一种人源性脉络丛乳头状瘤来源的细胞系及其应用的制作方法
未命名
10-19
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1.本技术涉及细胞系技术领域,尤其涉及一种人源性脉络丛乳头状瘤来源的细胞系及其应用。
背景技术:
2.脑脉络丛(choroid plexus,cp)是构成中枢神经系统血-脑脊液屏障(blood-cerebrospinal fluid barrier,bcb)的组织学基础,在脑的发育、成熟、老化过程、内分泌调控以及一些神经退行性疾病的病理过程中发挥重要作用。cp由室管膜向脑室内陷后分化形成,在脑室内呈网状排列,根据其解剖定位不同,可以分为侧脑室脉络丛、第三脑室脉络丛及第四脑室脉络丛。脉络丛不仅是脑脊液(cerebrospinal fluid,csf)的重要来源,同时也是构成的血-脑脊液屏障的结构基础,它可以阻止一些存在于外周血循环中的有害因子进入脑组织,同时也将一些血源性物质选择性地向csf内转运或将代谢废物排出至外周血循环,对中枢神经系统稳态的维持至关重要。
3.从生理角度看,脉络丛对中枢神经系统具有保护作用。首先,脉络丛具有屏障作用,可以将外周循环中的有害物质阻隔在中枢神经系统之外,维持神经系统的稳态。其次,脉络丛具有选择通透性,其表面大量的微绒毛和特定功能的蛋白受体/转运体能够有选择地主动吸收营养成分或排出代谢产物。再次,脉络丛具有分泌功能,是脑脊液形成的重要来源,而后者对脑组织具有一定的缓冲作用;同时,脉络丛分泌的生长因子等活性成分具有神经营养功能。在神经退行性疾病、中毒、神经炎症等一些病理情况下,脉络丛也发挥着很重要的作用。例如,在一些重金属(如铅、汞、镉等)中毒、毒性症状进行性加重时,脉络丛作为毒物进入脑实质组织之前的主要靶向贮存场所,使表现出对毒物具有蓄积效应,以及一定的缓冲池的作用。因此,脉络丛对于维持神经系统内环境的稳态具有重要意义,同时也是一些疾病病理过程的作用位点和关键因素,具有重要研究价值。
4.细胞系(cell line)指原代细胞培养物经首次传代成功后所繁殖的细胞群体,可分为有限细胞系(finite cell line)和无限细胞系(infinite cell line);二者的区别在于细胞培养物是否可以无限增殖、传代。细胞系是进行生命科学、生物学、医学研究的重要工具。1964年,wiktor等使用wi-38人肺成纤维细胞生产狂犬病疫苗。1975年,kohler和milstein发明了杂交瘤技术,使骨髓瘤细胞与免疫的动物脾细胞融合,形成能分泌针对该抗原的均质的高特异性的抗体——单克隆抗体的杂合细胞系,不仅在生物学和免疫学基础研究中具有重要的价值,在医学诊断中也有广泛的应用。20世纪80年代,通过对各类肿瘤细胞的研究,基因表达调控和癌基因的转化得到了深入的探索;20世纪90年代,大规模工业化的细胞培养被应用于生物制药行业。
5.细胞系是进行体外研究的基础,尤其是无限细胞系应用更为广泛,具有重要的应用价值。至今,全球最大的生物资源中心——美国模式培养物集存库(american type culture collection,atcc)已收录近4000种人源性细胞系和其他150个物种相关的各类细胞系,其中,scp细胞系(绵羊脉络丛组织来源)可被用于研究脉络丛组织功能。另已有的其
他6种未被收录的cp上皮细胞系,应用较多的是z310细胞系(大鼠脉络丛组织来源)和hibcpp细胞系(人脉络丛乳头状瘤来源),但z310细胞系具有种属差异性以及hibcpp恶性程度高,使其研究结果向应用的转化受到一定程度的限制。
技术实现要素:
6.为克服上述缺陷,本发明构建来源于良性的脉络丛乳头状瘤的人源性脉络丛细胞系,以最大程度保留其上皮细胞相关的生物学特性,满足相关的研发需求,为以脉络丛和血-脑脊液屏障为研究对象的生物学、医学、毒理学、药理学等研究提供有力的工具。
7.具体的,第一方面,本发明的目的之一在于提供一种新的人源性脉络丛乳头状瘤来源的细胞系,所述的细胞系表达生长因子,所述的生长因子包括生长分化因子15(growth differentiation factor 15,gdf15)、转化生长因子-β(transforming growth factor beta,tgfβ)和/或碱性成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor,fgf2)。
8.优选的,所述的生长因子至少包括gdf15,进一步优选的,所述的生长因子还包括tgfβ和/或fgf2。
9.优选的,所述的生长因子包括以蛋白或mrna的形式表达。
