引物探针组合以及试剂盒的制作方法

1.本发明涉及检测试剂领域，特别涉及引物探针组合以及试剂盒。


背景技术：

2.呼吸道感染分上呼吸道感染和下呼吸道感染，从病原体分又分为病毒感染和细菌感染，但由于各种不同的呼吸道病原体感染导致的症状体征基本相同，均表现急性起病，高热，咳嗽，可伴有寒战，呼吸道分泌物增加等，但针对不同病原体的治疗方法却大相径庭，比如不同的病毒需要不同类型的抗病毒药物，不同的细菌所需要的抗菌素种类区别也很大。而且不同类型病原体感染导致的风险程度也大不相同，有些可以自愈，有些则可能导致严重的并发症危及生命，有些甚至可能导致严重呼吸道传染病的迅速传播和爆发。因此在临床诊疗中尽快确定感染病原体的种类非常关键，这对于尽快采取特异性治疗措施，从而减少药物滥用、为提高患者治愈率和存活率争取宝贵的时间。降低社会医疗负担和支出，乃至及早发现和排查新型突发性呼吸道传染病病原体都非常重要。
3.但在目前的临床实践中，都是采用单个靶标的病原体体检测，医生往往依据流行病信息经验、理化、影像等从可能性较高的病原体开始检查并逐步排除，但这种做法耗时长、高成本，加剧病人痛苦、贻误治疗的最佳时机。为此，很多时候医生只能在没有明确病原学诊断的情况下盲目经验性给药，这又造成了药物滥用，增加了毒副作用和病原体耐药的机率，还造成医疗资源浪费，同时也无益于提高疗效。因此，国内外学者多年来一直致力于研发多靶标同时检测的技术，但是多对引物探针存在于一个反应体系中会导致难以想象的复杂局面：
4.众所周知，不同靶标的引物探针之间如果存在数个连续的碱基互补，则很有可能在聚合酶作用下相互结合产生扩增延伸，导致大量的非特异假阳性扩增产物。连续三个碱基与其它序列相同的概率为1/4
×
1/4
×
1/4＝1/64，显然随着引物探针数量的增加，发生不同序列间相互重叠的或互补的几率将迅速增加，甚至几乎无法避免，因此以往用于单靶标检测的引物探针将不适用。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明提供了引物探针组合以及试剂盒，其具有灵敏、特异、抗干扰性强和稳定性高等特点。
6.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
7.本发明提供了引物探针组，包括：
8.(1)、具有如seq id no.1、seq id no.2、seq id no.4、seq id no.5、seq id no.7和/或seq id no.8任一所示的核苷酸序列的引物；和
9.(2)、具有如seq id no.3、seq id no.6和/或seq id no.9任一所示的核苷酸序列的探针。
10.在本发明的一些具体实施方案中，上述引物探针组还包括：
no.3(20mm)、1μl seq id no.4(20mm)、1μl seq id no.5(20mm)、0.5μl seq id no.6(20mm)、1μl seq id no.7(20mm)、1μl seq id no.8(20mm)、0.5μl seq id no.9(20mm)、0.8μl seq id no.10(20mm)、0.8μl seq id no.11(20mm)和0.4μl seq id no.12(20mm)，用灭菌纯化水和核酸模板补足至50μl。
33.在本发明的一些具体实施方案中，所述引物探针组或所述试剂盒的反应程序包括：50℃2min；95℃预变性2min；95℃变性15s；60℃退火30s，返回变性然后退火并如此重复45个循环；25℃冷却10s。
34.本发明还提供了试剂盒，包括上述引物探针组以及可接受的辅料或助剂。
35.在本发明的一些具体实施方案中，所述的辅料或助剂包括dmso、tmac、ssb、甲酰胺、海藻糖、甜菜碱和/或非离子型洗涤剂。
36.在本发明的一些具体实施方案中，试剂盒还包括反应试剂；所述试剂包括dntps、udg酶、tth酶和/或mgcl2中的一种或多种。
37.本发明还提供了检测方法，包括使用上述引物探针组进行real time pcr，根据检测得出的ct值判断样品是否存在鲍曼不动杆菌基因、嗜麦芽窄食单胞菌基因或者洋葱伯克霍尔德菌基因中的一种或多种。
38.本发明的引物探针组有如下效果：
39.1、本发明的引物探针组检测不同样品时比同一批设计的引物探针组的ct值整体较低，且信号强度整体较高，说明本发明的引物探针组合扩增效率较高。
