基于汉滩和汉城病毒包膜糖蛋白保守区域设计的通用亚单位疫苗及其制备方法和应用

1.本发明涉及疫苗制备方法领域，具体涉及一种基于汉滩和汉城病毒包膜糖蛋白保守区域设计的通用亚单位疫苗及其制备方法和应用。


背景技术：

2.目前，关于汉坦病毒的疫苗，仅在我国和韩国有汉滩病毒(hantaan virus，htnv)和汉城病毒(seoul virus，seov)的全病毒灭活疫苗上市，欧美国家至今尚无临床可用的疫苗，并且该类灭活疫苗诱导机体产生中和抗体的能力较弱，细胞免疫应答欠佳，维持时间短等缺点并存在一定的副作用及安全性隐患。
3.在汉坦病毒新型基因工程疫苗的国内外基础研究中，主要是针对单一病毒型进行设计。在国外，研发汉坦病毒核酸疫苗、病毒载体疫苗等多种形式的备选疫苗方面有显著进展，部分已进入临床i期。在国内，针对htnv的核酸疫苗、病毒样颗粒(vlp)疫苗、亚单位疫苗等方向也取得一定进展。尽管利用汉坦病毒包膜糖蛋白(gn和和gc)作为抗原组分进行设计的研究已取得长足进展，但均是针对htnv、puuv等等单一型别病毒，目的蛋白表达量较低，距离实际应用还有差距。进一步对汉坦病毒进行创新研究，设计、优化、组合有效的保护性抗原，选择合适的表达载体并优化表达系统，以提高目的基因产物刺激机体免疫应答的能力，都值得深入探索。
4.现有肾综合征出血热(hemorrhagic fever with renal syndrome，hfrs)上市疫苗为全病毒灭活疫苗，该类疫苗引起机体的免疫应答偏弱、保护效价偏低，并存在一定副作用及生物安全隐患。在目前新型基因工程疫苗的国内外研究中，主要是针对单一型病毒进行设计，尚无针对多种汉坦病毒设计一种疫苗的相关研究。


技术实现要素：

5.为解决上述技术问题，本发明提供了一种亚单位疫苗及其制备方法和应用，所述亚单位疫苗稳定性好、易于纯化、不含病毒核酸成分，安全性较高，是一种可预防流行的汉坦病毒感染的通用疫苗。
6.本发明的第一个目的提供一种亚单位疫苗的制备方法，包括以下步骤：
7.s1，共有序列设计：根据汉滩病毒和汉城病毒m基因高度同源性优势，运用生物信息学方法，获得1条汉滩病毒包膜糖蛋白共有序列，如seq id no.1所示，获得1条汉城病毒包膜糖蛋白共有序列如seq id no.2所示，然后，结合公共数据库已知汉滩及汉城病毒包膜糖蛋白gn和gc的基因序列信息，去除其中的滞留信号tm，分别提取汉滩病毒和汉城病毒的gn和gc基因序列的共有序列；
8.s2，目的基因重组质粒的构建：以包膜糖蛋白共有序列为模版，引入限制性内切酶酶切位点和c端凝血酶切割位点，以高保真dna聚合酶进行pcr扩增获得产物，然后将产物进行双酶切消化，分别与已酶切的s2细胞表达载体pmt/bip/v5-his-a连接，连接产物转化筛
选获得目的基因重组质粒；
9.s3，目的蛋白的表达、纯化：将重组质粒转染s2细胞，筛选阳性细胞，诱导蛋白表达，将稳定表达重组蛋白的s2细胞系扩大培养，诱导蛋白表达并纯化，获得通用亚单位疫苗。
10.进一步地，s1中，根据ncbi数据库中已发表的166条汉滩病毒包膜糖蛋白序列(1135个氨基酸)和98条汉城病毒包膜糖蛋白序列(1133个氨基酸)，基于序列比对分析结果，以每个位点出现频率大于50％的氨基酸残基作为候选序列。其中，由于汉滩病毒包膜蛋白354位和359位存在高变异率，分别以两位点最保守的氨基酸残基g354(35％同源性)和m359(45％同源性)作为目标序列获得完整的包膜糖蛋白共有序列。
11.进一步地，s2中，转化过程为：将连接产物转化至top10大肠杆菌感受态，通过amp抗性筛选，获得成功构建的重组质粒。
12.进一步地，s3中，转染过程具体为：将包含汉滩病毒或汉城病毒gn头部区、gn膜外区和gc膜外区共有序列的6个重组质粒分别与筛选质粒pcoblast以19:1的质量比混合，通过cacl2转染试剂共转染至果蝇s2细胞中，置于28℃无co2的培养箱孵育。