10.优选的,所述的细胞系来源于人脉络丛乳头状瘤,所述的细胞系具有接触抑制能力。进一步优选的,所述的细胞系来源于良性人脉络丛乳头状瘤,例如who分级为i级的良性人脉络丛乳头状瘤。
11.优选的,所述的细胞系为永生化无限细胞系。
12.优选的,所述的细胞系包含sv40大t抗原片段,所述的细胞系已将sv40的大t抗原片段整合入细胞系的细胞核内。
13.优选的,所述的细胞系表达上皮细胞特征性分子。
14.优选的,所述的上皮细胞特征性分子包括krt,进一步优选的,所述的上皮细胞特征性分子包括角蛋白7(keratin-7,krt-7)和角蛋白8(keratin-8,krt-8)。
15.优选的,所述的上皮细胞特征性分子包括以蛋白或mrna的形式表达。
16.优选的,所述的细胞系表达粘附连接(aj)蛋白和紧密连接(tj)蛋白,进一步优选的,所述的粘附连接蛋白包括钙粘蛋白(e-cadherin,cdh1),所述的紧密连接蛋白包括闭合蛋白(claudins,cldns),紧密连接蛋白(tight junction proteins,tjps),咬合蛋白(occludin,ocln)和/或紧密连接蛋白(junctional adhesion molecules,jams),更进一步优选的,所述的紧密连接蛋白包括闭合蛋白1(claudin-1,cldn1)、闭锁小带蛋白1(zonula occludens-1,zo-1)、封闭蛋白(occludin,ocln)、闭合蛋白11(claudin-11,cldn11)和/或连接黏附分子a(junctional adhesion molecules-a,jam-a)。
17.优选的,所述的粘附连接蛋白或紧密连接蛋白包括以蛋白或mrna的形式表达。
18.在本技术的一个实施方式中,所述的细胞系在mrna水平上表达cdh1、cldn1、cldn11、zo1、ocln和/或jama(jam1)等。
19.在本技术的一个实施方式中,所述的细胞系在蛋白水平上表达cdh1、cldn1、zo-1和/或ocln。
20.优选的,所述的细胞系表达脉络丛上皮细胞的特征性分子,进一步优选的,所述的脉络丛上皮细胞的特征性分子包括转甲状腺素蛋白(transthyretin,ttr)。
21.优选的,所述的脉络丛上皮细胞的特征性分子包括以蛋白或mrna的形式表达。
22.优选的,所述的细胞形态为多边形、多角形或竹节形。
23.优选的,所述的细胞系包括紧密连接和/或微绒毛结构等结构。
24.优选的,所述的细胞系包含amelogenin性别位点的杂合性缺失。
25.优选的,所述的细胞系命名为hcpp(human-derived choroid plexus papilloma cell line),保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为cgmcc no.45152,保藏日期为2022年05月17日。
26.第二方面,提供了一种上述的人源性脉络丛乳头状瘤来源的细胞系的构建方法,所述的方法包括:
27.(1)原代培养:将脉络丛乳头状瘤组织剪碎,分离组织细胞后,对细胞接种培养,传代;
28.(2)永生化;
29.(3)连续传代培养;
30.(4)生物学特性鉴定,获得人源性脉络丛乳头状瘤来源的细胞系。
31.优选的,所述的永生化包括病毒基因转染法、端粒酶激活法、癌基因法或回复性永生法。
32.进一步优选的,所述的病毒基因转染法包括使用eb病毒(epstein-barr virus,ebv)、猿猴病毒40(simian virus40,sv40)或人乳头瘤病毒(human papillomavirus,hpv)。
33.进一步优选的,所述的癌基因法包括对原癌基因进行基因转染,所述的原癌基因包括myc、c-jun、c-ias、vsrc或mdm2。
34.在本技术的一个实施方式中,采用脂质体法转染sv40大t抗原的表达质粒实现细胞系的永生化。
35.第三方面,提供一种细胞培养物或亚克隆细胞,所述细胞培养物或亚克隆细胞由上述的人源性脉络丛乳头状瘤来源的细胞系培养或者传代获得。
36.第四方面,提供一种组织或器官或其培养物,所述的组织或器官或其培养物来源于上述的人源性脉络丛乳头状瘤来源的细胞系或上述的细胞培养物或亚克隆细胞。
37.第五方面,提供一种上述的人源性脉络丛乳头状瘤来源的细胞系、上述的细胞培养物或亚克隆细胞或上述的组织或器官或其培养物的应用,所述的应用包括:
38.1)构建脉络丛上皮细胞或者组织的仿生模型;
39.2)构建血-脑脊液屏障的体外模型;
