一种腻苔的量化分析方法

1.本发明涉及生物分析方法，特别涉及一种腻苔的量化分析方法。


背景技术：

2.舌诊是中医诊断体系中的一项重要诊断方法，清代章楠《医门棒喝
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伤寒论本旨》记载：“观舌体，可验其阴阳虚实，审舌垢，即知其邪之寒热浅深也”。这里的舌垢即是舌苔。中医理论认为舌苔是胃气蒸化谷气上承于舌面而形成，与脾胃运化功能密切相关。腻苔是中医诊断的重要依据，腻苔的特征是在舌面上一层致密黏滑苔，其病理本质现在仍不清楚，缺少可以量化分析的生化方法。
3.细菌生物膜是指细菌及其分泌的粘稠胞外基质共同构成的三维结构。细菌分泌的生物膜，含有大量的粘性多糖和粘蛋白，在舌面上形成一层致密的膜状物。这种致密的结构能提高细菌的黏附能力，并使细菌可以隔离抗生素，是细菌耐药性的主要原因。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种腻苔的量化分析方法。
5.本发明的目的通过下述技术方案实现：
6.一种腻苔的量化分析方法，是通过检测舌苔样本中微生物的成膜性，判断其是否属于腻苔。
7.所述的微生物的成膜性是通过结晶紫染色、荧光染料染色或黏蛋白染色中的至少一种进行检测的。
8.所述的微生物的成膜性，与舌苔样本经结晶紫染色后测定的od值、舌苔样本经荧光染色后测定的荧光强度或舌苔样本经黏蛋白染色后测定的染色值中的至少一种正相关。
9.所述的判断的标准为，当舌苔样本的检测结果符合以下的至少一条时，判断为腻苔：
10.a.舌苔样本经结晶紫染色后测定的od值为0.2以上；
11.b.舌苔样本经结晶紫染色后测定的od值为阴性对照的两倍以上；
12.c.舌苔样本经荧光染色后测定的荧光强度为阴性对照的两倍以上；
13.d.舌苔样本经黏蛋白染色后染色值检测结果为阴性对照的两倍以上。
14.所述的od值为590nm下测定的od值。
15.所述的od值为三次重复实验取得的平均值。
16.所述的染色值以红色(r)范围45～255内的像素占总像素的百分比为染色值。
17.所述的舌苔样本为从舌中部取的舌苔样本。
18.所述的结晶紫染色，具体步骤如下：
19.取舌苔样本，接种到培养基进行培养，培养完成后，固定、染色、洗涤、溶解，检测其吸光度。
20.所述的培养基为胰蛋白胨大豆肉汤培养基。
21.所述的培养为35～38℃下培养18～36h；优选为37℃下培养24h。
22.所述的固定为使用甲醇固定。
23.所述的染色为使用0.5～2％的结晶紫溶液染色；优选为使用1％的结晶紫溶液染色。
24.所述的溶解为使用30～35％的冰乙酸溶液溶解；优选为使用33％的冰乙酸溶液溶解。
25.所述的荧光染料染色，具体步骤如下：
26.取舌苔样本，加入荧光染料，染色完成后，检测其荧光强度。
27.所述的荧光染料为ebbabiolight 680。
28.所述的黏蛋白染色，具体步骤如下：
29.取舌苔样本，使用黏蛋白染色试剂盒染色，染色完成后，检测其染色值。
30.所述的黏蛋白染色试剂盒为ab-pas染色试剂盒。
31.一种量化分析腻苔的试剂盒，能够通过检测舌苔样本中微生物的成膜性，判断其是否属于腻苔。
32.所述的试剂盒，包括用于检测微生物成膜性的试剂。
33.所述的试剂盒，包括用于结晶紫染色、荧光染料染色或黏蛋白染色中至少一种的试剂。
34.所述的试剂盒，当舌苔样本的检测结果符合以下的至少一条时，判定为腻苔：
35.a.舌苔样本经结晶紫染色后测定的od值为0.2以上；
36.b.舌苔样本经结晶紫染色后测定的od值为阴性对照的两倍以上；
37.c.舌苔样本经荧光染色后测定的荧光强度为阴性对照的两倍以上；
38.d.舌苔样本经黏蛋白染色后染色值检测结果为阴性对照的两倍以上。
39.所述的od值为590nm下测定的od值。
