用于宫颈癌甲基化检测的引物探针、试剂盒及检测方法与流程

1.本发明涉及肿瘤基因检测技术领域，具体来说是用于宫颈癌甲基化检测的引物探针、试剂盒及检测方法。


背景技术：

2.宫颈癌一直位居妇科恶性肿瘤的前列，是女性最常见的恶性肿瘤之一。多数宫颈癌是由一种称为人乳头瘤病毒的病毒引起的，人乳头瘤病毒(hpv)通过与已经携带该病毒的人的性接触而传播，但并非所有类型的hpv都会导致宫颈癌。
3.目前，宫颈癌主要靠检测筛查，按照宫颈癌的筛查策略，有很大机会在还没有发展到宫颈癌的时候，在癌前病变时就发现问题，然后尽早解决，进行宫颈癌及其癌前病变的早期诊断和治疗，从而降低宫颈癌的发病率及死亡率。宫颈癌筛查技术最早采用的是细胞学筛查，可有效发现早期宫颈癌。细胞学检查由妇科医师采用宫颈刮板或宫颈刷收集宫颈脱落细胞，其准确性受取材、涂片、染色和读片等因素影响较大。细胞学技术以宫颈细胞形态学改变为基础，对妇科或细胞病理医师的水平依赖程度较高。另外，hpvdna检测是分子诊断技术，具有客观、可靠及易于重复，且短时间内可获得结果等优势，提高了筛查效率。但hpv检测特异性低(假阳性高)易造成过度治疗浪费金钱，引起恐慌。宫颈癌甲基化是直接检测癌细胞的状态，有效侦测受检者宫颈细胞是否属于正常，比传统的细胞学检查和hpv分型检测能更早发现宫颈细胞是否进展成癌前病变或宫颈癌。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于解决现有技术的不足，提供一种用于宫颈癌甲基化检测的引物探针组合、试剂盒及其检测方法，所述试剂盒具有检测灵敏度高、特异性好的优点。
5.为了实现上述目的，设计一种用于宫颈癌甲基化检测的引物和探针组合，所述引物和探针用于检测dapk2、cadm2的基因组合；所述引物和探针组合包括dapk2正向引物f、dapk2反向引物r、dapk2探针p、cadm2正向引物f、cadm2反向引物r和cadm2探针p；所述dapk2正向引物f、dapk2反向引物r、dapk2探针p、cadm2正向引物f、cadm2反向引物r和cadm2探针p的核苷酸序列分别如seq id no：1～seq id no：6所示。
6.优选的：所述dapk2探针p和cadm2探针p的5’端采用fam标记；所述dapk2探针p和cadm2探针p的3’端采用bhq1标记。
7.本发明还提供一种用于宫颈癌甲基化检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1或2所述的引物和探针组合、β﹣actin正向引物f、β﹣actin反向引物r和β﹣actin探针p；所述β﹣actin正向引物f、β﹣actin反向引物r和β﹣actin探针p的核苷酸序列如seq id no：7～seq id no：9所示。
8.优选的：所述β﹣actin探针p的5’端采用vic标记；所述β﹣actin探针p的3’端采用bhq1标记。
9.优选的：所述试剂盒还包括10
×
pcr buffer、taq酶、dntps、无核酸酶水、阳性对照
和阴性对照。
10.优选的：所述阳性对照包括来自宫颈癌细胞株hela的dna；所述阴性对照包括来自宫颈癌细胞株c33a的dna。
11.本发明还提供了一种上述试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
12.s1.提取待测样本dna；
13.s2.将所述待检样本dna经重亚硫酸盐转化处理，得转化后dna；
14.s3.以所述转化后dna为模板，利用如权利1～4所述引物和探针组合进行pcr扩增反应，得到荧光检测结果；
15.s4.所述荧光检测结果，其中fam的阈值设置为8000，vic的阈值设置为12000；
16.s5.利用所述荧光检测结果，对待检样本进行判定；当βactin ct≤34，根据dapk2、cadm2基因与β-actin的
△
ct值判定各基因结果；dapk2基因
△
ct＞5则dapk2基因为阴性，dapk2基因
△
ct≤5则dapk2基因为阳性；cadm2基因
△
ct＞8则cadm2基因为阴性，cadm2基因
△
ct≤8则cadm2基因为阳性；dapk2与cadm2任一基因为阳性，则判定该样本为宫颈癌甲基化阳性，dapk2与cadm2基因同时检测为阴性，则判定该样本为宫颈癌甲基化阴性；当βactin ct＞34，则判定样本不足或有抑制物存在，pcr反应无效，需重复实验或采样；所述δct＝fam ct-vic ct。
17.优选的：所述步骤s3中pcr扩增反应使用的反应体系包括dapk2扩增体系和cadm2扩增体系；所述的dapk2扩增体系包括：dapk2 pcr反应液18.8μl、taq酶0.2μl和转化后的dna 1μl；所述dapk2 pcr反应液包括以下浓度的组分：1
