一种芦丁-壳聚糖包合物的制备方法及其应用

1.本发明涉及药物原料制备的技术领域，具体而言，涉及一种芦丁-壳聚糖包合物的制备方法及其应用。


背景技术：

2.芦丁(rutin)又名芸香苷，是由槲皮素c3位上的羟基和芸香糖结合而形成的双糖苷，归属于黄酮系列物质中的葡萄糖苷，广泛存在于人们日常食用的各种蔬菜、水果和中草药中。芦丁是天然的抗氧化剂，有清除自由基的特性,可调节众多疾病有关的细胞内和细胞外信号通路,影响细胞的生长、分化及其功能,对人们的健康、防病治病起着重要作用。芦丁具有广泛的药理活性，可抗氧化、抗炎、抗病毒、抗癌、预防和治疗心脑血管疾病。芦丁类药物毒副作用小、安全、成本低，但因其稳定性较差，在临床应用上受到一定的限制。
3.黄酮类化合物由于具有多羟基结构，容易受光、热等环境因素的影响而不稳定。芦丁的多羟基结构受环境影响被氧化后，其通过清除自由基、抗菌、防紫外等作用也会降低。研究表明，光照处理芦丁溶液的含量明显降低，经结构鉴定，芦丁的a环、b环的羟基氢解离，以负离子或自由基形式存在，使得芦丁的抑菌活性及防紫外线能力也相应降低。温度对芦丁稳定性的影响也较大，在25℃～270℃温度范围内，芦丁发生热变性，即一种伴随着芦丁氧化的热分解过程。在75℃时芦丁的分子结构开始发生变化，在270℃下芦丁分解成两种产物。
4.药物最基本的要求是安全、有效、稳定。药物的稳定性直接关系到药物的疗效甚至关系到人的生命安全。天然黄酮类药物芦丁的不稳定性使其在体内的生物利用度较低。