40.2、最低检测限试验结果表明，本发明的引物探针组的检测限：鲍曼不动杆菌为500copies/ml；嗜麦芽窄食单胞菌为500copies/ml；洋葱伯克霍尔德菌为500copies/ml。
41.3、交叉反应试验结果表明，本发明的引物探针组对金黄色葡萄球菌、流感嗜血杆菌、变性杆菌、肺炎链球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌和白色念珠菌等病原体感染样本无交叉反应，表明本发明的引物探针组其具有高特异性。
42.4、抗干扰性试验结果表明，当样本中含有200mg/dl血红蛋白、3000mg/dl甘油三酯、20mg/dl胆红素等内源性干扰物质时，本发明试剂盒的检测灵敏度不会受到明显干扰。说明本发明的引物探针组具有良好的抗干扰性。
43.5、稳定性试验结果表明，2～8℃运输7天、45℃加速7、10、14天的鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌及洋葱伯克霍尔德菌核酸检测试剂仍能检出阳性样品。2～8℃保存3、6、9、12个月的鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌及洋葱伯克霍尔德菌核酸检测试剂仍能检出阳性样品。说明本发明的引物探针组具有良好的稳定性。
附图说明
44.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
45.图1示鲍曼不动杆菌引物探针筛选扩增曲线；其中，横坐标为循环数；
46.图2示嗜麦芽窄食单胞菌引物探针筛选扩增曲线；其中，横坐标为循环数；
47.图3示洋葱伯克霍尔德菌引物探针筛选扩增曲线；其中，横坐标为循环数。
具体实施方式
48.本发明公开了引物探针组合以及试剂盒，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
49.解决背景技术所述的问题的办法就是重新精心设计引物探针，尽可能使各个靶标的引物探针序列之间的差别足够大，以至于不出现互补区域。而这却导致了各个引物探针之间的熔解温度(tm值)的巨大差异。众所周知，tm值与dna片段的长度以及g-c/a-t含量的差别有关，g-c对于tm值的贡献大于a-t。基于聚合酶识别能力和扩增特异性的要求，引物探针的长度被限制在一个很小的范围内，比如20至24个核苷酸，因此以此调节tm值的能力有限；而各个引物探针序列组成的差异必然导致g-c/a-t含量的巨大差别，从而使各自的tm值差异较大。但作为pcr的普遍理论，退火/延伸温度在接近tm值时才能获得比较好的扩增效率和特异性，故tm值的差异将导致同一反应体系(即同一个温度循环参数)中不同靶标的扩增效率和特异性不一致，甚至容易在造成某些靶标漏检的同时造成另一些靶标的假阳性。
50.为解决上述技术问题，我经过了多年的研究和实践，包括动用大数据和计算机自动检索技术，在海量的全球已知病原体序列数据库中反复筛选出多个高特异性序列作为初步备选序列，然后采用独特的计算机软件技术分析各个序列组合之间的非特异互补状况，并模拟扩增过程，从而进一步筛选出较为合适的次级备选序列，再通过人工合成上述序列后经实际病原体及其可能存在的交叉干扰菌标本进行大量的实际测试，终于筛选出以下序列用于本发明。因此，本发明中所包含的引物探针组合较好的克服了现有技术无法解决的上述问题，具有实质性技术创造，以及独特性和专有性，甚至是唯一性，并不是现有单靶标检测引物探针的简单组合。
51.尽管如此，上述优选序列仍然无法完全解决所面临的问题。为此，我们通过基于该序列组合的反应体系优化，调整了反应体系中的特定组分及其浓度和参数，从而进一步保证了检测性能的优异。具体表现为：dmso的加入及其特定浓度恰当的调整了反应溶液的导热性和表面张力，以保证该复杂扩增反应的均一性；甜菜碱作为温和的dna变性剂，其在该浓度下恰当的削弱了上述引物探针组合中g-c和a-t对tm值贡献的差异，使得这些引物探针的tm值趋向一致，从而有助于多靶标检测在同一个扩增温度循环下的扩增效率和特异性协调一致。另外，作为整合了反转录和dna聚合两种活性的tth酶，其承担核酸识别和复制的活性部位构象存在特殊性，造成锰离子、镁离子、钾离子对激活其活性的作用效果存在差异，即三者对于反转录、dna复制，以及扩增特异性和扩增效率的影响各不相同。为此在本发明中通过特殊优化其配比和浓度，使这些特性也在上述引物探针组合中得到了均衡。同时，反应体系ph值对于不同引物探针的扩增特异性和扩增效率的影响也各不相同，在本发明中也经过了特定优化，使其适配上述引物探针组合。
