紫草酸在制备治疗糖尿病溃疡药物中的应用的制作方法

1.本发明属于糖尿病溃疡药物技术领域，尤其涉及紫草酸在制备治疗糖尿病溃疡药物中的应用。


背景技术：

2.糖尿病溃疡是糖尿病的一种严重并发症，多发于患者脚部，因此又称为糖尿病足。糖尿病足作为糖尿病常见的难治性慢性并发症之一，发病率高达25％，其中15％以上的患者随时面临截肢甚至死亡的风险。糖尿病溃疡的治疗需要多学科协作，在调整好血糖、血脂、血压的基础上，治疗需遵从以下几个原则：抗感染、适时血运重建、减压以减少溃疡部位的创伤、处理创面以促进愈合。然而即使采取了清创、敷料、减压、抗感染和调控血糖等标准治疗措施，经过20周治疗后，糖尿病溃疡的治愈率仅能达到31％。因此，寻找一种高效、简便的糖尿病溃疡治疗方法是临床亟待解决的关键问题。
3.丹参为唇形科植物丹参的干燥根和根茎，具有活血化瘀、凉血消肿、清心除烦等功效。紫草酸是丹参的主要有效成分，近年来有研究表明在痛风大鼠模型中，紫草酸具有抗炎、抑制尿酸形成的作用。紫草酸在川芎、当归、藏红花等中药材中广泛存在，提取方便，价格较低。目前本领域尚未有紫草酸与糖尿病溃疡治疗有何相关性的有关报道，而且开发治疗糖尿病溃疡的新药具有重要意义。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明的目的在于提供紫草酸在制备治疗糖尿病溃疡药物中的应用，紫草酸在治疗糖尿病溃疡方面具有显著的疗效。
5.为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
6.本发明提供了紫草酸在制备治疗糖尿病溃疡药物中的应用。
7.优选的，所述紫草酸通过促进糖尿病溃疡创面愈合与再上皮化发挥作用。
8.优选的，所述紫草酸通过促进人角质形成细胞的增殖和迁移发挥作用。
9.优选的，所述紫草酸通过抑制糖尿病溃疡创面中炎症因子的表达发挥作用。
10.优选的，所述炎症因子包括il-6和il-1β。
11.本发明还提供了一种治疗糖尿病溃疡的药物，所述药物以紫草酸作为唯一活性成分。
12.优选的，所述药物为外用制剂。
13.本发明的有益效果：
14.本发明首次提出中药单体紫草酸具有治疗糖尿病溃疡的作用，且取得了显著的治疗效果，为今后临床开发高效策略治疗糖尿病溃疡提供了依据。
15.本发明采用小鼠糖尿病溃疡模型和人角质形成细胞系hacat，研究紫草酸在小鼠、体外细胞上对糖尿病溃疡愈合指标、炎症指标表达情况的作用效果，为制备治疗糖尿病溃疡的药物提供重要的实验依据。
附图说明
16.图1为紫草酸对糖尿病溃疡小鼠伤口愈合情况的影响，其中a图为伤口愈合拍照结果及伤口愈合率计算结果，b图为he染色结果；
17.图2为紫草酸对hacat细胞增殖、迁移的影响，其中a图为cck-8实验结果，b图为划痕实验结果；
18.图3为紫草酸对hacat细胞中炎症因子il-6、il-1βmrna表达的影响。
具体实施方式
19.本发明提供了紫草酸在制备治疗糖尿病溃疡药物中的应用。
20.在本发明中，所述紫草酸的化学结构式为：
[0021][0022]
分子式为c
27h22o12
。
[0023]
本发明对于紫草酸的具体来源没有特殊限定，可自行提取制备获得，也可经市售购买获得。在本发明中，所述紫草酸优选的通过促进糖尿病溃疡创面愈合与再上皮化发挥作用，更优选的通过促进人角质形成细胞的增殖和迁移发挥作用。在本发明中，所述紫草酸还通过抑制糖尿病溃疡创面中炎症因子的表达发挥作用，所述炎症因子优选的包括il-6和il-1β。
[0024]
本发明还提供了一种治疗糖尿病溃疡的药物，所述药物以紫草酸作为唯一活性成分。
[0025]
在本发明中，所述药物优选的为外用制剂，所述药物优选的还包括外用制剂常用的辅料。本发明对于外用制剂常用的辅料种类以及具体来源没有特殊限定，采用本领域外用制剂常见辅料即可。
[0026]
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
[0027]
下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。
[0028]
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0029]