技术实现要素：

5.本发明所要解决的是问题如何提高芦丁的稳定性。
6.为解决上述问题，本发明提供一种芦丁-壳聚糖包合物的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
7.s1、脱乙酰壳聚糖溶解在乙酸水溶液中，调节溶液ph值，制得脱乙酰壳聚糖溶液；
8.s2、将芦丁溶解于三聚磷酸钠水溶液，制备芦丁溶液；
9.s3、将芦丁溶液过滤，而后逐滴注射到脱乙酰壳聚糖溶液中，搅拌，静置取上层清液，得到芦丁-壳聚糖包合物溶液；
10.s4、将上层清液冷冻干燥，获得芦丁-壳聚糖包合物的冻干粉。
11.脱乙酰壳聚糖在溶液中是带正电荷的多聚电解质，具有很强的吸附性，可作为良好的包衣材料。将脱乙酰壳聚糖溶于乙酸缓冲液以提高脱乙酰壳聚糖的溶解度；调节ph值至4.0-6.4以提高脱乙酰壳聚糖的电荷密度并增强其吸附阴离子能力。三聚磷酸钠溶液带负电，将芦丁溶解于三聚磷酸钠溶液可增加芦丁的溶解度并使其均匀分散在溶液中。过滤芦丁溶液逐滴加至脱乙酰壳聚糖溶液并搅拌后，带负电的芦丁因分子间静电作用被带正电的脱乙酰壳聚糖包裹，即形成均匀的芦丁-壳聚糖包合物溶液。而后通过将上层的芦丁-壳
聚糖包合物溶液取出，冷冻干燥后获得芦丁-壳聚糖包合物的冻干粉。
12.可选的，所述步骤s1中的脱乙酰壳聚糖的脱乙酰度为80.0～95.0％，其分子量为100,000。
13.可选的，所述步骤s1中，乙酸水溶液的浓度为0.5～1.0％。
14.可选的，所述步骤s1中，脱乙酰壳聚糖溶解在乙酸水溶液中，在25～27℃、1000～1200rpm的条件下搅拌24h。
15.可选的，所述步骤s1中，使用0.1mol/lnaoh溶液调节ph值，调节后的ph值为4.0～6.4。
16.可选的，所述步骤s2中，三聚磷酸钠水溶液的浓度为0.5～1.0％。
17.可选的，所用芦丁的质量份为1份，所用脱乙酰壳聚糖的质量份为10～20份。
18.芦丁与脱乙酰壳聚糖的比例为1∶(10～20)，能够使芦丁与脱乙酰壳聚糖形成芦丁-壳聚糖包合物不会浪费太多脱乙酰壳聚糖或芦丁原料。
19.根据上述的制备方法制得的芦丁-壳聚糖包合物。
20.所述芦丁-壳聚糖包合物为球形纳米颗粒物，并且所述芦丁-壳聚糖包合物的平均粒径为372nm。
21.根据上述的制备方法制得的芦丁-壳聚糖包合物在制备药品中的应用。
22.本发明的有益效果为：本发明提供一种芦丁-壳聚糖包合物的制备方法及其应用。该制备方法能够得到芦丁-壳聚糖包合物，该包合物相较于芦丁的标准品具有较高的光稳定性、热稳定性以及抗氧化稳定性。
附图说明
23.图1为实施例一制备的芦丁-壳聚糖包合物的电镜图；
24.图2为芦丁标准品和实施例一制备的芦丁-壳聚糖包合物的光稳定性结果图；
25.图3为芦丁标准品的热稳定性结果图；
26.图4为实施例一制备的芦丁-壳聚糖包合物的热稳定性结果图；
27.图5为芦丁标准品和实施例一制备的芦丁-壳聚糖包合物的dpph自由基清除率检测结果图；
28.图6为芦丁标准品和实施例一制备的芦丁-壳聚糖包合物的abts自由基清除率检测结果图。
具体实施方式
29.为使本发明的上述目的、特征和优点能够更为明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施例做详细的说明。
30.实施例一
31.本实施例提供一种芦丁-壳聚糖包合物的制备方法，包括以下步骤：
32.s1、0.1g脱乙酰壳聚糖溶解在20ml的0.75％乙酸水溶液中，脱乙酰壳聚糖的脱乙酰度为80.0％，其分子量为100,000。在25℃、1000rpm的条件下搅拌24h，以确保完全溶解，并用0.1mol/lnaoh溶液调节溶液ph值至4.8，制得0.5％脱乙酰壳聚糖溶液；
33.s2、将10mg芦丁溶解于5ml1.0％三聚磷酸钠水溶液，制备芦丁溶液；
34.s3、将芦丁溶液经过0.45μm滤膜过滤，而后逐滴注射到脱乙酰壳聚糖溶液中，在1,500rpm的条件下搅拌15min，静置2h后取上层清液，得到芦丁-壳聚糖包合物溶液；
35.s4、上清液冷冻干燥15h，获得芦丁-壳聚糖包合物的冻干粉。
36.本实施例制得的芦丁-壳聚糖的电镜照片如图1所示。本实施例制得的芦丁-壳聚糖包合物为球形纳米颗粒物，平均粒径为372nm。
37.实施例二
38.本实施例提供一种芦丁-壳聚糖包合物的制备方法，包括以下步骤：
39.s1、0.15g脱乙酰壳聚糖溶解在20ml的0.5％乙酸水溶液中，脱乙酰壳聚糖的脱乙酰度为85.0％，其分子量为100,000。在26℃、1,100rpm的条件下搅拌24h，以确保完全溶解，并用0.1mol/lnaoh溶液调节溶液ph值至4.0，制得0.75％脱乙酰壳聚糖溶液；
