一种耐高温羊肚菌菌株及该菌株的选育方法、应用
未命名
10-19
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1.本发明涉及微生物育种技术领域,具体涉及一种耐高温羊肚菌菌株及该菌株的选育方法、应用。
背景技术:
2.羊肚菌是世界四大名菌之一,近年来羊肚菌热度较高。羊肚菌营养丰富,含有多种活性和风味物质,肉质脆嫩、风味独特,高蛋白低脂肪、营养价值非常高,含有多种营养和药用活性成分,具有抗氧化、抗肿瘤、降血脂、消除焦虑、增强睡眠、调节免疫力等诸多作用,食药用价值极高,开发应用前景广阔。
3.然而,羊肚菌是一种低温型菌类,出菇温度范围较窄,丰产与否对气候条件有很大的依赖性,菌丝在10-20℃温度下能快速生长,温度低于4℃或高于25℃菌丝生长都会受到影响。我国南方地区普遍使用遮阳网简易大棚栽培羊肚菌,基本不具有调节小环境的能力。有研究发现,南方地区羊肚菌原基形成和子实体生长期间如果遇到3-10天超过20℃的高温天气,高温高湿易使羊肚菌幼小的原基和小菇大量死亡,导致减产和绝收。出菇期间遇到高温,不但影响子实体的生长,还会影响土层中的子实体原基分化,后期高温常造成出土的菇体早衰或腐烂,子实体分化较少或甚至不分化,减少了出菇批次,严重影响羊肚菌产量。因此,选育耐高温羊肚菌品种,减少高温等不利环境条件对羊肚菌生长的不利影响,对于羊肚菌的实际推广应用有着非常重要的意义。
技术实现要素:
4.解决的技术问题
5.针对现有技术所存在的上述缺点,本发明提供了一种耐高温羊肚菌菌株及该菌株的选育方法、应用,能够有效地解决高温下羊肚菌子实体出菇难的问题,减少高温对羊肚菌生长发育的不利影响,从而保障产品质量和栽培效益,促进羊肚菌产业的健康发展。
6.本发明是采用以下技术方案解决上述技术问题的:
7.本发明提供一种耐高温羊肚菌菌株,分类命名:羊肚菌monchella esculentayj5,保藏编号cctcc no:m20221971,保藏日期为2022年12月13日,保藏单位为中国典型培养物保藏中心,保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山。
8.本发明提供一种耐高温羊肚菌菌株的选育方法,所述选育方法包括以下步骤:
9.step1、菌丝收集:将原始羊肚菌菌株接种于pda培养平板上培养48h,然后挑取三至四片豆粒大小菌丝块接种至铺有灭菌过的玻璃纸的pda培养平板上,在25℃的温度下培养30h,最后收集菌丝体;
10.step2、菌丝清洗:向pbs溶液中加入质量分数为其0.001%的巯基乙醇,混合均匀后记作清洗液,使用所述清洗液对step1中的收集菌丝体清洗2-3次,洗去菌丝表面残留的培养基等杂质;
11.step3、原生质体制备:将蜗牛酶、溶壁酶和纤维素酶进行混合制得复合酶酶解液,
将经step2处理后的菌丝体加入到含有5ml复合酶酶解液的离心管中,在25℃的温度下酶解2h,获得原生质体悬浮液;
12.step4、原生质体诱变:使用血球计数板计数,将step3中的原生质体悬浮液的细胞浓度在106个/ml左右,接着取上述原生质体悬浮液均匀涂布到无菌培养皿中,并置于超净工作台上风干制成菌膜,然后使用离子注入机进行n
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的注入,在注入n
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的过程中,每个菌株做6个梯度剂量,每个剃度剂量做两个pda培养平板,并做真空对照pda培养平板,上述6个梯度剂量的n
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注入剂量分别为3.0
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ion/cm2和1.2