40.所述的染色值以红色范围45～255内的像素占总像素的百分比为染色值。
41.所述的舌苔样本为从舌中部取的舌苔样本。
42.上述量化分析腻苔的试剂盒在鉴定腻苔中的应用。
43.本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
44.本发明基于前期研究，发现腻苔的本质是舌面菌在舌丝状乳头之间形成一层生物膜，牢固粘附于丝状乳头之间。基于生物膜的检测方法，从腻苔和正常舌苔中分别沾取舌苔样本，体外培养并检测生物膜形成的数量。发现腻苔的菌生物膜远高于正常舌苔。因此通过检测舌苔微生物的成膜性，可以高通量快速定性区别腻苔。
45.通过划分成膜性强弱区间，可以定性区别腻苔，标准如下：
46.1、腻苔菌整体成膜性0.2为区分腻苔与正常舌苔的界线
47.2、以未接种菌的培养液作为阴性对照，阴性值的2倍作为界限值(dc)。从腻苔中分离的单菌d值＞2
×
dc。
48.3、腻苔舌苔涂片加荧光染料后，荧光亮度高于正常舌苔2倍以上。
49.4、腻苔舌苔涂片以ab/pas染色后，粘蛋白染色值高于正常舌苔2倍以上。
附图说明
50.图1是正常舌苔与腻苔图片。
51.图2是实施例1中测定的成膜性的箱式图。
52.图3是实施例1中染色后的96孔板照片图。
53.图4是实施例1中蘸取舌苔的滤纸浸泡于离心管照片图。
54.图5是正常舌苔涂片生物膜糖类成分染色照片图。
55.图6是腻苔涂片生物膜糖类成分染色照片图。
具体实施方式
56.下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
57.下面实施方案中若未注明具体试验条件，则通常按照常规试验条件或按照试剂公司所建议的试验条件。所使用的材料、试剂等，若无特殊说明，均为从商业途径得到的试剂和材料。
58.实施例1腻苔样本的整体成膜性分析
59.实验材料：
60.样本来自大学生志愿者，共24人，按中医舌象鉴定标准进行区分，其中有腻苔的个体11人、无腻苔的个体13人。
61.实验方法：
62.(1)用约1/8张圆形灭菌滤纸对上述24人进行舌苔蘸取取样，放入1.5ml无菌离心管中，加入1ml pbs缓冲液中浸泡1小时，3000rpm 5分钟离心后，弃上清，加入生理盐水10μl，重悬后取菌体5μl，至每孔装有95μl胰蛋白胨大豆肉汤培养基(tsb)的96孔板中，每个样品3个复孔，37℃静置培养24小时。
63.(2)培养完成后，吸出培养液，用无菌pbs清洗3次。每孔加入100μl甲醇固定15分钟后吸出，自然风干。之后每孔加入100μl 1％结晶紫溶液，室温染色5分钟。吸出染料后均匀冲洗各孔至对照孔无颜色，自然风干。每孔加入100μl 33％冰乙酸溶液，37℃溶解30分钟。酶标仪590nm条件下测定各孔od值。
64.上述实验条件下所得正常舌苔与腻苔对比图片及成膜性如图1，两组统计结果如表1。腻苔可见致密水滑片状膜居于舌中部(图1)。
65.以非参数分析统计方法分析，成膜性结晶紫定量显示腻苔组od值(成膜性)的中位数是正常组的2倍以上，p值＜0.01。正常组a590在0.095～0.176之间，腻苔组a590在0.248～0.928之间，如图2所示。实验结果证明，通过检测微生物的成膜性可以明显区分出腻苔和正常舌苔。
66.表1吸光度测定结果
[0067][0068]
实施例2腻苔样本单菌成膜性测定
[0069]
用同等大小的扇形灭菌滤纸对腻苔组和正常舌苔组进行舌苔取样，放入1ml无菌pbs缓冲液中浸泡1小时，3000rpm 5分钟离心后，取样本悬液在胰蛋白胨大豆肉汤培养基(tsb)划线，37℃培养，挑取菌落，在新培养板上再划线。重复上述步骤，最终形成纯化后的单菌落，对得到的单菌落进行pcr扩增测序分析。
[0070]
腻苔组最终分离纯化得到的菌落与正常舌苔组对比，发现两株正常舌苔组中不存在的菌，经鉴定分别为不动杆菌、咽峡炎链球菌。
