柯林斯菌在制备防治大肠杆菌型腹泻的产品中的应用

1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种柯林斯菌在制备防治大肠杆菌型腹泻的产品中的应用。


背景技术：

2.腹泻是我国养殖业长期存在并且迫切需要解决的关键问题。许多病原微生物可导致仔猪、羔羊和犊牛等幼畜的腹泻。在大规模养殖场中，解决此类问题的方法是使用抗生素。抗生素药物的使用与对正常菌群的干扰有关，因此，由于微生物群的变化，可能会发生炎症性肠病或过敏等疾病。此外，抗生素相关腹泻减少了碳水化合物的消化和短链脂肪酸的吸收，从而导致诱发渗透性腹泻。由于抗生素在动物生产中的应用受到广泛限制，因此需要满足对替代饲料添加剂和成分的日益增长的需求，以改善健康状况，提高生产性能，并避免细菌耐药性等棘手问题。
3.益生菌是有益的活性微生物，当被宿主作为食物来源的一部分以足够数量食用时，可以给动物健康状况带来许多好处，并作为某些疾病预防和治疗的潜在战略。有研究表明，产生丁酸的细菌可以缓解炎症性肠病、2型糖尿病和肥胖症。而柯林斯菌恰是一种能产生丁酸的厌氧菌，它也可以改变宿主胆汁酸和血浆胆固醇水平。醋酸、甲酸和乳酸是柯林斯菌属的主要发酵产物，柯林斯菌能够通过黏附作用产生乳酸、醋酸等有机酸或为产生scfa的细菌提供更适宜的环境来直接促进肠道scfa，来防治动物腹泻。
4.益生菌是专门选择的，不会促进抗生素耐药性的传播，也不会携带可转移的抗生素耐药性。因此，益生菌是安全、绿色、无公害的替抗产品，开发益生菌菌株对我国养殖业也具重要意义。
5.由上可知，柯林斯菌具有调控肠道健康的作用。但目前，柯林斯菌在防治腹泻方面的研究鲜有报道。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种柯林斯菌在制备防治大肠杆菌型腹泻的产品中的应用。
7.为实现上述目的，本发明所设计的技术方案如下：
8.本发明提供了一种柯林斯菌在制备防治大肠杆菌型腹泻的产品中的应用。
9.进一步地，所述产品为药物或饲料。
10.上述柯林斯菌购于atcc公司，型号为25986。
11.本发明还提供了一种柯林斯菌在制备预防或治疗仔猪、羔羊或犊牛腹泻的药物或饲料中的应用。
12.进一步地，所述腹泻是大肠杆菌引起的细菌性腹泻。
13.本发明还提供了一种柯林斯菌菌悬液的制备方法，包括以下步骤：
14.(1)从甘油管中蘸取柯林斯菌的菌液在改良强化梭菌固体培养基上划线，厌氧环
境下37℃培养48h，得到单菌落；挑取单菌落接种于改良强化梭菌液体培养基中，厌氧环境下37℃培养48h进行活化培养；
15.(2)将步骤(1)得到的活化后的菌液按照按体积比2％的接种量接种至液体培养基中，37℃培养18-24h后得到发酵液，离心，弃上清，pbs重悬菌体，并调整活菌数等于1
×
109cfu/ml，制成柯林斯菌菌悬液。
16.进一步地，所述步骤(1)中，改良强化梭菌液体培养基，其配方为蛋白胨10.0g，牛肉浸粉10.0g，酵母提取物3.0g，葡萄糖5.0g，nacl 5.0g，可溶性淀粉1.0g，l-半胱氨酸盐酸盐0.5g，乙酸钠3.0g，刃天青0.001g，将上述成分加入蒸馏水中，定容至1000ml。
17.本发明还提供了一种上述柯林斯菌菌悬液在制备预防或治疗大肠杆菌型腹泻的药物或饲料中的应用。
18.本发明还提供了一种上述柯林斯菌在制备治疗仔猪、羔羊或犊牛腹泻的药物或饲料中的应用。
19.本发明的有益效果：
20.(1)本发明所提供的柯林斯菌对动物无毒副作用，和用于治疗腹泻的传统药物相比具有优势。
21.(2)采用本发明所提供的柯林斯菌，能够显著降低大肠杆菌诱导腹泻期间小鼠的腹泻指数，减轻结肠的缩短。