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ion/cm2;诱变完成后,每个pda培养平板上加入1ml无菌水洗涤菌体,制成原生质体菌悬液;
13.step5、耐高温羊肚菌突变体初筛:将step4中的原生质体菌悬液稀释100倍后分别涂布于原生质体复苏培养基中,在28℃的温度下培养4d,以原始羊肚菌菌株为对照,挑选生长速度更快的突变菌株,用于复筛试验;
14.step6、耐高温羊肚菌突变体复筛:以原始羊肚菌菌株为对照,将初筛出的突变菌株分别取直径5mm的菌丝块,接种pda培养平板上,在28℃的温度下培养4d,十字交叉法测定菌丝生长速度,选取生长速度最快的突变菌株,作为目标突变菌株;
15.step7、耐高温羊肚菌菌株鉴定:对step6中获得的目标突变菌株进行鉴定,鉴定结果确认所述目标突变菌株为羊肚菌,所得即为耐高温羊肚菌菌株。
16.更进一步地,所述step1中原始羊肚菌菌株为实验室保存的菌株名称为y5的菌株。
17.更进一步地,所述step2中的pbs溶液为浓度为0.2mol/l的磷酸缓冲液,且所述磷酸缓冲液的ph值为6。
18.更进一步地,所述step3中复合酶酶解液的各组分终浓度分别为:蜗牛酶的终浓度为4mg/ml、溶壁酶的终浓度为5mg/ml、纤维素酶的终浓度为4mg/ml。
19.更进一步地,所述step4中每个无菌培养皿中涂布的原生质体悬浮液的量为0.1ml,且step4中离子注入机的注入能量为15kev,所述无菌水为灭菌后的双蒸水。
20.更进一步地,所述step6中的菌丝生长速度的计算方式为菌落半径/培养天数。
21.更进一步地,所述step7中的鉴定方法包括以下步骤:
22.步骤1、基因组dna提取:在无菌条件下刮取pda培养平板上需要进行鉴定的新鲜菌丝体,接着使用dna提取试剂盒提取基因组dna;
23.步骤2、its序列扩增:its序列pcr扩增采用真菌its通用引物its1和its4,pcr反应体系为50μl,该体系包括2
×
pcr master mix 25μl,通用引物its1和its4(浓度为0.2μmol/l)各1.5μl,模板dna(即步骤1中提取的基因组dna)1μl,加双蒸水补齐50μl,随后置于pcr仪上扩增,其中,pcr仪程序设定为:94℃预变性3min、94℃变性1min、54℃退火1min,72℃延伸2min,共计30个循环,循环结束后在72℃再延伸8min得到pcr扩增产物;
24.步骤3、its扩增产物的序列测定:将步骤2中的pcr扩增产物进行纯化,接着将纯化后的pcr扩增产物和引物送去测序;
25.步骤4、测序序列比对:利用blast在线比对工具对步骤3中的测序结果进行序列分析,完成鉴定。
26.一种耐高温羊肚菌菌株的应用,所述耐高温羊肚菌菌株应用于富硒羊肚菌的生产,具体生产方法为:
27.s1、菌种活化:将通过上述选育方法得到的耐高温羊肚菌菌株置于25℃的生化培养箱中培养24h,接着挑选直径为5mm的菌丝块接种于pda培养基上,再次于25℃的生化培养箱中培养3-4d;
28.s2、羊肚菌一级种的制备:在超净工作台上,从s1中培养的菌株中挑选直径5mm的菌丝块接种于含有100ml液体发酵培养基的三角瓶中,接着置于24-28℃,160-200rpm的恒温摇床中培养2-3d,所得即为羊肚菌一级种;
29.s3、羊肚菌二级种的制备:将羊肚菌一级种按3-5%的接种量接种于含150-300ml液体发酵培养基的二级摇瓶中,接着置于24-28℃,160-200rpm的恒温摇床中培养6-12h;
30.s4、诱导剂添加:向s3中的液体发酵培养基中添加诱导剂组分,直至诱导剂组分的终浓度为10-20mg/l,接着继续在24-28℃,160-200rpm的恒温摇床中培养6-12h;
31.s5、亚硒酸钠添加:向s4中的的液体发酵培养基中添加亚硒酸钠,直至亚硒酸钠的终浓度为10-30mg/l,接着继续在24-28℃,160-200rpm的恒温摇床中培养3-5d,所得即为富硒羊肚菌;
32.所述s4中的诱导剂组分为山梨醇、乳糖和糊精中的一种或者数种混合制得。
