一种酚酸类化合物RetusiusinesH及其制备方法和应用与流程

一种酚酸类化合物retusiusines h及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明属于抗菌活性研究技术领域，具体涉及一种酚酸类化合物retusiusines h及其制备方法和应用。


背景技术：

2.黑色素瘤是由黑色素细胞恶性转化而来的，最具转移性和危险性的皮肤癌，占所有皮肤癌死亡人数的90％。大约90％的黑色素瘤死亡归因于转移，转移后的iv期黑色素瘤患者的中位无进展生存期仅为1.7个月。目前，世卫组织估计每年黑色素瘤确诊患者的死亡率可达30％，严重威胁人类健康。
3.目前临床上针对抑制黑色素瘤转移的主要化疗药物有替莫唑胺、达卡巴嗪、索拉菲尼。但现有的化疗药物对进展期黑色素瘤的客观应答率仅为10％～15％，且存在严重的耐药性和毒副作用等问题。因此，寻找新的低毒高效的治疗药物成为实现健康中国战略目标的重大需求。
4.天然产物在治疗各种疾病时表现出了独特的疗效，具有减毒增效、成本低、低循环的特点。天然产物在抗癌药物研发中不断涌现出大量具有显著抗癌作用的新结构，如紫杉醇酰胺衍生物ave8062。1981年1月至2019年9月全世界批准上市的小分子抗肿瘤新药共计185个，与天然产物相关的药物共计156个(占84％)。因此，从天然产物中寻找新型抗肿瘤药物是本领域研究的热点。


技术实现要素：

5.本发明的主要目的在于提供一种酚酸类化合物retusiusines h、其制备方法及其在抗黑色素瘤药物方面的应用。所述酚酸类化合物re tusiusines h在低浓度的情况下可有效抑制人皮肤黑色素瘤a2058生长，具有非常大的应用潜能。
6.第一方面，本发明提供一种式(i)所示的酚酸类化合物retusius ines h，
[0007][0008]
第二方面，本发明提供上述式(i)所示的酚酸类化合物retusius ines h在制备治疗和/或预防黑色素瘤的药物中的应用。
[0009]
在一些实施方案中，所述黑色素瘤为a2058人皮肤黑色素瘤。
[0010]
第三方面，本发明提供上述式(i)所示的酚酸类化合物retusius ines h的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
[0011]
步骤(1)：取霍山石斛，提取，得提取液，减压浓缩，得到霍山石斛提取物；
[0012]
步骤(2)：将步骤(1)得到的提取物用水溶解后，用乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯相减压浓缩，得到霍山石斛浸膏；
[0013]
步骤(3)：将步骤(2)得到的浸膏通过正相硅胶柱层析分离，梯度洗脱，收集各梯度的梯度洗脱液并浓缩，经tlc监测，合并相同的部分，得到7个组分fr.1-fr.7；
[0014]
步骤(4)：将步骤(3)得到的组分fr.2通过正相硅胶柱层析分离，梯度洗脱，收集各梯度的梯度洗脱液并浓缩，经tlc监测，合并相同的部分，得到6个亚组分2a1-2a6；
[0015]
步骤(5)：对步骤(4)得到的亚组分2a2通过半制备高效液相色谱分离，得到式(ⅰ)所示的酚酸类化合物retusiusines h。
[0016]
在一些实施方案中，步骤(1)中，霍山石斛的提取方式为浸渍提取、超声提取、回流提取等，优选为浸渍提取；
[0017]
和/或，提取溶剂为乙醇；
[0018]
和/或，提取时间为5-9天，例如7天；
[0019]
和/或，提取次数为1-5次，例如3次。
[0020]
在一些实施方案中，步骤(1)具体为：将霍山石斛鲜样，去叶保茎，用粉碎机粉碎，常温下20l无水乙醇浸渍提取3次，每次7天，后过滤取滤液，减压浓缩，得到霍山石斛提取物。
[0021]
在一些实施方案中，所述制备方法包括如下步骤：
[0022]
步骤(1)，将霍山石斛鲜样，去叶保茎，用粉碎机粉碎，常温下20l无水乙醇浸渍提取3次，每次7天，后过滤取滤液，减压浓缩，得到霍山石斛提取物；
[0023]
步骤(2)，将步骤(1)得到的提取物用水溶解后，用乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯相减压浓缩，得到浸膏；
[0024]
步骤(3)，将步骤(2)得到的浸膏干法上样，通过正相硅胶柱层析分离，然后进行梯度洗脱，收集各梯度的梯度洗脱液并浓缩，经tlc监测，合并相同的部分，得到7个组分fr.1-fr.7；
[0025]
