一种用于治疗实体肿瘤的联合用药物和药物组合物

1.本发明属于医药技术领域，具体涉及一种用于治疗实体肿瘤的联合用药物和药物组合物。


背景技术：

2.核糖体是细胞内蛋白质合成中心。肿瘤生长需要提高核糖体功能以满足其快速生长所需的蛋白质合成。因此，抑制核糖体功能被认为是肿瘤治疗的重要策略。高三尖杉酯碱(homoharringtonine,hht)是一种从三尖杉酯中分离出来的植物生物碱，是我国自主研制的一种高效抗肿瘤药。hht可结合在核糖体肽基转移酶中心从而阻断蛋白质合成。hht是目前唯一一种用于临床癌症治疗的核糖体抑制剂，其被广泛应用于急性非淋巴细胞白血病的治疗。然而，临床研究表明，实体肿瘤包括头颈癌、乳腺癌、结直肠癌、肾癌等对hht治疗不响应，其原因尚不清楚。因此，探究实体肿瘤细胞抵抗hht的分子机制，对于拓展hht在肿瘤治疗中的应用具有重要意义。
3.snail1是主要定位于细胞核质中的重要转录因子，在上皮间充质转化(emt)、肿瘤转移与生存、代谢重编程及肿瘤干细胞特性等方面发挥重要作用。然而snial1是否可定位于核仁并参与调控核糖体生成目前尚无报道。snail1蛋白主要通过泛素依赖的蛋白酶体途径降解，因此泛素化和去泛素化调控是影响snail1蛋白稳定性的关键因素。usp36是特异性定位于核仁的去泛素化酶，其通过稳定b23、纤维蛋白(fbl)及c-myc等蛋白，从而促进核糖体rrna转录及加工，进而促进核糖体生成。
4.目前，对于usp36-snail1相关通路与抗肿瘤之间的关系，尚未见到其他任何报道。


技术实现要素：

5.针对现有技术的问题，本发明提供一种用于治疗实体肿瘤的联合用药物和药物组合物，目的在于联合使用包括高三尖杉酯碱在内的核糖体抑制剂和jnk-usp36-snail通路抑制剂进行实体肿瘤的治疗。
6.jnk-usp36-snail通路抑制剂在制备用于消除实体肿瘤抵抗核糖体抑制剂的药物中的用途。
7.本发明还提供核糖体抑制剂联合jnk-usp36-snail通路抑制剂在制备治疗实体肿瘤的药物中的用途。
8.优选的，所述核糖体抑制剂选自高三尖杉酯碱、anisomycin、puromycin、g418或blasticidin中的至少一种。
9.优选的，所述jnk-usp36-snail通路抑制剂选自jnk抑制剂、usp36抑制剂或snail1抑制剂中的至少一种。
10.优选的，所述jnk抑制剂选自sp600125、jnk-in-8、jnk-930或bentamapimod中的至少一种；usp36抑制剂选自针对usp36的特异性sirna；snail1抑制剂选自针对snail1的特异性sirna。
11.优选的，所述实体肿瘤为肺癌、头颈癌、乳腺癌、结直肠癌或肾癌。
12.本发明还提供一种用于治疗实体肿瘤的联合用药物，所述联合用药物是分别或同时给药的核糖体抑制剂和jnk-usp36-snail通路抑制剂。
13.优选的，所述核糖体抑制剂选自高三尖杉酯碱、anisomycin、puromycin、g418或blasticidin中的至少一种。
14.优选的，所述jnk-usp36-snail通路抑制剂选自jnk抑制剂、usp36抑制剂或snail1抑制剂中的至少一种。
15.优选的，所述jnk抑制剂选自sp600125、jnk-in-8、jnk-930或bentamapimod中的至少一种；usp36抑制剂选自针对usp36的特异性sirna；snail1抑制剂选自针对snail1的特异性sirna。
16.优选的，所述联合用药物用于治疗肺癌、头颈癌、乳腺癌、结直肠癌或肾癌。
17.本发明还提供一种药物组合物，它是以核糖体抑制剂和jnk-usp36-snail通路抑制剂为活性成分，加入药学上可接受的辅料或辅助性成分制成的。
18.优选的，所述核糖体抑制剂选自高三尖杉酯碱、anisomycin、puromycin、g418或blasticidin中的至少一种。
19.优选的，所述jnk-usp36-snail通路抑制剂选自jnk抑制剂、usp36抑制剂或snail1抑制剂中的至少一种。
20.优选的，所述jnk抑制剂选自sp600125、jnk-in-8、jnk-930或bentamapimod中的至少一种；usp36抑制剂选自针对usp36的特异性sirna；snail1抑制剂选自针对snail1的特异性sirna。
21.优选的，所述核糖体抑制剂和jnk-usp36-snail通路抑制剂的用量比例为重量比0.5:7.5-3:25。