40.3)提取脉络丛合成分泌的多种神经营养物质,开发相关生物制品。
41.优选的,所述仿生模型或体外模型用于以脉络丛和血-脑脊液屏障为研究对象的生物学、医学、毒理学、药理学等研究,更优选的,所述仿生模型或体外模型用于与脉络从相关疾病的药物开发研究。
42.优选的,所述的神经营养物质包括但不限于脑脊液中所需要的各种蛋白、糖类等。
43.优选的,所述的脉络从相关疾病包括但不限于与脉络丛相关的炎症、血管病、肿瘤、变性、畸形、遗传病、免疫性疾病、营养代谢性疾病、中毒、外伤、寄生虫病。
44.第六方面,提供一种确定测试物质对血-脑脊液屏障的毒性的方法,该方法包括将所述测试物质与上述的人源性脉络丛乳头状瘤来源的细胞系或上述的细胞培养物或亚克
隆细胞一起孵育并评估细胞的活力。
45.优选的,所述的测试物质包括但不限于各种药物、毒物或微生物。
46.本发明相关术语说明
47.细胞系:从一个或几个共同祖先细胞扩增的细胞群体,例如但不限于从单个分离的细胞扩增的细胞克隆群体。
48.亚克隆:在细胞克隆中,对培养的细胞来说,从原有的克隆中,再筛选出具有某种特性的细胞进行培养,就是亚克隆。
49.与现有技术相比,本技术的有益效果:
50.第一,该细胞系是一株无限细胞系,可连续传代;
51.第二,相比于z310、scp细胞系,本技术细胞系为人源性细胞系,避免了种属差异对实验结果造成的影响;
52.第三,本技术细胞系较好地保留了脉络丛上皮细胞的生物学特征,具有较为完整的细胞紧密连接和分泌功能,细胞的恶性程度低于现有人源性脉络丛上皮细胞(hibcpp)。在以脉络丛上皮细胞或血-脑脊液屏障为主要研究对象的基础医学研究、生物医药研发、毒理学药理学等研究领域中具有较高的应用价值。
53.保藏信息:细胞系于2022年05月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为cgmcc no.45152。
附图说明
54.图1:构建hcpp细胞系的技术路线图;
55.图2:患者肿瘤组织病理诊断结果:脉络丛乳头状瘤(who i级)。图a和b为不同观察视野,放大倍数均为400x;
56.图3:光学显微镜下hcpp的形态学观察,100
×
,其中,a1、a2分别为hcpp passage64低密度和高密度细胞形态图,b1、b2分别为hcpp passage104低密度和高密度细胞形态图,c1、c2分别为hcpp passage134低密度和高密度细胞形态图;
57.图4:透射电子显微镜下hcpp的超微结构观察(a:2500
×
;b:2000
×
);
58.图5:hcpp细胞生长曲线,n=4;
59.图6:细胞系的str分型图谱;
60.图7:细胞系的核型分析代表图;
61.图8:hcpp鉴定相关指标mrna表达情况,n=3;
62.图9:krt的蛋白表达水平,其中,
“‑”
:tk-6细胞,作为阴性对照,“+”:hepg2细胞,作为阳性对照,pan-krt为全部krt抗体;
63.图10:ttr mrna扩增的溶解曲线;
64.图11:ttr mrna的扩增曲线;
65.图12:ttr的蛋白表达水平,其中,
“‑”
:tk-6细胞,作为阴性对照,“+”:hepg2细胞,作为阳性对照;
66.图13:连接蛋白的表达情况,其中,
“‑”
:tk-6细胞,作为阴性对照,“+”:hepg2细胞,作为阳性对照;
67.图14:elisa方法检测hcpp分泌gdf15情况;
68.图15:采用软琼脂克隆形成实验检查hcpp细胞恶性转化程度的代表图片;
69.图16:采用裸鼠荷瘤实验检查hcpp细胞恶性转化程度的代表图片;
70.图17:hcpp细胞培养上清液中支原体污染检测结果,其中,“m”:dna marker,
“‑”
:人口腔咽拭子-阴性对照物,“+”:人口腔咽拭子-阳性对照物,“空”:pbs-空白对照组,p67、p107、p137为不同传代次数;
71.图18:采用western blot测定hccp细胞对神经毒物-氯化锰刺激的反应性结果,其中,a为gdf-15蛋白表达水平,b为不同氯化锰浓度下gdf-15蛋白的相对表达情况;
72.图19:采用western blot测定hccp细胞对神经保护性药物刺激的反应性结果,其中,a为gdf-15蛋白表达水平,b为不同药物刺激下gdf-15蛋白的相对表达情况,memantine为美金刚,amantadine为金刚烷胺。
具体实施方式
73.以下由特定的具体实施例说明本技术的实施方式,熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本技术的其他优点及功效。