52.综上说述，本发明的技术组合具有实质性技术创造，以及独特性和专有性，并不是现有单靶标检测技术的简单组合，同时也产生了意想不到的技术效果，即解决了多靶标的同时、快速、高灵敏度、高特异性检测的技术问题。
53.附：
54.seq id no.1～2所示引物对的扩增产物序列如下所示：(seq id no.13)
[0055][0056][0057]
seq id no.4～5所示引物对的扩增产物序列如下所示：(seq id no.14)
[0058][0059]
seq id no.7～8所示引物对的扩增产物序列如下所示：(seq id no.15)
[0060][0061]
内标的序列如下所示：(seq id no.16)
[0062][0063]
本发明提供的检测引物、探针或其组合，以及检测试剂、检测试剂盒中，所用原料及试剂均可由市场购得。
[0064]
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
[0065]
实施例1：鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌及洋葱伯克霍尔德菌三联核酸检测试剂盒的制备
[0066]
试剂盒中的引物、探针序列如下表1所示：
[0067]
表1引物、探针序列
[0068] 名称核苷酸序列(5
’‑3’
)aba上游引物seq id no.1tggtaatgatcttgctcgtgcttaba下游引物seq id no.2tcccacttaaatacttctgtggtggttaba探针seq id no.3atgctttgatcggccttgagcaccasma上游引物seq id no.4agaaatcaaccgagattccgtaagtasma下游引物seq id no.5tcagatacagggctatcaccttctatgsma探针seq id no.6acgagcgaacgcggactagccctbcc上游引物seq id no.7accaatccgacggatctcaabcc下游引物seq id no.8tagacgtcttcggccgtcagbcc探针seq id no.9tcgggctaaaggccaccctaccg内标上游引物seq id no.10gaaggctcatggcaagaaag内标下游引物seq id no.11ctcactcagtgtggcaaagg内标探针seq id no.12cttgaggttgtccaggtgagccag
[0069]
试剂盒中还包括：10mm的dntps，1u/μl的udg酶，5u/μl的tth酶、50mm的mgcl2。试剂盒还包括阴性对照(无菌水)和阳性对照(人工合成的浓度1
×
106copies/ml的菌株)。
[0070]
实施例2：本发明试剂盒的检测方法
[0071]
本发明的检测方法为实时荧光定量pcr，实时荧光定量pcr反应过程为：
[0072]
(1)udg酶消化，时间一般为2min～5min，消化温度一般为37℃～50℃，udg酶消化的目的为使消除pcr产物气溶胶的污染，排除检测结果的假阳性；(2)预变性，时间和长度取决于靶核苷酸长度及碱基组成，预变性的温度一般为90℃～105℃，时间一般为2～10min，预变性的目的为使双链核苷酸序列彻底分离为单链；(3)变性，温度一般为91℃～105℃，时间一般为10s～35s；退火，使各引物退火至udg酶消化或内标质控核酸的靶序列上。退火的温度通常为40℃～60℃，退火的时间可以是10s～60s(4)延伸，引物与模板结合，开始合成新的dna双链，延伸温度一般为40℃～80℃，延伸时间可以是10s～1min。
[0073]
表2反应体系
[0074]
[0075][0076]
荧光检测通道选择：(1)选择fam通道(reporter：fam，quencher：none)，检测鲍曼不动杆菌；(2)选择rox通道(reporter：rox，quencher：none)，检测嗜麦芽窄食单胞菌；(3)选择cy5通道(reporter：cy5，quencher：none)，检测洋葱伯克霍尔德菌；(4)选择hex通道，检测内标；(5)参比荧光(passive reference)设置为none。荧光定量实时反应条件如表3所示。
[0077]
表3荧光定量实时pcr反应条件
[0078][0079]