22.本发明通过研究发现，激活jnk-usp36-snail1信号通路是实体肿瘤抵抗包括高三尖杉酯碱在内的核糖体抑制剂的关键。进一步利用细胞及动物模型研究发现：1)联合jnk抑制剂sp600125与核糖体抑制剂可显著抑制体外肿瘤细胞存活及体内实体肿瘤生长；2)利用rnai干扰技术沉默usp36或snail1可显著促进核糖体抑制剂介导体外肿瘤细胞死亡及体内肿瘤生长抑制。通过上述实验结果可知：靶向抑制jnk-usp36-snail信号通路将增强实体肿瘤细胞对核糖体抑制剂的敏感性；因此，本发明提出联合核糖体抑制剂及jnk-usp36-snail通路抑制剂进行实体肿瘤治疗，这是一种全新的策略，能够为癌症患者的临床治疗提供更多的选择。
23.显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
24.以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
25.图1为hht促进snail1蛋白核仁聚集。(a)用20ng/ml hht处理所示细胞24小时，然后利用免疫荧光染色检测snail1蛋白的亚细胞定位情况，b23为核仁标志物，dapi为细胞核
染料，比例尺为25μm。(b)利用皮尔逊相关系数(pearson’s correlation coefficient)计算(a)中snail1蛋白和b23蛋白的共定位情况，来自于三次独立实验的40个细胞用于此计算。(c)用20ng/ml hht处理hcc1806细胞24小时，然后分离细胞组分(cp,胞质；np，核质；no,核仁)并免疫印迹检测各组分中snail1蛋白的表达情况。tubulin为细胞胞质的标志物，sp1为核质的标志物。
26.图2为hht通过增加usp36表达从而促进snail1蛋白核仁聚集。(a)用20ng/ml hht处理所示细胞24小时，然后用50μg/ml蛋白质合成抑制剂放线菌酮(chx)处理细胞所示时间，然后免疫印迹检测snail1蛋白表达情况。对snail1蛋白进行定量分析，然后绘制snail1蛋白半衰期图谱。(a)用20ng/ml hht、20nm mtor抑制剂rapamycin(rap)、200ng/ml核糖体抑制剂puromycin(puro)及2μg/ml核糖体抑制剂blasticidin(blasti)处理hcc1806细胞24小时，然后免疫印迹检测usp36及snail1蛋白的表达情况。(c)在hcc1806及sum159细胞中稳定表达野生型usp36(usp36-wt)或usp36去泛素化酶活失活突变体usp36-c131a，然后免疫印迹检测snail1蛋白的表达情况。(d)在敲低usp36(shusp36)的hcc1806细胞中回补usp36-wt或usp36-c131a，然后免疫印迹检测snail1蛋白的表达情况。(e)在hcc1806细胞中稳定表达usp36-wt或usp36-c131a，然后免疫荧光染色检测snail1蛋白亚细胞定位情况。(f)用20ng/ml hht处理敲低(shusp36)或未敲低(shgfp)usp36的hcc1806细胞24小时，然后免疫荧光染色检测snail1蛋白亚细胞定位情况。比例尺为25μm。
27.图3为usp36是核仁snail1的去泛素化酶。(a)免疫共沉淀实验检测核仁中内源usp36及snail1蛋白复合物形成情况。(b)在hek-293细胞中稳定表达野生型usp36(usp36-wt)或去泛素化酶活失活突变体usp36-c131a，然后用50μg/ml蛋白质合成抑制剂放线菌酮(chx)处理细胞所示时间，然后免疫印迹检测snail1蛋白表达情况，对snail1蛋白进行定量分析，然后绘制snail1蛋白半衰期图谱。(c)在hcc1806细胞中敲低usp36(shusp36)，然后用50μg/ml蛋白质合成抑制剂放线菌酮(chx)处理细胞所示时间，然后免疫印迹检测snail1蛋白表达情况，对snail1蛋白进行定量分析，然后绘制snail1蛋白半衰期图谱。(d)免疫共沉淀实验检测usp36-wt或usp36-c131a对snail1蛋白泛素化的影响。(e)利用免疫共沉淀实验检测敲低usp36(shusp36)对snail1蛋白泛素化的影响。(f)免疫共沉淀实验检测usp36对所示snail1蛋白泛素化的影响。(g-h)在hek-293细胞中稳定表达野生型snail1(snail1-wt)或snail1-k146r/k206r突变体(snail1-2kr)，用50μg/ml蛋白质合成抑制剂放线菌酮(chx)处理细胞所示时间，然后免疫印迹检测snail1蛋白表达情况(g)；对snail1蛋白进行定量分析，然后绘制snail1蛋白半衰期图谱(h)。
28.图4为snail1蛋白上第157位赖氨酸(k157)是snail1-usp36蛋白复合物形成及snail1核仁定位的关键位点。(a)zdock预测snail1与usp36结合的关键氨基酸残基。(b)免疫共沉淀检测野生型snail1(snail1-wt)或snail1-k157r在核仁中与usp36结合情况。(c-d)细胞组分分离实验检测usp36或hht对核仁中snail1蛋白表达的影响(cp,胞质；np，核质；no,核仁)。(e-f)免疫荧光染色检测usp36或hht对snail1蛋白亚细胞定位的影响。比例尺为25μm。