33.更进一步地,所述s2中液体发酵培养基的成分为(每l):马铃薯200g、葡萄糖20g、蛋白胨5g、磷酸二氢钾1g、硫酸镁0.5g和维生素b1 10mg,所述液体发酵培养基的ph值为6。
34.有益效果
35.采用本发明提供的技术方案,与已知的公有技术相比,具有如下有益效果:
36.本发明通过氮离子注入诱变技术,选育成功具有优良耐高温性能的羊肚菌菌株,该菌株在26-28℃条件下仍然能正常生长,具有更宽泛的出菇温度范围,对生产上可能出现的高温不利天气具有更好的耐受性;而且,该菌株还具有优良的富硒性能,在不同温度和不同硒浓度下培养,均具有优良的富硒特性。本发明提供的羊肚菌菌株,不仅对高温具有较好的耐受性,有助于缓解生产中由于高温不利天气造成羊肚菌产量低,种植户经济损失严重的问题,而且该菌株富硒性能优异,可以用于富硒羊肚菌的生产,具有良好的市场应用前景。
附图说明
37.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
38.图1为本发明的耐高温羊肚菌菌株的选育方法步骤流程图;
39.图2为本发明的富硒羊肚菌的生产步骤流程图。
具体实施方式
40.下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
41.实施例1
42.本实施例的一种耐高温羊肚菌菌株的选育方法,选育方法包括以下步骤:如图1-2所示,
43.step1、菌丝收集:将原始羊肚菌菌株接种于pda培养平板上培养48h,然后挑取三至四片豆粒大小菌丝块接种至铺有灭菌过的玻璃纸的pda培养平板上,在25℃的温度下培养30h,最后收集菌丝体;
44.step2、菌丝清洗:向pbs溶液中加入质量分数为其0.001%的巯基乙醇,混合均匀后记作清洗液,使用清洗液对step1中的收集菌丝体清洗2-3次,洗去菌丝表面残留的培养基等杂质;
45.step3、原生质体制备:将蜗牛酶、溶壁酶和纤维素酶进行混合制得复合酶酶解液,将经step2处理后的菌丝体加入到含有5ml复合酶酶解液的离心管中,在25℃的温度下酶解2h,获得原生质体悬浮液;
46.step4、原生质体诱变:使用血球计数板计数,将step3中的原生质体悬浮液的细胞浓度在106个/ml左右,接着取上述原生质体悬浮液均匀涂布到无菌培养皿中,并置于超净工作台上风干制成菌膜,然后使用离子注入机进行n
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的注入,在注入n
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的过程中,每个菌株做6个梯度剂量,每个剃度剂量做两个pda培养平板,并做真空对照pda培养平板,上述6个梯度剂量的n
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注入剂量分别为3.0
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ion/cm2、6.0
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ion/cm2和1.2
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ion/cm2;诱变完成后,每个pda培养平板上加入1ml无菌水洗涤菌体,制成原生质体菌悬液;
47.step5、耐高温羊肚菌突变体初筛:将step4中的原生质体菌悬液稀释100倍后分别涂布于原生质体复苏培养基中,在28℃的温度下培养4d,以原始羊肚菌菌株为对照,挑选生长速度更快的突变菌株,用于复筛试验;
48.step6、耐高温羊肚菌突变体复筛:以原始羊肚菌菌株为对照,将初筛出的突变菌株分别取直径5mm的菌丝块,接种pda培养平板上,在28℃的温度下培养4d,十字交叉法测定菌丝生长速度,选取生长速度最快的突变菌株,作为目标突变菌株;
