核酸递送载体及功能协同的药物组合物应用的制作方法

1.本发明涉及医药技术领域，具体地，涉及一种核酸递送载体及功能协同的药物组合物应用。


背景技术：

2.免疫治疗，尤其是免疫检查点(icb)疗法，目的是激活t细胞，增加t细胞在肿瘤部位的浸润，来增强抗肿瘤免疫反应，该疗法的优点就是激活的免疫反应持续时间长。目前获批的免疫检查点有三种，分别是ctla-4，pd-1和pdl1，其中pd-l1在肿瘤细胞中高表达。pd-1干扰的是t细胞抗原受体介导的信号通路，保护癌细胞免受t细胞攻击；抗pd-l1是消除了对t细胞功能的障碍。以pd-1/pd-l1单抗阻断为代表的癌症免疫治疗在临床上取得的进展使我们大受鼓舞。利用小干扰rna如sipd-l1下调癌细胞膜pd-l1蛋白的表达来敲除pd-1和pd-l1之间的相互作用，从而解除肿瘤细胞对t细胞的抑制。然而冷肿瘤(非免疫原性)的病人对icb疗法响应率低，将“冷”肿瘤转变为“热”肿瘤(增加的t细胞浸润的免疫原性肿瘤)可有效提高对icb治疗的响应率。
3.光动力疗法(pdt)可以诱发产生免疫原性细胞死亡(icd)，释放肿瘤相关抗原(taas)和损伤相关的分子模式(damps)，产生原位疫苗以促进树突状细胞(dc)的成熟，显著增强抗原暴露，启动和激活初始t细胞，从淋巴结通过血液进入肿瘤部位，识别杀伤癌细胞。但是它的治疗效果被致密的肿瘤组织、乏氧的肿瘤微环境严重削弱。近红外一区光敏剂小分子其激发和发射波长在近红外一区，其特点及面临的问题：有限的穿透深度(～1mm)，不能有效地穿透肿瘤深层部位。越来越多近红外二区的光敏剂被设计合成，来加强pdt的抗肿瘤功效，一方面，近红外二区光敏剂在nir-ii光刺激下产生具有细胞毒性的活性氧ros；另一方面，垂死的肿瘤细胞释放taas，包括高迁移蛋白b1(hmgb1)，钙网蛋白(crt)，三磷酸腺苷(atp)促进dc成熟，然后被转运到淋巴结中，进而激活t细胞，发挥t细胞介导的抗肿瘤免疫作用，产生全身免疫，抑制肿瘤的转移。总之，由近红外二区光动力治疗诱导的高度特异性肿瘤细胞死亡不会损害机体对肿瘤的免疫力，会激活多克隆肿瘤特异性免疫反应，使“冷”肿瘤向“热”肿瘤转变，激起机体自身的免疫应答。pdt使免疫抵抗性的肿瘤对免疫检查点疗法icb更加敏感，增强肿瘤免疫治疗效果。
4.纳米药物在免疫治疗中具有独特的作用，纳米颗粒通过增强的渗透和滞留效应(epr)在肿瘤内积聚，将药物集中在肿瘤部位。纳米颗粒可以设计为与外部能源相互作用，如光、热、磁，以增强免疫原性细胞死亡，可通过调整纳米颗粒的结构，如表面修饰聚乙二醇(peg)，聚乙烯亚胺(pei)的方法，增强纳米颗粒的稳定性。纳米颗粒可以控制药物释放的动力学，可以通过颗粒化学进行预编程，如二硫键；也可以通过对外部刺激(如光或热)的响应来控制。目前主要的递送平台包括仿生体、脂质体、无载体、无机纳米颗粒以及聚合物纳米颗粒等，而聚合物纳米颗粒因其可修饰性、生物可降解性受到广泛关注。
5.但是，目前鲜有关于肿瘤微环境响应型且可降解的光敏聚合物的研究。


技术实现要素：

6.本发明的目的是为了克服现有技术存在的问题，提供一种核酸递送载体及功能协同的药物组合物应用，该核酸递送载体具有良好的细胞毒性，药物组合物可进行核酸高效递送，实现基因治疗、光动力和免疫治疗的有机协同，有效抑制多种肿瘤细胞的增殖。
7.为了实现上述目的，本发明第一方面提供一种核酸递送载体，该核酸递送载体的结构如式(i)所示，
[0008][0009]
其中，m、n、p各自独立地为3-15的正整数，q为40-120的正整数。
[0010]
本发明第二方面提供一种核酸递送载体的制备方法，包括以下步骤：
[0011]
(1)在反应溶剂i存在的条件下，将式(ii)所示的化合物、2,2-双(溴甲基)-1,3-丙二醇、双(2-羟乙基)二硫化物与l-赖氨酸二异氰酸酯混合进行反应i，再与甲氧基聚乙二醇-羟基混合进行反应ii得到式(iii)所示的反应物p1；
[0012]
(2)在反应溶剂ii存在的条件下，将反应物p1与式(iv)所示的化合物混合进行反应iii，得到式(i)所示的核酸递送载体；
[0013]
[0014][0015]
其中，m、n、p各自独立地为3-15的正整数，q为40-120的正整数。
[0016]