×
pcr buffer、0.25mm dntp、0.4μm dapk2正向引物f、0.4μm dapk2反向引物r、0.2μm dapk2探针p、0.4μmβ-actin正向引物f、0.4μmβ-actin反向引物r和0.2μmβ-actin探针p；所述的cadm2扩增体系包括：cadm2 pcr反应液18.8μl、taq酶0.2μl和转化后的dna 1μl；所述cadm2 pcr反应液包括以下浓度的组分：1
×
pcr buffer、0.25mm dntp、0.4μm cadm2正向引物f、0.4μm cadm2反向引物r、0.2μm cadm2探针p、0.4μmβ-actin正向引物f、0.4μmβ-actin反向引物r和0.2μmβ-actin探针p。
18.优选的：所述步骤s3中pcr扩增反应的具体条件为，先在95℃反应5min；然后分别在95℃反应10s和60℃反应30s且循环40次，所述在反应条件为60℃30s的过程中采集荧光。
19.本发明同现有技术相比，其优点在于：
20.1.本发明所选dapk2基因和cadm2基因与宫颈癌进程密切相关，每个靶基因的检测探针均针对核心调控区域的多个cpg位点，相对与单个碱基的检测减少了碱基变化的随机性；
21.2.本发明还提供了一种用于宫颈癌甲基化检测的引物和探针组合，本发明采用的探针具有高敏感性和高特异性的优势，可准确稳定的检测出低至浓度1ng/μl，6.67％甲基化率；并且所述探针具有单碱基分辨率，可特异区分甲基化和未甲基化的dna；
22.3.本发明所述试剂盒使用管家基因β-actin作为内参基因对样本进行质量控制，考虑到管家基因自身可能的甲基化情况，在设计内参引物探针时没有选择cpg岛的区域，保证管家基因β-actin可满足对样本质量进行控制的要求。而且，因为宫颈癌的发生是个多诱因多步骤的过程，宫颈癌的进展过程中不同个体所述2个基因的甲基化程度有明显差异，本发明采用两基因联合检测，对样本进行综合评价，相对于单基因检测具有更高的敏感性和特异性。此外，本发明所述试剂盒的整个检测流程可在2h内完成。其操作简单、快速、灵敏的
特点适用于临床检测；
23.4.本发明可特异性的检出高级别宫颈上皮内瘤变及以上病变样本，当dapk2或cadm2任一基因甲基化检测结果为阳性，提示该样本有高级别宫颈上皮内瘤变及以上病变的风险。本发明引物探针组合检测高级别宫颈上皮内瘤变及以上病变的敏感性为73.24％，特异性为77.05％，准确度为75.21％。
附图说明
24.图1为典型宫颈癌脱落细胞样本甲基化pcr扩增曲线；
25.图2为典型正常宫颈脱落细胞样本甲基化pcr扩增曲线。
具体实施方式
26.实施例1
27.本发明中，所述引物和探针组合是根据ncbi(美国国立生物技术信息中心)公开的人类全基因组序列，使用methyl primer press v1.0及primer premier5.0软件设计，由上海生工生物工程有限公司合成。
28.本发明中，所述dapk2扩增后的靶基因的核苷酸序列如seq id no：10所示，具体为:
29.gggcgtttcgagtttcgtttcgggtagtcgggcgcgtttttagtcggcgtttgggacggggttggtcgtttcgttttttcggtttttaggttgttcggcgggcgggtgtcgggcgttttgggaggagaggattgtagggtcgag
30.所述cadm2扩增后的靶基因的核苷酸序列如seq id no：11所示，具体为：
31.cgttgtcgtttttgttgtcgtcgattcgagttcgcgggttcgaatatcgtagcggtggggacggtgggttcggcgggcgtcgggaggaggatattagcggagttttgtattttcgtgtttcgtttattagtatttatttgttttttcgttttttttttagttttttagagaagggattatgatttggaaacg
32.本发明中，所述dapk2探针p和cadm2探针p的5’端优选的采用fam标记作为发光基团；dapk2探针p和cadm2探针p的3’端优选的采用bhq1标记作为淬灭基团。
33.本发明还提供了一种用于宫颈癌甲基化检测的试剂盒，所述试剂盒包括上述方案所述的引物和探针组合、βactin正向引物f、βactin反向引物r和βactin探针p；所述βactin正向引物f、βactin反向引物r和βactin探针p的核苷酸序列如seq id no：7～seq id no：9所示，具体如下：βactin正向引物f：tggtgatggaggaggtttagtaagt；βactin反向引物r：aaccaataaaacctactcctcccttaa；βactin探针p：accaccacccaacacacaataaca；