40.s2、将10mg芦丁溶解于5ml0.5％三聚磷酸钠水溶液，制备芦丁溶液；
41.s3、将芦丁溶液经过0.45μm滤膜过滤，而后逐滴注射到脱乙酰壳聚糖溶液中，在1,500rpm的条件下搅拌15min，静置2h后取上层清液，得到芦丁-壳聚糖包合物溶液；
42.s4、上清液冷冻干燥15h，获得芦丁-壳聚糖包合物的冻干粉。本实施例制得的芦丁-壳聚糖包合物为球形纳米颗粒物，平均粒径为372nm。
43.实施例三
44.本实施例提供一种芦丁-壳聚糖包合物的制备方法，包括以下步骤：
45.s1、0.20g脱乙酰壳聚糖溶解在20ml的1.0％乙酸水溶液中，脱乙酰壳聚糖的脱乙酰度为90.0％，其分子量为100,000。在27℃、1,200rpm的条件下搅拌24h，以确保完全溶解，并用0.1mol/lnaoh溶液调节溶液ph值至6.4，制得1.0％脱乙酰壳聚糖溶液；
46.s2、将10mg芦丁溶解于5ml0.75％三聚磷酸钠水溶液，制备芦丁溶液；
47.s3、将芦丁溶液经过0.45μm滤膜过滤，而后逐滴注射到脱乙酰壳聚糖溶液中，在1,500rpm的条件下搅拌15min，静置2h后取上层清液，得到芦丁-壳聚糖包合物溶液；
48.s4、上清液冷冻干燥15h，获得芦丁-壳聚糖包合物的冻干粉。本实施例制得的芦丁-壳聚糖包合物为球形纳米颗粒物，平均粒径为372nm。
49.实验例
50.实验例一
51.对实施例一制备的芦丁-壳聚糖包合物进行光稳定性检测，检测条件如下：色谱柱：diamonsil-c18
(5μm，4.6mm
×
150mm)。流动相：甲醇+水(55+45)，以磷酸调ph至3.5，临用前用超声波除气。流速：0.8ml/min柱温：30℃。检测波长：uv257nm；进样量：5ull；进样时间：20min。检测方法包括如下步骤：
52.v1、分别取10mg芦丁标准品和芦丁-壳聚糖包合物溶于10ml60％乙醇中，置于4℃、光照强度4500lx的恒温光照培养箱，
53.v2、分别在0h、4h、8h、12h、16h、20h时准确吸取样品2.0ml，用甲醇定容，经0.45um微孔滤膜滤过后采用高效液相色谱法检测芦丁含量。
54.参照图2，随着光照处理时间从0h增加到20h，芦丁-壳聚糖包合物中芦丁含量从0.78mg/ml减少到0.65mg/ml，降低了16.67％；芦丁标准品中芦丁含量从0.97mg/ml减少到0.31mg/ml，降低了68.06％。由此可见，芦丁标准品极易受光照影响发生结构改变、有效成分含量降低，而芦丁-壳聚糖包合物中芦丁受光照的影响较小、含量变化不大，有较好的光
稳定性。
55.实验例二
56.对实施例一制备的芦丁-壳聚糖包合物进行热稳定性检测，检验条件如下：在德国netzsch公司tg209f3tarsus热重分析仪上进行。以高纯度氮气(99.99％)为载气，流量为40ml/min。热稳定性检测方法包括如下步骤：
57.n1、分别取芦丁标准品和芦丁-壳聚糖包合物,试样用量控制在10mg左右.
58.n2、对芦丁标准品和芦丁-壳聚糖包合物分别采用20k/min的升温速率，在室温至800℃进行动态升温实验，系统自动采集数据，得到图3和图4的tg～dtg曲线。
59.实验例三
60.对实施例一制备的芦丁-壳聚糖包合物进行抗氧化稳定性检测，抗氧化稳定性方法包括如下步骤：
61.m1、分别取10mg芦丁标准品和芦丁-壳聚糖包合物溶于10ml60％乙醇中，避光置于25℃恒温培养箱中，以芦丁标准品为空白组，芦丁-壳聚糖包合物为待测组；
62.m2、分别在0h、20h、40h、60h、80h、100h、120h取样检测dpph
+
、abts
+
清除率。
63.参照图3温度从0℃增加到800℃，芦丁标准品的质量不断下降，在280.38℃处出现尖锐失重峰，800℃时失重率为35.87％；参照图4，芦丁-壳聚糖包合物的质量呈下降～平稳～下降～平稳的趋势，在130.46℃和512.47℃处出现尖锐失重峰，而在约150℃～450℃、550℃～800℃温度范围内，质量基本没有变化，800℃时失重率为51.32％。测试结果可知，芦丁标准品较芦丁-壳聚糖包合物对温度更敏感，受温度变化影响大，更易受热分解失重，而芦丁-壳聚糖包合物则具有更好的热稳定性。
64.a.dpph
+
清除率
65.空白组加入1mmol/ldpph溶液3ml、去离子水1ml、60％乙醇1ml；待测组加入1mmol/ldpph溶液3ml、去离子水1ml、待测样液1ml。避光半小时后在波长517nm处测定吸光值(使用60％乙醇校零)。按照下列公式计算芦丁标准品和芦丁-壳聚糖包合物对dpph自由基的清除率：
