D族维生素及其代谢物用于真核动物细胞核糖体激动剂的用途

d族维生素及其代谢物用于真核动物细胞核糖体激动剂的用途
技术领域
1.本技术涉及生物化学领域，具体涉及d族维生素及其代谢物用于真核细胞核糖体激动剂的用途。


背景技术：

2.组织老化可能会导致组织损伤、变性或萎缩，从而导致肌肉减少症、恶病质、骨质疏松症、胰腺萎缩和阿尔茨海默病等与年龄相关的疾病。为了在不增加癌症风险的情况下恢复组织生长，需要确定可以促进细胞生长而不增加细胞增殖的小分子药物。虽然已经有了许多用于细胞增殖的高通量药物筛选研究，但很少有基于有丝分裂后合成代谢生长的筛选(例如在骨骼肌中)。骨骼肌由经有丝分裂的多核肌纤维组成。随着肌肉减少症的发展，骨骼肌的质量和力量都会下降，这是因为净肌肉蛋白质合成显著减少。在体外2d培养中，人类骨骼肌成肌细胞能够退出细胞周期、融合并分化为经有丝分裂的多核肌管，体外2d培养是一种适合高内涵成像、自动图像分割和提取的培养系统，而且这些成像信息都会被用于高通量筛选的形态学参数。然而，除了针对化学刺激促进肌肉收缩和抗肌萎缩蛋白缺乏症的救治的药物筛选之外，几乎没有专门针对有丝分裂后肌肉生长或细胞体积增加的药物筛选(ebhardt et al.,2017；fukawa et al.,2016；regeur et al.,1994；xin et al.,2017；zeng et al.,2019)(carson et al.,2002)(fukawa et al.,2016；khamoui et al.,2016；li et al.,2019；russell et al.,2009)(young et al.,2018)(sun et al.,2020)。
3.在药物筛选领域，近几十年来新批准的药物数量的显著下降部分归因于基于分子靶点的筛选模型的失败。十多年来对fda批准的新药的评估表明，尽管在同一时期对基于靶点的项目进行了大量投资，但通过表型筛选成功的药物数量超过了通过基于分子靶点筛选发现的药物数量。这一令人惊讶的结果促使人们对用于药物开发的表型筛选越来越感兴趣。然而，相关研究的进展十分缓慢。通常表型筛选进展缓慢的一个部分原因是准确有效地识别药物靶点的巨大困难，使得优化药物、识别分子生物标志物和选择用于临床的患者亚群十分困难。结合表型筛选和基于靶点筛选的优势的新兴技术趋势是使用高通量热蛋白质温度范围分析(tpp-tr)技术。tpp-tr假设药物结合改变了溶液中蛋白质的结构和热稳定性，并可以通过比较药物处理前后溶液中蛋白质的丰度来揭示这一点，从而能够对小分子药物的蛋白质靶标在特定温度范围内进行无偏见和全面的搜索。tpp-tr的另一个优点是它可以应用于完整的活细胞和组织而无需化合物标记(sun et al.,2020)(franken et al.,2015；wagner,2016)(franken et al.,2015；mateus et al.,2016)。


技术实现要素：

4.在本技术中，我们将细胞生长表型筛选和用于蛋白质组学靶标发现的tpp-tr相结合，揭示了骨化三醇和胆钙化醇(维生素d3的生物活性和非活性形式)都通过直接结合和激活核糖体进行蛋白质合成来促进人类骨骼肌生长。维生素d3(胆钙化醇)需要在肝脏中代谢
成无活性的25-羟基维生素d(25(oh)d或骨化二醇)，然后运输到肾脏，在那里代谢成生物活性形式1,25-二羟基维生素d(1,25(oh)2d或骨化三醇)。维生素d3缺乏在老年人中很常见，并且与肌肉无力和随后的肌肉减少症有关，其可能导致慢性疼痛、虚弱、跌倒和死亡的风险增加。骨化三醇通过维生素d核激素受体(vdr)发挥基因组作用以诱导或抑制基因转录，但其广泛推测的对骨骼肌功能和代谢的非基因组影响的机制仍不清楚。此外，肌肉组织中的vdr表达在发育和衰老过程中逐渐降低，在成人骨骼肌中的水平非常低(asano et al.,2017；hayashi et al.,2020)(hangelbroek et al.,2019；li et al.,2021；meinnel et al.,1988)(abboud et al.,2018；dzik and kaczor,2019；ryan et al.,2016)(girgis et al.,2019；puthucheary et al.,2011)(olsson et al.,2016)。我们对小分子代谢物化合物的高含量、高通量表型筛选表明，生物活性骨化三醇和无活性胆钙化醇在促进有丝分裂后肌肉生长、同时抑制肌肉细胞增殖方面均表现突出。tpp-tr蛋白质组学进一步揭示核糖体复合物中的数十种核糖体蛋白是骨化三醇的新靶点，ribo mega-sec进一步证实骨化三醇可以直接与纯化的核糖体复合物结合。我们发现骨化三醇的一个非基因组效应是作为一种小分子激动剂，直接促进核糖体蛋白质合成，并提高肌肉中肌原纤维蛋白的表达，这表明维生素d3代谢物在改善肌肉质量和力量方面是有效的候选小分子。具体地，本技术提供了：