实施例1
[0030]
紫草酸对糖尿病溃疡小鼠伤口愈合情况的影响
[0031]
1.动物：c57/bl雄性小鼠(6-7周龄)，体重22～24g。
[0032]
动物模型：糖尿病组小鼠被喂食高脂肪饮食，持续4周。除正常对照组(4只小鼠)外，所有小鼠均隔天注射链脲霉素(stz)，且4小时后饮用5％葡萄糖溶液。7天后测量血糖水平，如果血糖浓度高于300.6mg dl-1
，且监测糖尿病小鼠具有多尿、多食、多饮的症状，则认为糖尿病模型构建成功。体重减轻超过20％或运动能力差的小鼠被排除在外。成功建立的12只糖尿病小鼠随机分为糖尿病组、糖尿病紫草酸治疗组和糖尿病阳性治疗组。溃疡模型造模前异氟醚麻醉小鼠，随后从背部取下4cm
×
4cm的毛发，用打孔器制作4个6mm宽、2mm深
的圆形伤口，实验在无菌条件下进行。
[0033]
2.分组及治疗：
[0034]
(1)正常组(control)：进行溃疡造模，不采用任何药物治疗；(2)糖尿病组(stz)：进行溃疡造模，不采用任何药物治疗；(3)糖尿病紫草酸治疗组(stz+la)：将紫草酸单体溶解于乙醇溶液中，浓度为50μg/ml，以50μl/只/天的用量湿敷小鼠溃疡处，连续9日；(4)糖尿病阳性治疗组(stz+rb-bfgf)：将浓度为200ng/ml的贝复济(rb-bfgf)以50μl/只/天的用量局部外用于小鼠溃疡处，连续9日。
[0035]
3.实验方法：
[0036]
(1)伤口愈合分析
[0037]
宏观观察：分别于给药治疗后的第1、3、5、7、9天进行拍照，使用image-j软件处理拍照图片计算创面溃疡面积，采用以下公式计算伤口闭合情况：
[0038]
伤口愈合率(％)＝(1-治疗伤口宽度/对照伤口宽度)
×
100，其中对照伤口宽度为day0造模时的伤口宽度。
[0039]
(2)组织学苏木精-伊红染色(he染色)
[0040]
诱导后第5、9天处死小鼠，取皮肤标本放入4％中性甲醛缓冲液中固定24h。常规组织学检查，石蜡包埋，切片，he染色。在数字切片扫描仪下观察切片。
[0041]
4.实验结果
[0042]
紫草酸可以改善糖尿病溃疡小鼠伤口愈合
[0043]
采用伤口愈合分析以及he染色观察紫草酸在体内对糖尿病溃疡伤口愈合的影响，结果如图1所示，由图1a可以看出，与糖尿病阳性治疗组相比，糖尿病紫草酸治疗组在伤后第5、7、9天有更显著的伤口愈合效果。he染色结果(图1b)显示第5、9天糖尿病紫草酸治疗组伤口显著缩小，且效果优于糖尿病阳性治疗组。该结果表明stz诱导的糖尿病小鼠创面愈合减慢，紫草酸干预可有效促进糖尿病创面愈合与再上皮化，且较阳性对照贝复济疗效更显著。
[0044]
实施例2
[0045]
体外应用紫草酸对hacat细胞增殖、迁移的影响
[0046]
1.细胞模型：人角质形成细胞系hacat。细胞培养在dmem-高糖，含10％胎牛血清和1％链霉素-青霉素溶液中，在37℃下恒温培养。
[0047]
2.分组：
[0048]
(1)正常组(nc)；(2)紫草酸治疗组(la)：用浓度为5μg/ml的紫草酸(la)干预hacat细胞；(3)阳性对照组(bfgf)：用浓度为20ng/ml的阳性对照药物碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)干预hacat细胞。
[0049]
3.实验方法：
[0050]
(1)细胞计数试剂盒-8(cck-8)检测
[0051]
cck-8根据制造商的说明用于评估hacat细胞的增殖。简单地说，细胞以2000个细胞/100μl的密度接种于96孔板，分三次接种，在指定的时间点加入cck-8溶液检测450nm处的吸光度。将吸光度值归一化，与对照细胞的吸光度值一致。3个独立实验的数据作为平均标准差。
[0052]
(2)划痕实验
[0053]
把消化收集到的对数生长期的细胞稀释后以细胞密度为5
×
105每个孔加到6孔板中，每个实验组做3个重复孔，等细胞在显微镜下被观察到呈单层贴壁生长时，用提前消过毒的200μl枪头和直尺在6孔板上方垂直划痕，之后用pbs多次清洗尽量洗干净划下来悬浮着的细胞；接着分别加入紫草酸及碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)处理，放入5％co2(37℃，相对湿度95％)培养箱内培养，分别在0h、6h、12h、24h后置于显微镜下拍照。通过image-j软件计算细胞迁移面积，分析各组划痕面积修复率。公式如下：