[0071]
上述分离到的2种菌，分别在tsb培养基3ml 220rpm 37℃摇菌培养18小时，之后分别取10ul菌液至装有90ul的tsb培养基的96孔板中，之后参照实施例1的方法测试其成膜性。
[0072]
结果判定：数值取3个复孔平均值(d值)，以未接种菌的培养液作为阴性对照，阴性值的2倍作为界限值(dc)。基于d值，菌株可分为3类：强生物被膜形成株(d＞2
×
dc)；(2)弱生物被膜形成株(dc＜d≤2
×
dc)；(3)无生物被膜形成株(d≤dc)。
[0073]
上述实验条件下所得腻苔舌苔分离菌株成膜性如表2，可见所分离的菌株成膜性均是强。
[0074]
表2腻苔分离菌株成膜性
[0075][0076]
实施例3使用荧光染料显示腻苔生物膜的强度
[0077]
用干净且灭菌的玻片在腻苔和正常舌苔上，从舌中向舌尖轻轻刮取舌苔，在另一块玻片上平推制成涂片。滴加1滴荧光染料ebbabiolight 680(1：500稀释)，该染料购自艾美捷公司，可以与生物膜中多种聚糖有较好的亲和力，常温避光孵育10分钟，再用荧光显微镜对光示踪荧光进行分析，发现腻苔玻片荧光值远高于正常舌苔，在本实施例中，发现荧光亮度高于正常2倍以上。
[0078]
实施例4使用黏蛋白染色技术检测腻苔中的黏蛋白组成
[0079]
黏蛋白染色技术常用作广泛检测黏蛋白的手段，先经标准阿利新蓝(ph＝2.5)染色再使用pas技术。阿利新蓝可将唾液黏蛋白、硫黏蛋白和蛋白多糖染成蓝色。pas技术可将中性黏蛋白染成深红或红紫色，同时将既含中性黏蛋白又含酸性黏蛋白的组织和细胞染成深浅不同的紫色
[0080]
用干净且灭菌的玻片在腻苔和正常舌苔上，从舌中向舌尖轻轻刮取舌苔，在另一块玻片上平推制成涂片，然后使用ab-pas染色试剂盒(阿利新蓝-过碘酸-雪夫染色试剂盒)进行染色，具体步骤参照试剂盒说明书，操作如下：
[0081]
1.用95％乙醇固定5min，蒸馏水洗2min。
[0082]
2.入阿利新蓝染色液，染色10～20min。
[0083]
3.蒸馏水洗3次，每次1～2min。
[0084]
4.入过碘酸溶液，氧化5min。
[0085]
5.入schiff reagent，浸染10～20min。
[0086]
6.倾去schiff reagent，流水冲洗10min。
[0087]
7.苏木素染色液，染核1～2min。
[0088]
8.用酸性分化液分化2～5s，水洗。
[0089]
9.用scott蓝化液返蓝，水洗3min。
[0090]
10.逐级常规乙醇脱水。二甲苯透明，中性树胶封固。
[0091]
结果如图5和图6所示，图6中的腻苔舌苔涂片代表生物膜粘性的粘蛋白含量远高于图5中的正常舌苔涂片，证明腻苔样本中黏蛋白含量较正常组显著增多，主要来源于其中成膜性较高的菌株，因此，通过检测其黏蛋白含量也可以有效区分腻苔和正常舌苔。
[0092]
涂片的显微镜照片，使用图像分析软件，对特定颜色进行灰度值计算染色值。本实施例采用相同放大倍率下含有相近细胞数量的图5和图6进行计算，使用软件image j，以红色(r)范围45～255(包括两个端点)进行灰度值计算，落入这一范围的像素为阳性，以阳性像素的数量除以总像素，得到染色值。图5中第一张图片的中染色部分阳性面积占比4.355％，得到染色值4.355，分辨率429*343；第二张占比60.640％，得到染色值60.640，分辨率423*340，图6的染色值为图5的13.92倍，染色值高于2倍以上。