本发明第三方面提供一种功能协同的药物组合物，该药物组合物含有sirna以及前述的核酸递送载体和/或前述的制备方法制得的核酸递送载体。
[0017]
本发明第四方面提供一种制备功能协同的药物组合物的方法，包括以下步骤：将前述的核酸递送载体和/或前述的制备方法制得的核酸递送载体与胶束剂进行混合反应i得到核酸递送载体胶束，将所述核酸递送载体胶束与sirna进行混合反应ii。
[0018]
本发明第五方面提供前述的核酸递送载体、前述的制备方法制得的核酸递送载体、前述的药物组合物和前述的方法制得的药物组合物中的至少一者在制备抗肿瘤药物中的应用。
[0019]
通过上述技术方案，本发明的有益效果为：
[0020]
本发明提供的核酸递送载体属于主链串联nir-ii aza-bodipy的光敏剂，含有肿瘤微环境响应二硫键单体，且其侧链修饰胆固醇阳离子单体使其表面呈正电，在808nm激光照射下能够产生有毒性的活性氧(ros)杀死肿瘤细胞；该核酸递送载体可进行核酸(sirna)高效递送，实现基因治疗、光动力治疗和免疫治疗的有机协同，更重要的是，光动力治疗可诱发产生icd效应，促进dc的成熟，进而招募更多的细胞毒性t淋巴细胞(ctl)，将“冷”肿瘤转化为“热”肿瘤，同时产生全身免疫进一步抑制肿瘤的转移和复发，有效地提高肿瘤对免
疫治疗的敏感性。本发明提供的核酸递送载体通过静电作用吸附sipd-l1，可顺利进入细胞并实现内涵体逃逸进入细胞质中发挥作用，通过抑制pd-l1基因的表达，下调pd-l1蛋白的表达，解除肿瘤细胞对t细胞的“枷锁”，进一步放大pdt诱导的免疫疗法。
[0021]
本发明提供的功能协同的药物组合物在体内外均具有较好的安全性，有效实现荷载核酸的逃逸与释放，具有较高的基因沉默效率，rnai和pdt联合治疗能够有效抑制肿瘤细胞的增殖，在多种肿瘤模型中均表现出良好的治疗效果。
附图说明
[0022]
图1是实施例1中式(i-1)所示的聚合物pdnp的合成路线图；
[0023]
图2是实施例1中式(iii-1)所示的反应物p1的1h nmr图谱；
[0024]
图3是实施例1中式(i-1)所示的聚合物pdnp的1h nmr图谱；
[0025]
图4是实施例4制得的药物组合物pdnp/sinc的结构示意图；
[0026]
图5是实施例5制得的药物组合物pdnp/sinc的粒径和电势图；
[0027]
图6是实施例1制得的pdnp聚合物进行紫外吸收光谱和荧光发射光谱，其中a为紫外吸收光谱，b为荧光发射光谱；
[0028]
图7是实施例4制得的药物组合物pdnp/sinc的凝胶阻滞实验的电泳图；
[0029]
图8是测试例3中采用dpbf探针测定pdnp/sinc在不同光照时间(0-330s)下产生1o2的能力；
[0030]
图9是测试例3中clsm图像评价sinc、lipo/sinc和pdnp/sirna在细胞系ct26产生活性氧能力图，标尺为50μm，l表示光照，光照的条件为：波长808nm，强度1w/cm2，时间3min；
[0031]
图10是测试例4中naked sinc、lipo/sinc和实施例6制得的不同质量比的pdnp/sinc处理后的ct26细胞活力图，a为无光照，b为有光照(光照的条件为：波长808nm，强度1w/cm2，时间3min)；
[0032]
图11是测试例5中药物组合物pdnp/sirna的基因沉默效果评价图，其中，a为采用qrt-pcr检测pdnp/sipd-l1在ct26细胞系的基因的沉默效果图，b为不同处理后4t1-luc细胞的相对荧光素酶活性，l表示光照(光照的条件为：波长808nm，强度1w/cm2，时间3min)；
[0033]
图12是测试例6中药物组合物pdnp/sirna摄取能力的评价图，其中，a为通过流式细胞分选仪获取的pdnp/cy5-sirna复合物的细胞摄取效率，b为对图12a的平均荧光强度和sirna细胞摄取百分比的定量分析图，c为pdnp/cy5-sirna在不同细胞内吞抑制剂处理后的记录细胞摄取，d为流式细胞术定量分析细胞摄取；
[0034]
图13是测试例7中pdnp/sirna复合物内涵体逃逸能力图，其中，a为激光共聚焦图像，b为激光共聚焦的曲线图定量；
[0035]