49.step7、耐高温羊肚菌菌株鉴定:对step6中获得的目标突变菌株进行鉴定,鉴定结果确认目标突变菌株为羊肚菌,所得即为耐高温羊肚菌菌株。
50.step1中原始羊肚菌菌株为实验室保存的菌株名称为y5的菌株。
51.step2中的pbs溶液为浓度为0.2mol/l的磷酸缓冲液,且磷酸缓冲液的ph值为6。
52.step3中复合酶酶解液的各组分终浓度分别为:蜗牛酶的终浓度为4mg/ml、溶壁酶的终浓度为5mg/ml、纤维素酶的终浓度为4mg/ml。
53.step4中每个无菌培养皿中涂布的原生质体悬浮液的量为0.1ml,且step4中离子注入机的注入能量为15kev,无菌水为灭菌后的双蒸水。
54.step6中的菌丝生长速度的计算方式为菌落半径/培养天数。
55.step7中的鉴定方法包括以下步骤:
56.步骤1、基因组dna提取:在无菌条件下刮取pda培养平板上需要进行鉴定的新鲜菌丝体,接着使用dna提取试剂盒提取基因组dna;
57.步骤2、its序列扩增:its序列pcr扩增采用真菌its通用引物its1和its4,pcr反应体系为50μl,该体系包括2
×
pcr master mix 25μl,通用引物its1和its4(浓度为0.2μmol/
l)各1.5μl,模板dna(即步骤1中提取的基因组dna)1μl,加双蒸水补齐50μl,随后置于pcr仪上扩增,其中,pcr仪程序设定为:94℃预变性3min、94℃变性1min、54℃退火1min,72℃延伸2min,共计30个循环,循环结束后在72℃再延伸8min得到pcr扩增产物;
58.步骤3、its扩增产物的序列测定:将步骤2中的pcr扩增产物进行纯化,接着将纯化后的pcr扩增产物和引物送去测序;
59.步骤4、测序序列比对:利用blast在线比对工具对步骤3中的测序结果进行序列分析,完成鉴定。
60.实施例2
61.本实施例的一种耐高温羊肚菌菌株的应用,耐高温羊肚菌菌株应用于富硒羊肚菌的生产,具体生产方法为:如图1-2所示,
62.s1、菌种活化:将通过上述实施例1中的选育方法得到的耐高温羊肚菌菌株置于25℃的生化培养箱中培养24h,接着挑选直径为5mm的菌丝块接种于pda培养基上,再次于25℃的生化培养箱中培养3d;
63.s2、羊肚菌一级种的制备:在超净工作台上,从s1中培养的菌株中挑选直径5mm的菌丝块接种于含有100ml液体发酵培养基的三角瓶中,接着置于24℃,160rpm的恒温摇床中培养2d,所得即为羊肚菌一级种;
64.s3、羊肚菌二级种的制备:将羊肚菌一级种按3%的接种量接种于含150ml液体发酵培养基的二级摇瓶中,接着置于24℃,160rpm的恒温摇床中培养6h;
65.s4、诱导剂添加:向s3中的液体发酵培养基中添加诱导剂组分,直至诱导剂组分的终浓度为10mg/l,接着继续在24℃,160rpm的恒温摇床中培养6h;
66.s5、亚硒酸钠添加:向s4中的的液体发酵培养基中添加亚硒酸钠,直至亚硒酸钠的终浓度为10mg/l,接着继续在24℃,160rpm的恒温摇床中培养3d,所得即为富硒羊肚菌。
67.s2中液体发酵培养基的成分为(每l):马铃薯200g、葡萄糖20g、蛋白胨5g、磷酸二氢钾1g、硫酸镁0.5g和维生素b1 10mg,液体发酵培养基的ph值为6。
68.s4中的诱导剂组分为山梨醇。
69.实施例3
70.本实施例的一种耐高温羊肚菌菌株的应用,耐高温羊肚菌菌株应用于富硒羊肚菌的生产,具体生产方法为:如图1-2所示,
71.s1、菌种活化:将通过上述实施例1中的选育方法得到的耐高温羊肚菌菌株置于25℃的生化培养箱中培养24h,接着挑选直径为5mm的菌丝块接种于pda培养基上,再次于25℃的生化培养箱中培养4d;
72.s2、羊肚菌一级种的制备:在超净工作台上,从s1中培养的菌株中挑选直径5mm的菌丝块接种于含有100ml液体发酵培养基的三角瓶中,接着置于26℃,180rpm的恒温摇床中培养3d,所得即为羊肚菌一级种;
73.s3、羊肚菌二级种的制备:将羊肚菌一级种按4%的接种量接种于含200ml液体发酵培养基的二级摇瓶中,接着置于26℃,180rpm的恒温摇床中培养8h;