13.进一步地，s3中，诱导蛋白表达所用试剂为终浓度为10μm的cdcl2。
14.进一步地，s1中，所述的汉滩及汉城病毒包膜糖蛋白gn和gc的基因序列信息均从公共数据库中获取。
15.本发明的第二个目的是提供一种所述的制备方法制备得到的汉坦病毒亚单位疫苗。
16.本发明的第三个目的是提供所述的亚单位疫苗在制备预防汉坦病毒感染的疫苗注射剂中的应用。
17.进一步地，所述疫苗为基因工程疫苗。
18.进一步地，所述疫苗不含病毒核酸成分。
19.与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
20.1、本发明采用htnv和seov m基因共同保守区域序列设计疫苗，获得可预防我国流行的汉坦病毒感染的通用疫苗
21.2、本发明在蛋白序列的设计中，去除htnv及seov胞膜糖蛋白gn和gc基因滞留信号tm，增加蛋白可溶性，提高亚单位蛋白疫苗产量。
22.3、本发明制备得到的亚单位疫苗具有稳定性好、易于纯化的优点，不含病毒核酸成分，安全性较高。
附图说明
23.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
24.图1表示本发明中重组质粒构建与鉴定结果；
25.其中，图a表示免疫原选择与重组蛋白构建策略示意图；图中，目的蛋白n端为s2细胞bip信号肽序列，其c端为凝血酶(thrombin)切割位点和组氨酸标签融合；
26.图b表示酶切前重组质粒pcr扩增胶图；
27.其中，各序号含义如下：1.汉滩病毒gn头部区共有序列(1062bp)；2.汉滩病毒gn膜外区共有序列(1425bp)；3.汉滩病毒gc膜外区共有序列(1347bp)；4.汉城病毒gn头部区共有序列(1062bp)；5.汉城病毒gn膜外区共有序列(1425bp)；6.汉城病毒gc膜外区共有序列(1347bp)
28.图c表示阳性重组质粒双酶切鉴定结果(双酶切后载体片段和目的基因片段)；其中，各序号含义同r图b；
29.图2表示本发明中重组蛋白的western blot检测结果；
30.其中，序号1表示样本为细胞培养上清；序号2表示样本为细胞裂解物；
31.图3表示本发明中重组蛋白的表达纯化；
32.图4表示本发明中小鼠血清中特异性结合抗体检测；
33.其中，图a为htnv gn/gc特异性结合抗体elisa检测结果；
34.图b为seov gn/gc特异性结合抗体elisa检测结果；
35.图5表示本发明中小鼠血清中和抗体结合抗体检测；
36.其中，图a表示假病毒法htnv血清的中和抗体检测结果；
37.图b表示假病毒法seov血清的中和抗体检测结果；
38.图6表示本发明中细胞因子分泌水平的检测；
39.其中，图a表示小鼠脾细胞分泌ifn-γ水平检测结果；
40.图b表示小鼠脾细胞分泌il-4水平检测结果。
具体实施方式
41.下面对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明各实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
42.实施例1
43.基于汉滩和汉城病毒包膜糖蛋白保守区域设计的通用亚单位疫苗制备方法和应用
44.1、汉滩病毒和汉城病毒包膜糖蛋白共有序列设计
45.根据ncbi数据库中已发表的166条汉滩病毒包膜糖蛋白序列(1135个氨基酸)和98条汉城病毒包膜糖蛋白序列(1133个氨基酸)，基于序列比对分析结果，以每个位点出现频率大于50％的氨基酸残基作为候选序列，分别获得1条汉滩病毒包膜糖蛋白共有序列(如seq id no.1所示)和1条汉城病毒包膜糖蛋白共有序列(如seq id no.2所示)。其中，由于汉滩病毒包膜蛋白354位和359位存在高变异率，分别以两位点最保守的氨基酸残基g354(35％同源性)和m359(45％同源性)作为目标序列获得完整的包膜糖蛋白共有序列。
46.seq id no.1：