[0093]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种腻苔的量化分析方法，其特征在于：通过检测舌苔样本中微生物的成膜性，判断其是否属于腻苔；所述的微生物的成膜性是通过结晶紫染色、荧光染料染色或黏蛋白染色中的至少一种进行检测的。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的微生物的成膜性，与舌苔样本经结晶紫染色后测定的od值、舌苔样本经荧光染色后测定的荧光强度或舌苔样本经黏蛋白染色后测定的染色值中的至少一种正相关。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的判断的标准为，当舌苔样本的检测结果符合以下的至少一条时，判断为腻苔：a.舌苔样本经结晶紫染色后测定的od值为0.2以上；b.舌苔样本经结晶紫染色后测定的od值为阴性对照的两倍以上；c.舌苔样本经荧光染色后测定的荧光强度为阴性对照的两倍以上；d.舌苔样本经黏蛋白染色后染色值检测结果为阴性对照的两倍以上；所述的od值为590nm下测定的od值；所述的染色值以红色范围45～255内的像素占总像素的百分比为染色值。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的结晶紫染色，具体步骤如下：取舌苔样本，接种到培养基进行培养，培养完成后，固定、染色、洗涤、溶解，检测其吸光度；所述的培养基为胰蛋白胨大豆肉汤培养基；所述的培养为35～38℃下培养18～36h；所述的固定为使用甲醇固定；所述的染色为使用0.5～2％的结晶紫溶液染色；优选为使用1％的结晶紫溶液染色；所述的溶解为使用30～35％的冰乙酸溶液溶解；优选为使用33％的冰乙酸溶液溶解。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的荧光染料染色，具体步骤如下：取舌苔样本，加入荧光染料，染色完成后，检测其荧光强度；所述的荧光染料为ebbabiolight 680。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的黏蛋白染色，具体步骤如下：取舌苔样本，使用黏蛋白染色试剂盒染色，染色完成后，检测其染色值；所述的黏蛋白染色试剂盒为ab-pas染色试剂盒。7.一种量化分析腻苔的试剂盒，其特征在于：能够通过检测舌苔样本中微生物的成膜性，判断其是否属于腻苔；所述的试剂盒，包括用于检测微生物成膜性的试剂。8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒，包括用于结晶紫染色、荧光染料染色或黏蛋白染色中至少一种的试剂。9.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒，当舌苔样本的检测结果符合以下的至少一条时，判定为腻苔：
a.舌苔样本经结晶紫染色后测定的od值为0.2以上；b.舌苔样本经结晶紫染色后测定的od值为阴性对照的两倍以上；c.舌苔样本经荧光染色后测定的荧光强度为阴性对照的两倍以上；d.舌苔样本经黏蛋白染色后染色值检测结果为阴性对照的两倍以上；所述的od值为590nm下测定的od值；所述的染色值以红色范围45～255内的像素占总像素的百分比为染色值。10.权利要求7～9任一所述的量化分析腻苔试剂盒在鉴定腻苔中的应用。

技术总结
本发明提供了一种腻苔的量化分析方法。基于前期研究，发明人发现腻苔的本质是舌面菌在舌丝状乳头之间形成一层生物膜，牢固粘附于丝状乳头之间。基于生物膜的检测方法，从腻苔和正常舌苔中分别沾取舌苔样本，体外培养并检测生物膜形成的数量，发现腻苔的菌生物膜远高于正常舌苔。因此通过检测舌苔微生物的成膜性，或刮取部分舌苔涂片，以荧光染料法、AB/PAS粘多糖染色法检测舌苔涂片中代表生物膜粘腻性质的聚糖类成分，可以高通量快速量化检测腻苔的强弱。的强弱。的强弱。


技术研发人员：权利要求书2页说明书5页附图3页
受保护的技术使用者：广州中医药大学（广州中医药研究院）
技术研发日：2022.11.24
技术公布日：2023/7/11