5.1.d族维生素用于真核细胞核糖体激动剂的用途。
6.2.根据项1所述的用途，其中所述d族维生素为维生素d2或维生素d3。
7.3.根据项1或2所述的用途，其中所述d族维生素选自如下的一项或多项：麦角钙化醇、胆钙化醇、骨化三醇、25-羟维生素d3、1，25-二羟维生素d3、24，25-二羟维生素d3。
8.4.根据项1-3任一项所述的用途，所述真核细胞来自脊椎动物，进一步优选来自人类以及人类饲养动物，最优选选自下组：人、猪、牛、马、狗、猫、山羊、兔、鸡、鱼。
9.5.根据项1-4的任一项所述的用途，所述用途包括向怀孕的母体、幼体和成体给药骨化三醇；进一步优选向猪的怀孕的母体、幼体和成体给药骨化三醇。
10.6.根据项1-5的任一项所述的用途，所述用途包括按照0.1μg/kg至10.0μg/kg的量向所述怀孕的母体、幼体和成体给药骨化三醇。
11.7.根据项1-6的任一项所述的用途，所述d族维生素促进蛋白质合成或促进肌管生长、成熟或分化。
12.8.一种高通量筛选核糖体激动剂的方法，其包括使用高通量热蛋白质组温度范围分析(tpp-tr)和蛋白合成效率分析候选化合物，如果候选化合物能够引起核糖体蛋白的热稳定性变化并且提升蛋白合成效率，提示该候选化合物为核糖体激动剂。
13.9.项8的方法，其中所述核糖体蛋白选自如下的一项或多项：rpl15、rps8、rpl6和rpl37a。
14.10.一种促进或提高脊椎动物核糖体功能的方法，包括给予所述脊椎动物d族维生素。
15.11.根据项10的方法，其中所述d族维生素为维生素d2或维生素d3。
16.12.根据项10或11所述的方法，其中所述d族维生素选自如下的一项或多项：麦角钙化醇、胆钙化醇、骨化三醇、25-羟维生素d3、1，25-二羟维生素d3、24，25-二羟维生素d3。
17.13.用于增加蛋白质或核糖体产物的表达量的组合物，所述组合物包含选自下组的一项或多项的d族维生素：麦角钙化醇、胆钙化醇、骨化三醇、25-羟维生素d3、1，25-二羟
维生素d3、24，25-二羟维生素d3，和核糖核酸。本技术的技术方案实现的有益技术效果
18.我们的研究结果表明，骨化三醇和相关的维生素d3代谢物代表了一类新的核糖体激动剂，这预示着它们具有成为预防和治疗衰老过程中肌肉减少症的有效方法的潜力。
附图说明
19.图1用于人类骨骼肌生长的高通量药物筛选显示骨化三醇是热门药物；(a)为流程图，先是基于人成肌细胞衍生的肌管3d体积的初级筛选的高通量药物筛选过程，然后是对形态和肌源性基因表达的剂量依赖性影响的二级筛选过程；(b)为targetmol库集的高通量筛选数据的点图表示出用于识别促进人类肌管分化和成熟的新化合物。实线描绘了平均响应。虚线表示阳性命中，八个主要阳性命中用散点突出显示。箭头：骨化三醇；(c)为在处理后第7天，经dmso和骨化三醇处理的人类肌管的估计3d体积的数字相衬(dpc)图像；(d)为相对于dmso载体对照，源自用骨化三醇处理的成肌细胞的人肌管的肌管形态(肌管宽度、长度、面积、％肌管面积和体积)特征。n＝20孔；(e)为肌管成熟度，如通过对源自用骨化三醇处理的成肌细胞的人肌管中的肌球蛋白重链(mhc，绿色)蛋白的免疫染色所指示的，相对于dmso载体对照。细胞核用hoechst复染；(f)为骨化三醇和dmso处理的肌管的融合指数。n＝20孔；(g)为图1g为图1a的进一步细化，主要筛选基于机械学习驱动的对人成肌细胞来源的肌管及其3d体积的识别，然后是剂量依赖性效应的验证试验；(h)为以生长诱导的胰岛素样生长因子-1为阳性对照，以生长抑制的白介素-1β为阴性对照的初级筛选验证；(i)为在加入生长诱导胰岛素样生长因子-1作为阳性对照，加入生长抑制白介素-1β作为阴性对照后，量化肌管面积百分比；(j)为在处理后第7天经骨化三醇和dmso处理的人肌管的估计肌管面积百分比的数字相衬(dpc)图像。图1k显示，肌生成标志物的mrna分析表明，骨化三醇在处理后第4天诱导出肌生成标志物如acta1和myh7的表达；(k)数据为经骨化三醇和dmso处理的人肌管中肌原标记基因表达的定量rt-pcr。*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001，n＝3个独立实验。