图14是测试例8中药物组合物pdnp/sirna的免疫原性细胞死亡研究图，其中，a为atp的分泌，b为crt的暴露的流式定量结果，c为crt的共聚焦实验结果，d为hmgb1的释放共聚焦实验结果；
[0036]
图15是测试例9中药物组合物pdnp/sirna在治疗结肠癌模型中的研究图，其中，a为肿瘤治疗示意图和分组信息，6h后肿瘤区域被808nm激光照射，b为治疗期间肿瘤体积生长曲线，c为治疗期间的体重，d为治疗11天后切除肿瘤的相对肿瘤重量，e为治疗11天后的肝/体脏器系数，f为治疗11d后脾/体脏器系数，g为荷瘤小鼠的生存曲线；
[0037]
图16是测试例10中评估药物组合物pdnp/sirna治疗后肿瘤微环境和免疫器官的免疫状态变化图，其中，a为肿瘤中cd80+cd86+t树突状细胞的流式细胞术分析，b为淋巴结中cd80+cd86+t树突状细胞的流式细胞术分析，c为肿瘤中cd3+cd4+t树突状细胞的流式细胞术分析，d为肿瘤中cd3+cd8+t树突状细胞的流式细胞术分析，e为脾脏中cd3+cd4+t树突状细胞的流式细胞术分析，f为脾脏中cd3+cd8+t树突状细胞的流式细胞术分析；
[0038]
图17为测试例11中药物组合物pdnp/sirna的体内安全性评估图；
[0039]
图18为测试例12中药物组合物pdnp/sirna治疗后的体内安全性评估图，balb/c小鼠心、肝、脾、肺、肾的h&e染色，标尺为100μm；
[0040]
图19为测试例13中药物组合物pdnp/sirna在治疗乳腺癌模型中的研究，其中，a为肿瘤治疗示意图和分组信息，b为治疗期间肿瘤体积生长曲线，c为治疗期间各组小鼠体重变化，d为治疗25d后切除肿瘤的重量，e为治疗后解剖的肿瘤质量，f为肿瘤中pd-l1基因的表达，g为肿瘤中pd-l1基因表达的定量，h为治疗后各组小鼠的生化指标；
[0041]
图20为测试例14中药物组合物pdnp/sirna在治疗肝脏pdx肿瘤模型中的研究，其中，a为肿瘤治疗分组信息，b为治疗期间肿瘤体积生长曲线，c为治疗6d后的肿瘤重量，d为荷瘤小鼠的生存曲线，e为治疗后plk1基因表达定量，f为治疗6d后肝/体脏器系数和脾/体脏器系数。
具体实施方式
[0042]
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
[0043]
本发明第一方面提供一种核酸递送载体，该核酸递送载体的结构如式(i)所示，
[0044][0045]
其中，m、n、p各自独立地为3-15的正整数，q为40-120的正整数。
[0046]
本发明提供的如式(i)所示的核酸递送载体属于主链串联nir-ii aza-bodipy(氮杂氟硼二吡咯)的聚合物光敏剂，含有肿瘤微环境响应二硫键单体，且其侧链修饰胆固醇阳离子单体，使得该聚合物的表面带正电，可有效负载sirna；该核酸递送载体的最强吸收波长为830nm，最强发射波长为960nm，具有二区荧光和光动力能力，在808nm激光照射下能够产生有毒性的活性氧ros杀死肿瘤细胞，具有良好的细胞毒性。在应用于负载药物的纳米颗粒时，核酸递送载体的主链上的二硫键在肿瘤微环境高gsh水平下可响应断裂，使得纳米颗粒崩解，释放药物。因此，该核酸递送载体可进行核酸(sirna)高效递送，实现基因治疗、光动力治疗和免疫治疗的有机协同，更重要的是，光动力治疗可诱发产生icd效应，促进dc的成熟，进而招募更多的ctl，将“冷”肿瘤转化为“热”肿瘤，同时产生全身免疫进一步抑制肿瘤的转移和复发，有效地提高肿瘤对免疫治疗的敏感性。
[0047]
根据本发明，优选地，m、n、p均为3，示例性地，核酸递送载体中m、n、p均为3，q为113，其结构式如式(i-1)所示：
[0048][0049]
本发明第二方面提供一种核酸递送载体的制备方法，包括以下步骤：
[0050]
(1)在反应溶剂i存在的条件下，将式(ii)所示的化合物、2,2-双(溴甲基)-1,3-丙二醇、双(2-羟乙基)二硫化物与l-赖氨酸二异氰酸酯混合进行反应i，再与甲氧基聚乙二醇-羟基混合进行反应ii得到式(iii)所示的反应物p1；
[0051]
(2)在反应溶剂ii存在的条件下，将反应物p1与式(iv)所示的化合物混合进行反应iii，得到式(i)所示的核酸递送载体；
[0052]
