一种关于天然活性化合物HF诱导ATC细胞凋亡的应用

一种关于天然活性化合物hf诱导atc细胞凋亡的应用
技术领域
1.本发明涉及药物化学技术领域，具体涉及一种关于天然活性化合物hf诱导atc细胞凋亡的应用。


背景技术：

2.甲状腺未分化癌(anaplasticthyroidcarcinoma,atc)是甲状腺癌中罕见但恶性程度最高的一种，发病率只占全部甲状腺癌的1-3％，但由atc引起的死亡人数约占所有由甲状腺癌引起死亡人数的半数，患者中位生存期仅4-6个月。atc发病迅速，早期即可发生浸润和转移，恶性程度高，预后差。临床上患者来就诊时往往已失去根治性手术机会，外科干预很大程度上仅有利于提高局部控制减轻相关并发症，并且放射性碘及激素抑制治疗都不适用于atc患者，atc对传统的放化疗反应也有限。
3.因此，开发新型有效的治疗方法对控制atc进展和改善其预后具有重要意义。本技术发明人通过研究发现化学药物研发依然是开发atc有效治疗方式的主要方面。天然活性化合物一直是抗肿瘤药物研发的主要来源，明确其抗肿瘤机制对抗肿瘤天然药物研发具有重要的意义。
4.为此，本发明提供一种关于天然活性化合物hf诱导atc细胞凋亡的应用。