20.图2显示了骨化三醇能够促进人类肌源性分化、成熟和细胞粘附；(a和b)为dmso和骨化三醇处理的hskm衍生肌管中肌原标记的定量rt-pcr；(a)未分化的成肌细胞标记基因的表达；(b)肌管分化标记基因的表达。*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001，n＝3个独立实验；(c)为用dmso载体或100nm骨化三醇处理72小时后的人肌管中肌球蛋白重链(mhc)亚型、myod1、myog和gapdh蛋白丰度的蛋白质印迹定量图；(d)为在第1天用dmso载体或100nm骨化三醇处理，通过在第5天染色和计算ki67阳性细胞的比例来评估成肌细胞增殖能力。通过在5天内每天计算dapi+细胞总数来测量成肌细胞-肌细胞增殖，n＝3个单独的实验；(e)为在不同时间窗口(分化的0-72小时、0-24小时、24-48小时和48-72小时)用dmso或骨化三醇处理的人肌管中的肌原标记的定量rt-pcr图；(f)为在第4天和第7天，用dmso载体或100nm骨化三醇处理的人肌管中细胞分层与粘附的代表性图像；(g)用dmso载体或骨化三醇在i型胶原包被的培养表面上处理5天后人类肌管生长的代表性图像。图2h显示，骨化三醇显著下调增殖成肌细胞标志物pax3、pax7和myf5(图2a)，并显著上调myod1、myog和有丝分裂后肌管的其他下游生物标志物，如acta1、ncam1、mhc、myh3、myh8、myh2和myh7，以及dmso对照；(h)数据为用dmso或骨化三醇在i型胶原包被的培养表面上处理的人肌管中的肌原性标记物的定量rt-pcr图。*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001，n＝3个独立实验；(i)在i型胶原包被的培
养表面上暴露于dmso载体或骨化三醇的人肌管中mhc、myod1、myog和gapdh蛋白丰度的蛋白质印迹定量图。
21.图3使用热蛋白质组分析(tpp)技术无偏见地鉴定骨化三醇的蛋白质靶标；(a)用于无偏见发现药物结合靶标的tpp温度范围(tr)实验的示意图。肌管与dmso载体或100nm骨化三醇一起孵育3小时，然后在不同的预定温度下处理，用tmt16同位素标记进行量化，并通过lc-ms/ms进行蛋白质组学分析和量化；(b)为暴露于dmso载体或骨化三醇3小时后，蛋白质在37至59℃范围内在人肌管中的热图。灰度键表示相对溶解度，范围从高(浅色)到低(深色)；(c)为核糖体蛋白rpl15、rps8、rpl6和rpl37a在59℃与59℃下的溶解度变化最大。相比之下，eny2、anp32e、pggt1b和ptk7的溶解度没有变化；(d)为核糖体蛋白rpl15、rps8、rpl6和rpl37a在37℃至59℃的温度范围内的代表性蛋白质溶解度/稳定性曲线。相比之下，在骨化三醇处理后，eny2、anp32e、pggt1b和ptk7在整个温度范围内没有差异；(e)和(f)代表ribo mega-sec色谱图，这些多核糖体、80s核糖体、60s亚基和40s亚基从人类肌管中分离出来，然后用dmso载体(e)或骨化三醇(f)处理，例如使用uhplc分析。x轴表示保留时间，y轴表示260nm处的紫外吸光度。表格描述了与每个峰对应的峰面积和uv信号值；(g)用chx处理16小时，用dmso载体或骨化三醇处理72小时后肌管生长的代表性图像；(h)是图3e-f的进一步细化，左图为，用uhplc分析从人肌管中分离和纯化的核糖体(8-13分钟)和核糖体片段(13-15分钟)丰度的代表性ribo mega-sec色谱图，黑长虚色为对照处理的核糖体，黑短虚线为20μm骨化三醇处理的核糖体。纯20μm骨化三醇作为对照，在～20.5min时出现峰值(黑实线)。右图为ribo mega-sec色谱图的量化图，从人肌管中分离和纯化80s核糖体、60s亚基和40s亚基，在体外用对照(黑色)或骨化三醇(条纹)处理，使用uhplc分析。横轴为保留时间(min)，纵轴为260nm处的紫外吸光度。
22.图4骨化三醇直接与核糖体结合以促进骨骼肌细胞中的蛋白质翻译；(a)为从人肌管中分离的纯化多核糖体、80s核糖体、60s亚基和40s亚基丰度的代表性ribo mega-sec色谱图，然后用载体(深色)或骨化三醇(浅色)处理，例如使用uhplc分析。横轴表示保留时间(min，分钟)，纵轴表示260nm处的uv吸光度；(b)为用核糖体抑制剂放线菌酮(chx)处理16小时并用dmso载体或骨化三醇处理72小时的人肌管中mhc、myod1、myog和gapdh蛋白丰度的代表性蛋白质印迹定量图；(c)为用op标记的嘌呤霉素处理的肌管的代表性图像，以跟踪新生的蛋白质的合成；在用dmso或骨化三醇处理0.5小时和3小时后，在人肌管中；细胞核用hoechst染色，n》3个单独实验；(d)在不存在或存在骨化三醇的情况下，人类肌管中嘌呤霉素掺入和gapdh的代表性蛋白质印迹图。
具体实施方式
23.下面将参照附图更详细地描述本发明的具体实施例。虽然附图中显示了本发明的具体实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