[0054]
划痕面积修复率＝(0h划痕面积-划痕面积)/0h划痕面积
×
100％
[0055]
4.实验结果：
[0056]
紫草酸促进hacat细胞增殖、迁移
[0057]
cck-8结果显示紫草酸组细胞在48h、72h增殖能力显著高于正常组和阳性对照组(图2a)。划痕实验显示在紫草酸治疗12h、24h显著增强了hacat细胞的迁移能力(图2b)。以上结果表明紫草酸可有效促进hacat细胞的增殖、迁移能力，且其效果优于bfgf。
[0058]
实施例3
[0059]
体外应用紫草酸对hacat细胞中炎症因子il-6、il-1βmrna表达的影响
[0060]
1.细胞模型：人角质形成细胞系hacat。
[0061]
2.分组：
[0062]
(1)正常组(nc)；(2)疾病组(mgo)：甲基乙二醛(mgo)干预hacat细胞，诱导糖尿病溃疡体外炎症模型；(3)紫草酸治疗组(mgo+la)：在疾病组的基础上用5μg/ml的la治疗；(4)阳性对照组(mgo+bfgf)：在疾病组的基础上用20ng/ml的阳性对照药物bfgf治疗。
[0063]
3.实验方法：
[0064]
实时定量聚合酶链反应(qpcr)
[0065]
使用标准的trizol方案从hacat细胞中提取总rna。再采用反转录试剂(takara primescript rt master mix(perfect real time)rr036a)将rna反转录为cdna。接着选择tb green premix ex taq ii(tli rnaseh plus)，code no.rr820a进行real time pcr反应，反应结束后收集数据，用2-δδct
方法对相关定量数据进行分析，并将差异倍数与空白对照以rna的表达水平来表示。
[0066]
引物的详细信息如下表1所示：
[0067]
表1引物序列
[0068][0069]
4.实验结果
[0070]
紫草酸抑制hacat细胞中炎症因子il-6、il-1βmrna表达
[0071]
本实施例采用mgo干预hacat细胞，诱导糖尿病溃疡体外炎症模型，结果表明炎症
因子il-6、il-1βmrna表达升高，而紫草酸可显著降低mgo诱导的炎症浸润，效果较bfgf显著(图3)。
[0072]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.紫草酸在制备治疗糖尿病溃疡药物中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述紫草酸通过促进糖尿病溃疡创面愈合与再上皮化发挥作用。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述紫草酸通过促进人角质形成细胞的增殖和迁移发挥作用。4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述紫草酸通过抑制糖尿病溃疡创面中炎症因子的表达发挥作用。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述炎症因子包括il-6和il-1β。6.一种治疗糖尿病溃疡的药物，其特征在于，所述药物以紫草酸作为唯一活性成分。7.根据权利要求6所述的药物，其特征在于，所述药物为外用制剂。

技术总结
本发明提供了紫草酸在制备治疗糖尿病溃疡药物中的应用，属于糖尿病溃疡药物技术领域。本发明首次提出中药单体紫草酸具有治疗糖尿病溃疡的作用，采用小鼠糖尿病溃疡模型和人角质形成细胞系HaCaT，研究紫草酸在小鼠、体外细胞上对糖尿病溃疡愈合指标、炎症指标表达情况的作用效果，结果表明紫草酸对于糖尿病溃疡具有显著的治疗效果，为今后临床开发高效策略治疗糖尿病溃疡以及制备治疗糖尿病溃疡的药物提供重要的依据。物提供重要的依据。物提供重要的依据。


技术研发人员：李斌 罗成 蒯仂 张元元 张豪 李永勇 吴德群 陈启龙 王瑞平 张展
受保护的技术使用者：上海市皮肤病医院
技术研发日：2022.10.11
技术公布日：2023/7/11