34.本发明中，所述βactin探针p的5’端采用vic标记作为发光基团；所述βactin探针p的3’端优选的采用bhq1标记作为淬灭基团。
35.本发明中，所述试剂盒还包括10
×
pcr buffer，taq酶、dntps、无核酸酶水、阳性对照和阴性对照；所述阳性对照优选的包括来自宫颈癌细胞株hela的dna(其中dapk2基因和cadm2基因的甲基化率100％)；所述阴性对照优选的包括来自宫颈癌细胞株c33a的dna，其中dapk2基因和cadm2基因的甲基化率0％。
36.本发明中，所述无核酸酶水、10
×
pcr buffer、taq酶和dntps优选的购自于宝生物(大连)有限公司；所述的酶优选为hs taq酶。
37.本发明还提供了上述方案所述试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
38.s1.提取待测样本dna；
39.s2.将所述待检样本dna经重亚硫酸盐转化处理，得转化后dna；
40.s3.以所述转化后dna为模板，利用如权利1～4所述引物和探针组合进行pcr扩增反应，得到荧光检测结果；
41.s4.所述荧光检测结果，其中fam的阈值设置为8000，vic的阈值设置为12000；
42.s5.利用所述荧光检测结果，对待检样本进行判定；当βactin ct≤34，根据dapk2、cadm2基因与β-actin的
△
ct值判定各基因结果；dapk2基因
△
ct＞5则dapk2基因为阴性，dapk2基因
△
ct≤5则dapk2基因为阳性；cadm2基因
△
ct＞8则cadm2基因为阴性，cadm2基因
△
ct≤8则cadm2基因为阳性；dapk2与cadm2任一基因为阳性，则判定该样本为宫颈癌甲基化阳性，dapk2与cadm2基因同时检测为阴性，则判定该样本为宫颈癌甲基化阴性；当βactin ct＞34，则判定样本不足或有抑制物存在，pcr反应无效，需重复实验或采样；所述δct＝fam ct-vic ct。
43.本发明首先提取待检样本dna；所述待测样本包括宫颈脱落细胞、组织样本、ffpe(福尔马林固定石蜡包埋组织)；所述待测样本优选的来自于浙江普陀医院病理科；本发明对所述提取待检样本dna的方法没有特殊限制，采用本领域常规方法即可，本发明具体实施过程中优选的采用爱思进生物技术(杭州)有限公司的基因组dna抽提试剂盒进行提取。
44.在得到待检样本dna后，本发明将所述待检样本dna经重亚硫酸盐转化处理，得到转化后的dna；本发明对将所述待检样本dna经重亚硫酸盐转化处理的方法没有特殊限制，采用本领域常规方法即可，本发明具体实施过程中优选的采用zymo research提供的ez dna methylation tm kits转化试剂盒进行处理。
45.得到转化后的dna后，本发明以所述转化后的dna为模板，利用上述方案所述的引物和探针组合进行pcr扩增反应，得到荧光检测结果；所述pcr扩增反应使用的反应体系包括dapk2扩增体系cadm2扩增体系。
46.所述的dapk2扩增体系包括：dapk2 pcr反应液18.8μl、taq酶0.2μl和转化后的dna 1μl；所述dapk2 pcr反应液包括以下浓度的组分：1
×
pcr buffer、0.25mm dntp、0.4μm dapk2正向引物f、0.4μm dapk2反向引物r、0.2μm pax1探针p、0.4μmβ-actin正向引物f、0.4μmβ-actin反向引物r和0.2μmβ-actin探针p。
47.所述的cadm2扩增体系包括：cadm2 pcr反应液18.8μl、taq酶0.2μl和转化后的dna 1μl；所述cadm2 pcr反应液包括以下浓度的组分：1
×
pcr buffer、0.25mm dntp、0.4μm cadm2正向引物f、0.4μm cadm2反向引物r、0.2μm pax1探针p、0.4μmβ-actin正向引物f、0.4μmβ-actin反向引物r和0.2μmβ-actin探针p。
48.本发明pcr扩增反应的具体条件为，先在95℃反应5min；然后分别在95℃反应10s和60℃反应30s且循环40次，所述在反应条件为60℃30s的过程中采集荧光。
49.得到荧光检测结果后，本发明根据所述荧光检测结果，对待检样本进行判定，当βactin ct≤34，根据dapk2、cadm2基因与β-actin的
△
ct值判定各基因结果。当dapk2基因