29.图5为hht通过激活jnk上调usp36表达。(a)用20ng/ml hht处理hcc1806细胞24小时，然后利用荧光定量pcr检测usp36的mrna表达情况。(b-c)用20ng/ml hht单独或联合20μm jnk抑制剂sp600125处理hcc1806细胞24小时，然后免疫印迹或荧光定量pcr检测usp36蛋
白及mrna表达情况。(d)用20ng/ml hht单独或联合20μm sp600125处理hcc1806细胞24小时，然后分离细胞组分(cp,胞质；np，核质；no,核仁)并免疫印迹检测各组分中snail1蛋白的表达情况。tubulin为细胞胞质的标志物，sp1为核质的标志物。
30.图6为基因沉默snail1或usp36显著促进hht介导体外肿瘤细胞死亡及体内肿瘤生长抑制。(a-b)在敲低snail1的hcc1806细胞中回补野生型snail1(snial1-wt)或丧失核仁定位的snail1突变体snail1-k157r,用20ng/ml hht处理hcc1806细胞24小时，然后(1)用免疫印迹检测所示蛋白表达情况(a)；(2)用流式细胞仪检测细胞凋亡情况(b)。(c)将5
×
105个所示hcc1806细胞接种于雌性balb/c裸鼠右颈皮下(n＝5/组)；在接种后第3天，腹腔注射hht(1mg/kg,每天)；第14天处死小鼠并取出肿瘤拍照(c)并检测各肿瘤重量(d)。(e-f)在敲低usp36的hcc1806细胞中回补snail1-wt或snail1-k157r,用20ng/ml hht处理细胞24小时，然后(1)用免疫印迹检测所示蛋白表达情况；(2)用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。
31.图7为联合jnk抑制剂sp600125及hht显著抑制体外肿瘤细胞存活及体内肿瘤生长。(a-b)用20ng/ml hht单独或联合20μm jnk抑制剂sp600125处理所示细胞24小时，然后(1)用免疫印迹检测所示蛋白表达情况(a)；(2)用流式细胞仪检测细胞凋亡情况(b)。(c-d)将5
×
105个hcc1806细胞接种于雌性balb/c裸鼠右颈皮下(n＝5/组)；在接种后第3天，腹腔每天单独或联合注射hht(1mg/kg)及sp600125(15mg/kg)；第17天处死小鼠取出肿瘤并检测各肿瘤重量(c)；利用免疫印迹检测各肿瘤组织中所示蛋白的表达情况。
32.图8为联合jnk抑制剂sp600125及核糖体抑制剂anisomycin或blasticidin显著抑制体外肿瘤细胞存活。(a)用50ng/ml anisomycin(aniso),200ng/ml puromycin(puro),1μg/ml g418,或者2μg/ml blasticidin(blasti)处理hcc1806细胞24小时，然后利用免疫荧光染色检测snail1蛋白的亚细胞定位情况，b23为核仁标志物，dapi为细胞核染料，比例尺为25μm。(b)利用皮尔逊相关系数(pearson’s correlation coefficient)计算(a)中snail1蛋白和b23蛋白的共定位情况，来自于三次独立实验的40个细胞用于此计算。(c)用核糖体抑制剂hht(20ng/ml),anisomycin(50ng/ml),puromycin(200ng/ml),g418(1μg/ml),或者blasticidin(2μg/ml)处理所示hcc1806细胞24小时，然后利用免疫荧光染色检测snail1蛋白的细胞核定位情况，随机选取各组中的约200细胞，然后统计核仁snail1阳性细胞的百分比。(d-e)用20ng/ml hht、50ng/ml anisomycin(aniso)、2μg/ml blasticidin(blasti)单独或联合20μm jnk抑制剂sp600125处理所示细胞24小时，然后(1)用免疫印迹检测所示蛋白表达情况(d)；(2)用流式细胞仪检测细胞凋亡情况(e)。
具体实施方式
33.以下实施例和实验例中，未具体说明的试剂和原料均为市售品。
34.实施例1用于治疗癌症的高三尖杉酯碱和sp600125的联合用药物
35.本实施例提供高三尖杉酯碱和sp600125的联合用药物，其可同时使用，也可以分开使用，高三尖杉酯碱和sp600125的用量比例为质量比：1:15。
36.作为一种优选的方案，该联合用药物是分别独立使用的1mg/kg的高三尖杉酯碱水溶液和15mg/kg的sp600125水溶液。