反应结束后，仪器自动保存结果，利用仪器自带的软件进行自动分析或手动调节基线的开始值、结束值以及阈值线值进行分析，然后记录样本ct值和定值结果。具体测试结果分析如下：
[0080]
seq id no.3、seq id no.6和seq id no.9所示探针通道无荧光值，且seq id no.12所示探针通道的ct值≤35，报告检测结果为阴性；
[0081]
seq id no.3所示探针通道的ct值≤30，但seq id no.6和seq id no.9所示探针通道ct值＞30，报告为鲍曼不动杆菌阳性；
[0082]
seq id no.6所示探针通道的ct值≤30，但seq id no.3和seq id no.9所示探针通道ct值＞30，报告为嗜麦芽窄食单胞菌阳性；
[0083]
seq id no.9所示探针通道的ct值≤30，但seq id no.3和seq id no.6所示探针通道ct值＞30，报告为洋葱伯克霍尔德菌阳性；
[0084]
当seq id no.12所示探针通道ct值＞35，出现阴性对照有ct值或呈典型s扩增曲线、阳性对照无ct值或无扩增曲线两种情况中的任一种时，该检测结果无效，应查找并排除原因，并重复试验。
[0085]
实施例3：引物探针筛选
[0086]
本研究通过检索ncbi数据库，分别针对不同株的鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、洋葱伯克霍尔德菌基因组dna序列进行多序列比对，分析得到鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌及洋葱伯克霍尔德菌的高度保守区域，应用primer premier 3.0进行引物探针设计，对鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、洋葱伯克霍尔德各设计3套引物探针。
[0087]
(1)鲍曼不动杆菌引物探针筛选
[0088]
应用鲍曼不动杆菌的三套引物探针检测4例鲍曼不动杆菌样本，各设置3个重复，对比ct值进行筛选：分别比较三套引物探针对4例鲍曼不动杆菌样本的ct值，由于ct越大，扩增效率越低，因此，应选择ct值均值较小的引物探针组合三(seq id no.1、seq id no.2、seq id no.3)。图1示鲍曼不动杆菌引物探针筛选扩增曲线。
[0089]
表4鲍曼不动杆菌引物探针筛选试验结果
[0090][0091]
(2)嗜麦芽窄食单胞菌引物探针筛选
[0092]
应用嗜麦芽窄食单胞菌的三套引物探针检测4例嗜麦芽窄食单胞菌样本，各设置3个重复，对比ct值进行筛选：分别比较三套引物探针对4例麦芽窄食单胞菌样本的ct值，由于ct越大，扩增效率越低，因此，应选择ct值均值较小且出值稳定的的引物探针组合三(seq id no.4、seq id no.5、seq id no.6)。图2嗜麦芽窄食单胞菌引物探针筛选扩增曲线。
[0093]
表5嗜麦芽窄食单胞菌引物探针筛选试验结果
[0094][0095]
(3)洋葱伯克霍尔德菌引物探针筛选
[0096]
应用洋葱伯克霍尔德菌的三套引物探针检测4例洋葱伯克霍尔德菌样本，各设置3个重复，对比ct值进行筛选：分别比较三套引物探针对4例洋葱伯克霍尔德菌样本的ct值，由于ct越大，扩增效率越低，因此，应选择ct值均值较小且信号强度高的的引物探针组合三(seq id no.7、seq id no.8、seq id no.9)。图3洋葱伯克霍尔德菌引物探针筛选扩增曲线。
[0097]
表6洋葱伯克霍尔德菌引物探针筛选试验结果
[0098][0099]
实施例4：本发明试剂盒的可行性试验
[0100]
1、最低检测限(lod)试验
[0101]
(1)鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌及洋葱伯克霍尔德菌三联核酸检测试剂配制：采用实施例1的方法制备鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌及洋葱伯克霍尔德菌三联核酸检测试剂。
[0102]
(2)病原体样本提取
[0103]
将管中5个不同浓度的鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌及洋葱伯克霍尔德菌人咽拭子洗脱液用移液器混匀，取出100μl于一个新的离心管中，12000rpm离心5min，小心弃去上清；向沉淀中加入200μl的细菌裂解液(来自北京百奥莱博科技有限公司)，充分混匀，100℃水浴5min，10000rpm离心5min备用。