74.在进一步描述本技术具体实施方式之前,应理解,本技术的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案;还应当理解,本技术实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案,而不是为了限制本技术的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法,通常按照常规条件,或者按照各制造商所建议的条件。
75.除非另外定义,本技术中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外,根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本技术的记载,还可以使用与本技术实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本技术。
76.实施例1hcpp细胞系的制备
77.本技术的技术路线如图1所示,首先将患者的脉络丛乳头状瘤组织进行原代培养、永生化、连续传代培养等操作获得一株全新的人源性脉络丛乳头状瘤细胞系,并对该细胞的生物学特征进行了系统的鉴定,鉴定指标包括脉络丛上皮细胞特征性分子的表达水平鉴定、紧密连接相关分子的鉴定、分泌功能的鉴定,以及生长曲线、遗传学、形态性等指标的鉴定。本实验是在获得医学伦理审查委员会批准、并知情同意的情况下进行。
78.(一)组织来源
79.组织来源于首都医科大学附属北京天坛医院患者的第三脑室病理占位性病变部位(影像学),该患者(2岁,男性)被诊断为脉络丛乳头状瘤(who分级,i级)。将术后4℃保存的脉络丛组织于手术当日(2016年3月21日)取回进行组织培养操作。患者肿瘤组织病理诊断结果如图2所示,表现为脑室内肿瘤组织呈外生性生长的乳头状结构,由少量疏松结缔组织及成熟毛细血管构成乳头的轴心,表面衬附分化良好的单层立方上皮样肿瘤细胞,细胞异质性较小,细胞核排列极向比较整齐,未见浸润,病变符合脉络丛乳头状瘤。病理分型为脉络丛乳头状瘤(who i级)。
80.(二)原代培养
81.组织剪碎后,采用胰蛋白酶消化法分离组织细胞,其方法步骤如下:
82.(1)将组织切至形成约1~3mm3的小块,并移入15ml离心管中,加入dmem清洗组织
块去除血液,自然沉淀后去除上清。
83.(2)组织块中加入2ml胰蛋白酶消化液(0.25%),置于37℃恒温摇床上孵育5
84.min后,自然沉淀取上清。
85.(3)上清移入50ml离心管中,加入4ml胎牛血清中和胰酶的消化作用;沉淀中继续加入2ml胰酶消化液进行消化。
86.(4)重复上述步骤5~10次,直至组织块被消化完全。
87.(5)收集各次上清,300g离心10min后去除上清,加入适量完全培养基(含有10% fbs、10ng/ml人表皮生长因子、100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素的dmem培养基)重悬细胞。
88.(6)细胞悬液过70μm细胞筛去除组织碎片,随后进行细胞计数,并重悬至1
×
89.106个/ml。
90.(7)将细胞接种在10cm平皿中,置于37℃、5% co2进行培养。
91.(8)细胞每3~4天更换完全培养基,细胞增殖至90%左右汇合度时进行传代。
92.(三)细胞永生化
93.培养的细胞采用脂质体(lipofectamine 3000)法转染sv40大t抗原的表达质粒(plenti-ef1a-sv40 large t)进行永生化,操作步骤如下:
94.(1)将原代培养物传代并接种在6孔板中。
95.(2)待细胞生长至汇合度达到70%~80%进行转染。
96.(3)取0.6ml离心管,标记为“a”,并加入125μl opti-mem培养基和7.5μl lipofectamine 3000试剂,充分混匀。
97.(4)取0.6ml离心管,标记为“b”,并加入125μl opti-mem培养基、2.5μg plenti-ef1a-sv40 large t质粒和5μl p3000试剂,充分混匀。
98.(5)将a、b两管中的试剂混合,室温孵育10~15min。
99.(6)细胞换液,加入2ml完全培养基,随后将混合物加入培养基,充分混匀。
100.(7)细胞置于37℃、5% co2培养箱中培养,进行后续的连续传代操作。
101.(四)连续传代培养