37.在其他实施例中，可以将本实施例的高三尖杉酯碱替换为其他核糖体抑制剂，例如：anisomycin、puromycin、g418或blasticidin。
38.下面通过实验对本发明的技术方案进行进一步的说明。
39.实验例1实体肿瘤细胞抵抗hht的分子机制
40.一、实验方法
41.1、细胞培养
42.a549(人非小细胞肺癌)、hs 578t(人乳腺癌)、hcc1806(人乳腺鳞状癌)和sum159(人乳腺癌)细胞培养于添加了10％胎牛血清(fbs，hyclone,logan,ut,usa)、100单位/ml青霉素(gibco,rockville,md,usa)及100μg/ml链霉素(gibco,rockville,md,usa)的dmem培养基(gibco,rockville,md,usa)中。细胞生长在37℃及5％ co2加湿培养箱中。
43.2、细胞凋亡和细胞活力测定
44.细胞培养于6孔板中，待细胞合率约为70％时，用20ng/ml单独或联合20μm jnk抑制剂sp600125(s1460,houston,usa)处理细胞24小时，然后用annexin v-fitc和pi(beyotime,c1052，china)孵育细胞，流式细胞仪分析细胞凋亡情况(facscan,bd biosciences,usa)；对于细胞活力，使用celltiter 96试剂盒(promega,usa)进行mts检测。
45.3、细胞组分分离和体内snail1泛素化测定
46.细胞质、核质和核仁的细胞组分分离：收集细胞，用冷pbs洗涤两次，重悬于1ml缓冲液a(10mm tris-hcl ph 7.8；10mm kcl；1.5mm mgcl2；0.5mm dtt)并在冰上放置10分钟；然后在4℃下，228g离心5分钟，上清为细胞质部分。用缓冲液a洗涤细胞沉淀，然后用1ml缓冲液s1(0.25m蔗糖；10mm mgcl2)，分层在1ml缓冲液s2(0.35m蔗糖，0.5mm mgcl2)上，在1430g下在4℃下离心10分钟。将洁净的细胞沉淀重悬于0.5ml缓冲液s2中；在冰浴中以20％的全功率超声12
×
10秒(每次超声之间休息10秒)，以防止样品过热，然后加入0.5ml缓冲液s3(0.88m蔗糖；0.5mm mgcl2)。在4℃下，3,000g离心20分钟。收集上清(核质部分)和沉淀(核仁部分)。将核仁重悬于0.5ml缓冲液s1和0.5ml 0.35m缓冲液s2中；在4℃下，以2500rpm(1430g)离心10分钟。对于western blot分析，含有核仁的不溶性部分在1
×
sds样品缓冲液(#7722,cst)中裂解，必要时进行超声处理。在共免疫沉淀实验中，核仁在高盐ripa缓冲液(50mm tris ph 7.5,500mm nacl,1％nonidet p-40,0.5％脱氧胆酸盐和蛋白酶体抑制剂)中裂解。
47.对于snail1蛋白泛素化实验，收集的细胞在预煮的变性细胞裂解缓冲液中裂解(50mm ph7.4 tris-hcl,70mmβ-me，新鲜添加β-me)。细胞裂解液煮沸10分钟，加入4倍体积的稀释缓冲液(20mm ph 7.4tris-hcl,300mm nacl,1mm edta,1mm egta,1％ triton x-100,2.5mm焦磷酸钠，1mmβ-甘油磷酸，1mm na3vo4,1μg/ml胰肽)。细胞裂解液在12000g离心30分钟，然后进行免疫沉淀和western blot分析。
48.4、western blot，共免疫沉淀和免疫荧光染色分析
49.对于western blot分析，收集细胞，用冷pbs洗涤两次，然后在1x sds样品缓冲液(#7722,cell signaling technology,usa)中裂解。等量的蛋白质被装载到sds-page胶中并进行电泳分离，然后将蛋白转移到pvdf膜上(millipore,darmstadt,germany)。将膜在4％的脱脂牛奶中封闭，然后与一抗和辣根过氧化物酶(hrp)偶联的二抗杂交，随后通过化学发光(bio-rad)进行检测。使用image lab software 5.0对凝胶和印迹图像进行分析。snail1(#3895,1:1000)，gapdh(#5174,1:2000)，p38(#9212,1:1000)，p-p38(#9216,1:1000)，jnk(#9252,1:1000)，p-jnk(#9251,1:1000)，tubulin(#3873,1:1000)，sp1(#5931,
1:1000)，ha-tag(#5017,1:1000)，cleaved-caspase 3(#9654,1:1000)和flag-tag(#8146,1:1000)的抗体购买自cell signaling technology(danvers,ma,usa)。usp36抗体(14783-1-ap,1:1000)购自proteintech(chicago,il,usa)。b23抗体(ma5-12508,1:1000)购自thermofisher scientific(wilmington,de,usa)。
