一种斑秃的外周血TCR标志物序列及其检测试剂盒和应用的制作方法

一种斑秃的外周血tcr标志物序列及其检测试剂盒和应用
技术领域
1.本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种斑秃的外周血tcr标志物及其检测试剂盒和应用。


背景技术：

2.斑秃(alopecia areata，aa)是一种常见的炎症性非瘢痕性脱发，其临床表现为头皮突然发生的边界清晰的圆形斑状脱发，但有7-10％为中、重度病情，脱发可累及整个头皮，甚至全身的被毛。轻症患者大部分可自愈，但有约半数患者反复发作，可迁延数年或数十年。斑秃可发生于任何年龄，中青年多见，无明显性别差异。斑秃可能对患者的心理健康和生活质量产生严重负面影响。
3.1、病因和发病机制
4.斑秃是一种毛囊特异性的自身免疫性疾病，其病因目前尚不完全清楚，目前认为是环境因素与遗传因素共同作用所致。主要组织相容性复合物ⅰ类和ⅱ类(mhc i/ii)抗原在毛囊中的表达量很低，因此毛囊被认为是免疫豁免器官之一。然而，某些非特异性刺激(如感染和局部创伤等)可引起促炎症细胞因子如γ干扰素(ifn-γ)和肿瘤坏死因子α(tnf-α)等的释放，并暴露原本被屏蔽的毛囊自身抗原，斑秃进展期抗原呈递细胞(朗格汉斯细胞)及淋巴细胞增加并浸润毛囊，使得cd8+t淋巴细胞识别这些自身抗原，导致发生自身免疫破坏毛囊上皮细胞，形成斑秃。部分斑秃患者甚至会并发自身免疫性疾病，如自身免疫性甲状腺疾病及红斑狼疮等。斑秃还可并发特应性皮炎、过敏性鼻炎等过敏(炎症)性疾病。此外，精神应激也可能与斑秃发病有关。遗传因素在斑秃发病中具有重要作用，约1/3的斑秃患者有阳性家族史，同卵双生子共同患病率约55％。已发现多个基因位点与斑秃有关，包括hla、ulbp1、ctla4及il-2/il-21等。
5.2、临床表现
6.斑秃典型的临床表现是突然发生的斑状脱发，脱发斑多呈圆形或椭圆形，通常边界清晰，大小不等，可单发或多发。脱发主要见于头发，也可累及胡须、眉毛等其他部位体毛。皮肤外观基本正常，一般无明显自觉症状，少数患者可有轻度头皮痒感或头皮紧绷感。部分患者可有指(趾)甲变化如甲点状凹陷、点状白甲等。部分患者可并发自身免疫性或炎症性疾病，如桥本氏甲状腺炎、红斑狼疮、特应性皮炎及白癜风等。
7.根据病情的进展情况，斑秃可分进展期(活动期)、稳定期(静止期)和恢复期。进展期：脱发斑扩大或数量增加，可有断发，脱发区边缘拉发试验(pull test)阳性，弥漫型斑秃患者整个头部均可出现拉发试验阳性；稳定期：毛发脱落停止，拉发试验阴性，大多局限性斑秃患者在3-4个月后进入恢复期；恢复期：脱发区有新生毛发长出，最初出现纤细、柔软及色浅的细发，逐渐转变为黑色毛发。
8.3、检查与诊断
9.1)拉发试验
10.患者试验前3日内不洗头，以拇指和食指拉起一束毛发(大约五、六十根)，轻轻向
外拉，计数拉下的毛发数，》6根为阳性，表明有活动性脱发。进展期斑秃常为阳性，毛发根部呈杵状或锥形。然而，急性或慢性休止期脱发、急性生长期脱发者的活动期，其拉发试验也可为阳性。
11.2)皮肤镜检查
12.皮肤镜(dermoscopy)检查在斑秃的诊断、鉴别诊断和病情活动性评判中有重要价值。斑秃的脱发区域毛囊开口完好存在，脱发区域可见感叹号样发(毛发近头皮处逐渐变细、形成上粗下细的感叹号形态)、黑点征、黄点征、断发、锥形发(毛发近端逐渐变细)、毛干粗细不均、毳毛增多以及猪尾状发等。其中感叹号样发是斑秃的特异性皮肤镜表现。皮肤镜检查还可判断及监测斑秃的活动性，稳定期主要表现为黄点征，若出现黑点征、感叹号样发、锥形发、断发和毛干粗细不均等则提示病情处于活动期。