102.将转染后的原代培养物按照常规的传代培养方式进行为期6年的连续培养,至今已超过130代。在此过程中,细胞培养物的形态学特征稳定,生长状态良好,可判定该细胞培养物为一全新的、人源性脉络丛上皮乳头状瘤组织来源的无限细胞系,将其命名为hcpp(human-derived choroid plexus papilloma cell line)细胞系。
103.实施例2hcpp细胞系的生物学特征鉴定
104.人脉络丛上皮细胞之间的紧密连接是构成血-脑脊液屏障的核心结构,同时脉络丛上皮细胞也具有分泌脑脊液的重要功能。因此,对于该细胞系的生物学特征鉴定将紧密围绕上述两种功能展开。采用形态学、分子生物学、细胞生物学相关指标对三个代次的hcpp细胞进行系统的鉴定,一方面明确其生物学特征,另一方面通过三个代次细胞的比较来判断这些生物学特征的稳定性。
105.本发明分别对细胞形态学、生长动力学、遗传学、恶性程度等进行检测,确定该细胞系的生物学特征。
106.1.形态学特征
107.采用光学显微镜观察细胞的形态,采用电子显微镜观察细胞的微绒毛等超微结
构。光镜下hcpp呈多角(边)形或竹节形;在生长至中、高汇合度下,细胞之间相互连接形成“结网”状。如图3所示,3代次细胞均呈圆形或卵圆形,观察发现细胞显示出均匀的多边形上皮样形态,细胞呈铺路石样镶嵌排列,此外,hcpp细胞在生长至细胞密度较高时可观察到“接触抑制”现象,提示细胞的恶性程度较低。
108.在透射电子显微镜下观察hcpp细胞,如图4所示,图4a黑色箭头指向处是一个明显的连接样结构,这是一种仅存在于上皮和内皮细胞间的一种结构;图4b可见细胞表面存在清晰可见的微绒毛,参与细胞的分泌功能;除此之外,电镜下也观察到了细胞核和丰富的线粒体等细胞的基本结构。
109.2.细胞生长动力学指标
110.采用实时细胞分析系统(real-time cell assay,rtca)监测细胞的复制增殖状况,软件可根据生长曲线计算得出细胞的群体倍增时间,如图5所示。其群体倍增时间为16.0
±
1.3h。
111.3.遗传学特征鉴定
112.(1)str基因型鉴定
113.以短串联重复序列(short tandem repeats,str)作为遗传标记对细胞进行遗传分型,是进行细胞交叉污染和性质鉴定的最有效和准确的方法之一,str基因分型应用于细胞鉴定已被atcc等机构强烈推荐。美国的atcc细胞库、德国的dsmz细胞库以及日本的jcrb细胞库等为str分型提供了各细胞株的数据供比对。
114.str基因位点由长度为3~7个碱基对的短串连重复序列组成,这些重复序列广泛存在于人类基因组中,可作为高度多态性标记,被称为细胞的dna指纹,其可通过pcr(聚合酶链式反应)来检测。str基因座位上的等位基因可通过扩增区域内重复序列的拷贝数的不同来区分,在毛细管电泳分离之后可通过荧光检测来识别。随后通过一定的计算方法,即可根据所得的str分型结果与专业的细胞str数据库比对从而推算出样品所属的细胞系或可能的交叉污染的细胞系名称。
115.针对实施例1所构建的hcpp细胞及其组织来源的str鉴定结果如图6和表1所示,结果显示:
116.表1hcpp(p64)的基因分型结果(str分析,atcc认可的9位点)
117.基因位点hcpp某患者amelogeninx,xx,yd5s81812,1312,13d13s31711,1311,13d7s8208,108,10d16s5399,119,11vwa16,1816,18th017,107,10tpox11,1111,11csf1po10,1310,13
118.1)hcpp细胞中没有发现其他人源性细胞的交叉污染,为单一来源的人类细胞系;
119.2)hcpp的21个str检测位点峰值结果与患者肿瘤组织检测结果相比,除性别位点
外,20个str检测基因座检测结果完全一致,判断该细胞系来源于该患者的肿瘤组织,hcpp细胞在性别位点amelogenin处发生了杂合型丢失(loss of heterozygosity,loh);
120.3)hcpp的str分型结果数据与美国atcc、德国dsmz的str数据库中细胞对比,未发现与该细胞系位点完全相同的细胞株,说明hcpp细胞系为一株全新的细胞系。
121.(2)染色体核型分析
122.染色体核型分析是以分裂中期染色体为研究对象,根据染色体的长度、着丝点位置、长短臂比例、随体的有无等特征,并借助显带技术对染色体进行分析、比较、排序和编号,根据染色体结构和数目的变异情况来进行诊断。核型分析可以为细胞遗传分类、染色体数目和结构变异的研究提供重要依据,以确定细胞的基因组倍型和染色体畸变情况。