步骤(4)，将步骤(3)得到的组分fr.2干法上样，通过正相硅胶柱层析分离，然后进行梯度洗脱，收集各梯度的梯度洗脱液并浓缩，经tlc监测，合并相同的部分，得到6个亚组分2a1-2a6；
[0026]
步骤(5)，对步骤(4)得到的亚组分2a2进行半制备高效液相色谱纯化，得到式(ⅰ)所示的酚酸类化合物。
[0027]
在一些实施方案中，步骤(2)中，
[0028]
乙酸乙酯与水的体积比为0.5-3:1，例如1:1；
[0029]
和/或，采用超声进行萃取操作，萃取后静置过夜；
[0030]
和/或，萃取次数为3-5次。
[0031]
在一些实施方案中，步骤(2)中具体为：
[0032]
将步骤(1)得到的提取物用水溶解后，加入等体积的乙酸乙酯，在室温条件下超声0.5-1.5h，然后室温条件下静置8-12h，取上清，减压浓缩；萃取次数为3-5次。
[0033]
在一些实施方案中，步骤(3)中正相硅胶柱层析分离过程中，采用干法上样。
[0034]
在一些实施方案中，步骤(3)中，浸膏干法上样的具体方法为：将浸膏用10倍体积乙酸乙酯溶解后，用与浸膏等质量的80-100目硅胶吸附拌样后上样。
[0035]
在一些实施方案中，步骤(3)中，所述的正相硅胶柱中装柱硅胶为200-300目的正相硅胶。
[0036]
在一些实施方案中，步骤(3)中，梯度洗脱采用的流动相为二氯甲烷和甲醇的混合溶剂；
[0037]
优选地，二氯甲烷和甲醇的混合溶剂中二氯甲烷和甲醇的体积比依次为100:0、100:1、80:1、50:1、30:1、10:1、5:1、1:1、0:1；
[0038]
优选地，每个梯度洗脱到tlc点板无点后，更换下一梯度洗脱，得到fr.1-fr.7共7个组分。
[0039]
在一些实施方案中，步骤(4)中正相硅胶柱层析分离过程中，采用干法上样。
[0040]
在一些实施方案中，步骤(4)中，干法上样的具体方法为：将组分fr.2用10倍体积甲醇溶解后，用与组分fr.2等质量的80-100目硅胶吸附拌样后上样。
[0041]
在一些实施方案中，步骤(4)中，所述的正相硅胶柱中装柱硅胶为200-300目的正相硅胶。
[0042]
在一些实施方案中，步骤(4)中，梯度洗脱采用的流动相为石油醚和乙酸乙酯的混合溶剂；
[0043]
优选地，石油醚和乙酸乙酯的体积比依次为100:1、60:1、30:1、10:1、1:1；
[0044]
优选地，每个梯度洗脱到tlc点板无点后，更换下一梯度洗脱，得到2a1-2a6共6个亚组分。
[0045]
在一些实施方案中，步骤(5)中，先采用凝胶色谱纯化，再采用半制备高效液相色谱纯化。
[0046]
在一些实施方案中，步骤(5)中，凝胶色谱纯化采用的凝胶柱为sephadex lh-20，以体积比为1：1的二氯甲烷和甲醇的混合溶剂作为流动相。
[0047]
在一些实施方案中，步骤(5)中，凝胶色谱纯化时，将亚组分2a2用2倍体积甲醇溶解后上样，经tlc监测，合并相同的部分。
[0048]
在一些实施方案中，步骤(5)中，半制备高效液相色谱纯化的色谱条件为：
[0049]
流动相为体积比为9:1的甲醇和水的混合溶剂；
[0050]
流速为1ml/min；
[0051]
收集开始出峰时间为5.6min的组分；
[0052]
采用c
18
反向色谱柱；规格优选为：4.6mmx250mm，5μm；
[0053]
柱温：30℃；
[0054]
每次进样量：20μl；
[0055]
采用紫外检测器，检测波长为210nm。
[0056]
在一些实施方案中，梯度洗脱时，采用tlc监测，合并相同部分。
[0057]
本发明与现有技术相比，其有益效果为：
[0058]
(1)本发明提供了一个新颖的酚酸类化合物retusiusines h(化合物结构参见附图1)。
[0059]
(2)本发明还提供了所述酚酸类化合物retusiusines h在制备治疗和/或预防黑色素瘤的药物中的应用，所述的酚酸类化合物能够在低浓度的情况下抑制人皮肤黑色素瘤细胞，表现出显著的活性，ic
50
值为9.59μmol/l。由此可见，所述的酚酸类化合物在抗黑色素瘤药物开发上具有非常大的应用潜能。
[0060]
(3)本发明还提供了所述酚酸类化合物retusiusines h的制备方法，能够快速准
确高效的从霍山石斛中制备获得所述化合物。
附图说明
[0061]
图1为本发明所述的酚酸类化合物retusiusines h的化学结构式；
[0062]
图2为本发明所述的酚酸类化合物retusiusines h的1h nmr图；
[0063]
图3为本发明所述的酚酸类类化合物retusiusines h的
13
c nmr图。
具体实施方式