[0104]
(3)样本检测
[0105]
将25μl处理好的标本上清加入到鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌及洋葱伯克霍尔德菌三联核酸检测试剂反应管中，每个浓度20个复孔，同时加入25μl纯净水到检测液中作为阴性对照，按照实施例2中检测方法进行检测。
[0106]
(4)结果分析
[0107]
通过采用实施例1制备的试剂盒和采用实施例2的检测方法对鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌及洋葱伯克霍尔德菌三联核酸检测试剂各浓度梯度的样本进行检测，结果表明本检测方法的检测灵敏度(lod)鲍曼不动杆菌为500copies/ml，嗜麦芽窄食单胞菌为500copies/ml，洋葱伯克霍尔德菌为500copies/ml，具体数据如表4、表5和表6所示。
[0108]
表4鲍曼不动杆菌检测限确认
[0109]
样本浓度(copies/ml)检测重复数阳性检测数阳性检出率2000copies/ml2121100％1000copies/ml2121100％500copies/ml2121100％300copies/ml212095.％100copies/ml211780.9％
[0110]
表5嗜麦芽窄食单胞菌检测限确认
[0111]
样本浓度(copies/ml)检测重复数阳性检测数阳性检出率2000copies/ml2121100％500copies/ml2121100％300copies/ml211466.6％200copies/ml211361.9％100copies/ml2100
[0112]
表6洋葱伯克霍尔德菌检测限确认
[0113]
样本浓度(copies/ml)检测重复数阳性检测数阳性检出率2000copies/ml2121100％500copies/ml2121100％300copies/ml211990.4％200copies/ml211257.1％100copies/ml21628.6％
[0114]
2、与其它疾病的交叉反应情况
[0115]
(1)鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌及洋葱伯克霍尔德菌三联核酸检测试剂配制：采用实施例1的方法制备鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌及洋葱伯克霍尔德菌三联核酸检测试剂。
[0116]
(2)交叉病原体样本提取
[0117]
将管中的鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、洋葱伯克霍尔德菌、金黄色葡萄球菌、流感嗜血杆菌、变性杆菌、肺炎链球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌咽拭子洗脱液用移液器混匀，取出100μl于一个新的离心管中，12000rpm离心5min，小心弃去上清；向沉淀中加入200μl的细菌裂解液，充分混匀，100℃水浴5min，10000rpm离心5min备用。
[0118]
(3)样本检测
[0119]
将25μl处理好的标本上清加入到鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌及洋葱伯克霍尔德菌三联核酸检测反应管中，同时加入25μl纯净水到检测液中作为阴性对照，提取的鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、洋葱伯克霍尔德菌作为阳性对照试验，按照实施例2中检测方法进行检测。
[0120]
(4)结果分析
[0121]
通过采用实施例1制备的试剂盒和采用实施例2的检测方法对鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、洋葱伯克霍尔德菌以外的其它病原体进行检测，结果表明：鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、洋葱伯克霍尔德菌等阳性对照呈阳性，阴性对照呈阴性，金黄色葡萄球菌、流感嗜血杆菌、变性杆菌、肺炎链球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌等病原体感染样本无交叉反应，表明本发明的试剂盒具有高特异性，具体结果如表7。