24.需要说明的是，在说明书及权利要求当中使用了某些词汇来指称特定组件。本领域技术人员应可以理解，技术人员可能会用不同名词来称呼同一个组件。本说明书及权利要求并不以名词的差异来作为区分组件的方式，而是以组件在功能上的差异来作为区分的
准则。如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本发明的较佳实施方式，然所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本发明的范围。本发明的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。
25.如本文所用，就特定组分而言“基本上不含”在本文中用于表示特定组分未被有目的地配制到组合物中和/或仅作为污染物或以痕量存在。因此，由组合物的任何意外污染导致的特定组分的总量低于0.05％，优选低于0.01％。最优选的是其中特定组分的量用标准分析方法检测不到的组合物。
26.如在本说明书中所使用的，“一”或“一个”可以表示一个或多个。如权利要求中所使用的，当与单词“包含”一起使用时，单词“一”或“一个”可以表示一个或多于一个。
27.在权利要求中使用术语“或”用于表示“和/或”，除非明确指出仅指代替代方案或者替代方案是相互排斥的，尽管本公开内容支持仅指代替代方案和“和/或”的定义。如本文所用，“另一个”可以表示至少第二个或更多个。
28.贯穿本技术，术语“约”用于指示值包括装置的误差的固有变化，该方法用于测定该值或存在于研究对象之间的变化。
29.实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用本技术在第一方面涉及d族维生素的用途。
30.本技术在第一方面涉及d族维生素用于真核细胞核糖体激动剂的用途。
31.在一个具体实施方式中，提供了d族维生素及其代谢物用于真核细胞核糖体激动剂的用途。
32.在本说明书的上下文中，d族维生素或维生素d(简称vd)是指一种脂溶性维生素，其为一种环戊烷多氢菲类化合物，是一组结构上与固醇有关，功能上可防止佝偻病的维生素，其最主要的成员是维生素d3与d2。前者由人皮下的7-脱氢胆固醇经紫外线照射而成。后者由植物或酵母中含有的麦角固醇经紫外线照射而成。维生素d的主要功用是促进小肠粘膜细胞对钙和磷的吸收。肠中钙离子吸收需要一种钙结合蛋白，1，25-二羟基维生素d3可诱导此蛋白合成，促进ca
2+
的吸收，又可促进钙盐的更新及新骨生成，也促进磷吸收与肾小管细胞对钙、磷的重吸收，故可提高血钙、血磷浓度，有利于新骨生成和钙化。此外维生素d还有促进皮肤细胞生长、分化及调节免疫功能作用。一般成年人经常接触日光不致发生缺乏病，婴幼儿、孕妇、乳母及不常到户外活动的老人要增加维生素d供给量到每日10μg(相当于400国际单位)。缺乏维生素d儿童可患佝偻病，成人患骨质软化症。新兴的研究热点有d族维生素对于肌肉功能方面的影响。在本说明书中，“核糖体”符合生物学领域的一般定义，它是指一类无膜结构的细胞器，主要由蛋白质(40％)和rna(60％)构成。核糖体按沉降系数分为两类，一类(70s)存在于线粒体、叶绿体以及细菌中，另一类(80s)存在于真核细胞的细胞质中。它们有的漂浮在细胞内，有的结集在一起。核糖体是细胞内蛋白质合成的场所，被喻为蛋白质的“合成工厂”。把dna翻译为蛋白质。当配对形成完毕的mrna从细胞核核孔出来后，核糖体便附着于上，开始滑动。从起始密码子(例如：auu,aug等)开始，一直翻译到终止密码子(uaa,uag和uga)。每翻译一个密码子便可通过trna的搬运形成一个氨基酸分子，翻译的
过程中，各氨基酸分子脱水缩合形成肽链。翻译完成后即形成初始的蛋白质。在本说明书的上下文中，“激动剂”符合生物学领域的一般定义，它是拮抗剂的对应词，是指与某生物活性物质的受体结合，进而呈现该活性物质的作用的物质或药品。
33.在又一具体实施方式中提供了：所述d族维生素及其代谢物选自下组的一项或多项：麦角钙化醇形式的维生素d2、骨化三醇和胆钙化醇形式的维生素d3。
34.在本说明书的上下文中，d族维生素是a、b、c和d环结构相同但侧链不同的分子总称，a、b、c、d环的结构来源于类固醇的环戊氢烯菲环结构。维生素d根据其侧链结构的不同而有d2、d3、d4、d5、d6和d7等多种形式，在动物营养中真正发挥作用的只有d2(麦角钙化醇)和d3(胆钙化醇)两种活性形式。
35.在再一具体实施方式中提供了：所述真核细胞来自脊椎动物，进一步优选来自人类或人类饲养动物，最优选选自下组：人、猪、牛、马、狗、猫、山羊、兔、鸡、鱼。