其中，m、n、p各自独立地为3-15的正整数，q为40-120的正整数。
[0053]
本发明提供的核酸递送载体的制备方法，步骤简单，条件温和，易于操作，有利于对核酸递送载体的生产开发。
[0054]
本发明中，式(ii)所示的化合物、2,2-双(溴甲基)-1,3-丙二醇、双(2-羟乙基)二硫化物、l-赖氨酸二异氰酸酯、甲氧基聚乙二醇-羟基和式(iv)所示的化合物可以分别商购获得，也可以根据现有技术中公开的方法自行制备获得。
[0055]
根据本发明，步骤(1)中各原料的用量可在较宽的范围内选择。优选地，步骤(1)中式(ii)所示的化合物、2,2-双(溴甲基)-1,3-丙二醇、双(2-羟乙基)二硫化物、l-赖氨酸二异氰酸酯与甲氧基聚乙二醇-羟基的重量比为1:0.8-1.2:0.6-0.9:2-2.4:4.5-5.5。发明人发现，在该优选实施方式下，有利于提高式(iii)所示的反应物p1的制备效率，进而提高核酸递送载体的产率。
[0056]
根据本发明，甲氧基聚乙二醇-羟基可以选用常规聚合度的甲氧基聚乙二醇-羟基(mpeg-oh)产品，优选地，甲氧基聚乙二醇-羟基的分子量为2000-5000，例如mpeg
2000-oh、mpeg
5000-oh。
[0057]
根据本发明，在上述式(i)所示的核酸递送载体的制备方法中，反应i的条件可在较宽的范围内选择。优选地，反应i的条件包括：温度为45-55℃，具体可以为45℃、47℃、49
℃、51℃、53℃、55℃，或者上述两个数值之间的任意值；时间为10-15h，具体可以为10h、11h、12h、13h、14h、15h，或者上述两个数值之间的任意值。发明人发现，在该优选实施方式下，有利于提高式(i)所示的核酸递送载体的产率。
[0058]
根据本发明，在上述式(i)所示的核酸递送载体的制备方法中，反应ii的条件可在较宽的范围内选择。优选地，反应ii的条件包括：温度为45-55℃，具体可以为45℃、47℃、49℃、51℃、53℃、55℃，或者上述两个数值之间的任意值；时间为10-15h，具体可以为10h、11h、12h、13h、14h、15h，或者上述两个数值之间的任意值。发明人发现，在该优选实施方式下，有利于提高式(i)所示的核酸递送载体的产率。
[0059]
根据本发明，步骤(2)中各原料的用量可在较宽的范围内选择。优选地，步骤(2)中式(iii)所示的反应物p1与式(iv)所示的化合物的重量比为2.5-3.5:1。发明人发现，在该优选实施方式下，有利于进一步提高式(i)所示的核酸递送载体的荧光效应和细胞毒性。
[0060]
根据本发明，在上述式(i)所示的核酸递送载体的制备方法中，反应iii的条件可在较宽的范围内选择。优选地，反应iii的条件包括：温度为45-55℃，具体可以为45℃、47℃、49℃、51℃、53℃、55℃，或者上述两个数值之间的任意值；时间为10-15h，具体可以为10h、11h、12h、13h、14h、15h，或者上述两个数值之间的任意值。发明人发现，在该优选实施方式下，有利于提高式(i)所示的核酸递送载体的产率。
[0061]
根据本发明，优选地，反应溶剂i和反应溶剂ii分别独立地选自无水n，n-二甲基甲酰胺、无水二氯甲烷、无水四氢呋喃和无水二甲基亚砜中的至少一种。更优选地，反应溶剂i和反应溶剂ii为无水n，n-二甲基甲酰胺。发明人发现，在该优选实施方式下，有利于提高式(i)所示的核酸递送载体制备时的反应效率。
[0062]
根据本发明，可以选用本领域常规的分离方法将反应物p1从反应ii得到的反应液中分离出。优选地，步骤(1)还包括：将反应ii得到的反应液进行透析i得到透析液i，将透析液i进行干燥得到式(iii)所示的反应物p1。示例性地，可以将反应ii得到的反应液与少量水混合后，采用7000mw透析袋截留目标反应物p1。
[0063]
根据本发明，可以选用本领域常规的分离方法将核酸递送载体从反应iii得到的反应液中分离出。优选地，步骤(2)还包括：将反应iii得到的反应液进行透析ii得到透析液ii，将透析液ii进行干燥得到式(i)所示的核酸递送载体。
[0064]
本发明中，干燥可以选用本领域内常规的干燥方法，例如真空冷冻干燥、热风干燥、冷冻干燥等，优选地，透析液i和透析液ii的干燥采用冷冻干燥，具体的冷冻干燥的过程包括：将透析液i或者透析液ii分别在-90℃至-70℃条件下预冷25-35min，再进行冷冻干燥40-60h。