22.(3)采用本发明所提供的柯林斯菌，能够缓解e.coli诱导的小鼠结肠组织会出现的明显损伤，包括个别肠腺消失被增生的结缔组织取代，杯状细胞数量轻微减少，周围并伴有少量的淋巴细胞浸润。
23.(4)与模型组小鼠相比，柯林斯菌干预组小鼠的结肠组织中促炎细胞因子tnf-α、il-6、il-8和il-1β的浓度显著降低，抗炎细胞因子il-10的浓度显著提高。
24.(5)与模型组小鼠相比，柯林斯菌干预使血清免疫球蛋白iga、igg、siga的浓度降低。
附图说明
25.图1为不同组别小鼠腹泻指数图；
26.图2为不同组别小鼠结肠长度图；
27.图3为不同组别小鼠结肠形态图；
28.图4为不同组别小鼠回肠组织he染色图；
29.图5为不同组别小鼠回肠绒毛高度图；
30.图6为不同组别小鼠回肠隐窝深度图；
31.图7为不同组别小鼠回肠绒毛高度/隐窝深度图；
32.图8为不同组别小鼠结肠组织he染色图；
33.图9为不同组别小鼠结肠组织临床评分图；
34.图10为不同组别小鼠tnf-α的含量图；
35.图11为不同组别小鼠il-1β含量图；
36.图12为不同组别小鼠结肠组织内il-6的含量图；
37.图13为不同组别小鼠结肠组织内il-8的含量图；
38.图14为不同组别小鼠结肠组织内il-10的含量图；
39.图15为不同组别小鼠igg含量图；
40.图16为不同组别小鼠iga含量图；
41.图17为不同组别小鼠siga含量图。
具体实施方式
42.下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述，以便本领域技术人员理解。
43.下述实施例中涉及的培养基如下：
44.改良强化梭菌液体培养基：
45.蛋白胨10.0g，牛肉浸粉10.0g，酵母提取物3.0g，葡萄糖5.0g，nacl 5.0g，可溶性淀粉1.0g，l-半胱氨酸盐酸盐0.5g，乙酸钠3.0g，刃天青0.001g，将上述成分加入蒸馏水中，定容至1000ml；调节ph为7.0，于121℃高压灭菌20min。
46.la固体培养基：胰蛋白胨10g，酵母膏5g，nacl 10g，琼脂15g，将上述成分加入蒸馏水中，定容至1000ml，于121℃高压灭菌20min；
47.lb固体培养基：胰蛋白胨10g，酵母膏5g，nacl 10g，将上述成分加入蒸馏水中，定容至1000ml，于121℃高压灭菌20min；
48.无菌pbs：称取nacl 8.0g，kcl 0.2g，na2hpo
4 1.42g，kh2po
4 0.27g加入到1l去离子水中，充分搅拌溶解后，滴加浓盐酸调节ph至7.4，121℃高压灭菌20min。
49.实施例1柯林斯菌菌悬液的制备
50.(1)从甘油管中蘸取柯林斯菌(柯林斯菌购于atcc公司，型号为25986)的菌液在改良强化梭菌固体培养基上划线，厌氧环境下37℃培养48h，得到单菌落；挑取单菌落接种于改良强化梭菌液体培养基中，厌氧环境下37℃培养48h进行活化培养。
51.(2)将步骤(1)得到的活化后的菌液按照按2％(v/v)的接种量接种至改良强化梭菌液体培养基中，37℃培养18-24h后得到发酵液，离心，弃上清，pbs重悬菌体，并调整活菌数1
×
109cfu/ml，制成柯林斯菌菌悬液。
52.实施例2大肠杆菌菌悬液的制备
53.(1)从甘油管中蘸取大肠杆菌的菌液在la培养基上划线,37℃培养12-24h，得到单菌落；挑取单菌落接种于lb液体培养基中，37℃,220rpm过夜震荡培养。
54.(2)将步骤(1)得到的活化后的菌液按照按2％(v/v)的接种量接种至lb液体培养基中，37℃,220rpm,8-12h,震荡培养后，离心，弃上清，pbs重悬菌体，并调整活菌数1