50.对于内源性免疫共沉淀(co-ip)，核仁在高盐ripa缓冲液(50mm tris ph 7.5,500mm nacl,1％nonidet p-40,0.5％脱氧胆酸盐和蛋白酶体抑制剂)中裂解。细胞裂解液在12000g离心30min，等量总蛋白与一抗或正常igg在4℃下孵育过夜，然后加入30μl蛋白a/g珠，再孵育2h。对于外源性co-ip，将抗ha磁珠(或抗flag磁珠)加入到等量蛋白溶液中孵育过夜，然后离心磁珠(500g,30s)，用洗涤缓冲液(20mm tris-hcl,250mm nacl,0.2mm egta,0.1％nonidet p-40)洗涤磁珠三次。在western blot分析之前，在100℃下加热10分钟。anti-flag m2亲和凝胶(a2220)购自sigma-aldrich(st.louis,usa)。pierce anti-ha磁珠(#88836)购自thermo fisher scientific(waltham,ma,usa)。
51.免疫荧光染色：依次用4％多聚甲醛固定盖片上生长的细胞、0.1％triton x-100对细胞进行打孔、4％牛血清白蛋白进行封闭，然后将细胞与合适的一抗杂交(snail1:50,sc-271977,santa cruz biotechnology(ca,usa)；usp36:1:4000,14783-1-ap,proteintech；b23:1:50,ma5-12508,thermofisher；ha-tag:1:1000，#5017,cst)，flag-tag:1:1000，#8146,cst)，然后用二抗(山羊抗小鼠alexa fluor 488,a-11029或山羊抗兔alexa fluor 514,a-31558,thermofisher)孵育，用含有dapi(#82961,cst)的gold antifade reagent对细胞进行复染，并使用徕卡tcs sp5ii共聚焦激光扫描显微镜拍摄。为了确定snail1与核仁b23或usp36共定位，利用免费软件image j.fiji结合coloc 2插件和pearson相关系数计算双荧光相关系数，并通过散点图给出共定位荧光情况。
52.二、实验结果
53.1、hht促进snail1蛋白核仁聚集
54.snail1是定位于细胞核核质中的关键转录因子，其在调控上皮-间充质转化(epithelial-to-mesenchymal transition，emt)、细胞存活、代谢重编程和肿瘤细胞干性等生物学过程中起着重要作用。为了探究snail1在实体肿瘤细胞抵抗hht中的作用，本实验例首先利用免疫荧光染色检测了hht对snail1蛋白亚细胞定位的影响。如图1a-b所示，hht能显著促进乳腺癌细胞hs578t、sum159以及肺癌细胞a549中snail1蛋白与核仁标志物b23的共定位。此外，细胞组分分离实验也表明，hht能显著促进乳腺癌细胞hcc1806核仁中snail1蛋白表达(图1c)。上述结果表明，hht可显著促进snail1蛋白在核仁聚集。
55.2、hht通过增加usp36表达从而促进snail1蛋白核仁聚集
56.接下来，本实验例探究了hht促进snail1蛋白核仁聚集的分子机理。通过蛋白半衰期分析实验发现，hht能显著增加snail1蛋白稳定性(图2a)。因此，推测hht可能通过增加snail1蛋白稳定性从而促进其在核仁中聚集。usp36是一个特异性定位于核仁中的去泛素化酶。本实验例发现，hht能显著增加usp36及snail1蛋白的表达(图2b)。异源表达野生型usp36(usp36-wt)能显著增加snail1的表达，但usp36去泛素化酶活失活突变体usp36-c131a却对snail1蛋白表达无显著影响(图2c)。此外，敲低usp36也显著降低了snail1蛋白表达(图2d)。回补usp36-wt能完全恢复敲低usp36介导的snail1蛋白降低，但回补usp36-c131a却不能实现这一过程(图2d)。结果表明，usp36正调控sanil1蛋白表达，且这一过程依
赖于usp36的去泛素化酶活性。进一步，利用免疫荧光染色检测了usp36对snail1蛋白核仁定位的影响。如图2e所示，异源表达usp36-wt能显著促进snail1蛋白在核仁中聚集，但usp36-c131a对snail1蛋白定位无显著影响。重要的是，敲低usp36能显著抑制hht介导的snail1蛋白核仁聚集。综上结果表明，hht通过上调usp36的表达，从而促进snail1蛋白在核仁聚集。