13.典型的斑秃根据临床表现和皮肤镜检查即可诊断，无需进行特殊检查。部分表现不典型的患者需要与其他脱发进行鉴别，必要时可进行相关辅助检查。
14.3)皮损组织病理检查
15.斑秃的组织病理表现包括：毛球部周围炎性细胞浸润，以淋巴细胞为主，可伴有少量嗜酸性粒细胞和肥大细胞。然而，细胞浸润的程度与病情严重程度并不成比例，全秃和普秃患者皮损中并不一定有明显的炎症浸润；急性期仅有轻度的炎症浸润，亚急性期以毛囊周期的改变和炎症浸润为特点，慢性斑秃皮损中炎症浸润不明显。生长期毛囊减少，退行期和休止期毛囊增多(比例》50％)，并可见毛囊微小化及营养不良的生长期毛囊。另外，同一患者的不同区域可同时出现不同时期的组织病理表现。因此，皮损组织病理检查在斑秃诊治过程中只能作为一种辅助检查。
16.4)实验室检查
17.目前并没有可以作为斑秃的诊断依据的实验室检验方法，现有实验室检查只用于鉴别诊断以明确是否并发其他免疫异常及过敏等表现。包括甲状腺功能和甲状腺自身抗体检查、抗核抗体及血清总ige等，必要时可进行真菌镜检和梅毒螺旋体抗体检测等以除外感染性疾病所致脱发。
18.4、鉴别诊断
19.1)斑秃vs拔毛癖：常表现为斑片状脱发，但脱发区形状往往不规则，边缘不整齐，脱发区毛发并不完全脱落，可见大量牢固的断发。多见于儿童，皮肤镜下可见到黑点征、长短不一的断发及断发的断端卷曲或分叉，皮损组织病理亦具有特征性表现。
20.2)斑秃vs头癣：好发于儿童，除了斑片状脱发外，头皮有程度不等的红斑、鳞屑及结痂等炎症改变，断发中可检出真菌。
21.3)斑秃vs瘢痕性秃发：盘状红斑狼疮、毛发扁平苔藓、局限性硬皮病及秃发性毛囊炎、头皮的物理或化学性损伤、感染等多种原因都可引起瘢痕性秃发，常表现为局限性永久性的秃发。瘢痕性秃发常常有炎症过程，脱发区域头皮可见萎缩、瘢痕或硬化，标志性的表现为毛囊开口消失，此时毛囊被彻底破坏，不能再生。
22.4)斑秃vs梅毒性脱发：梅毒脱发的皮肤镜表现及组织病理表现与斑秃相似，临床上多表现为虫蚀状的多发性小脱发斑，血清梅毒特异性抗体阳性，并可出现二期梅毒皮肤表现。
23.5)斑秃vs生长期脱发：药物(如化疗药等)引起的弥漫性脱发，需要和急性弥漫性
斑秃鉴别。
24.6)斑秃vs女性型雄激素性秃发：需要与弥漫性斑秃鉴别。雄激素性秃发发病缓慢，以额部及顶部为主，拉发试验阴性，皮肤镜下无断发、黑点征或感叹号样发。
25.7)斑秃vs休止期脱发：各种营养不良、内分泌疾病、精神因素以及节食减肥等可导致休止期脱发，通常脱发较为弥漫，部分可出现拉发试验阳性，但一般无断发、黑点征或感叹号样发。
26.8)斑秃vs先天性秃发：儿童斑秃需要与先天性秃发鉴别。先天性秃发通常发病更早，出生时或生后不久发病，可无毛发或毛发稀疏，可局部或全身毛发受累，毛干可有结构改变，如念珠状发和羊毛状发等，部分患者可并发外胚叶发育异常。儿童斑秃一般出生时毛发正常，儿童期开始出现斑状脱发，毛发常可再生，病情常反复。
27.5、治疗与预后
28.1)一般治疗
29.避免精神紧张，缓解精神压力，保持健康的生活方式和充足的睡眠，均衡饮食，适当参加体育锻炼，如并发炎症和免疫性疾病，则应积极治疗并发的炎症或免疫性疾病。
30.2)局部治疗
31.a)外用糖皮质激素：适用于轻中度斑秃。对于面积较大的重度斑秃患者可使用强效糖皮质激素乳膏封包治疗。
32.b)皮损内注射糖皮质激素：适用于脱发面积较小的稳定期成人患者，如轻度或中度的单发型和多发型斑秃。
33.c)局部免疫疗法：可用于治疗重型斑秃，但不良反应较多。
34.3)系统治疗