36.在本说明书的上下文中，“脊椎动物”特指脊椎动物亚门(vertebrate)的动物，它们的脊椎都包在骨头里，是脊索动物门中最大和最先进的亚门。因大多数都具有代替脊索、由脊椎连接组成的脊柱而得名。并以此区别于无脊椎动物。此亚门包括现存的约39000种，分属于7纲：圆口纲、软骨鱼纲、硬骨鱼纲、两栖纲、爬行纲、鸟纲和哺乳纲。体形左右对称，一般分为头、躯干和尾三部分。躯干部多具有成对附肢，水栖动物成为胸鳍、腹鳍，陆栖动物成为前肢、后肢。体内具有1条由许多脊椎骨连接而成的脊柱，头骨发达。中枢神经系统在身体背侧，心脏在腹侧，与无脊椎动物的正相反。繁殖有3种类型：卵生、卵胎生或胎生。本技术优选的人类饲养动物：猪、牛、马、狗、猫、山羊、兔、鸡、鱼都可以给人类提供食用肉类。
37.在一个具体实施方式中提供了：所述用途包括向怀孕的母体、幼体和成体给药骨化三醇；进一步优选向猪的怀孕的母体、幼体和成体给药骨化三醇。
38.在再一具体实施方式中提供了：所述用途包括按照0.1μg/kg至10.0μg/kg的量向所述怀孕的母体、幼体和成体给药骨化三醇。
39.在又一具体实施方式中提供了：所述核糖体激动剂的生物学效果为促进蛋白质合成，优选所述生物学效果是促进肌管生长。
40.本技术在第二方面涉及高通量筛选核糖体激动剂的方法。
41.在一个具体实施方式中，提供了一种高通量筛选核糖体激动剂的方法，其包括使用高通量热蛋白质组温度范围分析(tpp-tr)根据细胞生长表型进行高通量筛选。tpp-tr假设药物结合改变了溶液中蛋白质的结构和热稳定性并可以通过比较药物处理前后溶液中蛋白质的丰度来揭示这一点，从而能够对小分子药物的蛋白质靶标在特定温度范围内进行无偏见和全面的搜索。
42.在本说明书的上下文中，高通量筛选(high throughput screening，hts)技术是指以分子水平和细胞水平的实验方法为基础，通常以微板形式作为实验工具载体，以自动化操作系统执行试验过程，以灵敏快速的检测仪器采集实验结果数据，以计算机分析处理实验数据，在同一时间检测数以千万的样品，并以得到的相应数据库支持运转的技术体系，它具有微量、快速、灵敏和准确等特点。简言之就是可以通过一次实验获得大量的信息，并从中找到有价值的信息。在本技术中，有时以“隔室”概念代替“微板”。
43.本技术在第三方面提供了一个用于增加核糖体产物的表达量的方法。
44.在一个具体实施方式中，提供了一种用于增加核糖体产物的表达量的方法，其包
含给予脊椎动物如本技术的上下文所述任一d族维生素(例如麦角钙化醇、胆钙化醇、骨化三醇、25-羟维生素d3、1，25-二羟维生素d3、24，25-二羟维生素d3)和核糖核酸。在某些实施方案中，所述组合物包含的d族维生素和核糖核酸是以共价键相互结合在一起。在某些实施方案中，所述组合物包含的d族维生素和核糖核酸不是以共价键相互结合在一起。在某些实施方案中，所述d族维生素是以共价键偶联在核糖核酸的5撇端。在某些实施方案中，所述d族维生素是以共价键偶联在核糖核酸的3撇端。在某些实施方案中，所述d族维生素是以共价键偶联在核糖核酸序列中的任一核酸碱基。在某些实施方案中，所述d族维生素是通过激活核糖体或结合核糖体，增加所述组合物中所述核糖核酸所编码的蛋白或核糖体产物的表达量。
45.在本技术在第四方面提供了一种用于增加蛋白质或核糖体产物的表达量的组合物，所述组合物包含选自下组的一项或多项的d族维生素：麦角钙化醇、胆钙化醇、骨化三醇、25-羟维生素d3、1，25-二羟维生素d3、24，25-二羟维生素d3，以及核糖核酸。
46.实施例部分
47.实施例一验证骨化三醇对人肌管成熟的剂量依赖性作用(dpc图像)
48.为了验证这些命中化合物对骨骼肌生长的影响，我们设置了0.1nm到10um的滴度，用于剂量依赖性细胞生长和肌肉特异性标志物表达的二级筛选。与dmso对照相比，骨化三醇对肥大肌管的百分比显示出明显的剂量依赖性影响，并且在0.1um的浓度下达到最大百分比(图1j)。类似地，肌生成标志物的mrna分析也表明，骨化三醇在第4天诱导了肌生成标志物如acta1和myh7的表达(图1k)。重要的是，骨化三醇组的平均肌管体积明显高于dmso对照组(图1c-d)。其他参数，如肌管宽度、长度、总面积和肌管百分比面积，在骨化三醇组中也明显更高(图1d)。这些观察结果表明，骨化三醇显著促进了人肌管肥大。根据第7天的mhc染色，通过融合指数进一步估计肌管终末分化(图1e)。与dmso载体对照组(70.80％融合)相比，骨化三醇处理的成肌细胞分化为多核肌管的程度更高(75.08％融合，图1f)。这些结果强烈表明骨化三醇主要促进肌管生长和成熟，但也促进肌管终末分化。基于上述发现，我们选择骨化三醇作为最终的先导化合物。
49.实施例二验证骨化三醇对成肌细胞增殖、分化和肌管分层的影响(mrna分析)