×
109cfu/ml，制成大肠杆菌菌悬液。
55.实施例3
56.柯林斯菌对大肠杆菌诱导腹泻小鼠症状的缓解作用步骤如下：
57.(1)取balb/c小鼠(15-18g)24只，随机分为3组，3组分别命名为：空白对照组(control)、造模组(e.coli)、柯林斯菌干预组(c.a+e.coli)；采用每组10只。
58.(2)对空白对照组(control)、造模组(e.coli)、柯林斯菌干预组(c.a+e.coli)进行处理；其中，柯林斯菌干预组(c.a+e.coli)的处理方法为：实验第1-7天，每天给柯林斯菌干预组(c.a+e.coli)灌胃1
×
109cfu/ml柯林斯菌菌悬液300μl，自由饮用蒸馏水；实验第8-14天，每天给柯林斯菌干预组(c.a+e.coli)灌胃1
×
109cfu/ml的柯林斯菌菌悬液300μl和1
×
109cfu/ml的大肠杆菌菌悬液300μl，自由饮用蒸馏水；
59.造模组(e.coli)的处理方法为：实验第1-7天，每天灌胃300μl生理盐水，自由饮用蒸馏水；实验第8-14天，每天给e.coli组灌胃1
×
109cfu/ml e.coli菌悬液300μl,自由饮用蒸馏水；
60.空白对照组(control)的处理方法为：实验过程中，每天给对照组灌胃生理盐水300μl，自由饮用蒸馏水。
61.造模期间，检测各组小鼠腹泻指数变化(检测结果见图1)。
62.造模结束后，分别将空白对照组(control)、造模组(e.coli)、柯林斯菌干预组(c.a+e.coli)处死，取整段结肠(盲肠末端至肛门)，测量结肠长度(检测结果见图2)并且对结肠外观进行观察。
63.造模结束时，e.coli组小鼠的腹泻指数升高至2.14，而c.a干预组(c.a+e.coli)干预使小鼠的腹泻指数降低至1.17，因此c.a干预组(c.a+e.coli)干预组的腹泻指数显著低于模型组(检测结果见图1)。
64.正常组小鼠结肠长度为7.8cm，e.coli造模组小鼠的结肠长度仅为6.0cm，而c.a干预组(c.a+e.coli)干预显著增加了结肠长度，达到8.1cm(检测结果见图3)。
65.对照组小鼠结肠呈现正常红色，粪便呈颗粒状；造模组结肠可见肠壁暗红色，肿胀出血；而c.a干预组(c.a+e.coli)结肠较为接近空白组。
66.因此，本发明的柯林斯菌对e.coli诱导的腹泻小鼠具有较好的改善效果。
67.实施例4：柯林斯菌对腹泻小鼠肠组织的保护作用
68.具体实施方式同实施例3中的步骤(1)-(2)；
69.将实施例3中的步骤(2)得到的造模结束后小鼠处死，取远端结肠组织1cm进行固定，脱水，包埋，he染色，观察不同组别小鼠回、结肠组织he染色，测量不同组别小鼠回肠绒毛高度、回肠隐窝深度，计算回肠绒毛高度/空肠隐窝深度比值以及结肠临床评分。
70.由图4和图8可以看出柯林斯菌干预组(c.a+e.coli)的回、结肠组织结构与正常组相似，肠组织各层结构清晰；黏膜层上皮完整，上皮细胞形态正常，固有层肠腺数量丰富、排列紧密；肌层肌细胞排列规则、形态正常；未见明显的炎性改变。而e.coli诱导的小鼠结肠组织会出现明显的损伤，包括个别肠腺消失被增生的结缔组织取代，杯状细胞数量轻微减少，周围并伴有少量的淋巴细胞浸润。此外，由图5-7可知，柯林斯菌干预组(c.a+e.coli)和e.coli组相比回肠绒毛高度增加，回肠隐窝深度降低，回肠绒毛高度/空肠隐窝深度比值增加。
71.最后，图9显示，柯林斯菌干预组(c.a+e.coli)和造模组的结肠临床评分差异极显著。综上所述，本发明的菌株柯林斯菌对小鼠肠组织有很好的保护作用。