74.s4、诱导剂添加:向s3中的液体发酵培养基中添加诱导剂组分,直至诱导剂组分的终浓度为15mg/l,接着继续在26℃,180rpm的恒温摇床中培养8h;
75.s5、亚硒酸钠添加:向s4中的的液体发酵培养基中添加亚硒酸钠,直至亚硒酸钠的
终浓度20mg/l,接着继续在26℃,180rpm的恒温摇床中培养4d,所得即为富硒羊肚菌。
76.s2中液体发酵培养基的成分为(每l):马铃薯200g、葡萄糖20g、蛋白胨5g、磷酸二氢钾1g、硫酸镁0.5g和维生素b1 10mg,液体发酵培养基的ph值为6。
77.s4中的诱导剂组分为山梨醇、乳糖和糊精按照1:3:2的质量比混合制得。
78.实施例4
79.本实施例的一种耐高温羊肚菌菌株的应用,耐高温羊肚菌菌株应用于富硒羊肚菌的生产,具体生产方法为:如图1-2所示,
80.s1、菌种活化:将通过上述实施例1中的选育方法得到的耐高温羊肚菌菌株置于25℃的生化培养箱中培养24h,接着挑选直径为5mm的菌丝块接种于pda培养基上,再次于25℃的生化培养箱中培养4d;
81.s2、羊肚菌一级种的制备:在超净工作台上,从s1中培养的菌株中挑选直径5mm的菌丝块接种于含有100ml液体发酵培养基的三角瓶中,接着置于28℃,200rpm的恒温摇床中培养3d,所得即为羊肚菌一级种;
82.s3、羊肚菌二级种的制备:将羊肚菌一级种按5%的接种量接种于含300ml液体发酵培养基的二级摇瓶中,接着置于28℃,200rpm的恒温摇床中培养12h;
83.s4、诱导剂添加:向s3中的液体发酵培养基中添加诱导剂组分,直至诱导剂组分的终浓度为20mg/l,接着继续在28℃,200rpm的恒温摇床中培养12h;
84.s5、亚硒酸钠添加:向s4中的的液体发酵培养基中添加亚硒酸钠,直至亚硒酸钠的终浓度为30mg/l,接着继续在28℃,200rpm的恒温摇床中培养5d,所得即为富硒羊肚菌。
85.s2中液体发酵培养基的成分为(每l):马铃薯200g、葡萄糖20g、蛋白胨5g、磷酸二氢钾1g、硫酸镁0.5g和维生素b1 10mg,液体发酵培养基的ph值为6。
86.s4中的诱导剂组分为山梨醇和乳糖按照1:3的质量比混合制得。
87.性能测试
88.对通过本发明中实施例2-4制得的富硒羊肚菌进行富硒性能测定,具体测定方法为:
89.1)分别收集实施例2-4制得的富硒羊肚菌的菌丝,然后使用双蒸水洗涤2遍,真空冷冻干燥,称重;
90.2)根据gb 1903.22-2016《食品安全国家标准食品营养强化剂富硒食用菌粉》的标准,用afs-9760双道原子荧光光谱计测定羊肚菌粉中的有机硒含量,在此基础上计算无机硒转化为有机硒的富硒率。
91.通过上述测定方法获得的数据如下:
92.实施例2的测定数据显示:富硒羊肚菌的菌丝干重6.58g/l,菌丝中硒含量为0.12mg/g,富硒率为7.90%,原始羊肚菌菌丝干重5.87g/l,菌丝中硒含量为0.11mg/g,富硒率为6.46%,由此可知通过本实施例1的选育方法获得的耐高温羊肚菌菌株的生长性能及富硒性能均优于原始羊肚菌菌株。
93.实施例3的测定数据显示:富硒羊肚菌的菌丝干重7.82g/l,菌丝中硒含量为0.48mg/g,富硒率为18.77%,原始羊肚菌菌丝干重2.58g/l,菌丝中硒含量为0.21mg/g,富硒率为2.71%,由此可知通过本实施例1的选育方法获得的在26℃高温下培养的耐高温羊肚菌菌株的生长性能及富硒性能均优于原始羊肚菌菌株。
94.实施例4的测定数据显示:富硒羊肚菌的菌丝干重5.37g/l,菌丝中硒含量为0.24mg/g,富硒率为4.30%,原始羊肚菌菌丝干重0.38g/l,菌丝中硒含量为0.33mg/g,富硒率为0.42%,由此可知通过本实施例1的选育方法获得的在28℃高温下培养的耐高温羊肚菌菌株的生长性能及富硒性能均优于原始羊肚菌菌株。
95.通过上述测定数据能够表明,本发明制得的耐高温羊肚菌菌株的生长性能更好,且以本发明制得的耐高温羊肚菌菌株通过诱导制备的富硒羊肚菌的富硒性能更加,具有更好的市场应用前景价值。