[0064]
下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
[0065]
除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。
[0066]
应用实施例1酚酸类化合物retusiusines h的制备
[0067]
酚酸类化合物retusiusines h的制备方法，包括以下步骤：
[0068]
1)将20kg霍山石斛鲜样，去叶保茎，用粉碎机粉碎，常温下20l无水乙醇浸渍提取3次，每次7天，后过滤取滤液，减压浓缩，得到霍山石斛提取物；
[0069]
2)将步骤1)中的得到的提取物用水溶解后，用乙酸乙酯萃取，水和乙酸乙酯的体积比为1:1，取乙酸乙酯相减压浓缩，得到浸膏967g；
[0070]
3)将步骤(2)得到的浸膏用乙酸乙酯溶解后用硅胶吸附拌样，经正向硅胶色谱柱粗分梯度洗脱得到组分fr.1-fr.7，硅胶柱层析的固定相为200-300目的正相硅胶，流动相依次为二氯甲烷/甲醇(100:0
→
0:100)；
[0071]
具体为：将浸膏用10倍体积乙酸乙酯溶解后，用与浸膏等质量80-100目硅胶吸附拌样后上样；
[0072]
梯度洗脱采用的流动相按洗脱顺序依次为二氯甲烷和甲醇的混合溶剂。二氯甲烷和甲醇的混合溶剂中二氯甲烷和甲醇的体积比依次为100:0、100:1、80:1、50:1、30:1、10:1、5:1、1:1、0:1，每个梯度洗脱到tlc点板无点后，更换下一梯度洗脱，得到fr.1-fr.7共7个组分。
[0073]
4)组分fr.2经正相硅胶柱层析，tlc监测，合并相同的部分，得到6个亚组分(2a1-2a6)，硅胶柱层析的固定相为200-300目的正相硅胶，流动相为石油醚/乙酸乙酯(100:1
→
1：1)；
[0074]
具体为：将组分fr.2用10倍体积甲醇溶解后，用与组分fr.2等质量80-100目硅胶吸附拌样后上样；梯度洗脱采用的流动相为石油醚和乙酸乙酯的混合溶剂，石油醚和乙酸乙酯的体积比依次为100:1、60:1、30:1、10:1、1:1，每个梯度洗脱到tlc点板无点后，更换下一梯度洗脱，得到2a1-2a6共6个亚组分。
[0075]
5)2a2经凝胶柱层析sephadex lh-20、hplc纯化；凝胶的流动相为二氯甲烷/甲醇(1：1)；hplc的流动相为甲醇/水(9：1)，流速为1ml/min，收集开始出峰时间为5.6min的组分，得到化合物ret usiusines h(5mg)。
[0076]
凝胶色谱纯化时，将亚组分2a2用2倍体积甲醇溶解后上样；使用10ml试管进行收
集，每一管收集5ml，共收集60管，经tlc监测，合并相同的部分，将10-20管进行合并，减压浓缩后经hplc纯化。
[0077]
所述的hplc色谱条件为流动相为甲醇和水(体积比为9：1)的混合溶剂，流速为1ml/min，收集开始出峰时间为5.6min的组分，采用安捷伦c
18
反向色谱柱，规格为：4.6mmx250mm，5μm；柱温：30℃，每次进样量：20ul，采用紫外检测器，检测波长为210nm。
[0078]
通过核磁谱图确定了获得的单体化合物retusiusines h的结构，所得化合物的性状和波谱数据如下：
[0079]
酚酸类化合物retusiusines h的结构式如式(ⅰ)所示；
[0080][0081]
英文名为retusiusines h(3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)propyl3-phenylpropanoate)，无色油状液体，分子式为c
19h22
o4，分子量为314.1518。
[0082]1h nmr(cdcl3,500mhz)δh:6.65(1h,s,h-2)，6.83(1h,d,j＝8.39hz,h-5)，6.64((1h,d,j＝7.00hz,h-6)，2.57(2h,t,j＝7.50hz,h-7)，1.90(2h,m,h-8)，4.09(2h,t,j＝6.56hz,h-9)，3.87(3h,s,h-10)，7.21(1h,d,j＝7.72hz,h-2
′
)，7.29(1h,t,j＝8.16hz,h-3
′
)，7.19(1h,t,j＝7.89hz,h-4
′
),7.29(1h,t,j＝8.16hz,h-5
′
),7.21(1h,d,j＝7.72hz,h-6
′
),2.96(2h,t,j＝7.78hz,h-7
′
),2.65(2h,t,j＝8.10hz,h-8
′
),5.51(1h,s,4-oh).