57.3、usp36是核仁snail1的去泛素化酶
58.上述研究表明，hht通过增加usp36的表达从而促进snail1蛋白核仁聚集。进一步探究usp36是否是核仁snail1蛋白的去泛素化酶，如图3a所示，usp36与snail1在核仁中形成稳定的蛋白复合物。异源表达usp36-wt能显著增加snail1蛋白稳定性，但去泛素化酶活失活突变体usp36-c131a却对snail1蛋白稳定性无显著影响(图3b)。反之，敲低usp36明显降低了snal1蛋白稳定性(图3c)。接下来，检测usp36对snail1蛋白泛素化的影响。如图3d所示，异源表达usp36-wt能显著抑制snail1蛋白的泛素化，而usp36-c131a对snail1蛋白泛素化无显著影响。敲低usp36明显增加了snail1蛋白的泛素化(图3e)。进一步，通过点突变技术分析发现，snail1蛋白上的146位赖氨酸(k146)及206位赖氨酸(k206)是usp36的去泛素化位点。如图3f所示，异源表达usp36显著降低了野生型snail1(snail1-wt)蛋白的泛素化，但对snail1-k146r/k206r(snail1-2kr)泛素化无明显影响。蛋白半衰期实验分析表明，异源表达usp36显著增加snail1-wt蛋白稳定性，但对snail1-2kr蛋白稳定性无明显影响(图3g-h)。综上，本实验例的研究表明，(1)usp36是核仁snail1蛋白的去泛素化酶；(2)usp36通过去除snail1蛋白k146及k206上的泛素链，从而稳定snail1蛋白。
59.4、snail1蛋白上第157位赖氨酸(k157)是snail1-usp36蛋白复合物形成及snail1核仁定位的关键位点
60.生物信息学预测表明，snail1蛋白上第157位赖氨酸(k157)可能是snail1-usp36蛋白复合物形成的关键氨基酸残基(图4a)。的确，通过点突变及免疫共沉淀实验分析发现，野生型snail1蛋白可与usp36在核仁中形成稳定的蛋白复合物，但snail1-k157r却不能与usp36形成蛋白复合物(图4b)。进一步通过细胞组分分离及免疫荧光染色实验分析发现，过表达usp36或hht处理都不能促进snail1-k157r蛋白核仁聚集(图4c-f)。结果表明，snail1蛋白上的k157是调控snail1-usp36蛋白复合物形成及影响snail1核仁定位的关键氨基酸残基。
61.5、hht通过激活jnk上调usp36表达
62.接下来，解析hht上调usp36表达的分子机制：荧光定量pcr分析表明，hht能显著增加usp36基因的mrna表达水平(图5a)。提示，hht促进usp36转录。研究表明，hht可显著激活jnk信号通路，从而调控基因的转录。因此我们推测，hht可能通过jnk信号通路，从而促进usp36表达。如图五b-c所示，hht能显著激活jnk，而jnk特异性抑制剂sp600125能显著抑制hht介导的usp36蛋白及mrna表达水平增加。此外，sp600125也明显抑制了hht介导的snail1蛋白核仁聚集(图5d)。上述结果表明，hht通过激活jnk从而上调usp36表达及snail1核仁聚集。
63.综上，通过本实验例的研究可知，hht可显著激活jnk从而上调核仁去泛素化酶usp36表达；增加的usp36通过提高核仁snail1蛋白的稳定性,从而促进snail1蛋白核仁聚集及肿瘤细胞存活。因此，激活jnk-usp36-snail1信号通路是实体肿瘤抵抗hht的关键。
64.实验例2基因沉默snail1或usp36显著促进hht介导体外肿瘤细胞死亡及体内肿瘤生长抑制
65.一、实验方法
66.1、慢病毒感染和rna干扰
67.将慢病毒为基础的shrna靶向snail1(#1:5
′‑
ccactcagatgtcaagaagta-3’(seq id no.1)；#2:5
′‑
ccaggctcgaaaggccttcaa-3
′
(seq id no.2))、usp36(#1:5
′‑
gcggtcagtcaggatgctatt-3
′
(seq id no.3)；#2:5
′‑
acagaacatccaacgtcttaa-3
′
(seq id no.4))或绿色荧光蛋白(gfp,5
′‑
gaagcagcacgacttcttc-3
′
(seq id no.5))构建到plko.1质粒中。用lipofectamine 2000(invitrogen,carlsbad,ca,usa)转染pmd2g和pspax2包装质粒和plko.1质粒到汇合度为70％的hek-293ft细胞中，转染后60小时收集慢病毒。在10μg/ml聚苯乙烯条件下，用重组慢病毒感染汇合度为60％的目的细胞，最终得到敲低靶基因的稳定细胞株。