[0065]
本发明第三方面提供一种功能协同的药物组合物，含有sirna以及前述的核酸递送载体和/或前述的制备方法制得的核酸递送载体。
[0066]
本发明所提供的核酸递送载体与sirna形成的药物组合物具有理想的粒径、电势，能够顺利进入细胞并实现内涵体逃逸进入细胞质中发挥作用，通过抑制pd-l1基因的表达，下调pd-l1蛋白的表达，解除肿瘤细胞对t细胞的“枷锁”，进一步放大pdt诱导的免疫疗法；该药物组合物在体内外同时具有较好的安全性，且在长时间下依然保持较高的基因沉默效率，可以有效的抑制肿瘤细胞的增殖，在多种肿瘤模型(ct26结直肠癌、4t1-luc乳腺癌、肝癌患者癌组织异种移植)中均表现出良好的治疗效果。
[0067]
根据本发明，药物组合物中核酸递送载体与sirna的用量可以在较宽的范围内选择。优选地，核酸递送载体与sirna的重量比为10-100:1。发明人发现，在该优选实施方式下，有利于提高药物组合物对肿瘤细胞生长的抑制性能。
[0068]
根据本发明，sirna可以选用本领域内能够负载于胆固醇阳离子上，且具有特异性靶向治疗靶点的rna药物(sirna对)，例如sirna可以为选择性沉默肿瘤细胞高表达的pd-l1蛋白的sipd-l1、特异性靶向plk1蛋白的siplk1或者特异性靶向萤火虫荧光素酶的sifl，的sirna对。优选地，sirna含有完全反向互补的正义链和反义链，正义链和反义链的核苷酸序列分别如seq id no.1和seq id no.2、seq id no.3和seq id no.4以及seq id no.5和seq id no.6中的任意一对所示；
[0069]
sipd-l1正义链(seq id no.1)：5
’‑
agacguaagcaguguugaa-3’；
[0070]
sipd-l1反义链(seq id no.2)：5
’‑
uucaacacugcuuacgucucc-3’；
[0071]
siplk1正义链(seq id no.3)：5
’‑
ugaagaagaucacccuccuuadtdt-3’；
[0072]
siplk1反义链(seq id no.4)：5
’‑
uaaggagggugaucuucuucadtdt-3’；
[0073]
sifl正义链(seq id no.5)：5
’‑
cccuauucuccuucuucgcdtdt-3’；
[0074]
sifl反义链(seq id no.6)：5
’‑
gcgaagaaggagaauagggdtdt-3’；
[0075]
sipd-l1反义链从5’末端开始的19个核苷酸与相应的sipd-l1正义链的19个核苷酸完全反向互补；sipd-l1反义链的3’末端连接有2个额外的核苷酸，从而在sipd-l1反义链互补配对后形成由2个核苷酸构成的3’突出端。
[0076]
本发明第四方面提供一种制备功能协同的药物组合物的方法，其特征在于，包括以下步骤：将前述的核酸递送载体和/或前述的制备方法制得的核酸递送载体与胶束剂进行混合反应i得到核酸递送载体胶束，将核酸递送载体胶束与sirna进行混合反应ii。
[0077]
本发明中，将核酸递送载体形成核酸递送载体胶束后，与sirna通过静电吸附作用结合，以得到药物组合物，制备过程工艺简单、便于操作。
[0078]
根据本发明，优选地，核酸递送载体与sirna的重量比为10-100:1。
[0079]
根据本发明，优选地，所述sirna含有完全反向互补的正义链和反义链，所述正义链和所述反义链的核苷酸序列分别如seq id no.1和seq id no.2、seq id no.3和seq id no.4以及seq id no.5和seq id no.6中的任意一对所示。
[0080]
根据本发明，胶束剂可以选用本领域内能够使得式(i)所示的核酸递送载体形成胶束的胶束剂。优选地，胶束剂为超纯水；相对于1mg核酸递送载体，胶束剂的用量为0.1-0.3ml。发明人发现，在该优选实施方式下，有利于提高对式(i)所示的核酸递送载体的胶束效率，且胶束效果更优。
[0081]