47.mgiwkwlvmaslvwpvltlrnvydmkiecphtvsfgensvigyvelppmpladtaqmvpesscsmdnhqslntitkytqvswrgkadqsqssqnsfetvstevdlkgtcvlkhkmveesyrsrksitcydlscnstyckptlymiv
pihacnmmksclialgpyrvqvvyertycmtgvliegkcfvpdqsvvsiikhgifdiasvhivcffvavkgntykifeqvkksfestcndtenkvqgyyicivggnsapiyvptlddfrsmeaftgifrsphgedhdlageeiasysivgpanakvphsassdtlsliaysgipsysslsiltssteakhvfspglfpklnhtncdkgaiplmwtgmidlpgyyeaihpctvfcvlsgpgasceafseggifnitspmclvskqnrfrlteqqvnfvcqrvdvdivvycngqrkviltktlvigqciytitslfsllpgvahsiavelcvpgfhgwataallvtfcfgwvlipaitfiiltilkfianifhtsnqenrlksvlrkikeefektkgsmvcdvckyecetykelkahgvscpqsqcpycfthcepteaafqahykvcqvthrfrddlkktvtpqnftpgcyrtlnlfryksrcyiftmwifllvlesilwaasasetpltpvwndnahgvgsvpmhtdleldfsltssskytyrrkltnpleeaqsidlhieieeqtigvdvhalghwfdgrlnlktsfhcygactkyeypwhtakchyerdyqyetswgcnpsdcpgvgtgctacglyldqlkpvgsaykiitirysrrvcvqfgeenlckiidmndcfvsrhvkvciigtvskfsqgdtllffgpleggglifkhwctstcqfgdpgdimsprdkgflcpefpgsfrkkcnfattpiceydgnmvsgykkvmatidsfqsfntstmhftderiewkdpdgmlrdhinilvtkdidfdnlgenpckiglqtssiegawgsgvgftltclvsltecptfltsikacdkaicygaesvtltrgqntvkvsgkgghsgstfkcchgedcsqiglhaaaphldkvngiseienskvyddgapqcgikcwfvksgewisgifsgnwivlivlcvfllfslvllsilcpvrkhkks
48.seq id no.2：
49.mwsllllaalvgqgfalknvfdmriqcphsvnfgetsvsgytelpplslqeaeqlvpesscnmdnhqslstinkltkviwrkkanqesanqnsfevvesevsfkglcmlkhrmveesyrnrrsvicydlacnstfckptvymivpihacnmmkscliglgpyriqvvyertycttgiltegkcfvpdkavvsalkrgmyaiasieticffihqkgntykivtaitsamgskcnntdtkvqgyyiciiggnsapvyapagedframevfsgiitsphgedhdlpgeeiatyqisgqieakiphtvssknlkltafagipsysstsilaasedgrfifspglfpnlnqsvcdnnalpliwrglidltgyyeavhpcnvfcvlsgpgasceafseggifnitspmclvskqnrfraaeqqisfvcqrvdmdiivycngqkktiltktlvigqciytitslfsllpgvahsiaielcvpgfhgwataallitfcfgwvlipactlaillvlkffanilhtsnqenrfkailrkikeefektkgsmvceickyecetlkelkahnlscvqgecpycfthceptetaiqahykvcqathrfredlkktvtpqnigpgcyrtlnlfryksrcyiltmwtllliiesilwaasaaeiplvplwtdnahgvgsvpmhtdleldfslpssskytykrhltnpvndqqsvslhieiesqgigadvhhlghwydarlnlktsfhcygactkyqypwhtakchfekdyeyenswacnppdcpgvgtgctacglyldqlkpvgtafkiisvrysrkvcvqfgeeylcktidmndcfvtrhakiciigtvskfsqgdtllflgpmegggiifkhwctstchfgdpgdvmgpkdkpficpefpgqfrkkcnfattpvceydgniisgykkvlatidsfqsfntsnihftderiewrdpdgmlrdhiniviskdidfenlaenpckvglqaaniegawgsgvgftltcqvsltecptfltsikacdmaicygaesvtlsrgqntvkitgkgghsgssfkcchgkecsstglqasaphldkvngiselenekvyddgapecgitcwfkksgewvmgiingnwvvlivlcvlllfslillsilcpvrkhkks
50.2、目的基因重组质粒的构建
51.根据果蝇s2细胞密码子偏嗜性优化并合成2条共有包膜糖蛋白序列，并以其作为模版，根据gn头部区(1062bp)、gn膜外区(1425bp)和gc膜外区(1347bp)片段序列及载体多克隆位点，分别设计特异性引物(具体引物对见表1)，引入限制性内切酶酶切位点和c端凝血酶(thrombin)切割位点(图1，图a)，以高保真dna聚合酶进行pcr扩增6段目的基因片段。扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳分析，pcr产物清晰可见，片段长度与预期大小一致(图1，图b)。纯化后的pcr产物通过限制性内切酶xba i和bgl ii进行双酶切消化，分别与已酶切的s2细胞表达载体pmt/bip/v5-his-a经t4连接酶16℃连接4小时，连接产物转化至top10大肠杆菌感受态，通过amp抗性筛选，分别挑选3-5个菌落作为候选阳性克隆，培养12小时后提取质粒用以双酶切验证。酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳分析显示，阳性克隆酶切后目的片段
和载体片段条带清晰且单一，大小与预期值相符(图1，图c)，进一步测序结果表明阳性重组质粒与相应共有序列100％同源。成功构建的重组质粒，其目的基因片段n端为s2细胞bip信号肽序列，辅助胞内表达的目的蛋白分泌到胞外；目的基因片段c端包含凝血酶切割位点和组氨酸标签序列，用以蛋白表达检测和纯化(图1，图a)。
52.表1 htnv和seov包膜糖蛋白特异性引物对
[0053][0054][0055]
3、目的蛋白的表达
[0056]
将包含汉滩病毒或汉城病毒gn头部区、gn膜外区和gc膜外区共有序列的6个重组质粒分别与筛选质粒pcoblast以19:1的质量比混合，通过cacl2转染试剂共转染至果蝇s2细胞中，置于28℃无co2的培养箱孵育。16小时后彻底洗涤细胞并换以新鲜完全培养基继续培养4天，后续加入25μg/ml blasticidin筛选阳性细胞，在筛选压力存在的条件下进行细胞传代和放大培养。将处于对数生长期的筛选后细胞更换为无血清培养基培养，同时加入终浓度为10μm的cdcl2诱导目的蛋白的表达。在诱导表达后4天，分别收取细胞和细胞培养上清，通过western blot依次经抗组氨酸一抗和碱性磷酸酯酶(ap)标记二抗孵育，并经bcip/nbt底物反应显色检测目的蛋白表达和分泌水平。
[0057]