35.a)糖皮质激素：对于急性进展期和脱发面积较大的中、重度成人患者，可酌情系统使用糖皮质激素。常可在短期内获得疗效，但减量过快或停药后复发率较高，应缓慢减药。若3-6个月后无明显疗效，应停止使用。对于儿童患者，应谨慎使用。
36.b)免疫抑制剂：对部分患者有效，但因其不良反应相对较多、费用相对较高及停药后复发率高等，临床不作为一线药物使用。
37.4)预后
38.斑秃的病程与预后因人而异，轻度斑秃患者大部分可自愈或在治疗后痊愈。本病复发常见，部分患者呈缓解与复发交替，部分患者脱发逐步加重，形成终生秃发状态。
39.研究结果显示，34-50％的轻症患者可在1年内自愈，另有14-25％的患者病情持续或进展到全秃或普秃，且一般病程》2年者对治疗反应差。有研究表明，成人头皮斑秃面积《25％者，68％可以恢复；25-50％者，32％可以恢复；》50％者，仅有8％可以恢复。
40.综上所述，虽然大部分斑秃患者较易诊断，但因其发病率高，仍然有相当数量患者难以确诊及判断治疗效果。鉴别诊断斑秃与其它脱发类疾病，以及确定斑秃疾病的进展和转归，目前仍缺乏简单且可以量化的实验室检验手段。


技术实现要素：

41.本发明的目的在于：针对现有技术中存在的不足，提供一种利用斑秃患者的外周血中tcr的cdr3序列作为全新的标志物及其检测试剂盒和应用。该方法能无创且准确快速
的判断待测样本是否罹患斑秃。
42.本发明采用的技术方案如下：
43.一种斑秃的外周血中的tcr标志物，标志物来自tcr可变区cdr3序列，其包括序列seq id no.1-100所示蛋白中的至少一种，如表1所示：
44.表1斑秃特征性tcr标志物序列。
45.46.[0047][0048]
进一步地，标志物的蛋白序列为seq id no.1-100所示的序列经取代、缺失和/或替换一个或多个氨基酸后，仍具有相同功能的蛋白。
[0049]
上述的标志物在制备检测或治疗斑秃的制剂中的应用。
[0050]
进一步地，制剂包括含有该tcr标志物的t细胞受体的质粒、病毒载体或核酸片段。
[0051]
一种用于斑秃检测的试剂盒，包括能与上述tcr标志物发生特异性结合的抗体。
[0052]
一种制剂，包括能与上述tcr标志物发生特异性结合的抗体；制剂可用于对斑秃进
行诊断、预测、检测或筛查。
[0053]
一种检测斑秃的蛋白质芯片，蛋白质芯片包括基片和点样在基片上的特异性抗体，特异性抗体为能与上述tcr标志物发生特异性结合的抗体。
[0054]
本发明原理如下：
[0055]
人体内的b淋巴细胞和t淋巴细胞是获得性免疫系统中重要的两类细胞。b细胞通过细胞表面的b细胞受体(bcr)识别抗原，后期bcr在b细胞分化成浆细胞时，表达成抗体，分泌到细胞外。t细胞通过细胞表面的t细胞受体(tcr)识别抗原。bcr和tcr的多样性是建立获得性免疫系统的基础。bcr多样性的理论值是10
18
，tcr多样性的理论值是10
14
。bcr与tcr序列中，抗原决定簇3(cdr3)是决定其抗原特异性最重要的部分，因此cdr3的序列被认为可以代表bcr、tcr序列的特性。
[0056]
在各种疾病中，随着不同的抗原刺激，bcr和tcr的多样性或者表达水平都会发生改变。因此，利用bcr或者tcr高通量测序结果可以追踪疾病的发生、发展。人体内细胞中，衰老蛋白质降解后，其片段会被运输到细胞表面，通过组织相容性抗原ii(mchii)呈递给免疫系统中的t细胞。正常细胞呈递的抗原片段，由于免疫耐受的关系，不会引起免疫反应。一旦当正常细胞出现癌变后，突变的基因表达的异常蛋白，其片段被呈递到细胞表面后，就会引起人体免疫系统产生针对性的免疫反应。因此，分析bcr或tcr的变化，能够检测出肿瘤或其他疾病的发生和发展。
[0057]