根据本发明，优选地，混合反应i的过程包括：将核酸递送载体溶于溶剂后，滴入胶束剂中，再在温度为5-40℃、转速为80-150rpm的条件下搅拌25-35min得到混合反应液，将混合反应液进行透析iii得到核酸递送载体胶束。发明人发现，在该优选实施方式下，有利于优化对亲水性核酸递送载体形成胶束的效果，进而提高药物组合物的产率。
[0082]
本发明中，核酸递送载体的溶剂可以是本领域内常规能够溶解该核酸递送载体的溶剂，优选地，溶剂选自无水n，n-二甲基甲酰胺、无水二氯甲烷、无水四氢呋喃和无水二甲基亚砜中的至少一种，更优选为n,n-二甲基甲酰胺。
[0083]
根据本发明，混合反应ii的条件可在较宽的范围内选择。优选地，混合反应ii的条
1)所示的反应物p1的1h nmr图谱如图2所示，式(i-1)所示的聚合物pdnp的1h nmr图谱如图3所示。从图2可以看出，反应物p1的1h nmr图谱中出现了式(ii)所示的化合物(峰a)、m-peg
5000
(峰b和c)、双(2-羟乙基)二硫化物(峰d)的特征峰，证实了这些单体成功连接在聚合物链上；从图3可以看出，聚合物pdnp的1h nmr图谱中除了式(ii)所示的化合物(峰a)、m-peg
5000
(峰b和c)、双(2-羟乙基)二硫化物(峰d)的特征峰，还出现了式(iv)所示的化合物(峰e，f和g)的特征峰，证实聚合物pdnp成功合成。
[0115]
[0116][0117]
实施例2
[0118]
(1)准确称取20.75mg式(ii)所示的化合物、16.6mg的2,2-双(溴甲基)-1,3-丙二醇、12.45mg的双(2-羟乙基)二硫化物、41.5mg的l-赖氨酸二异氰酸酯加入到5ml无水n,n-二甲基甲酰胺中，在温度为45℃条件下反应15h，再加入93.4mg的m-peg
5000-oh，继续在温度为45℃条件下反应15h得到反应液i，向反应液i中加入少量水，使用7000mw透析袋截留目标聚合物，透析结束后将透析液i冷冻干燥60h，得到式(iii-1)所示的反应物p1；
[0119]
(2)称取50mg步骤(1)得到的反应物p1、20mg式(iv)所示的化合物加入到5ml无水n,n-二甲基甲酰胺中，在温度为45℃条件下反应15h得到反应液ii，向反应液ii中加入少量水，使用7000mw透析袋截留目标聚合物，透析结束后将透析液ii放进-90℃冰箱预冷25min，然后冷冻干燥60h，得到式(i-1)所示的聚合物pdnp。
[0120]
实施例3
[0121]
(1)准确称取20.75mg式(ii)所示的化合物、24.9mg的2,2-双(溴甲基)-1,3-丙二醇、18.6mg的双(2-羟乙基)二硫化物、49.8mg的l-赖氨酸二异氰酸酯加入到5ml无水n,n-二甲基甲酰胺中，在温度为55℃条件下反应10h，再加入114mg的m-peg
5000-oh，继续在温度为55℃条件下反应10h得到反应液i，向反应液i中加入少量水，使用7000mw透析袋截留目标聚合物，透析结束后将透析液i冷冻干燥40h，得到式(iii-1)所示的反应物p1；
[0122]
(2)称取70mg步骤(1)得到的反应物p1、20mg式(iv)所示的化合物加入到5ml无水n,n-二甲基甲酰胺中，在温度为55℃条件下反应10h得到反应液ii，向反应液ii中加入少量水，使用7000mw透析袋截留目标聚合物，透析结束后将透析液ii放进-70℃冰箱预冷35min，
然后冷冻干燥40h，得到式(i-1)所示的聚合物pdnp。
[0123]
实施例4
[0124]
称取10mg实施例1制得的聚合物pdnp，加入500μl的无水n，n-二甲基甲酰胺溶液，溶解后缓慢滴入到2ml超纯水中，使用磁力搅拌器以转速100rpm旋转30min得到混合反应液，将混合反应液使用7000mw分子量的透析袋进行透析12h，收集透析溶液得到pdnp胶束；将pdnp胶束和sirna(采用sinc)在室温下混合(pdnp聚合物与sirna的重量比分别为0.5:1、1:1、5:1、10:1、20:1、30:1、40:1、50:1、100:1)，静置30min，得到pdnp/sirna药物组合物，简称pdnp/sinc。
[0125]
实施例4制得的药物组合物pdnp/sirna的结构示意图如图4所示。
[0126]
实施例5