△
ct＞5则dapk2基因为阴性，dapk2基因
△
ct≤5则dapk2基因为阳性；cadm2基因
△
ct＞8则cadm2基因为阴性，cadm2基因
△
ct≤8则cadm2基因为阳性；dapk2与cadm2任一基因为阳性，则判定该样本为宫颈癌甲基化阳性，dapk2与cadm2基因同时检测为阴性，则判定该样本为宫颈癌甲基化阴性；当βactin ct＞34，则判定样本不足或有抑制物存在，pcr反应无效，需
buffer到ct conversion reagent中。在室温下溶解并且震荡10min，充分混匀。未用完的转化反应液请于-20℃保存，保存不超过一周。
76.表1亚硫酸盐转化体系
77.成分体积待转化dna1-20μl(500ng-2μg dna)转化反应液130μlrnase-free water补足150μl总150μl
78.2.亚硫酸盐转化运行程序，见表2
79.表2亚硫酸盐转化运行程序
80.反应温度时间98℃10min64℃2.5h4℃≤20h
81.3.亚硫酸盐转化后dna的纯化
82.1)取纯化柱加入600μl m-binding buffer，再将转化产物转移至纯化柱中，颠倒混匀数次；
83.2)10000rpm离心30s，弃废液；
84.3)加200μl wash buffer，10000rpm离心30s，弃废液；
85.4)加入200μl desulphonation buffer，室温静置15min，10000rpm离心30s，弃废液；
86.5)加200μl wash buffer，10000rpm离心30s，弃废液；
87.6)重复步骤5)；
88.7)将纯化柱插入到一新的ep管中，加入20μl elution buffer，室温静置1min；
89.8)10000rpm离心1min收集流出液即为已转化的dna溶液，保存于-20℃。
90.四、pcr流程
91.1、使用的pcr仪器为abi 7500,反应体系为20μl；
92.2、pcr反应体系配制及条件见如下表3和表4所示：
93.表3反应体系
[0094][0095][0096]
表4 pcr反应条件
[0097]
[0098]
五、结果分析
[0099]
阈值fam的阈值为8000，vic的阈值为12000，δct＝fam ct-vic ct。
[0100]
试剂盒检测结果满足质控要求，根据检测结果对样本进行判断。当βactin ct≤34，根据dapk2、cadm2基因与β-actin的
△
ct值判定各基因结果；dapk2基因
△
ct＞5则dapk2基因为阴性，dapk2基因
△
ct≤5则dapk2基因为阳性；cadm2基因
△
ct＞8则cadm2基因为阴性，cadm2基因
△
ct≤8则cadm2基因为阳性；dapk2与cadm2任一基因为阳性，则判定该样本为宫颈癌甲基化阳性，dapk2与cadm2基因同时检测为阴性，则判定该样本为宫颈癌甲基化阴性；当βactin ct＞34，则判定样本不足或有抑制物存在，pcr反应无效，需重复实验或采样。
[0101]
表5结果判读
[0102][0103][0104]
所有测试宫颈脱落细胞样本中vic ct值均≤34，各基因扩增曲线呈s型，且有明显指数增长期，结果可信；典型宫颈癌脱落细胞扩增曲线和典型正常人群宫颈脱落细胞样本扩增曲线分别见图1和图2；对试剂盒性能的统计分析显示该试剂盒检测宫颈癌及高级别上皮内瘤变的敏感性为73.24％，特异性为77.05％，准确度为75.21％。
[0105]
表6检测性能分析
[0106]
[0107]
以上所述，仅为此发明的具体实施方式，但本发明的保护范围不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案和新型的构思加于等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种用于宫颈癌甲基化检测的引物和探针组合，其特征在于，所述引物和探针用于检测dapk2、cadm2的基因组合；所述引物和探针组合包括dapk2正向引物f、dapk2反向引物r、dapk2探针p、cadm2正向引物f、cadm2反向引物r和cadm2探针p；所述dapk2正向引物f、dapk2反向引物r、dapk2探针p、cadm2正向引物f、cadm2反向引物r和cadm2探针p的核苷酸序列分别如seq id no：1～seq id no：6所示。2.如权利要求1所述的一种用于宫颈癌甲基化检测的引物和探针组合，其特征在于，所述dapk2探针p和cadm2探针p的5’端采用fam标记；所述dapk2探针p和cadm2探针p的3’端采用bhq1标记。3.