根据本发明得到的标志物，采用高通量测序分析外周血tcr序列以检测是否患有斑秃，具体步骤如下：
[0058]
(1)通过高通量测序得到训练集及验证集的斑秃患者和对照组的外周血中的tcr序列，并分析确定每条tcr的cdr3氨基酸序列；去除cdr3序列长度小于8个氨基酸残基及大于20个氨基酸残基的tcr序列；保证每个样本的功能性tcr序列总数不低于30000；
[0059]
(2)对每个样本的tcr序列进行随机不放回抽样，使每个样本的tcr序列数量总和均为30000；
[0060]
(3)数据分析，确定斑秃特征性tcrcdr3序列：
[0061]
a)将训练集对照组样本所有cdr3序列归总、去重，设为对照组tcr序列集；
[0062]
b)将训练集斑秃患者样本所有cdr3序列归总、去重，再去除所有在对照组tcr序列集中出现过的cdr3序列，所得到的cdr3序列定义为斑秃特征性tcr序列集；
[0063]
c)将斑秃特征性tcr序列集中，出现于两个及以上训练集斑秃患者样本中的cdr3序列，根据下列公式1计算其斑秃特征性权重。其中n
x
为包含序列x的训练集斑秃患者样本数，ci为第i个包含序列x的训练集斑秃患者样本中序列x的重复出现次数(表达水平)。将这些序列按斑秃特征性权重从高到低排序，以筛选出代表性的斑秃特征性tcrcdr3序列。
[0064][0065]
(4)利用斑秃特征性指数判断未知受试者罹患斑秃风险：
[0066]
a)训练集及验证集中对照组、斑秃患者和交叉验证组样本的免疫图谱，根据下列公式2分析其斑秃特征性指数。
[0067]
其中ms为某个样本s中包含的属于斑秃特征性tcr序列集的cdr3序列的种类，cj在
为第j种属于斑秃特征性tcr序列集的cdr3序列在该样本内的重复出现次数(表达水平)。
[0068][0069]
b)当未知健康状况受试者的斑秃特征性指数高于或接近某一阈值时，此人具有较高风险罹患斑秃；如其斑秃特征指数低于该阈值，则表明其患斑秃风险低。
[0070]
本发明的有益效果为：
[0071]
1、本发明中，首先利用非斑秃的对照组样本和斑秃患者的tcr高通量测序数据建立分析模型，确定斑秃特征性tcr序列。通过和这些斑秃特征性tcr序列对比，可以清楚的判断待测样本中是否有较高斑秃风险者；
[0072]
2、通过高通量测序分析tcr变化可以发现很早期的斑秃，根据斑秃特征性tcr序列分析人的免疫系统中的t细胞对斑秃的反应，是一种新型的检测方法；
[0073]
3、本发明中，由于采用高通量测序技术，同时比较巨大数量的特征性tcr序列，比起单独检测一种或几种标记物，具有更高的特异性和准确性；
[0074]
4、本发明中使用的高通量测序仪器成本低于大型影像学设备，且可向第三方外包，此外，采样、处理的人力成本低于同时检测多种标记物，也低于大量细胞学检测，因此，本发明大大降低了检测成本；
[0075]
5、本发明只需要采取少量外周血，采样简便、安全，是一种无创检验方法；
[0076]
6、本发明中所述斑秃特征性tcr序列，也可用于斑秃的免疫治疗。
附图说明
[0077]
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
[0078]
图1为曼哈顿散点图；其展示了对比对照组样本和斑秃患者样本的tcr序列，确定斑秃特征性tcr序列及其表达水平；横坐标代表对照组tcr序列集和斑秃特征性tcr序列集中独特的tcr cdr3氨基酸序列，对照组tcr序列集包含2.0
×
107种独特的tcr cdr3序列，斑秃特征性tcr序列集包含1.8
×