50.为了证实骨化三醇增强人成肌细胞分化的能力，我们对骨化三醇和dmso处理的肌管进行了mrna分析，以获得多种成肌细胞和肌管生物标志物。骨化三醇显著下调增殖成肌细胞标志物pax3、pax7和myf5(图2a)，并显著上调myod1、myog和有丝分裂后肌管的其他下游生物标志物，如acta1、ncam1、mhc、myh3、myh8、myh2和myh7，与dmso对照(图2b)。此外，当我们对肌肉特异性蛋白质生物标志物进行蛋白质印迹分析时，我们发现与dmso组相比，骨化三醇显著增加了三种mhc亚型：mhc i、iia和iix(图2c)。这些观察结果进一步支持我们的观点，即骨化三醇具有改善人类肌管分化和成熟的能力。
51.大多数现有的研究表明胆钙化醇抑制小鼠c2c12和人类成肌细胞增殖。相反，capiati等人已经表明，骨化三醇(1,25(oh)2d3)在未分化的鸡胚成肌细胞中刺激细胞增殖并抑制肌生成。为了研究骨化三醇对人骨骼肌成肌细胞增殖的影响，我们进行了细胞计数和ki67免疫荧光染色。尽管在第5天骨化三醇处理的成肌细胞中ki67+的比例略有增加，但没有统计学意义(图2d)。此外，细胞计数显示骨化三醇治疗抑制了原代人成肌细胞增殖(图2d)。因此，骨化三醇促进肌肉细胞生长而不增加细胞增殖。本领域众所周知，在培养的1-2
周内，由于体外细胞外基质(ecm)和营养条件不完善，大多数原代肌管将发生分层和细胞死亡。正如预期的那样，我们用dmso处理的原代人类成肌细胞在分化仅4天后就发生了分层，并且在第4天到第7天发现多核肌管的絮状聚集体漂浮在培养基中(图2f)。相比之下，骨化三醇处理的肌管在分化过程中不易分层(图2f)。在此，我们进一步研究了在肌管分化过程中通过用i型胶原ecm补充培养表面是否会消除骨化三醇的粘附作用。我们发现，尽管暴露于dmso的肌管在第3天已经发生分层，但暴露于骨化三醇的肌管在第5天仍显示出对i型胶原包被的培养孔的更强粘附。此外，mhc的mrna分析和蛋白质印迹证实，在i型胶原蛋白存在的情况下，骨化三醇促进肌管粘附和长期分化和成熟(图2h和2i)。
52.实施例三利用蛋白质组分析鉴定骨化三醇的蛋白质靶标(tpp实验)
53.在我们的初步筛选中鉴定出胆钙化醇和骨化三醇，它们对vdr的结合亲和力kd大不相同，而且vdr在成人肌肉中仅微弱表达的事实表明vdr独立机制可能正在运行。为了以无偏见的方式识别骨化三醇的新结合靶标，我们使用了热蛋白质组分析(tpp)中的最新技术。franken等人之前发现tpp在一个温度范围内和在固定的化合物浓度下进行，能够在蛋白质组范围内对药物靶向的蛋白质进行无偏见的评估。通过基于tmt量化不同温度后上清液中可溶性蛋白质的相对量，测量药物结合蛋白与非结合蛋白的热稳定性。相对于37℃(测试的最低温度)下的可溶性蛋白质丰度，量化了不同温度下的可溶性蛋白质丰度(chen et al.,2000)(olsson et al.,2016)(franken et al.,2015)。
54.tpp蛋白质组学结果的分层聚类显示，在有和没有短暂骨化三醇处理的情况下，整个蛋白质组的热稳定性曲线在很大程度上相似(图3b)，但热图中间的58种蛋白质显示出在短暂的骨化三醇处理后显著不同的热稳定性，即，在37-44℃左右的曲线(图3b)。有趣的是，其中大部分是核糖体蛋白，表明核糖体蛋白在37-44℃下的溶解度受骨化三醇的影响，并表明核糖体本身可以与骨化三醇结合(图3b右)。与dmso处理相比，骨化三醇处理后，代表性核糖体蛋白(rpl15、rps8、rpl6和rpl37a)在59℃和37℃下的溶解度显示出显著差异(图3c)。相比之下，作为阴性对照，蛋白质eny2、anp32e、pggt1b和ptk7显示出多种热稳定性趋势，但在骨化三醇处理后几乎没有差异(图3c)。当更详细地检查时，核糖体蛋白rpl15、rps8、rpl6和rpl37a的溶解度与温度(或“熔化”)曲线在骨化三醇和dmso处理的样品之间显著不同，而在阴性样品中没有观察到溶解度的差异。在整个温度范围内对照蛋白质eny2、anp32e、pggt1b和ptk7(图3d)。这些观察表明核糖体复合物直接与骨化三醇结合以产生这些热稳定性变化。
55.实施例四验证骨化三醇通过直接结合核糖体促进蛋白质翻译(ribo mega-sec分析)
56.为了使用正交方法确认我们的tpp-tr数据分析结果，我们使用uhplc对肌管核糖体蛋白进行了ribo mega-sec分析。ribo mega-sec是最近开发的一种方法，用于表征核糖体组装响应药物的变化。与yoshikawa等人的结果一致，我们在8-13分钟观察到80s核糖体复合物、60s亚基和40s亚基的独特峰(图3e)。当将骨化三醇添加到纯化的核糖体蛋白组分中并在4℃下孵育20分钟时，所有uhplc峰(80s核糖体、60s亚基、40s亚基)都显示出明显的变化(图3f和4a)。特别是，用纯骨化三醇对纯核糖体进行短暂处理会降低快速迁移的80s峰，并增加缓慢迁移的40s峰(图4a)。未结合的小分子会在核糖体峰之前洗脱，并且不应影响核糖体峰。因此，这些ribo mega-sec发现有力地支持了我们的结论，即骨化三醇直接与