western blot分析结果显示(图2)，在诱导后4天，汉滩病毒gn头部区(43.1kda)、gc膜外区(53.8kda)和汉城病毒gn头部区(43.1kda)、gc膜外区(53.8kda)共4种蛋白均在细胞内有效表达，并大量分泌到细胞外，蛋白条带大小与预期相符；其中，汉滩病毒gn头部区重组蛋白能够检测到2条胞内表达条带，可能是由于目的蛋白在细胞内存在不同程度的翻译后修饰。此外，汉滩病毒和汉城病毒的gn膜外区蛋白(56.3kda)均未能检测到明显的细胞内表达。
[0058]
4、目的蛋白的纯化与定量
[0059]
将构建好的稳定表达重组蛋白的s2细胞系分别转入旋转培养瓶扩大培养，在无血清培养基中加入10μg/ml blasticidin维持筛选压力。当细胞浓度到达1
×
10^7cells/ml时，加入终浓度为10μm的cdcl2诱导蛋白表达，在28℃培养箱悬浮培养6天后，通过离心收取细胞上清，经过滤浓缩后得到蛋白浓缩上清。在蛋白浓缩上清中加入镍鳌合琼脂糖(ni-nta agarose)，4℃旋转结合4小时后，通过蛋白柱除去未被结合的蛋白。后经洗脱，三轮pbs透析，纯化出带有组氨酸标签的目的重组蛋白(即通用亚单位疫苗)。将纯化后的蛋白进行sds-page跑胶和浓度测量，检验蛋白的产量及纯度。
[0060]
sds-page结果显示(图3)，汉滩病毒和汉城病毒的gn头部区蛋白和gc膜外区蛋白
共4种蛋白均已显示单一条带。
[0061]
5、免疫小鼠
[0062]
将30只6～8周龄的成年雌性balb/c小鼠随机分为8组，每组5只。分别免疫汉滩htnv-gn、汉滩htnv-gc、汉城seov-gn、汉城seov-gc、hfrs灭活病毒疫苗(vaccine)、以及生理盐水(pbs),免疫佐剂为铝佐剂。对各组小鼠，在第0周采用两点皮下注射方式，进行初次免疫，注射量为100μl/只。在第3周进行第二次免疫，第6周进行第三次免疫，共免疫3次，并且每次的免疫条件相同。在免疫前及第1、2、3次免疫后1周，对各组小鼠进行眼眶静脉采血。
[0063]
6、血清中特异性结合抗体的检测
[0064]
用亚单位疫苗gn或gc分别包被96孔聚苯乙烯微板，15ng/孔，4℃过夜。pbst洗涤5次，加入含1％bsa的pbst缓冲液，200μl/孔，37℃孵育1h。pbst洗涤5次，加入倍比稀释的各组小鼠血清，50μl/孔，37℃孵育1h，pbst洗涤5次，加入1:5000稀释的hrp标记羊抗小鼠igg，50μl/孔，37℃孵育1h。pbst洗涤5次，拍干后加入tmb显色液，室温避光静置10min后，加入elisa终止液，50μl/孔。酶标仪读取450nm处吸光度值。
[0065]
htnv gn/gc特异性结合抗体结果显示(图4，图a)：htnv-gn、htnv
‑‑
gc组的特异性结合抗体gmt可达到1：11664、1：27216。hfrs灭活疫苗vaccine组的小鼠血清中检测到的htnv gn/gc特异性抗体水平较低，滴度仅有1：1296和1：1584；seov gn/gc特异性结合抗体结果显示(图4，图b)：seov-gc组的特异性结合抗体gmt最高，可达到1：42768；hfrs灭活疫苗vaccine组的的小鼠血清中检测到的seov gn/gc结合抗体水平明显低于seov-gn、seov-gc组，仅有1：528和1：4464。以上结果表明，无论是htnv还是seov，gn、gc蛋白免疫小鼠后体内均可产生高水平的特异性结合抗体。
[0066]
7、血清中中和抗体的检测
[0067]
取vero e6细胞接种于白色不透明的96孔培养板，2
×
10^5个/ml，100ul/孔，置37℃ co2培养箱中培养24h，将各组小鼠血清置于56℃处理30min，灭活血清中的补体并除菌。将各实验组的小鼠血清用pbs缓冲液做1:10、1:20、1:40、1:80
……