106种独特的tcr cdr3序列；纵坐标代表某一种tcr序列在某一个/组样本中表达水平的对数值；如箭头所示，斑秃特征性tcr序列被单独放大显示；a、通过对比1527个训练集对照组样本中的tcr序列和90个训练集斑秃患者中的tcr序列，确定出斑秃特征性tcr序列；b、一个训练集中对照组示例样本的tcr序列；c、一个训练集中斑秃患者示例样本的tcr序列；d、一个验证集中对照组示例样本的tcr序列；e、一个验证集中斑秃患者示例样本的tcr序列。所有样本都有自己的曼哈顿散点图分析；
[0079]
图2为曼哈顿散点图；其显示了在训练集和验证集的斑秃患者中的斑秃特征性tcr序列的种类及表达水平远远高于其对应的对照组样本。横坐标代表各个样本中独特的斑秃特征性tcr cdr3序列，纵坐标是每种斑秃特征性tcr序列在该样本中表达水平的对数值。所有样本都有自己的斑秃特征性tcr序列的曼哈顿散点图，此处从每组样本中分别选取5个代表性的曼哈顿散点图展示；
[0080]
图3为斑秃特征指数比较图；显示训练集中的斑秃患者样本(n＝90)的斑秃特征指数显著高于对照组样本(n＝1527)的斑秃特征指数，验证集中的斑秃患者样本(n＝25)的斑秃特征指数显著高于对照组样本(n＝141)和交叉验证组样本(n＝40)的斑秃特征指数(***：p《0.001，mann-whitney u-test)；
[0081]
图4为roc曲线分析验证集中的对照组样本和斑秃患者样本的斑秃特征指数图；其auc＝0.989，p《0.001，表明该分析的灵敏度和特异性都是100％，可以准确判断斑秃；
[0082]
图5为roc曲线分析验证集中的交叉验证组样本和斑秃患者样本的斑秃特征指数图；其auc＝0.968，p《0.001，表明该分析的灵敏度和特异性都是或接近100％，可以准确判断斑秃。
具体实施方式
[0083]
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，即所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0084]
以下对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
[0085]
实施例1
[0086]
通过对比大量对照组样本和斑秃患者样本的tcr序列，确定斑秃特征性tcr序列集：
[0087]
1、参与分析的样本：
[0088]
训练集的对照组数据包括1527个样本(1414个健康人和113个其他轻微疾病患者)；训练集的斑秃数据包括90个已确诊的斑秃患者样本；验证集的对照组数据包括141个样本(100个健康人，41个其他轻微疾病患者)；验证集的斑秃患者数据包括25个已确诊的斑秃患者样本。
[0089]
通过高通量测序得到每个样本的外周血中tcr基因序列，并分析确定每条tcr的cdr3的氨基酸序列；去除cdr3序列长度小于8个氨基酸残基及大于20个氨基酸残基的tcr序列；保证每个样本的功能性tcr序列总数不低于30000；为了统一对比分析，每个样本随机不放回抽取30000个tcr序列。
[0090]
2、分析训练集中的对照组样本和斑秃患者样本的tcr序列，确定斑秃特征性tcr序列集：
[0091]
通过分析对比训练集中1527个对照组样本和90个斑秃患者样本的tcr cdr3氨基酸序列数据，建立斑秃特征性tcr序列分析模型，确定斑秃病人特有的tcr序列：
[0092]
1)将训练集中对照组样本的所有tcr cdr3氨基酸序列归总去重，定义为对照组tcr序列集，包含约2.0
×
107种独特的tcr cdr3氨基酸序列；
[0093]
2)将训练集中斑秃患者样本的所有tcr cdr3氨基酸序列归总去重，再去除所有在对照组tcr序列集中出现过的序列，所得到的tcr序列定义为斑秃特征性tcr序列集，包含约1.8