[0127]
称取10mg实施例1制得的pdnp聚合物，加入500μl的无水n，n-二甲基甲酰胺溶液，溶解后缓慢滴入到1ml超纯水中，室温下使用磁力搅拌器以转速80rpm旋转35min得到混合反应液，将混合反应液使用7000mw分子量的透析袋进行透析12h，收集透析溶液得到pdnp胶束；将pdnp胶束和sirna(采用sinc)在室温下混合(pdnp聚合物与sirna的重量比分别为0.5:1、1:1、5:1、10:1、20:1、30:1、40:1、50:1、100:1)，静置25min，得到pdnp/sirna药物组合物，简称pdnp/sinc。
[0128]
实施例5制得的纳米复合物pdnp/sirna采用动态光散射仪检测粒径和电势，结果如图5所示，，制得的纳米复合物粒径均一、大小和电势合适，有利于药物的递送。
[0129]
实施例6
[0130]
称取10mg实施例1制得的pdnp聚合物，加入500μl的无水n，n-二甲基甲酰胺溶液，溶解后缓慢滴入到3ml超纯水中，使用磁力搅拌器以转速150rpm旋转25min得到混合反应液，将混合反应液使用7000mw分子量的透析袋进行透析12h，收集透析溶液得到pdnp胶束；将pdnp胶束和sirna(采用sinc)在室温下混合(pdnp聚合物与sirna的重量比分别为0.5:1、1:1、5:1、10:1、20:1、30:1、40:1、50:1、100:1)，静置35min，得到pdnp/sirna药物组合物，简称pdnp/sinc。
[0131]
测试例1
[0132]
将实施例1制得的pdnp聚合物进行紫外吸收光谱和荧光发射光谱分析，结果如图6所示。从图6可以看出，实施例1制得的pdnp聚合物在830nm有强的紫外吸收峰，同时在900-1100nm处有强的宽荧光发射，在960nm有最强荧光发射，这表明pdnp材料的深穿透能力，在光动力治疗中会发挥更强作用。
[0133]
测试例2pdnp/sirna的凝胶阻滞实验和物理特性
[0134]
称取0.8g琼脂糖，加入40ml的tbe缓冲液，在微波炉中高火加热溶解成2重量％琼脂糖凝胶；然后加入4μl的1/10000的super red gel red
tm
(擎科，中国北京)，用玻璃棒轻轻搅拌混匀；倒入模具中，在室温静置30min；待冷却凝固后，取10μl实施例4中制得的pdnp/sinc溶液(颗粒的sirna终浓度为25pmol)，加入2μl上样缓冲液，吹打混匀后加入琼脂糖凝胶上样孔中；用1
×
tbe缓冲液(tris/acetate/edta缓冲液)作为电泳缓冲液，100v下电泳20min，然后通过凝胶成像仪进行成像拍照，以游离sirna(naked sinc)作为对照，结果如图7所示。
[0135]
通过凝胶阻滞实验分析实施例4中pdnp聚合物与sirna为不同重量比时pdnp聚合
物结合负载sirna药物的能力。如图7所示，游离的sirna条带在琼脂糖凝胶上没有受到阻滞，出现了明显的迁移且条带亮度较高，当pdnp聚合物与sirna重量比为10:1，泳道中的sirna条带完全消失，sirna被滞留在凝胶上样孔内，pdnp聚合物将sirna完全组装在纳米颗粒中，sirna与pdnp聚合物完全结合形成稳定的复合物。基于凝胶阻滞结果可知，pdnp聚合物与sirna的重量比为10-100:1时，pdnp聚合物材料已经完全负载sirna。
[0136]
以下测试例中，在无特殊说明的情况下，pdnp/sirna均采用实施例4中以pdnp聚合物与sirna的重量比为50:1时制得的pdnp/sirna复合物进行。
[0137]
测试例3药物组合物产生活性氧能力评价
[0138]
1，3二苯基异苯并呋喃(dpbf)是一种常用的1o2检测指示剂，在420nm有紫外吸收峰，能够快速与1o2进行反应，反应后紫外吸收值减少。因此使用dpbf进行活性氧(ros)检测，具体步骤如下：取10μl母液dpbf溶液，加入0.99ml的dmf，混合均匀后，在超声状态下加入到19ml水中，得到工作液；取3mg实施例4制得的pdnp/sirna(pdnp与sirna的重量比为50:1)，溶解于1ml的dmf中，得到浓度为3mg/ml的pdnp/sirna溶液，取96孔板，加入190μl工作液，再加入10μl的pdnp/sirna溶液，立马用酶标仪检测300-600nm的紫外吸收值，作为0s吸收对照曲线，然后在新的孔中加入190μl工作液和10μl的pdnp/sirna溶液，使用808nm激光器进行照射，强度为1w/cm2，照射10s后进行检测，重复上一步操作，改变光照射时间(0-330s)，记录检测数据，结果如图8所示，图8中从上至下的曲线依次与时间0s、30s、60s、90s、120s、150s、180s、210s、240s、270s、300s、330s对应。