123.针对实施例1所构建的hcpp细胞核型分析结果如图7、表2和表3所示,结果显示:随机选择分析的20个分裂相均为二倍体核型,该细胞系存在一定的数目及结构异常情况,具体如下:39~46,x,-y,add(5)(q35),-6,-7,add(8)(q24),+11,add(12)(q24),der(14;15)(q10;q10),add(15)(p11),add(15)(p11),der(15),-19,-21,i(21)(q10),-22,+mar1。
124.表2 hcpp(p72)染色体数目异常分布
125.染色体数量39404143444546合计细胞数目112346320
126.注:20个细胞分裂相均为二倍体核型
127.表3 hcpp(p72)染色体主要结构异常分布
128.核型异常类别-yadd(5)(q35)add(8)(q24)add(15)(p11)-21i(21)(q10)+mar1细胞数目20191912202019
129.注:
“‑”
:缺失该染色体;“add”:附加于染色体区带的未知来源的染色体片段;“i”:等臂染色体;“+mar”:标记染色体,不能通过显带方法辨别的结构异常的染色体4.脉络丛上皮细胞特征性分子的检测
130.首先采用了real-time pcr和western blot实验显示,hcpp表达较高水平的keratin-7、8,keratin被公认为是一种上皮细胞表达的中间丝蛋白,如图8-9和表5所示,提示该细胞系为上皮组织来源,其中,pcr过程中所使用的引物如表4所示。
131.表4实时荧光定量pcr相关引物序列
[0132][0133][0134]
表5 krt mrna表达情况,n=3
[0135]
基因名称ct(均值
±
标准差)tuba1a(内参)18.42
±
0.07krt719.66
±
0.04krt819.91
±
0.06
[0136]
此外,hcpp还表达脉络丛上皮细胞的特征性分子—ttr,如图8、10-12和表6所示,证明该细胞系来源于脉络丛上皮组织,并保留了一定的脉络丛上皮细胞特征。其中,pcr过程中所使用的ttr引物如表4所示。
[0137]
表6 ttr mrna表达情况,n=3
[0138]
基因名称ct(均值
±
标准差)tuba1a(内参)18.42
±
0.07
ttr29.71
±
0.13
[0139]
5.细胞紧密连接
[0140]
细胞之间的紧密连接属于不通透连接,普遍存在于脊椎动物体内各种上皮和内皮细胞。在相邻的两个细胞有紧密连接的区域的质膜形成索条,索条呈圆筒状,借助特定的蛋白质和二价阳离子,使两个索条紧密并列在一起,从而封闭了细胞之间的间隙,使大分子物质难以通透,而只允许水分子和离子从索条衔接处的小孔透过。质膜形成的索条带交织成网状,以增加紧密连接的面积和密度,更有效地防止大分子在细胞之间穿行。另外,索条与胞质内的细丝相连,可加强细胞韧性,使紧密连接也能起一定的机械支持作用。每条封闭索由一列嵌入两个原生质膜的跨膜蛋白复合体构成,蛋白的胞外结构域使其彼此间一个个直接相联。
[0141]
构成紧密连接跨膜蛋白复合体的蛋白组分包括claudins,zos,occludin和/或jams等。本技术采用real-time pcr和western blot技术检测hcpp细胞系紧密连接相关基因的表达水平,结果如图8和表7所示。在mrna水平上,hcpp细胞表达cdh1、cldn1、cldn11、zo1、ocln和jama,引物序列如表4所示。在蛋白水平上,如图13所示,hcpp细胞中zo-1、ocln、cdh1、cldn1等连接相关蛋白均有一定水平的表达。
[0142]
表7部分连接蛋白mrna表达情况,n=3
[0143]
基因名称ct(均值
±
标准差)tuba1a(内参)18.42
±
0.07cdh131.04
±
0.10cldn123.51
±
0.17cldn1123.53
±
0.03zo124.79
±
0.12ocln25.37
±
0.06jam124.87
±
0.06
[0144]
6.脑脊液分泌功能
[0145]
脉络丛上皮组织是脑脊液的主要来源,其分泌的各种蛋白分子具有营养神经元的功能。我们从中挑选了四个脉络丛上皮细胞特征性的分泌蛋白进行检测,包括tgfβ、gdf15、fgf2等三种营养因子。在mrna水平上,hcpp细胞表达gdf15、tgfb和fgf2,结果如图8和表8所示,引物序列如表4所示。在蛋白水平上,本技术亦采用elisa技术检测了gdf15的蛋白表达情况,如图14所示。
[0146]
表8分泌蛋白mrna表达情况,n=3
[0147]
基因名称ct(均值