96.以上实施例的各技术特征可以进行任意的组合,为使描述简洁,未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述,然而,只要这些技术特征的组合不存在矛盾,都应当认为是本说明书记载的范围。
97.以上实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
技术特征:
1.一种耐高温羊肚菌菌株,其特征在于,所述菌株的名称为羊肚菌monchella esculenta yj5,保藏编号cctcc no:m20221971,保藏日期为2022年12月13日,保藏单位为中国典型培养物保藏中心,保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山。2.一种耐高温羊肚菌菌株的选育方法,其特征在于,所述选育方法包括以下步骤:step1、菌丝收集:将原始羊肚菌菌株接种于pda培养平板上培养48h,然后挑取三至四片豆粒大小菌丝块接种至铺有灭菌过的玻璃纸的pda培养平板上,在25℃的温度下培养30h,最后收集菌丝体;step2、菌丝清洗:向pbs溶液中加入质量分数为其0.001%的巯基乙醇,混合均匀后记作清洗液,使用所述清洗液对step1中的收集菌丝体清洗2-3次,洗去菌丝表面残留的培养基等杂质;step3、原生质体制备:将蜗牛酶、溶壁酶和纤维素酶进行混合制得复合酶酶解液,将经step2处理后的菌丝体加入到含有5ml复合酶酶解液的离心管中,在25℃的温度下酶解2h,获得原生质体悬浮液;step4、原生质体诱变:使用血球计数板计数,将step3中的原生质体悬浮液的细胞浓度在106个/ml左右,接着取上述原生质体悬浮液均匀涂布到无菌培养皿中,并置于超净工作台上风干制成菌膜,然后使用离子注入机进行n
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的注入,在注入n
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的过程中,每个菌株做6个梯度剂量,每个剃度剂量做两个pda培养平板,并做真空对照pda培养平板,上述6个梯度剂量的n
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ion/cm2;诱变完成后,每个pda培养平板上加入1ml无菌水洗涤菌体,制成原生质体菌悬液;step5、耐高温羊肚菌突变体初筛:将step4中的原生质体菌悬液稀释100倍后分别涂布于原生质体复苏培养基中,在28℃的温度下培养4d,以原始羊肚菌菌株为对照,挑选生长速度更快的突变菌株,用于复筛试验;step6、耐高温羊肚菌突变体复筛:以原始羊肚菌菌株为对照,将初筛出的突变菌株分别取直径5mm的菌丝块,接种pda培养平板上,在28℃的温度下培养4d,十字交叉法测定菌丝生长速度,选取生长速度最快的突变菌株,作为目标突变菌株;step7、耐高温羊肚菌菌株鉴定:对step6中获得的目标突变菌株进行鉴定,鉴定结果确认所述目标突变菌株为羊肚菌,所得即为耐高温羊肚菌菌株。3.根据权利要求2所述的一种耐高温羊肚菌菌株的选育方法,其特征在于,所述step1中原始羊肚菌菌株为实验室保存的菌株名称为y5的菌株。4.根据权利要求2所述的一种耐高温羊肚菌菌株的选育方法,其特征在于,所述step2中的pbs溶液为浓度为0.2mol/l的磷酸缓冲液,且所述磷酸缓冲液的ph值为6。5.根据权利要求2所述的一种耐高温羊肚菌菌株的选育方法,其特征在于,所述step3中复合酶酶解液的各组分终浓度分别为:蜗牛酶的终浓度为4mg/ml、溶壁酶的终浓度为5mg/ml、纤维素酶的终浓度为4mg/ml。6.根据权利要求2所述的一种耐高温羊肚菌菌株的选育方法,其特征在于,所述step4中每个无菌培养皿中涂布的原生质体悬浮液的量为0.1ml,且step4中离子注入机的注入能量为15kev,所述无菌水为灭菌后的双蒸水。7.根据权利要求2所述的一种耐高温羊肚菌菌株的选育方法,其特征在于,所述step6