68.2、细胞凋亡和细胞活力测定
69.hcc1806(人乳腺鳞状癌)细胞培养于6孔板中，待细胞合率约为70％时，用20ng/ml单独或联合20μm jnk抑制剂sp600125(s1460,houston,usa)处理细胞24小时，然后用annexin v-fitc和pi(beyotime,c1052，china)孵育细胞，流式细胞仪分析细胞凋亡情况(facscan,bd biosciences,usa)；对于细胞活力，使用celltiter 96试剂盒(promega,usa)进行mts检测。
70.3、动物模型
71.本研究的动物实验均按照中国国家立法和机构伦理准则进行，并经四川大学机构审查委员会批准。雌性balb/c裸鼠(balb/cnj-foxn1nu/gpt)购自gempharmatech(中国成都)。将5
×
105个所示hcc1806细胞接种于6周龄雌性balb/c裸鼠(n＝5/组)右颈皮下。接种后第3天，小鼠腹腔每天注射hht(1mg/kg)。动态观察小鼠的肿瘤生长，并于给药后第14天处死小鼠，取出肿瘤并测定肿瘤的体积和重量。
72.二、实验结果
73.本实验例探究了jnk-usp36-snail1通路在实体肿瘤细胞抵抗hht中的作用。如图6a-b所示，敲低snail1显著促进hht介导的cleaved-caspase3(cc3，细胞凋亡标志物)表达及细胞凋亡,这一过程能被在核仁中表达的野生型snail1(snail1-wt)恢复，但不能被丧失核仁定位的snail1-k157r恢复。重要的是，敲低snail1也显著促进了hht对体内肿瘤生长的抑制作用，这一过程也能被snail1-wt恢复，但不能被snail1-k157r恢复(图6c-d)。此外，与敲低snail1一致，敲低usp36也明显促进hht介导的cc3表达及细胞凋亡,这一过程也被snail1-wt恢复，但不能被snail1-k157r恢复(图六e-f)。上述结果表明，(1)基因沉默snail1或usp36显著促进hht介导体外肿瘤细胞死亡及体内肿瘤生长抑制；(2)核仁snail1是肿瘤细胞抵抗hht的关键。
74.实验例3联合jnk抑制剂sp600125及hht显著抑制体外肿瘤细胞存活及体内肿瘤生长
75.一、实验方法
76.1、细胞凋亡和细胞活力测定
77.hs 578t(人乳腺癌)、hcc1806(人乳腺鳞状癌)和sum159(人乳腺癌)细胞培养于6
孔板中，待细胞合率约为70％时，用20ng/ml hht单独或联合20μm jnk抑制剂sp600125(s1460,houston,usa)处理细胞24小时，然后用annexin v-fitc和pi(beyotime,c1052，china)孵育细胞，流式细胞仪分析细胞凋亡情况(facscan,bd biosciences,usa)；对于细胞活力，使用celltiter 96试剂盒(promega,usa)进行mts检测。
78.2、动物模型
79.本研究的动物实验均按照中国国家立法和机构伦理准则进行，并经四川大学机构审查委员会批准。雌性balb/c裸鼠(balb/cnj-foxn1nu/gpt)购自gempharmatech(中国成都)。将5
×
105个hcc1806细胞接种于6周龄雌性balb/c裸鼠(n＝5/组)右颈皮下。接种后第3天，小鼠每天腹腔注射dmso(5％v/v)或sp600125(15mg/kg)和/或hht(1mg/kg)。每天监测小鼠肿瘤大小，于腹腔给药后第17天处死小鼠，取出肿瘤并测定肿瘤的重量。
80.二、实验结果
81.本实验例探究了jnk在实体肿瘤细胞抵抗hht中的作用。如图7a-b所示，相较于单独使用hht或jnk抑制剂sp600125，联合hht及sp600125显著促进了cleaved-caspase3(cc3)表达及细胞凋亡。重要的是，联合hht及sp600125显著促进了体内肿瘤组织中cc3的表达及明显抑制了体内肿瘤生长(图7c-d)。结果表明，联合jnk抑制剂sp600125及hht是一种肿瘤治疗的潜在新策略。
82.实验例4联合jnk抑制剂sp600125及核糖体抑制剂anisomycin或blasticidin显著抑制体外肿瘤细胞存活显
83.一、实验方法
84.1、细胞凋亡测定
85.hcc1806(人乳腺鳞状癌)细胞培养于6孔板中，待细胞合率约为70％时，用20ng/ml hht、50ng/ml anisomycin、200ng/ml puromycin、1μg/ml g418、2μg/ml blasticidin单独或联合20μm jnk抑制剂sp600125(s1460,houston,usa)处理细胞24小时，然后用annexin v-fitc和pi(beyotime,c1052，china)孵育细胞，流式细胞仪分析细胞凋亡情况(facscan,bd biosciences,usa)。