一种用于宫颈癌甲基化检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1或2所述的引物和探针组合、β﹣actin正向引物f、β﹣actin反向引物r和β﹣actin探针p；所述β﹣actin正向引物f、β﹣actin反向引物r和β﹣actin探针p的核苷酸序列如seq id no：7～seq id no：9所示。4.如权利3所述一种用于宫颈癌甲基化检测的试剂盒，其特征在于，所述β﹣actin探针p的5’端采用vic标记；所述β﹣actin探针p的3’端采用bhq1标记。5.如权利要求3所述的一种用于宫颈癌甲基化检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括10
×
pcr buffer、taq酶、dntps、无核酸酶水、阳性对照和阴性对照。6.如权利要求5所述的一种用于宫颈癌甲基化检测的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照包括来自宫颈癌细胞株hela的dna；所述阴性对照包括来自宫颈癌细胞株c33a的dna。7.一种如权利要求3～6任一所述试剂盒的检测方法，其特征在于，方法包括以下步骤：s1.提取待测样本dna；s2.将所述待检样本dna经重亚硫酸盐转化处理，得转化后dna；s3.以所述转化后dna为模板，利用如权利1～4所述引物和探针组合进行pcr扩增反应，得到荧光检测结果；s4.所述荧光检测结果，其中fam的阈值设置为8000，vic的阈值设置为12000；s5.利用所述荧光检测结果，对待检样本进行判定；当βactin ct≤34，根据dapk2、cadm2基因与β-actin的
△
ct值判定各基因结果；dapk2基因
△
ct＞5则dapk2基因为阴性，dapk2基因
△
ct≤5则dapk2基因为阳性；cadm2基因
△
ct＞8则cadm2基因为阴性，cadm2基因
△
ct≤8则cadm2基因为阳性；dapk2与cadm2任一基因为阳性，则判定该样本为宫颈癌甲基化阳性，dapk2与cadm2基因同时检测为阴性，则判定该样本为宫颈癌甲基化阴性；当βactin ct＞34，则判定样本不足或有抑制物存在，pcr反应无效，需重复实验或采样；所述δct＝fam ct-vic ct。8.如权利要求7所述的一种检测方法，其特征在于所述步骤s3中pcr扩增反应使用的反应体系包括dapk2扩增体系和cadm2扩增体系；所述的dapk2扩增体系包括：dapk2 pcr反应液18.8μl、taq酶0.2μl和转化后的dna 1μl；所述dapk2 pcr反应液包括以下浓度的组分：1
×
pcr buffer、0.25mm dntp、0.4μm dapk2正向引物f、0.4μm dapk2反向引物r、0.2μm dapk2探针p、0.4μmβ-actin正向引物f、0.4μmβ-actin反向引物r和0.2μmβ-actin探针p；所述的cadm2扩增体系包括：cadm2 pcr反应液18.8μl、taq酶0.2μl和转化后的dna 1μl；所述cadm2 pcr反应液包括以下浓度的组分：1
×
pcr buffer、0.25mm dntp、0.4μm cadm2正向引物f、0.4μm cadm2反向引物r、0.2μm cadm2探针p、0.4μmβ-actin正向引物f、0.4μmβ-actin
反向引物r和0.2μmβ-actin探针p。9.如权利要求7所述的一种检测方法，其特征在于，所述步骤s3中pcr扩增反应的具体条件为，先在95℃反应5min；然后分别在95℃反应10s和60℃反应30s且循环40次，所述在反应条件为60℃30s的过程中采集荧光。

技术总结
本发明涉及一种用于宫颈癌甲基化检测的引物和探针组合、试剂盒及其使用方法。所述引物和探针用于检测DAPK2和CADM2基因组合；所述引物探针组合包括DAPK2正向引物F、DAPK2反向引物R、DAPK2探针P、CADM2正向引物F、CADM2反向引物R、CADM2探针P；它们的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：6所示。本发明采用的引物探针组合具有高敏感性和高特异性的优势，可准确稳定的检测低至浓度1ng/μL样本，6.67％甲基化率；并且所述探针具有单碱基分辨率，可特异区分甲基化和未甲基化的DNA。可特异区分甲基化和未甲基化的DNA。可特异区分甲基化和未甲基化的DNA。


技术研发人员：张腾 宋文文 罗卫峰 王荣
受保护的技术使用者：浙江自贸区锐赛生物医药科技有限公司
技术研发日：2022.11.11
技术公布日：2023/7/11