×
106种独特的tcrcdr3序列，均没有在1527个对照组样本中出现过。
[0094]
3)分析结果展示为曼哈顿散点图(图1和图2)。图1a中横坐标代表对照组tcr序列集和斑秃特征性tcr序列集中独特的tcr cdr3氨基酸序列，纵坐标代表某一种cdr3序列x在某一样本中重复出现次数(表达水平)c
x
的对数值；图1b是一个训练集中对照组样本的曼哈顿散点图示例，图中显示训练集的对照组样本都没有斑秃特征序列(所有1527个训练集中的对照组样本都有类似的曼哈顿散点图)；图1c是一个训练集中斑秃患者的曼哈顿散点图示例，图中显示训练集中的斑秃样本都有多种类且表达水平较高的斑秃特征序列(所有90个训练集中的斑秃患者样本都有类似的曼哈顿散点图)。
[0095]
3、分析验证集样本的tcr序列，验证斑秃特征性tcr序列集：
[0096]
1)根据前述训练集样本分析建立的斑秃特征性tcr序列分析模型，分析验证集样本的tcr序列：其cdr3氨基酸序列与前述分析中确定的对照组tcr序列集中的任一序列相同的，归类为对照组tcr序列，其cdr3氨基酸序列与前述分析中确定的斑秃特征性tcr序列集中的任一序列相同的，归类为斑秃特征性tcr序列。
[0097]
图1d是一个验证集对照组样本的曼哈顿散点图示例，可见其中只有很少量的斑秃特征性tcr序列，而且表达水平也都很低(所有141个验证集对照组样本都有类似的曼哈顿散点图)；图1e是一个验证集斑秃患者的曼哈顿散点图示例，可见其中含有多种类且表达水平较高的斑秃特征性tcr序列(所有25个验证集斑秃患者样本都有类似的曼哈顿散点图)。
[0098]
2)所有样本都有自己的斑秃特征性tcr序列的曼哈顿散点图，图2展示了分别来自训练集对照组、训练集斑秃患者组、验证集对照组和验证集斑秃患者的5个代表性样本的曼哈顿散点图。结果表明训练集中，所有对照组样本都没有斑秃特征性tcr序列，所有斑秃患者都有多种类且表达水平较高的斑秃特征性tcr序列；验证集中，所有对照组样本都只有很少的斑秃特征性tcr序列，所有斑秃患者都有多种类且表达水平较高的斑秃特征性tcr序列。
[0099]
4、确定100种代表性的斑秃tcr标志物cdr3氨基酸序列：
[0100]
将斑秃特征性tcr序列集中，出现在两个及以上训练集斑秃患者样本里的tcr cdr3序列，根据下列公式1计算其斑秃特征性权重。其中n
x
为包含序列x的训练集斑秃患者样本数，ci为第i个包含序列x的训练集斑秃患者样本中序列x的重复出现次数(表达水平)。按这些序列的斑秃特征性权重从高到低排序，取排名前100的序列，作为代表性的斑秃特征性tcr标志物序列(表1)。
[0101][0102]
实施例2
[0103]
训练集、验证集中斑秃患者的斑秃特征性tcr序列的种类和表达水平都显著高于对应的对照样本，可以据此准确诊断斑秃患者：
[0104]
1、参与分析的样本：
[0105]
1)来自实施例1的样本：
[0106]
训练集的对照组数据包括1527个样本(1414个健康人和113个其他轻微疾病患者)；训练集的斑秃数据包括97个已确诊的斑秃患者样本；验证集的对照组数据包括141个样本(100个健康人，41个其他轻微疾病患者)；验证集的斑秃患者数据包括25个已确诊的斑
秃患者样本。
[0107]
2)新增样本：
[0108]
验证集的交叉验证组数据包括40个非斑秃的免疫相关疾病患者的样本。
[0109]