86.二、实验结果
87.本实验例探究了jnk在实体肿瘤细胞抵抗核糖体抑制剂anisomycin或blasticidin中的作用。如图8a-c所示，和hht一致，核糖体抑制剂anisomycin(aniso)、puromycin(puro)、g418,或blasticidin(blasti)都可显著促进snail1蛋白的核仁定位。重要的是，jnk抑制剂sp600125和anisomycin或blasticidin显著促进了细胞内cc3的表达及明显促进了细胞凋亡(图8d-e)。
88.本实验例结果表明，实体肿瘤抵抗多种核糖体抑制剂的机制是相同的，即通过jnk-usp36-snail信号通路实现。因此，联合jnk-usp36-snail通路抑制剂与核糖体抑制剂是一种肿瘤治疗的潜在新策略。
89.通过上述实验例可以看到，靶向抑制jnk-usp36-snail信号通路将增强实体肿瘤细胞对核糖体抑制剂的敏感性；联合核糖体抑制剂及jnk-usp36-snail通路抑制剂是一种全新的实体肿瘤治疗策略。本发明为实体肿瘤的临床治疗提供了一种新的选择，具有很好的应用前景。

技术特征：
1.jnk-usp36-snail通路抑制剂在制备用于消除实体肿瘤抵抗核糖体抑制剂的药物中的用途。2.核糖体抑制剂联合jnk-usp36-snail通路抑制剂在制备治疗实体肿瘤的药物中的用途。3.按照权利要求1或2所述的用途，其特征在于：所述核糖体抑制剂选自高三尖杉酯碱、anisomycin、puromycin、g418或blasticidin中的至少一种；所述jnk-usp36-snail通路抑制剂选自jnk抑制剂、usp36抑制剂或snail1抑制剂中的至少一种；所述jnk抑制剂选自sp600125、jnk-in-8、jnk-930或bentamapimod中的至少一种；usp36抑制剂选自针对usp36的特异性sirna；snail1抑制剂选自针对snail1的特异性sirna。4.按照权利要求1或2所述的用途，其特征在于：所述实体肿瘤为肺癌、头颈癌、乳腺癌、结直肠癌或肾癌。5.一种用于治疗实体肿瘤的联合用药物，其特征在于：所述联合用药物是分别或同时给药的核糖体抑制剂和jnk-usp36-snail通路抑制剂。6.按照权利要求5所述的联合用药物，其特征在于：所述核糖体抑制剂选自高三尖杉酯碱、anisomycin、puromycin、g418或blasticidin中的至少一种；所述jnk-usp36-snail通路抑制剂选自jnk抑制剂、usp36抑制剂或snail1抑制剂中的至少一种；所述jnk抑制剂选自sp600125、jnk-in-8、jnk-930或bentamapimod中的至少一种；usp36抑制剂选自针对usp36的特异性sirna；snail1抑制剂选自针对snail1的特异性sirna。7.按照权利要求5所述的联合用药物，其特征在于：所述联合用药物用于治疗肺癌、头颈癌、乳腺癌、结直肠癌或肾癌。8.一种药物组合物，其特征在于：它是以核糖体抑制剂和jnk-usp36-snail通路抑制剂为活性成分，加入药学上可接受的辅料或辅助性成分制成的。9.按照权利要求8所述的药物组合物，其特征在于：所述核糖体抑制剂选自高三尖杉酯碱、anisomycin、puromycin、g418或blasticidin中的至少一种；所述jnk-usp36-snail通路抑制剂选自jnk抑制剂、usp36抑制剂或snail1抑制剂中的至少一种；所述jnk抑制剂选自sp600125、jnk-in-8、jnk-930或bentamapimod中的至少一种；usp36抑制剂选自针对usp36的特异性sirna；snail1抑制剂选自针对snail1的特异性sirna。10.按照权利要求8所述的药物组合物，其特征在于：所述核糖体抑制剂和jnk-usp36-snail通路抑制剂的用量比例为重量比0.5:7.5-3:25。

技术总结
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种用于治疗实体肿瘤的联合用药物和药物组合物。本发明研究发现，激活JNK-USP36-Snail1信号通路是实体肿瘤抵抗包括高三尖杉酯碱在内的核糖体抑制剂的关键。靶向抑制JNK-USP36-Snail信号通路将增强实体肿瘤细胞对核糖体抑制剂的敏感性。基于此，本发明提出联合核糖体抑制剂及JNK-USP36-Snail通路抑制剂进行实体肿瘤治疗，这是一种全新的策略，能够为癌症患者的临床治疗提供更多的选择。床治疗提供更多的选择。床治疗提供更多的选择。


技术研发人员：肖智雄 易勇 秦可为 喻姝菡
受保护的技术使用者：四川大学
技术研发日：2023.08.24
技术公布日：2023/10/15