从人肌管中分离的纯化核糖体复合物结合。
57.实施例五对肌管中的mhc、myod1和myog进行了蛋白质印迹分析(westernblot实验)
58.为了进一步确认骨化三醇是否通过与核糖体的直接结合来增加人类肌肉蛋白的翻译活性，我们对肌管中的mhc、myod1和myog进行了蛋白质印迹分析，使用和不使用成熟的核糖体翻译抑制剂放线菌酮(chx)。与dmso载体相比，骨化三醇显著增加了mhc蛋白表达(图4b)。然而，这种增加被低浓度的chx特异性消除，低浓度的chx对dmso对照中的mhc或其他蛋白质几乎没有影响，无论dmso或骨化三醇处理如何，表明骨化三醇通过促进核糖体翻译上调mhc蛋白质丰度(图4b)。对肌管分化的细胞形态观察证实了这些发现(图3g)。此外，我们还通过在不存在或存在骨化三醇的情况下，通过使用非放射性探针将荧光标记的o-炔丙基-嘌呤霉素(op-puro)的蛋白质掺入来测量新生蛋白质的合成。与dmso载体对照相比，骨化三醇刺激显著增加了荧光op-puro的掺入，只需3小时的孵育，表明骨化三醇可以快速促进人肌管中的新生蛋白质合成(图4c)。最后，嘌呤霉素掺入的蛋白质印迹分析进一步证实，骨化三醇刺激在0.5小时内显著增加了新生蛋白质的合成(图4d)。这些数据进一步支持我们的发现，即骨化三醇可以在vdr依赖性转录的基因组效应开始生效之前，迅速促进人类骨骼肌中的蛋白质翻译。
59.实施例结果总结
60.为了在不增加衰老过程中患癌症的风险的情况下恢复组织生长，需要确定可以在不增加细胞增殖的情况下增加细胞生长的小分子药物。在我们针对有丝分裂后合成代谢生长的高通量表型药物筛选中，通过使用机器学习(ml)算法来估计细胞体积，维生素d3代谢物脱颖而出。众所周知，维生素d3可以调节多种人体组织的生理机能和功能，包括骨骼肌。大量流行病学研究表明，补充维生素d3能够改善肌肉减少症或老年患者的肌肉力量和身体机能，但其机制尚不清楚。一些研究表明，维生素d3通过增加ii型肌纤维面积来增强肌肉力量。在我们目前的研究中，我们发现骨化三醇和胆钙化醇都可以增加有丝分裂后肌管的生长，并且骨化三醇可以增加i型和iia/iix mhc蛋白水平，部分原因是直接增加核糖体蛋白的合成(ksiazek et al.,2019；wagatsuma and sakuma,2014；zhang et al.,2019)(polly and tan,2014；remelli et al.,2019)。
61.骨化三醇可以通过vdr依赖性和非依赖性机制刺激骨骼肌中的蛋白质合成。ryan等人表明，骨化三醇可以调节编码ecm受体蛋白的mrna的vdr依赖性转录、肌肉收缩、粘着斑和整合素信号通路。在我们目前的研究中，骨化三醇可能通过增加体外ecm蛋白表达来防止肌管从i型胶原涂层表面分层。开发体外人类肌肉纤维模型的尝试长期以来一直受到人类肌管过早分层以及迄今为止在体外维持长期人类肌管培养困难的阻碍。这一直是肌肉细胞培养领域的一个重要问题，而骨化三醇对肌管分层的预防作用可能代表了解决这一问题的新策略(garcia et al.,2019)(ryan et al.,2016)(andriani et al.,2017)。
62.但鉴于胆钙化醇和骨化三醇都出现在我们的高通量筛选中，尽管它们对vdr的结合亲和力不同，我们希望使用tpp蛋白质组学寻找与vdr无关的骨化三醇靶标。perrin及其同事此前曾使用tpp确定帕比司他在大鼠肝、肺、肾和脾脏中的靶标，并发现znf512与帕比司他结合。tpp还实现了药物靶点和下游效应器的高通量发现，包括跨膜蛋白靶点。在tpp中，温度梯度通常不可逆地逐渐变性和沉淀蛋白质。但是具有不同结构的单个蛋白质，尤其
dystrophy hipsc-derived myoblast drug screen identifies compounds that ameliorate disease in mdx mice.jci insight 5.
106.turkowsky,d.,lohmann,p.,muhlenbrink,m.,schubert,t.,adrian,l.,goris,t.,jehmlich,n.,and von bergen,m.(2019).thermal proteome profiling allows quantitative assessment of interactions between tetrachloroethene reductive dehalogenase and trichloroethene.j proteomics 192,10-17.