所有样本的tcr测序数据都按实施例1的分析：通过高通量测序得到每个样本的外周血中tcr基因序列，并分析确定每条tcr的cdr3的氨基酸序列；去除cdr3序列长度小于8个氨基酸残基及大于20个氨基酸残基的tcr序列；保证每个样本的功能性tcr序列总数不低于30000；为了统一对比分析，每个样本随机不放回抽取30000个tcr序列。
[0110]
2、训练集、验证集中斑秃患者的斑秃特征性tcr序列的种类和表达水平都显著高于对应的对照样本：
[0111]
为了对比不同组的样本之间的斑秃特征tcr序列的种类和表达水平，我们根据下列公式2定义了每个样本中的斑秃特征性指数。其中ms为某个样本s中包含的属于斑秃特征性tcr序列集的cdr3序列的种类，cj在为第j种属于斑秃特征性tcr序列集的cdr3序列在该样本内的重复出现次数(表达水平)。
[0112][0113]
分析结果见下表2及图3。训练集中1527个对照组样本的斑秃特征指数都为0，而训练集中90个斑秃患者样本的斑秃特征指数在8003到17426之间，因此训练集中斑秃患者的斑秃特征指数显著高于训练集中对照组样本的斑秃特征指数(p《0.001，mann-whitney u-test)。
[0114]
验证集中141个对照组样本的斑秃特征指数在1到4956之间，用于交叉验证的40个非斑秃的其他免疫相关疾病患者样本的斑秃特征指数在62到5867之间，而验证集中的25个斑秃患者样本的斑秃特征指数在1210到15379之间。因此，验证集中斑秃患者的斑秃特征指数显著高于验证集中对照组和交叉验证组样本的斑秃特征指数(p《0.001，mann-whitney u-test)。
[0115]
这些结果证明了无论训练组还是对照组中，斑秃患者样本的斑秃特征指数都显著高于对照组(健康人及轻微疾病病人)和非斑秃的其他免疫相关疾病患者。
[0116]
表2.训练集和验证集中不同样本组的斑秃特征性指数
[0117]
[0118]
[0119]
[0120][0121]
3、利用斑秃特征指数可以准确判断斑秃：
[0122]
1)roc曲线分析验证集中对照组样本和斑秃患者样本的斑秃特征指数：
[0123]
对验证集中对照组样本(包括健康人100人和其他轻微疾病患者41人，归为negative)和斑秃患者样本(25人，归为positive)的斑秃特征指数进行roc曲线(receiver operating characteristic curve,受试者工作特征曲线)分析(图4)。结果为auc(areaundercurve，roc曲线下面积)＝0.989，p《0.001，表明利用斑秃特征指数可以明确区分验证集中的对照组样本和斑秃患者样本。
[0124]
根据分层似然比计算(表3)，当取cut off值＝1121时，判断斑秃的特异性为97.9％和敏感度为100％，表明取这个cutoff值时，利用斑秃特征指数可以准确区分验证集中的对照组样本和斑秃患者样本。
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表3验证集中对照组样本和斑秃患者样本的斑秃特征指数roc曲线的分层似然比数据
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2)roc曲线分析验证集中交叉验证组样本和斑秃患者样本的斑秃特征指数：
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对验证集中交叉验证组样本(非斑秃的其他免疫相关疾病患者40人，归为negative)和斑秃患者样本(25人，归为positive)的斑秃特征指数进行roc曲线分析(图5)。结果为auc＝0.968，p《0.001，表明利用斑秃特征指数可以明确区分验证集中的交叉验证组样本和斑秃患者样本。