[0122]
表7交叉反应实验
[0123]
样本名称检测结果样本名称检测结果鲍曼不动杆菌阳性变性杆菌阴性嗜麦芽窄食单胞菌阳性肺炎链球菌阴性洋葱伯克霍尔德菌阳性大肠埃希菌阴性金黄色葡萄球菌阴性铜绿假单胞菌阴性流感嗜血杆菌阴性阴性对照阴性
[0124]
3、对潜在外源物质的抗干扰性
[0125]
(1)鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌及洋葱伯克霍尔德菌三联核酸检测试剂配制：采用实施例1的方法制备鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌及洋葱伯克霍尔德菌三联核酸检测试剂。
[0126]
(2)样本处理
[0127]
选取鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌及洋葱伯克霍尔德菌低值样本，浓度值均为1
×
103copies/ml。同时将正常给药浓度加入到对应细菌样本中，采用实施例3中交叉反应方法处理样本，按照实施例2中检测方法进行检测。
[0128]
(3)结果分析
[0129]
试验表明，正常给药浓度的阿齐霉素、注射用青霉素钾、左氧氟沙星片、阿莫西林克拉维酸钾片、注射用盐酸万古霉素、注射用盐酸去甲万古霉素、注射用盐酸头孢吡肟、哌拉西林、头孢他啶(复达欣粉针)、奥司他韦(达菲胶囊)、利巴韦林(利巴韦林片)、丙酸倍氯米松鼻喷雾剂、布地奈德鼻喷雾剂对检测无影响。
[0130]
4、对潜在内源物质的抗干扰性
[0131]
(1)鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌及洋葱伯克霍尔德菌三联核酸检测试剂配制：采用实施例1的方法制备鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌及洋葱伯克霍尔德菌三联核酸检测试剂。
[0132]
(2)样本处理
[0133]
选取鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌及洋葱伯克霍尔德菌低值样本，浓度值均为1
×
103copies/ml。同时将200mg/dl血红蛋白、3000mg/dl甘油三酯、20mg/dl胆红素等干扰物质浓度加入到对应细菌样本中，采用实施例3中交叉反应方法处理样本，按照实施例2中检测方法进行检测。
[0134]
(3)结果分析
[0135]
干扰判断：干扰率％小于项目所在行标允许的正确度偏倚(设定为10％)，即可判断为通过。
[0136]
干扰率计算公式：(干扰样本浓度-对照样本浓度)/对照样本浓度
×
100％。
[0137]
试验表明，当样本中含有200mg/dl血红蛋白、3000mg/dl甘油三酯、20mg/dl胆红素等内源性干扰物质时，本发明试剂盒的检测灵敏度不会受到明显干扰，具体见表9。
[0138]
表9内源物质的抗干扰性实验
[0139]
干扰物质干扰率(％)血红蛋白1.9甘油三酯1.3胆红素3.5
[0140]
实施例5：本发明试剂盒的2～8℃稳定性考核
[0141]
1、加速稳定性试验
[0142]
(1)鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌及洋葱伯克霍尔德菌三联核酸检测试剂配制：采用实施例1的方法制备鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌及洋葱伯克霍尔德菌三联核酸检测试剂。
[0143]
(2)样本提取
[0144]
将管中检出限浓度的鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌及洋葱伯克霍尔德菌人咽拭子洗脱液用移液器混匀，利用安图生物工程股份有限公司的核酸提取或纯化试剂盒进行核酸dna的纯化。
[0145]
(3)样本检测
[0146]
将25μl处理好的标本上清加入到37℃加速7、10、14天的鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄
食单胞菌及洋葱伯克霍尔德菌核酸检测试剂反应管中，每个型别2个复孔，同时加入25μl纯净水到检测液中作为阴性对照，按照实施例2中检测方法进行检测。