107.vaes,a.m.m.,tieland,m.,toussaint,n.,nilwik,r.,verdijk,l.b.,van loon,l.j.c.,and de groot,l.(2018).cholecalciferol or25-hydroxycholecalciferol supplementation does not affect muscle strength and physical performance in prefrail and frail older adults.j nutr 148,712-720.
108.van der meijden,k.,bravenboer,n.,dirks,n.f.,heijboer,a.c.,den heijer,m.,de wit,g.m.,offringa,c.,lips,p.,and jaspers,r.t.(2016).effects of1,25(oh)2 d3 and 25(oh)d3 on c2c12 myoblast proliferation,differentiation,and myotube hypertrophy.j cell physiol 231,2517-2528.
109.wagatsuma,a.,and sakuma,k.(2014).vitamin d signaling in myogenesis:potential for treatment ofsarcopenia.biomed res int 2014,121254.
110.wagner,b.k.(2016).the resurgence of phenotypic screening in drug discovery and development.expert opin drug discov 11,121-125.
111.xin,a.,mizukami,h.,inaba,w.,yoshida,t.,takeuchi,y.k.,and yagihashi,s.(2017).pancreas atrophy and islet amyloid deposition in patients with elderly-onset type 2 diabetes.j clin endocrinol metab 102,3162-3171.
112.yoshikawa,h.,larance,m.,harney,d.j.,sundaramoorthy,r.,ly,t.,owen-hughes,t.,and lamond,a.i.(2018).efficient analysis of mammalian polysomes in cells and tissues using ribo mega-sec.elife 7.
113.young,j.,margaron,y.,fernandes,m.,duchemin-pelletier,e.,michaud,j.,flaender,m.,lorintiu,o.,degot,s.,and poydenot,p.(2018).myoscreen,a high-throughput phenotypic screening platform enabling muscle drug discovery.slas discov 23,790-806.
114.zeng,y.,wu,j.,he,x.,li,l.,liu,x.,and liu,x.(2019).mechanical microenvironment regulation of age-related diseases involving degeneration of human skeletal and cardiovascular systems.prog biophys mol biol 148,54-59.
115.zhang,l.,quan,m.,and cao,z.b.(2019).effect of vitamin d supplementation on upper and lower limb muscle strength and muscle power in athletes:a meta-analysis.plos one 14,e0215826.

技术特征：
1.d族维生素用于真核细胞核糖体激动剂的用途。2.根据权利要求1所述的用途，其中所述d族维生素为维生素d2或维生素d3。3.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述d族维生素选自如下的一项或多项：麦角钙化醇、胆钙化醇、骨化三醇、25-羟维生素d3、1，25-二羟维生素d3、24，25-二羟维生素d3。4.根据权利要求1-3任一项所述的用途，所述真核细胞来自脊椎动物，进一步优选来自人类以及人类饲养动物，最优选选自下组：人、猪、牛、马、狗、猫、山羊、兔、鸡、鱼。5.根据权利要求1-4的任一项所述的用途，所述用途包括向怀孕的母体、幼体和成体给药骨化三醇；进一步优选向猪的怀孕的母体、幼体和成体给药骨化三醇。6.根据权利要求1-5的任一项所述的用途，所述用途包括按照0.1μg/kg至10.0μg/kg的量向所述怀孕的母体、幼体和成体给药骨化三醇。7.根据权利要求1-6的任一项所述的用途，所述d族维生素促进蛋白质合成或促进肌管生长、成熟或分化。8.一种高通量筛选核糖体激动剂的方法，其包括使用高通量热蛋白质组温度范围分析(tpp-tr)和蛋白合成效率分析候选化合物，如果候选化合物能够引起核糖体蛋白的热稳定性变化并且提升蛋白合成效率，提示该候选化合物为核糖体激动剂。9.权利要求8的方法，其中所述核糖体蛋白选自如下的一项或多项：rpl15、rps8、rpl6和rpl37a。10.一种促进或提高脊椎动物核糖体产物的方法，包括给予所述脊椎动物d族维生素。11.根据权利要求10的方法，其中所述d族维生素为维生素d2或维生素d3。12.根据权利要求10或11所述的方法，其中所述d族维生素选自如下的一项或多项：麦角钙化醇、胆钙化醇、骨化三醇、25-羟维生素d3、1，25-二羟维生素d3、24，25-二羟维生素d3。13.一种用于增加蛋白质或核糖体产物的表达量的组合物，所述组合物包含选自下组的一项或多项的d族维生素：麦角钙化醇、胆钙化醇、骨化三醇、25-羟维生素d3、1，25-二羟维生素d3、24，25-二羟维生素d3，以及核糖核酸。

技术总结
本申请涉及D族维生素及其代谢物用于真核细胞核糖体激动剂的用途；还涉及一种高通量筛选核糖体激动剂的方法；以及一种用于增加蛋白质或核糖体产物的表达量的组合物。质或核糖体产物的表达量的组合物。


技术研发人员：黄仕强 蒋宗敏
受保护的技术使用者：中国科学院动物研究所
技术研发日：2023.01.04
技术公布日：2023/7/11