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根据分层似然比计算(表4)，当取cut off值＝1219时(高于前面根据验证集对照组vs斑秃样本确定的cutoff值1121)，判断斑秃的特异性是92.5％，敏感度是96.0％，表明取该cutoff值，可以利用斑秃特征指数很好地区分交叉验证组样本和斑秃患者样本；当cutoff值＝818时(低于前面根据验证集对照组vs斑秃样本确定的cutoff值1121)，判断斑秃的特异性仍为92.5％，敏感度提高到100％，表明取该cutoff值，仍然可以利用斑秃特征指数很好地区分交叉验证组样本和斑秃患者样本。
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表4验证集中交叉验证组样本和斑秃患者样本的斑秃特征指数roc曲线的分层似然比数据
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综上所述，本发明所发现的斑秃特征性tcr序列，确实具有显著的斑秃特异性，可以用于准确判断斑秃患者，具有很高的特异性和灵敏度。这些斑秃特征性tcr序列未来还可
用于预测受试者罹患斑秃的风险和疾病进展，或用于斑秃的生物免疫治疗。
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本发明具体实施方式进行了详细地描述，但不应理解为对本专利的保护范围的限定。本领域技术人员不经创造性劳动即可做出的各种修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种斑秃的外周血tcr标志物，其特征在于，标志物来自tcr可变区cdr3序列，其包括序列seq id no.1-100所示蛋白中的至少一种。2.根据权利要求1所述的斑秃的外周血tcr标志物，其特征在于，所述标志物的蛋白序列为seq id no.1-100所示的序列经取代、缺失和/或替换一个或多个氨基酸后，仍具有相同功能的蛋白。3.权利要求1或2所述的tcr标志物在制备检测或治疗斑秃的制剂中的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述制剂包括含有该tcr标志物的t细胞受体，或能表达产生该tcr标志物的质粒、病毒载体或核酸片段。5.一种用于斑秃检测的试剂盒，其特征在于，包括能与权利要求1所述tcr标志物发生特异性结合的抗体。6.一种制剂，其特征在于，包括能与权利要求1所述tcr标志物发生特异性结合的抗体。所述制剂可用于对斑秃进行诊断、预测、检测或筛查。7.一种检测斑秃的蛋白质芯片，其特征在于，所述蛋白质芯片包括基片和点样在基片上的特异性抗体，所述特异性抗体为能与权利要求1所述tcr标志物发生特异性结合的抗体。

技术总结
本发明公开了一种斑秃的外周血TCR标志物及其检测试剂盒和应用，该标志物包括序列SEQ ID NO.1-100所示蛋白中的至少一种。本发明基于高通量测序方法，只需要采取少量外周血，提取RNA，通过对样本的处理建立免疫图谱文库，再经过高通量测序和TCR数据分析，首先确定斑秃外周血中特征性TCR序列集，然后将待测样本测试结果与该特征性TCR序列集比对，从而判断是否患有斑秃。本发明能够同时比较巨大数量的斑秃特征性TCR序列，相比单独检测一种或几种标记物，具有更高的特异性和灵敏度，提高了诊断效率。效率。


技术研发人员：张志新 杨鑫 何彭铭 卓越
受保护的技术使用者：成都益安博生物技术有限公司
技术研发日：2022.08.26
技术公布日：2023/10/15