±
标准差)tuba1a(内参)18.42
±
0.07gdf1532.78
±
0.13tgfb23.81
±
0.03fgf224.05
±
0.28
[0148]
7.其他特征
[0149]
(1)采用软琼脂克隆形成实验和裸鼠荷瘤实验评价细胞系的恶性程度
[0150]
正常细胞依靠细胞与细胞外基质的接触才能生长和分裂,相反,无论周围环境如
何,转恶性程度较高细胞均具有生长和分化的能力,因此能够以锚定独立的方式形成菌落的细胞在一定水平上被认为是恶性程度较高的。软琼脂克隆形成实验的总体目标是以半定量方式结合其他实验结果测定细胞的恶性程度,其中,克隆形成率=(克隆数/接种细胞数)
×
100%,结果发现,hcpp(passage64+)细胞的克隆形成率为0.79%
±
0.47%(n=3),克隆形成图片如图15所示。
[0151]
裸鼠荷瘤实验就是将细胞或组织通过原位或皮下移植到裸鼠体内,使其成瘤。balb/c nude小鼠目前是体内评价细胞恶性程度的常用裸鼠荷瘤实验动物模型。由于其先天性胸腺缺陷,缺乏t淋巴细胞功能,导致其在肿瘤学、免疫学、药品与生物制品的安全性评价及有效药品的筛选等实验方面,有着很高的研究价值。结果显示,与阳性对照组(成瘤率为100%)相比,hcpp裸鼠成瘤率为0%,裸鼠荷瘤实验典型结果图片如图16所示。
[0152]
软琼脂克隆形成实验和裸鼠荷瘤实验结果均提示,细胞以锚定方式生长能力较弱,不具有成瘤性。hcpp的恶性程度较低。
[0153]
(3)采用pcr法进行支原体的核酸检测。
[0154]
对第67、107和137代hcpp细胞培养上清液分别进行检测,所使用的引物如表4所示,检测结果如图17所示,结果为支原体的核酸呈阴性,表明hcpp细胞无支原体污染。
[0155]
实施例3hcpp细胞对毒理学、药理学外源性因子刺激的反应性
[0156]
gdf15具有重要的生理功能,对多巴胺神经元具有神经营养、神经保护作用,与脑神经功能障碍、神经退行性疾病的发生密切相关;同时,在中枢神经系统中脉络丛上皮细胞是gdf15主要来源。因此,脉络丛上皮细胞常作为神经退行性疾病、脑卒中/脑溢血、颅脑外伤的研究对象。在本研究中,我们对hcpp细胞gdf15的表达量进行测定,且观察hcpp细胞在某些毒物(如重金属锰)和神经保护性药物(美金刚、金刚烷胺)的刺激下gdf15表达含量的变化,即采用gdf15为指标评估hcpp细胞对不同毒理学、药理学外源性因子刺激的反应性,其结果如下。
[0157]
将hcpp细胞接种于六孔板内,待细胞处于对数生长期且生长汇合至80%左右进行染毒,实验一:基于hcpp研究重金属锰(mn,manganese)的毒性效应,分组情况如下:0μm,25μm,50μm,75μm,100μm,150μm,200μm;实验二:基于hcpp研究神经保护性药物(美金刚、金刚烷胺)的效应,分组情况如下:对照组(不添加任何物质),美金刚20μm,金刚烷胺30μm。经外源性因子处理24h后,细胞样本经裂解、超声、离心及变性等处理后用于western blot实验以测定细胞裂解液中gdf-15的含量。
[0158]
本实验采用25μm、50μm、75μm、100μm、150μm、200μm刺激hcpp细胞,以评估锰作用后hcpp细胞gdf15的表达变化情况,结果如图18所示,随着mn染毒浓度的升高,hcpp全细胞裂解液中gdf-15浓度也随之升高,且在50μm、75μm剂量下有统计学差异(p<0.05),表明在一定剂量下mn可引起hcpp细胞gdf-15表达上调。由于血脑脊液屏障(bcb)/cp作为mn过量暴露时mn向脑内转运的重要途径,同时gdf-15在体内发挥着重要的生理作用,人源性脉络丛上皮细胞hcpp的建立可以更好地探究神经退行性疾病的发生发展过程并可被应用于mn致gdf15表达改变的作用机制研究等。
[0159]
另分别采用20μm美金刚,30μm金刚烷胺刺激hcpp细胞,以检测神经保护性药物作用下,hcpp细胞gdf15的表达变化情况,结果如图19所示,在20μm美金刚的作用下,hcpp细胞gdf-15表达相对于对照组稍有上调,但在30μm金刚烷胺的作用下却表达下调。上述结果表
明ad药物美金刚可能通过引起cp细胞中gdf-15表达上调进而发挥保护作用,而pd药物金刚烷胺可能不涉及参与cp细胞中gdf-15相关的调控机制,或者上述结果是由于药物作用时间较短(24h)所致。不过,由于血-脑脊液屏障(bcb)/cp的结构和功能,人源性脉络丛细胞hcpp仍可被用于药物进入脑实质机制相关探究。
[0160]