72.实施例5：柯林斯菌对腹泻小鼠的免疫调节作用
73.具体实施方式同实施例3中的步骤(1)-(2)；
74.将实施例3中的步骤(2)得到的造模结束后小鼠处死，取结肠组织按照结肠组织生化指标测定方法检测结肠组织上清中的生化指标，生化指标包括tnf-α的含量、il-6的含量、il-8的含量、il-10的含量、il-1β的含量和血清iga、igg、siga的含量。
75.由图10～图14可知，e.coli处理增加了促炎细胞因子tnf-α、il-6、il-8和il-1β的浓度，降低了抗炎细胞因子il-10的浓度。而柯林斯菌处理可以降低tnf-α和il-6、il-8和
il-1β的浓度，显著提高il-10的浓度。此外，由图15～图17可知：柯林斯菌干预使血清免疫球蛋白iga、igg、siga的浓度降低。因此，柯林斯菌干预后显著改善了肠道的免疫反应。
76.其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

技术特征：
1.一种柯林斯菌在制备防治大肠杆菌型腹泻的产品中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述产品为药物或饲料。3.一种柯林斯菌在制备预防或治疗仔猪、羔羊或犊牛腹泻的药物或饲料中的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述腹泻是大肠杆菌引起的细菌性腹泻。5.一种柯林斯菌菌悬液的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)从甘油管中蘸取柯林斯菌的菌液在改良强化梭菌固体培养基上划线，厌氧环境下37℃培养48h，得到单菌落；挑取单菌落接种于改良强化梭菌液体培养基中，厌氧环境下37℃培养48h进行活化培养；(2)将步骤(1)得到的活化后的菌液按照按体积比2％的接种量接种至液体培养基中，37℃培养18-24h后得到发酵液，离心，弃上清，pbs重悬菌体，并调整活菌数等于1
×
109cfu/ml，制成柯林斯菌菌悬液。6.根据权利要求5所述柯林斯菌菌悬液的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中，改良强化梭菌液体培养基，其配方为蛋白胨10.0g，牛肉浸粉10.0g，酵母提取物3.0g，葡萄糖5.0g，nacl 5.0g，可溶性淀粉1.0g，l-半胱氨酸盐酸盐0.5g，乙酸钠3.0g，刃天青0.001g，将上述成分加入蒸馏水中，定容至1000ml。7.一种权利要求5所述柯林斯菌菌悬液在制备预防或治疗大肠杆菌型腹泻的药物或饲料中的应用。8.一种权利要求6所述柯林斯菌在制备治疗仔猪、羔羊或犊牛腹泻的药物或饲料中的应用。9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于：所述药物或饲料中，柯林斯菌菌悬液含量为300μl。

技术总结
本发明涉及一种柯林斯菌在制备防治大肠杆菌型腹泻的产品中的应用，采用本发明所提供的柯林斯菌能够显著降低大肠杆菌诱导腹泻期间小鼠的腹泻指数，缓解结肠的缩短。与模型组小鼠相比，柯林斯菌干预组小鼠的结肠组织中促炎细胞因子TNF-α、IL-6、IL-8、IL-1β和血清免疫球蛋白IgA、IgG、SIgA的浓度显著降低，抗炎细胞因子IL-10的浓度显著提高。本发明柯林斯菌菌株对腹泻病例有明显防治作用。菌株对腹泻病例有明显防治作用。菌株对腹泻病例有明显防治作用。


技术研发人员：许庆彪 胡明阳 司文瑾 杜雯鹃 王祥煌
受保护的技术使用者：华中农业大学
技术研发日：2023.03.20
技术公布日：2023/7/11