两倍倍比稀释，然后分别与假病毒(vsvδg-luci-htnv-m/vsvδg-luci-seov-m)液按1:1体积混合，同时设立假病毒阳性感染对照(假病毒与上述血清等体积的pbs混匀)，置于37℃孵育1h。吸弃e6细胞96孔板中的培养液，pbs洗涤2次，将假病毒与血清的混合液依次加入孔板中，37℃孵育1h。吸弃96孔板中病毒与血清的混合液，用pbs洗涤2次，加入含有2％fbs的dmem培养液，置于37℃培养箱中培养24h。利用promega双荧光素酶报告基因检测试剂盒，检测各孔的luciferase荧光值。结果判定：计算公式如下：(病毒对照的rla-测试样品中的rla)/病毒对照的rla。血清中和效价定义为50％最大抑制稀释度(id 50)，取该稀释度的倒数为对应的中和抗体滴度，并计算各组小鼠中和抗体的gmt。
[0068]
htnv小鼠免疫血清中和抗体结果显示(图5，图a)：htnv-gn与htnv-gc刺激小鼠产生的中和抗体滴度分别为1：16、1：288。灭活疫苗vaccine组检测到htnv的中和抗体gmt为1：88，与htnv-gc组相比，两者之间滴度相差约3倍；检测seov小鼠免疫血清中和抗体的结果显示(图5，图b)：ov-gc组的中和抗体gmt最高，能达到1：320，其显著高于seov-gn组与灭活疫苗vaccine组。以上结果说明，无论是htnv还是seov，gc蛋白免疫后能有效刺激小鼠生产中和抗体，并且免疫效果明显优于灭活疫苗。
[0069]
8、细胞因子分泌水平的检测
[0070]
将已包被检测抗体的elispot孔板(mabtech)用pbs洗涤4次，加入10％fbs的prmi-1640培养液，200μl/孔，室温封闭2h。将各组小鼠脾细胞，用含10％ fbs的prmi-1640培养液调整浓度至1.5x10^6个/ml，200μl/孔，再各自分别加入htnv-gn蛋白、htnv-gc蛋白、seov-gn蛋白、seov-gc蛋白，以及11条肽段，1μg/孔。同时设置加入相同浓度的cona(1μg/孔)作为阳性对照，加入pbs作为阴性对照、只含培养基的的背景对照，孔板置于37℃ co 2培养箱孵育48h。弃去孔板中液体，pbs洗涤5次，分别加入试剂盒提供的生物素标记抗ifn-γ、il-4单克隆抗体，100ng/孔，室温静置2h。弃去孔板中液体，pbs洗涤5次，加入试剂盒提供的hrp标记抗生物素抗体(1：1000)，室温静置1h。弃去孔板中液体，pbs洗涤5次，加入试剂盒提供的tmb显色液，待孔板底部有斑点形成后(约5-10min)，去离子水冲洗以终止反应，避光待孔板干燥后，elispot检测仪读取每孔斑点数，计算斑点形成细胞数(spot-forming cells，sfc)。
[0071]
小鼠脾细胞分泌的ifn-γ结果显示(图6，图a)：在各自对应的蛋白刺激下，各组小鼠的脾细胞均能分泌出ifn-γ细胞因子，htnv-gn、htnv-gc、seov-gn、htnv-gc、vaccine免疫组小鼠脾细胞分泌ifn-γ显著高于阴性对照(pbs)；小鼠脾细胞分泌的il-4结果(图6，图b)显示：在对应蛋白的刺激下，各组小鼠的脾细胞均能分泌出il-4细胞因子，htnv-gn、htnv-gc、seov-gn、htnv-gc、vaccine免疫组小鼠脾细胞分泌il-4显著高于阴性对照(pbs)；以上结果表明，htnv、seov亚单位疫苗免疫后可有效刺激小鼠脾细胞分泌ifn-γ与il-4细胞因子，但亚单位蛋白疫苗与灭活疫苗在细胞免疫水平上并无显著差异。因此，无论是htnv还是seov，它们的gn、gc蛋白均能在小鼠体内诱导出分泌产生ifn-γ和il-4的t细胞。
[0072]
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
[0073]
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

技术特征：