技术实现要素：

5.本发明的目的是为了解决上述问题，提供一种关于天然活性化合物hf诱导atc细胞凋亡的应用。
6.为了达到上述目的，本发明的技术方案如下：
7.本发明提供了一种关于天然活性化合物hf在诱导atc细胞凋亡上的应用。
8.进一步地，所述天然活性化合物hf用于靶向谷氨酰脯氨酰trna合成酶(eprs)在atc细胞中诱导氨基酸饥饿反应，使其不能有效摄入脯氨酸而导致atc细胞增殖抑制。
9.进一步地，所述天然活性化合物hf通过抑制i型胶原蛋白和上皮-间质转化(emt)抑制atc细胞转移，并通过诱导线粒体凋亡途径诱导atc细胞凋亡。
10.进一步地，所述天然活性化合物hf在治疗甲状腺未分化癌的药物的制备上的应用。
11.在本发明中，发明人通过研究及筛选得到天然活性化合物fe在atc肿瘤中表现出较好的活性，相比之下，根据其结构合成的衍生物hf具有更好的活性，并且对正常甲状腺滤泡细胞更低的细胞毒性。
12.发明人通过研究发现hf通过靶向谷氨酰脯氨酰trna合成酶(eprs)在atc细胞中诱导氨基酸饥饿反应，使其不能有效摄入脯氨酸从而导致atc细胞增殖抑制；并通过转录组测序发现，hf给药后调节细胞凋亡和细胞外基质通路。i型胶原蛋白是细胞外基质的主要成分，通过免疫组化发现在atc组织中i型胶原蛋白和血管生成密切相关，hf通过抑制i型胶原蛋白和上皮-间质转化(emt)来抑制atc细胞转移。在凋亡途径中，发明人通过研究发现hf通
过诱导线粒体凋亡途径诱导atc细胞凋亡。
13.与现有技术相比，本方案的有益效果：
14.1、通过本发明的方案，本发明提供了一个抗atc的天然活性化合物hf(常山酮)，hf在用于atc上的抗癌作用及其作用机制在现有技术中未见报道，其为hf(常山酮)在抗癌atc肿瘤上的新用途。
15.2、通过本发明的方案，证实eprs在atc肿瘤中高表达，可将其作为治疗靶点。
附图说明
16.图1是本发明实施例中hf在体内和体外中抑制atc肿瘤增殖；
17.图2是本发明实施例中hf诱导atc细胞凋亡。
18.图3是本发明实施例中hf抑制atc细胞转移。
具体实施方式
19.为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明的实施例及附图，对本发明的技术方案进行进一步详细地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
20.需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
21.术语解释：atc，甲状腺未分化癌的简称；hf，常山酮，由常山碱合成的衍生物。
22.实施例：
23.本发明实施例提供的方案为：提供了天然活性化合物hf在诱导atc细胞凋亡的应用，将其用于靶向抑制谷氨酰脯氨酰trna合成酶(eprs)在atc细胞中诱导氨基酸饥饿反应，使其不能有效摄入脯氨酸而导致atc细胞增殖抑制。天然活性化合物hf通过抑制i型胶原蛋白和上皮-间质转化(emt)抑制atc细胞转移，并通过诱导线粒体凋亡途径诱导atc细胞凋亡。
24.本实施例的方案是通过筛选得到一个抗atc药物：hf在atc上的抗癌作用及其作用机制未见报道；并证实了氨基酸饥饿反应在atc肿瘤发生发展中的重要性；同时证实了eprs在atc肿瘤中高表达，可将其作为治疗靶点。
25.以下本发明实施例方案的实验及实验数据：
26.一、hf是一种抗atc活性化合物
27.为了筛选抗甲状腺未分化癌(atc)药物，本技术发明人从327种天然产物库中进行筛选。将327种天然产物(10μm)作用atc细胞48小时，然后进行细胞活力测定以确定每种化合物的抑制作用，共有27种药物对癌细胞生长显示出抑制作用(》80％)，然后按照上述方法用27种药物(1μm)作用于atc细胞和正常甲状腺细胞，最终筛选得到5种活性化合物。在这5种候选药物中，本技术发明人重点研究了常山碱，这是一种最初从植物常山中分离出来的生物碱。常山酮(hf)是由常山碱合成的衍生物。与常山碱相比，hf是一种高效低毒的化合物(如图1中的a所示)。
28.二、hf在体外和体内抑制atc增殖
29.如图1中的b所示，不同浓度的hf(0.005至5μm)作用于bht-101和c643细胞48小时后进行cck8测定，atc细胞活力随着hf浓度的增加而显著降低。hf在bht-101和c643细胞上的ic
50
值分别为0.03μm和0.09μm，而hf对正常人甲状腺滤泡细胞的细胞毒性较小。此外还进行了细胞克隆形成实验，如图1中的c所示，hf呈剂量依赖性地降低atc细胞克隆形成。
30.在体内实验中，将裸鼠皮下注射bht-101和c643细胞，在接瘤一周后腹腔注射hf，隔一天给药，共24天(如图1中的d所示)。如图1中的e-g所示，与对照组相比，hf显著降低了肿瘤体积和肿瘤重量。h&e染色和免疫组织化学提供了hf抗肿瘤活性的进一步证据。如图1中的h所示，通过h&e染色，给药组中能观察到明显的细胞核固缩、细胞质浓缩和溶解。ki67是一种与各种恶性肿瘤预后呈正相关的肿瘤细胞增殖标志物，免疫组化分析表明hf显著抑制了肿瘤细胞的增殖(如图1中的i所示)。这些数据表明hf在体外和体内对atc具有有效的抗肿瘤作用。
31.三、hf诱导atc细胞凋亡
32.为了研究hf诱导atc细胞死亡机制，进行annexinv-fitc/pi双染实验，以分析hf作用bht-101和c64348小时后的细胞凋亡百分比。结果表明hf呈剂量依赖性地诱导bht-101和c643细胞凋亡(如图2中的a所示)，酶活性测定实验表明，hf处理组的bht-101和c643细胞的caspase-3酶活性分别是对照组的1.64和1.73倍(如图2中的c所示)。westernblotting实验表明hf作用于atc细胞后cleaved caspase-3表达量增加(如图2中的d所示)。tunel实验表明，给药组中肿瘤组织表达强的绿色荧光(如图2中b所示)。综上实验说明hf诱导了atc细胞凋亡。
33.caspase-8和caspase-9是分别参与死亡受体和线粒体途径凋亡的两个重要启动子，通过发生自我活化并激活下游caspase-3，从而诱导细胞凋亡。为了确定hf是通过哪条凋亡途径诱导atc细胞凋亡，酶活性测定实验表明hf增加了caspase-9激酶活性(如图2中的c所示)。western blotting实验表明，hf处理显著增加bht-101和c643细胞中cleaved caspase-9蛋白表达量和bax/bcl-2蛋白比率，降低了mcl-1的蛋白表达量(如图2中的d所示)。细胞色素c的免疫荧光实验表明，hf处理后细胞色素c从bht-101和c643细胞的线粒体中释放到细胞核和胞浆中(如图2中的e所示)。通过jc-1进一步测定线粒体膜的完整性，其中红色和绿色荧光分别代表健康和受损的线粒体。如图2中的f所示，其表明hf呈剂量依赖性地降低bht-101和c643细胞中红/绿荧光比率，综上实验表明hf诱导了atc细胞线粒体凋亡途径。
34.四、hf通过抑制emt过程抑制atc细胞转移
35.hf是i型胶原蛋白(col1)抑制剂,col1已被证明可以调节细胞增殖、迁移、凋亡和血管生成等过程。通过h&e和免疫组化染色观察到col1聚集在血管周围(如图3中的a所示)。因此，本技术发明人进一步对人源atc组织进行了col1和血管内皮标记蛋白cd31双重免疫荧光染色，发现cd31与col1共定位，进一步说明atc转移与肿瘤血管生成相关(如图3中的b所示)。
36.本技术发明人使用gepia数据库中的mrna数据研究了col1a1、col1a2与转移表型之间的联系。spearman相关性分析的结果显示，col1a1和col1a2与转移标志物基质金属蛋白酶(mmp)2(0.73(p＝0))、mmp9(0.21(p＝1.9
×
10-6))、twist(twist1)(0.9(p＝0))(如图3中的c所示)之间存在强相关性。基于生物信息学的统计数据表明了col1a1、col1a2与转移
标志物之间的强相关并表明col1在调节atc转移表型中的作用。transwell分析表明，hf处理显著降低了atc细胞的迁移能力，这可以通过添加脯氨酸来逆转(如图3中的d所示)。上皮-间质转化(emt)在转移表型中有着关键作用。hf处理增加了bht-101和c643细胞系中上皮标记物(e-cadherin)的表达，并降低了间质标记物(vimentin、β-catenin、gsk-3β、zeb1、snail)的表达(如图3中的e所示)。免疫荧光分析进一步验证了蛋白质印迹分析中的观察结果(如图3中的f所示)。这些结果表明，hf通过抑制emt过程抑制了atc细胞的转移。
37.通过本发明的上述实施例，本实施例方案提供的一个抗atc的天然活性化合物hf(常山酮)在用于atc上的抗癌作用及其作用机制在现有技术中未见报道，其为hf(常山酮)在抗癌atc肿瘤上的新用途。并且，通过本发明的方案及上述实验，证实eprs在atc肿瘤中高表达，可将其作为治疗靶点。
38.以上具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。