中的菌丝生长速度的计算方式为菌落半径/培养天数。8.根据权利要求2所述的一种耐高温羊肚菌菌株的选育方法,其特征在于,所述step7中的鉴定方法包括以下步骤:步骤1、基因组dna提取:在无菌条件下刮取pda培养平板上需要进行鉴定的新鲜菌丝体,接着使用dna提取试剂盒提取基因组dna;步骤2、its序列扩增:its序列pcr扩增采用真菌its通用引物its1和its4,pcr反应体系为50μl,该体系包括2
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pcr master mix 25μl,通用引物its1和its4(浓度为0.2μmol/l)各1.5μl,模板dna(即步骤1中提取的基因组dna)1μl,加双蒸水补齐50μl,随后置于pcr仪上扩增,其中,pcr仪程序设定为:94℃预变性3min、94℃变性1min、54℃退火1min,72℃延伸2min,共计30个循环,循环结束后在72℃再延伸8min得到pcr扩增产物;步骤3、its扩增产物的序列测定:将步骤2中的pcr扩增产物进行纯化,接着将纯化后的pcr扩增产物和引物送去测序;步骤4、测序序列比对:利用blast在线比对工具对步骤3中的测序结果进行序列分析,完成鉴定。9.根据权利要求2-8任一项所述的一种耐高温羊肚菌菌株的应用,其特征在于,所述耐高温羊肚菌菌株应用于富硒羊肚菌的生产,具体生产方法为:s1、菌种活化:将通过上述选育方法得到的耐高温羊肚菌菌株置于25℃的生化培养箱中培养24h,接着挑选直径为5mm的菌丝块接种于pda培养基上,再次于25℃的生化培养箱中培养3-4d;s2、羊肚菌一级种的制备:在超净工作台上,从s1中培养的菌株中挑选直径5mm的菌丝块接种于含有100ml液体发酵培养基的三角瓶中,接着置于24-28℃,160-200rpm的恒温摇床中培养2-3d,所得即为羊肚菌一级种;s3、羊肚菌二级种的制备:将羊肚菌一级种按3-5%的接种量接种于含150-300ml液体发酵培养基的二级摇瓶中,接着置于24-28℃,160-200rpm的恒温摇床中培养6-12h;s4、诱导剂添加:向s3中的液体发酵培养基中添加诱导剂组分,直至诱导剂组分的终浓度为10-20mg/l,接着继续在24-28℃,160-200rpm的恒温摇床中培养6-12h;s5、亚硒酸钠添加:向s4中的的液体发酵培养基中添加亚硒酸钠,直至亚硒酸钠的终浓度为10-30mg/l,接着继续在24-28℃,160-200rpm的恒温摇床中培养3-5d,所得即为富硒羊肚菌;所述s4中的诱导剂组分为山梨醇、乳糖和糊精中的一种或者数种混合制得。10.根据权利要求9所述的一种耐高温羊肚菌菌株的应用,其特征在于,所述s2中液体发酵培养基的成分为(每l):马铃薯200g、葡萄糖20g、蛋白胨5g、磷酸二氢钾1g、硫酸镁0.5g和维生素b1 10mg,所述液体发酵培养基的ph值为6。
技术总结
本发明涉及微生物育种技术领域,具体涉及一种耐高温羊肚菌菌株及该菌株的选育方法、应用;本发明通过氮离子注入诱变技术,选育成功具有优良耐高温性能的羊肚菌菌株,该菌株在26-28℃条件下仍然能正常生长,具有更宽泛的出菇温度范围,对生产上可能出现的高温不利天气具有更好的耐受性;而且,该菌株还具有优良的富硒性能,在不同温度和不同硒浓度下培养,均具有优良的富硒特性。本发明提供的羊肚菌菌株,不仅对高温具有较好的耐受性,有助于缓解生产中由于高温不利天气造成羊肚菌产量低,种植户经济损失严重的问题,而且该菌株富硒性能优异,可以用于富硒羊肚菌的生产,具有良好的市场应用前景。市场应用前景。市场应用前景。
技术研发人员:孙玉军 黄胜威 钱丽娟 马玉涵
受保护的技术使用者:安徽科技学院
技术研发日:2023.03.01
技术公布日:2023/10/15
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