[0147]
(4)结果分析
[0148]
采用实施例1制备的试剂盒和采用实施例2的检测方法对2～8℃运输7天、37℃加速7、10、14天的鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌及洋葱伯克霍尔德菌核酸检测试剂进行检测，具体检出情况如表10所示。
[0149]
表10加速稳定性试验
[0150][0151]
2、实时稳定性试验
[0152]
(1)鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌及洋葱伯克霍尔德菌核酸检测试剂配制：采用实施例1的方法制备鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌及洋葱伯克霍尔德菌核酸检测试剂。
[0153]
(2)样本提取
[0154]
将管中检出限浓度的鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌及洋葱伯克霍尔德菌人咽拭子洗脱液用移液器混匀，利用安图生物工程股份有限公司的核酸提取或纯化试剂盒进行核酸dan的纯化。
[0155]
(3)样本检测
[0156]
将25μl处理好的标本上清加入到2～8℃运输7天、2～8℃保存3、6、9、12个月的鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌及洋葱伯克霍尔德菌核酸检测试剂反应管中，每个型别2个复孔，同时加入25μl纯净水到检测液中作为阴性对照，按照实施例2中检测方法进行检测。
[0157]
(4)结果分析
[0158]
采用实施例1制备的试剂盒和采用实施例2的检测方法对2～8℃保存3、6、9、12个月的鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌及洋葱伯克霍尔德菌核酸检测试剂进行检测，具体检出情况如表11所示。
[0159]
表11实时稳定性试验
[0160][0161]
3、重复性试验
[0162]
(1)鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌及洋葱伯克霍尔德菌核酸检测试剂配制：采
用实施例1的方法制备鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌及洋葱伯克霍尔德菌核酸检测试剂。
[0163]
(2)样本提取
[0164]
将混合的的鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌及洋葱伯克霍尔德菌中浓度样本cv1、低浓度样本cv2，各10个重复利用安图生物工程股份有限公司的核酸提取或纯化试剂盒进行核酸dna的纯化。
[0165]
(3)样本检测
[0166]
将25μl处理好的cv1、cv2核酸加入到鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌及洋葱伯克霍尔德菌核酸检测试剂反应管中，按照实施例2中检测方法进行检测。
[0167]
(4)结果分析
[0168]
采用实施例1制备的试剂盒和采用实施例2的检测方法混合的鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌及洋葱伯克霍尔德菌cv1、cv2核酸检测试剂进行检测，具体数据如表12所示。
[0169]
表12重复性试验
[0170][0171]
三个靶标的中、低值样本变异系数均小于5％，说明试剂重复性良好。
[0172]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.引物探针组，其特征在于，其包括：(1)、具有如seq id no.1、seq id no.2、seq id no.4、seq id no.5、seq id no.7和/或seq id no.8任一所示的核苷酸序列的引物；和(2)、具有如seq id no.3、seq id no.6和/或seq id no.9任一所示的核苷酸序列的探针。2.如权利要求1所述的引物探针组，其特征在于，其还包括：(3)、具有如seq id no.10和/或seq id no.11所示核苷酸序列引物；和(4)、具有如seq id no.12所示核苷酸序列的探针。3.