1.基于汉滩和汉城病毒包膜糖蛋白保守区域设计的通用亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：s1，共有序列设计：根据汉滩病毒和汉城病毒m基因高度同源性优势，运用生物信息学方法，获得1条汉滩病毒包膜糖蛋白共有序列，如seq id no.1所示，获得1条汉城病毒包膜糖蛋白共有序列如seq id no.2所示，然后，结合已知汉滩及汉城病毒包膜糖蛋白gn和gc的基因序列信息，去除其中的滞留信号tm，分别提取汉滩病毒和汉城病毒的gn和gc基因序列的共有序列；s2，目的基因重组质粒的构建：以包膜糖蛋白共有序列为模版，引入限制性内切酶酶切位点和c端凝血酶切割位点，以高保真dna聚合酶进行pcr扩增获得产物，然后将产物进行双酶切消化，分别与已酶切的s2细胞表达载体pmt/bip/v5-his-a连接，连接产物转化筛选获得目的基因重组质粒；s3，目的蛋白的表达、纯化：将重组质粒转染s2细胞，筛选阳性细胞，诱导蛋白表达，将稳定表达重组蛋白的s2细胞系扩大培养，诱导蛋白表达并纯化，获得通用亚单位疫苗。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，s1中，根据ncbi数据库中已发表的166条汉滩病毒包膜糖蛋白序列和98条汉城病毒包膜糖蛋白序列，基于序列比对分析结果，以每个位点出现频率大于50％的氨基酸残基作为候选序列，其中，由于汉滩病毒包膜蛋白354位和359位存在高变异率，分别以两位点最保守的氨基酸残基g354和m359作为目标序列获得完整的包膜糖蛋白共有序列。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，s2中，转化过程为：将连接产物转化至top10大肠杆菌感受态，通过amp抗性筛选，获得成功构建的重组质粒。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，s3中，转染过程具体为：将包含汉滩病毒或汉城病毒gn头部区、gn膜外区和gc膜外区共有序列的6个重组质粒分别与筛选质粒pcoblast以19:1的质量比混合，通过cacl2转染试剂共转染至果蝇s2细胞中，置于28℃无co2的培养箱孵育。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，s3中，诱导蛋白表达所用试剂为终浓度为10μm的cdcl2。6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，s1中，所述的汉滩及汉城病毒包膜糖蛋白gn和gc的基因序列信息均从公共数据库中获取。7.权利要求1-6任一项所述的制备方法制备得到的汉坦病毒亚单位疫苗。8.权利要求7所述的亚单位疫苗在制备预防汉坦病毒感染的疫苗注射剂中的应用。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述疫苗为基因工程疫苗。10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述疫苗不含病毒核酸成分。

技术总结
本发明涉及疫苗制备方法领域，具体公开了基于汉滩和汉城病毒包膜糖蛋白保守区域设计的通用亚单位疫苗及其制备方法和应用，所述亚单位疫苗制备步骤为：分别提取汉滩病毒和汉城病毒M基因序列的共有序列，去除其中的滞留信号，分别表达不同长度的可溶性蛋白。通过在序列C段加HIS标签的方法，进行蛋白纯化，将合成好的基因克隆到表达载体中，转染S2细胞，筛选高表达株；然后批量成产，并通过蛋白携带的HIS标签进行蛋白纯化获得通用亚单位疫苗。本发明制备的亚单位疫苗稳定性好、易于纯化、不含病毒核酸成分，安全性较高，是一种可预防流行的汉坦病毒感染的通用疫苗。汉坦病毒感染的通用疫苗。汉坦病毒感染的通用疫苗。


技术研发人员：刘蓉蓉 吴兴安 束佳熠 吕云华 孙雯洁 刘梓谕 应旗康 侯诗源 王芳
受保护的技术使用者：中国人民解放军空军军医大学
技术研发日：2022.11.07
技术公布日：2023/7/11