[0083]
13
c nmr(cdcl3,125mhz)δc:133.2(c-1),111.0(c-2),146.5(c-3),144.0(c-4),114.4(c-5),121.1(c-6),31.1(c-7),30.6(c-8),63.9(c-9),56.0(c-10),140.6(c-1
′
),128.4(c-2
′
),128.6(c-3
′
),126.4(c-4
′
),128.6(c-5
′
),128.4(c-6
′
),31.9(c-7
′
),36.0(c-8
′
),173.1(c-9
′
).
[0084]
应用实施例2酚酸类化合物retusiusines h抑制人黑色素瘤a2058的活性研究
[0085]
1材料
[0086]
1.1细胞
[0087]
人黑色素瘤细胞(a2058)购自中国细胞库典藏细胞中心(武汉)。
[0088]
1.2材料
[0089]
胎牛血清购自杭州四季青生物制品公司，dmem培养基、磷酸盐缓冲液(pbs)、青霉素-链霉素、0.25％的胰蛋白酶均购自gibco公司(美国)，cck8试剂盒购自abcam公司(美国)。
[0090]
1.3仪器
[0091]
二氧化碳培养箱(香港力康生物医疗科技有限公司)，台式高速离心机(昆山市超声仪器有限公司)，酶标仪(美国bio-tek公司)
[0092]
2方法
[0093]
2.1实验分组
[0094]
研究不同浓度retusiusines h对a2058细胞的抑制效果，不同组细胞分别加入40μmol/l、20μmol/l、10μmol/l、5μmol/l、1μmol/l的retusiusines h培养。
[0095]
2.2细胞培养
[0096]
a2058细胞培养于含体积分数为10％胎牛血清的dmem培养基中，在5％ co2、37℃培养箱中培养，以胰酶消化，按照1:3比例传代。
[0097]
2.3cck8检测细胞增殖
[0098]
取对数生长期的a2058细胞，调整细胞浓度为4～5
×
104个/ml，以每孔100μl接种于96孔板，置于培养箱(37℃、5％co2)培养24h。取出96孔板，弃去培养基，实验组每孔加入100μl的含不同浓度的a2058培养基(培养基采用含体积分数为10％胎牛血清的dmem培养基)，分别设置5个复孔。继续培养24h，吸弃含药培养基，用pbs清洗3次，观察完毕后，每孔加10μl的体积分数为10％的cc k8，置于37℃避光孵育4h，用酶标仪在450nm处检测吸光度(od值)，并计算抑制率。
[0099]
3实验结果
[0100]
40μmol/l、20μmol/l、10μmol/l、5μmol/l、1μmol/l浓度retusiusines h对a2058细胞的抑制率分别为99.03％、80.36％、67.69％、16.69％、4.99％(表1)，因此retusiusines h对a2058细胞具有显著的抑制活性，ic
50
值为9.59μmol/l。
[0101]
表1不同浓度的retusiusines h对a2058细胞的抑制率
[0102] 40μmol/l20μmol/l10μmol/l5μmol/l1μmol/l抑制率％99.03
±
0.0680.36
±
0.0567.69
±
0.0716.69
±
0.084.49
±
0.11
[0103]
4实验结论
[0104]
retusiusines h能够显著抑制a2058细胞的增殖，ic
50
值为9.59μmol/l。由此可见，所述酚酸类化合物retusiusines h在抗黑色素瘤药物的应用方面有极大的应用潜能。
[0105]
以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种式(i)所示的酚酸类化合物retusiusines h，2.权利要求1所述的式(i)所示的酚酸类化合物retusiusines h在制备治疗和/或预防黑色素瘤的药物中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述黑色素瘤为a2058人皮肤黑色素瘤。4.