如权利要求1或2所述的引物探针组，其特征在于，其还具有：(5)、如(1)～(4)任一所示的核苷酸序列的互补序列；和/或(6)、如(1)～(5)任一所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(1)～(4)任一所示的相同或相似；和/或(7)、与(1)～(6)任一所示的核苷酸序列同源性达到不低于80％的核苷酸序列。4.如权利要求1至3任一项所述的引物探针组在制备用于鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌和/或洋葱伯克霍尔德菌检测试剂盒中的应用。5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述引物探针组或所述试剂盒的检测结果的判断标准包括：如seq id no.3、seq id no.6与seq id no.9所示探针通道ct值＞30或者无ct值，且seq id no.12所示探针通道的ct值≤35，报告检测结果为阴性；和/或如seq id no.3所示探针通道的ct值≤30，但seq id no.6和seq id no.9所示探针通道ct值＞30，报告为鲍曼不动杆菌阳性；和/或如seq id no.6所示探针通道的ct值≤30，但seq id no.3和seq id no.9所示探针通道ct值＞30，报告为嗜麦芽窄食单胞菌阳性；和/或如seq id no.9所示探针通道的ct值≤30，但seq id no.3和seq id no.6所示探针通道ct值＞30，报告为洋葱伯克霍尔德菌阳性；和/或当seq id no.12所示探针通道ct值＞35，出现：a)阴性对照有ct值或呈典型s扩增曲线；或b)阳性对照无ct值或无扩增曲线；任一种情况，则检测结果无效。6.如权利要求4或5所述的应用，其特征在于，所述引物探针组或所述试剂盒的反应体系包括：1μl甜菜碱(5m)、1.5μl dmso、1μl dntps(10mm)、0.1μl udg酶(1u/μl)、1μl tth酶(5u/μl)、3μl mgcl2(50mm)、1μl seq id no.1(20mm)、1μl seq id no.2(20mm)、0.5μl seq id no.3(20mm)、1μl seq id no.4(20mm)、1μl seq id no.5(20mm)、0.5μl seq id no.6(20mm)、1μl seq id no.7(20mm)、1μl seq id no.8(20mm)、0.5μl seq id no.9(20mm)、0.8μl seq id no.10(20mm)、0.8μl seq id no.11(20mm)和0.4μl seq id no.12(20mm)，用灭菌纯化水和核酸模板补足至50μl。7.如权利要求4至6任一项所述的应用，其特征在于，所述引物探针组或所述试剂盒的反应程序包括：50℃2min；95℃预变性2min；95℃变性15s；60℃退火30s，返回变性然后退火并如此重复45个循环；25℃冷却10s。
8.试剂盒，其特征在于，其包括如权利要求1至3任一项所述的引物探针组以及可接受的辅料或助剂。9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，其还包括反应试剂；所述试剂包括dntps、udg酶、tth酶和/或mgcl2中的一种或多种。10.检测方法，其特征在于，其包括使用如权利要求1至3任一项所述的引物探针组进行real time pcr，根据检测得出的ct值判断样品是否存在鲍曼不动杆菌基因、嗜麦芽窄食单胞菌基因或者洋葱伯克霍尔德菌基因中的一种或多种。

技术总结
本发明涉及检测试剂领域，特别涉及引物探针组合以及试剂盒。本发明提供的引物探针组具有如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7和/或SEQ ID NO.8任一所示的核苷酸序列的引物和具有如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.6和/或SEQ ID NO.9任一所示的核苷酸序列的探针。该引物探针组及其试剂盒具有灵敏、特异、抗干扰性强和稳定性高等特点。抗干扰性强和稳定性高等特点。


技术研发人员：兰定云 李进福 景培源 慎津进 薛寒 高利飞 郑业焕
受保护的技术使用者：郑州安图生物工程股份有限公司
技术研发日：2022.10.27
技术公布日：2023/7/11