技术特征：
1.一种关于天然活性化合物hf在诱导atc细胞凋亡上的应用。2.如权利要求1所述的应用，其特征是：所述天然活性化合物hf靶向谷氨酰脯氨酰trna合成酶(eprs)在atc细胞中诱导氨基酸饥饿反应，使其不能有效摄入脯氨酸而导致atc细胞增殖抑制。3.如权利要求1所述的应用，其特征是：所述天然活性化合物hf通过抑制i型胶原蛋白和上皮-间质转化(emt)抑制atc细胞转移，并通过诱导线粒体凋亡途径诱导atc细胞凋亡。4.如权利要求1所述的应用，其特征是：所述天然活性化合物hf在治疗甲状腺未分化癌的药物制备上的应用。

技术总结
本发明公开了一种关于天然活性化合物HF诱导ATC细胞凋亡的应用，涉及药物化学技术领域，其技术要点为：提供了天然活性化合物HF在诱导ATC细胞凋亡的应用，HF通过靶向谷氨酰脯氨酰tRNA合成酶(EPRS)在ATC细胞中诱导氨基酸饥饿反应，使其不能有效摄入脯氨酸而导致ATC细胞增殖抑制。天然活性化合物HF通过抑制I型胶原蛋白和上皮-间质转化(EMT)抑制ATC细胞转移，并通过诱导线粒体凋亡途径诱导ATC细胞凋亡。本发明通过筛选得到一个抗ATC药物：HF在ATC上的抗癌作用及其作用机制未见报道；并证实了氨基酸饥饿反应在ATC肿瘤发生发展中的重要性；同时证实了EPRS在ATC肿瘤中高表达，可将其作为治疗靶点。其作为治疗靶点。其作为治疗靶点。


技术研发人员：米粒 李志辉 吴文爽
受保护的技术使用者：四川大学华西医院
技术研发日：2023.02.02
技术公布日：2023/7/11