttggtccttgctggt ctgagatgcgtgttatgcgtgctaccgtg。2.一种如权利要求1中所述结合白细胞介素-22的核酸适配体的其制备方法，其特征在于，包括如下步骤，羧基磁珠固定il-22和bsa步骤，il-22偶联：取磁珠用水洗后加入edc和nhs混合液，孵育，孵育结束后水洗，加入il-22蛋白和ph 5.0的naac混合，孵育，磁分离用dpbs洗一次，并加入ph 8.5的乙醇胺封闭，再磁分离，用dpbs洗后用dpbs定容4℃存储备用；bsa偶联：取磁珠用水洗后加入edc和nhs混合液，孵育，孵育结束后水洗，加入bsa蛋白和ph 4.5的naac混合，孵育，磁分离用dpbs洗一次，并加入ph 8.5的乙醇胺，封闭，磁分离，用dpbs洗后用dpbs定容，4℃存储备用；文库变复性步骤，取随机单链核苷酸文库，而后离心，将文库离心到管底，用dpbs缓冲液溶解，分装到pcr管进行变复性处理；所述的随机单链核苷酸文库的序列为5
’‑
gggaccagcacacgcataac(36n)gtgttatgcgtgctaccgtg-3’，其中，“36n”表示36个任意的核苷酸碱基连接而成的序列；反筛步骤，文库变复性后首先与偶联好bsa的磁珠混合，而后孵育，孵育结束后进行磁吸，收集上清，记作正筛文库，磁珠用dpbs洗四次，清洗溶液记作pool 1-，pool 2-，pool 3-，pool 4-，磁珠加dpbs沸水浴，收集上清记作elution-；正筛步骤，将正筛文库与偶联好il-22的磁珠混合孵育，孵育结束后进行磁吸，去除上清，磁珠用dpbs洗四次，清洗溶液记作pool 1+，pool 2+，pool 3+，pool 4+，磁珠加dpbs沸水浴，收集上清记作elution+；e-pcr扩增步骤，将e-pcr mix与正筛步骤中获得的elution+混合，轻摇离心管充分混匀而后进行涡旋，将涡旋后的乳浊液平均分装到pcr管中，进行pcr扩增，所述e-pcr mix包括双蒸水、10*pfu酶buffer、dntp mix、正向引物lib2-s1-fam、反向引物lib2-a2-ploya以及pfu酶，所述lib2-s1-fam的序列为fam-gggaccagcacacgcataac，所述lib2-a2-ploya的序列为aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa-spacer18-cacggtagcacgc ataacac；扩增产物回收步骤，收集e-pcr扩增后的产物再分别超纯水以及正丁醇进行回收，得到浓缩的e-pcr扩增产物；单链制备步骤，将浓缩得到的e-pcr扩增产物加入tbe/尿素变性缓冲液，煮沸变性而后冰浴，而后进行凝胶电泳，使加长的fam标记的链与反向的链分开，而后检测带有fam标记的ssdna，将带有fam标记的ssdna的胶条粉碎提纯，而后再透析得到目标单链。3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，还包括q-pcr步骤，进行完整筛步骤之后先进行q-pcr步骤而后再进行e-pcr步骤，所述e-pcr步骤包括将pool 1-，pool2-，pool3-，
pool4-，elution-，pool 1+，pool2+，pool3+，pool4+以及elution+加入q-pcr mix中进行pcr扩增，所述q-pcr mix中包括双蒸水、10*pfu酶buffer、dntp mix、正向引物lib2-s1、反向引物lib2-a2、pfu酶以及evagreen；lib2-s1的序列为gggaccagcacacgcataac，所述lib2-a2的序列为cacggtagcacgcataacac。4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，每100ulq-pcr mix中包括双蒸水826ul、10*pfu酶buffer100μl、dntp mix20μl、lib2-s1 5μl、lib2-a25μl、pfu酶4μl以及evagreen 40μl。5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，每1000ul e-pcr mix包括双蒸水866μl、10*pfu酶buffer 100μl、dntp mix 20μl、lib2-s1-fam 5μl、lib2-a2-ploya 5μl以及pfu酶4μl。6.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，依序对文库变复性步骤、反筛步骤、e-pcr扩增步骤、扩增产物回收步骤以及单链制备步骤进行多次重复，且每一轮单链制备步骤中得到的单链作为下一轮温度文库变复性步骤的文库。7.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述单链制备步骤中的凝胶电泳所采用的凝胶为尿素变性聚丙烯酰胺凝胶。8.一种如权利要求1所述的结合白细胞介素-22的核酸适配体的应用，其特征在于，所述的结合白细胞介素-22的核酸适配体用于跟白细胞介素-22结合。

技术总结
本申请公开了结合白细胞介素-22的核酸适配体，本申请所公开的结合白细胞介素-22的核酸适配体序列为GGGACCAGCACACGCATAACTCGCCACGGTTGTTGGTCCTTGCTGGT CTGAGATGCGTGTTATGCGTGCTACCGTG。本申请还公开了制备上述核酸序列的方法，制备方法包括包括磁珠固定步骤、文库变复性步骤、正筛步骤、e-PCR扩增步骤、扩增产物回收步骤以及单链制备步骤。本申请还公开了白细胞介素-22的核酸适配体与白细胞介素-22结合时的应用。22结合时的应用。22结合时的应用。


技术研发人员：吴超超 牛成镇 高强 杨通
受保护的技术使用者：杭州佰辰医学检验所有限公司
技术研发日：2023.06.30
技术公布日：2023/10/15