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效,而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下,对上述实施例进行修饰或改变。因此,举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变,仍应由本发明的权利要求所涵盖。
技术特征:
1.一种人源性脉络丛乳头状瘤来源的细胞系,其特征在于,所述的细胞系表达生长因子,所述的生长因子包括gdf15、fgf2和/或tgfβ。2.根据权利要求1所述的细胞系,其特征在于,所述的生长因子至少包括gdf15,优选的,所述的生长因子还包括fgf2和/或tgfβ。3.根据权利要求1或2所述的细胞系,其特征在于,所述的细胞系具有接触抑制能力。4.根据权利要求1-3任一所述的细胞系,其特征在于,所述的细胞系为永生化无限细胞系,优选的,所述的细胞系包括sv40的大t抗原片段。5.根据权利要求1-4任一所述的细胞系,其特征在于,所述的细胞系表达上皮细胞特征性分子,优选的,所述的上皮细胞特征性分子包括krt,进一步优选的,所述的上皮细胞特征性分子包括krt-7和krt-8。6.根据权利要求1-5任一所述的细胞系,其特征在于,所述的细胞系表达粘附连接蛋白和紧密连接蛋白,优选的,所述的粘附连接蛋白包括cdh1,所述的紧密连接蛋白包括cldns,tjps,ocln和/或jams,进一步优选的,所述的紧密连接蛋白包括cldn1、zo-1、ocln、cldn11和/或jama。7.根据权利要求1-6所述的细胞系,其特征在于,所述的细胞系表达脉络丛上皮细胞的特征性分子,优选的,所述的脉络丛上皮细胞的特征性分子包括ttr。8.根据权利要求1-7任一所述的细胞系,其特征在于,所述的细胞包括紧密连接和/或微绒毛等结构。9.根据权利要求1-8任一所述的细胞系,其特征在于,所述的生长因子、上皮细胞特征性分子、粘附连接蛋白、紧密连接蛋白或脉络丛上皮细胞的特征性分子包括以蛋白或mrna的形式表达。10.根据权利要求1-9任一所述的细胞系,其特征在于,所述的细胞系命名为hcpp,保藏编号为cgmcc no.45152。11.权利要求1-10任一所述的细胞系的构建方法,其特征在于,所述构建方法包括:(1)原代培养:将脉络丛乳头状瘤组织剪碎,分离组织细胞后,对细胞接种培养,传代;(2)永生化;(3)连续传代培养;(4)生物学特性鉴定,获得人源性脉络丛乳头状瘤来源的细胞系。12.根据权利要求11所述的的构建方法,其特征在于,所述的永生化的方法包括病毒基因转染法、端粒酶激活法、癌基因法或回复性永生法。13.一种细胞培养物或亚克隆细胞,其特征在于,所述细胞培养物或亚克隆细胞由权利要求1-10任一所述的人源性脉络丛乳头状瘤来源的细胞系培养或者传代获得。14.一种组织或器官或其培养物,其特征在于,所述的组织或器官或其培养物来源于权利要求1-10任一所述的人源性脉络丛乳头状瘤来源的细胞系或权利要求13所述的细胞培养物或亚克隆细胞。15.一种权利要求1-10任一所述的人源性脉络丛乳头状瘤来源的细胞系、权利要求13所述的细胞培养物或亚克隆细胞或权利要求14所述的组织或器官或其培养物的应用,所述的应用包括:1)构建脉络丛上皮细胞或者组织的仿生模型;
2)构建血-脑脊液屏障的体外模型;3)提取脉络丛合成分泌的多种神经营养物质,开发相关生物制品;优选的,所述仿生模型或体外模型用于以脉络丛和血-脑脊液屏障为研究对象的生物学、医学、毒理学、药理学等研究,更优选的,所述仿生模型或体外模型用于与脉络从相关疾病的药物开发研究。16.一种确定测试物质对血-脑脊液屏障的毒性的方法,其特征在于,所述的方法包括将所述测试物质与权利要求1-10任一所述的人源性脉络丛乳头状瘤来源的细胞系或权利要求13所述的细胞培养物或亚克隆细胞一起孵育并评估细胞的活力。
技术总结
本申请公开一种人源性脉络丛乳头状瘤来源的细胞系及其应用。该细胞系来源于良性的脉络丛乳头状瘤,是一种永生化无限细胞系,对以脉络丛和血-脑脊液屏障为研究对象的生物学、医学、毒理学、药理学等研究具有重要的科学意义和应用价值。义和应用价值。义和应用价值。
技术研发人员:李国君 田永吉 李子南 敬海明 宁钧宇 谭壮生 高珊 张国艳 王建栋 张楠 曾晓芃 刘秀颖 张衡 刘智明
受保护的技术使用者:李国君
技术研发日:2023.06.19
技术公布日:2023/10/15
版权声明
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