[0066][0067]
其中a0为空白对照液的吸光度值，a1样品反应液的吸光度值。
[0068]
参照图5，处理时间从0h增加到120h，芦丁-壳聚糖包合物的dpph自由基清除率从97％下降到84％，降低了13％；芦丁标准品的dpph自由基清除率从89％下降到12％，降低了77％。可见芦丁-壳聚糖包合物样品有更好的抗氧化稳定性。
[0069]
b.abts+清除率
[0070]
精密移取5mlabts(7mmol/l)溶液于棕色瓶内，再加入88μl过硫酸钾溶液(140mmol/l)，于常温下避光放置过夜后放入冰箱保存，即得abts自由基储备液。用乙醇适当稀释至a734nm在0.7
±
0.02范围内，即得淡绿色的abts工作液。
[0071]
空白组加入1mmol/labts溶液3ml、去离子水1ml、60％乙醇1ml；待测组加入1mmol/labts溶液3ml、去离子水1ml、待测样液1ml。避光半小时后在波长734nm处测定吸光值(使用60％乙醇校零)。按照下列公式计算芦丁标准品和芦丁-壳聚糖包合物对abts自由基的清除率：
[0072][0073]
其中a0为空白对照液的吸光度值，a1样品反应液的吸光度值。
[0074]
参照图6，处理时间从0h增加到120h，芦丁-壳聚糖包合物的abts自由基清除率从95％下降到83％，降低了12％；芦丁标准品的abts自由基清除率从89％下降到19％，降低了70％。可见芦丁-壳聚糖包合物样品有更好的抗氧化稳定性。
[0075]
虽然本公开披露如上，但本公开的保护范围并非仅限于此。本领域技术人员，在不脱离本公开的精神和范围的前提下，可进行各种变更与修改，这些变更与修改均将落入本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种芦丁-壳聚糖包合物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：s1、脱乙酰壳聚糖溶解在乙酸水溶液中，调节溶液ph值，制得脱乙酰壳聚糖溶液；s2、将芦丁溶解于三聚磷酸钠水溶液，制备芦丁溶液；s3、将芦丁溶液过滤，而后逐滴注射到脱乙酰壳聚糖溶液中，搅拌，静置取上层清液，得到芦丁-壳聚糖包合物溶液；s4、将上层清液冷冻干燥，获得芦丁-壳聚糖包合物的冻干粉。2.根据权利要求1所述的芦丁-壳聚糖包合物的制备方法，其特征在于，所述步骤s1中的脱乙酰壳聚糖的脱乙酰度为80.0～95.0％，其分子量为100,000。3.根据权利要求1所述的芦丁-壳聚糖包合物的制备方法，其特征在于，所述步骤s1中，乙酸水溶液的浓度为0.5～1.0％。4.根据权利要求2所述的芦丁-壳聚糖包合物的制备方法，其特征在于，所述步骤s1中，脱乙酰壳聚糖溶解在乙酸水溶液中，在25～27℃、1000～1200rpm的条件下搅拌24h。5.根据权利要求1所述的芦丁-壳聚糖包合物的制备方法，其特征在于，所述步骤s1中，使用为naoh溶液调节ph值，调节后的ph值为4.0～6.4。6.根据权利要求1所述的芦丁-壳聚糖包合物的制备方法，其特征在于，所述步骤s2中，三聚磷酸钠水溶液的浓度为0.5～1.0％。7.根据权利要求1～6任一所述的芦丁-壳聚糖包合物的制备方法，其特征在于，所用芦丁的质量份为1份，所用脱乙酰壳聚糖的质量份为10～20份。8.一种芦丁-壳聚糖包合物，其特征在于，根据权利要求1～6任意一项所述芦丁-壳聚糖包合物的制备方法制得。9.根据权利要求8所述的芦丁-壳聚糖包合物，其特征在于，所述芦丁-壳聚糖包合物为球形纳米颗粒物，平均粒径为372nm。10.根据权利要求8所述的芦丁-壳聚糖包合物在制备药品中的应用。

技术总结
本发明涉及药物原料制备的技术领域，具体而言，涉及一种芦丁-壳聚糖包合物的制备方法及其应用，制备方法包括以下步骤：S1、脱乙酰壳聚糖溶解在乙酸水溶液中，调节溶液pH值，制得脱乙酰壳聚糖溶液；S2、将芦丁溶解于三聚磷酸钠水溶液，制备芦丁溶液；S3、将芦丁溶液过滤，而后逐滴注射到脱乙酰壳聚糖溶液中，搅拌，静置取上层清液，得到芦丁-壳聚糖包合物溶液；S4、将上层清液冷冻干燥，获得芦丁-壳聚糖包合物的冻干粉。本发明芦丁-壳聚糖包合物的制备方法提高了天然黄酮类药物芦丁的稳定性，使其在体内的生物利用度增高。在体内的生物利用度增高。在体内的生物利用度增高。


技术研发人员：俞超 周卉 徐欣 方文清 梅倚寒
受保护的技术使用者：浙江万里学院
技术研发日：2022.11.21
技术公布日：2023/7/11