权利要求1所述的式(i)所示的酚酸类化合物retusiusines h的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：步骤(1)：取霍山石斛，提取，得提取液，减压浓缩，得到霍山石斛提取物；步骤(2)：将步骤(1)得到的提取物用水溶解后，用乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯相减压浓缩，得到霍山石斛浸膏；步骤(3)：将步骤(2)得到的浸膏通过正相硅胶柱层析分离，梯度洗脱，收集各梯度的梯度洗脱液并浓缩，经tlc监测，合并相同的部分，得到7个组分fr.1-fr.7；步骤(4)：将步骤(3)得到的组分fr.2通过正相硅胶柱层析分离，梯度洗脱，收集各梯度的梯度洗脱液并浓缩，经tlc监测，合并相同的部分，得到6个亚组分2a1-2a6；步骤(5)：对步骤(4)得到的亚组分2a2通过半制备高效液相色谱分离，得到式(ⅰ)所示的酚酸类化合物retusiusines h。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，霍山石斛的提取方式为浸渍提取、超声提取、回流提取等，优选为浸渍提取；和/或，提取溶剂为乙醇；和/或，提取时间为5-9天，例如7天；和/或，提取次数为1-5次，例如3次；优选地，步骤(1)具体为：将霍山石斛鲜样，去叶保茎，用粉碎机粉碎，常温下20l无水乙醇浸渍提取3次，每次7天，后过滤取滤液，减压浓缩，得到霍山石斛提取物。6.根据权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，乙酸乙酯与水的体积比为0.5-3:1，例如1:1；和/或，采用超声进行萃取操作，萃取后静置过夜；和/或，萃取次数为3-5次；优选地，步骤(2)中具体为：将步骤(1)得到的提取物用水溶解后，加入等体积的乙酸乙酯，在室温条件下超声0.5-1.5h，然后室温条件下静置8-12h，取上清，减压浓缩；萃取次数为3-5次。7.根据权利要求4-6任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，正相硅胶柱层析分离过程中，采用干法上样；优选地，浸膏干法上样的具体方法为：将浸膏用10倍体积乙酸乙酯溶解后，用与浸膏等质量的80-100目硅胶吸附拌样后上样；和/或，所述的正相硅胶柱中装柱硅胶为200-300目的正相硅胶；
和/或，梯度洗脱采用的流动相为二氯甲烷和甲醇的混合溶剂；优选地，二氯甲烷和甲醇的混合溶剂中二氯甲烷和甲醇的体积比依次为100:0、100:1、80:1、50:1、30:1、10:1、5:1、1:1、0:1。8.根据权利要求4-7任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，正相硅胶柱层析分离过程中，采用干法上样；优选地，干法上样的具体方法为：将组分fr.2用10倍体积甲醇溶解后，用与组分fr.2等质量的80-100目硅胶吸附拌样后上样；和/或，所述的正相硅胶柱中装柱硅胶为200-300目的正相硅胶。和/或，梯度洗脱采用的流动相为石油醚和乙酸乙酯的混合溶剂；优选地，石油醚和乙酸乙酯的体积比依次为100:1、60:1、30:1、10:1、1:1。9.根据权利要求4-8任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，先采用凝胶色谱纯化，再采用半制备高效液相色谱纯化；优选地，凝胶色谱纯化采用的凝胶柱为sephadex lh-20，以体积比为1：1的二氯甲烷和甲醇的混合溶剂作为流动相；更为优选地，凝胶色谱纯化时，将亚组分2a2用2倍体积甲醇溶解后上样，经tlc监测，合并相同的部分；优选地，半制备高效液相色谱纯化的色谱条件为：流动相为体积比为9:1的甲醇和水的混合溶剂；流速为1ml/min；收集开始出峰时间为5.6min的组分；采用c
18
反向色谱柱；规格优选为：4.6mmx250mm，5μm；柱温：30℃；每次进样量：20μl；采用紫外检测器，检测波长为210nm。

技术总结
本发明提供了一个新颖的酚酸类化合物Retusiusines H。本发明还提供了所述酚酸类化合物Retusiusines H在制备治疗和/或预防黑色素瘤的药物中的应用，所述的酚酸类化合物能够在低浓度的情况下，抑制人皮肤黑色素瘤细胞有显著的活性，IC


技术研发人员：杨健 刘志超 孙云开 杨小龙 李静 白瑞斌 罗志强
受保护的技术使用者：六安市农业科学研究院
技术研发日：2023.04.04
技术公布日：2023/10/15