[0139]
利用clsm图像评价游离sirna(sinc组)、lipo/sinc组、实施例4制得的pdnp/sinc(pdnp与sirna的重量比为50:1)以及pdnp/sinc+l组在细胞系ct26产生活性氧能力，使用dcfh-da探针检测，dcfh-da被细胞酯酶水解后可被活性氧氧化为绿色荧光dcf，因此，可以用绿色荧光的强度来表示活性氧的水平。具体步骤如下：将ct26细胞铺在共聚焦显微镜培养皿内，每皿细胞密度为1
×
105/ml，24h后，吸弃原有培养基，加入分别含有pdnp/sinc复合物(实施例4制得，pdnp与sirna的重量比为50:1)、游离sirna(naked sinc)或者lipo/sinc(将sinc利用转染试剂lipofectamine 2000进行转染获得的复合物，作为阳性对照)的opti-mem培养基，于37℃细胞培养箱内继续培养3h；将dcfh-da(10mm)探针使用opti-mem培养基稀释到10μm作为工作液，吸弃掉培养皿中的所有液体，加入上述稀释好的dcfh-da工作液，于37℃细胞培养箱内避光孵育30min，30min后使用opti-mem培养基洗涤细胞2次，使用808nm激光器照射pdnp/sinc+l组，光强强度1w/cm2，光照时间4min，将hoechst 33342染料1：1000稀释后加入培养皿中10min，1
×
pbs缓冲液洗涤3次；使用共聚焦激光扫描显微镜(clsm)观察、记录，结果如图9所示，其中，nuclei为nucleus细胞核图像，merge为合并后图像。
[0140]
图8的结果表明，随着时间的推移，dpbf被pdnp/sinc复合物产生的活性氧氧化，在430nm处的特征峰下降；图9的结果表明，在经过不同组别处理后，pdnp/sinc复合物的绿色荧光明显强于其余各组。以上结果说明pdnp/sinc复合物在光照条件下可有效产生具有细胞毒性的活性氧。
[0141]
测试例4药物组合物的细胞活力和毒性评价
[0142]
使用mtt方法分析pdnp/sirna复合物对ct26细胞的毒性和评价，在光照条件下pdnp/sirna复合物对ct26细胞的杀伤能力。mtt是水溶性的化合物，其可被线粒体膜上的琥
珀酸脱氢酶还原为不溶性的甲瓒，具体步骤如下：将ct26细胞铺在96孔板上，每孔1
×
104个细胞，装有细胞的96孔板在37℃，5体积％co2的培养箱中培养24h，将实施例6制得的不同重量比例的pdnp/sinc复合物、游离sirna(naked sinc)和lipo/sinc(将sinc利用转染试剂lipofectamine 2000进行转染获得的复合物，作为阳性对照)用转染培养基(opti-mem)稀释到相应的体积(每孔100μl总体积)，然后将96孔板中的1640培养液吸弃，换成上述含有pdnp/sinc、naked sinc或者lipo/sinc的opti-mem培养基，转染4h后，每个孔补充100μl1640完全培养基，并继续培养20h，使用1640培养基将配置好的mtt母液(5mg/ml)稀释成100μg/ml的工作液，将96孔板中的培养液吸弃，加入上述配置好的工作液，放入培养箱中，4h后，吸弃每个孔中的所有液体，加入100μl dmso，在37℃孵育10min，使生成的甲瓒充分溶解，使用酶标仪在波长540和650nm处检测吸光度，结果见图10a。
[0143]
在评价pdnp/sirna复合物对ct26细胞的杀伤能力时，在转染完3h后对细胞进行光照处理，光强强度1w/cm2，光照时间4min，其他各步骤与上述mtt方法一致，结果见图10b。
[0144]
图10a表明在pdnp与sinc的重量比为50:1时，pdnp/sinc对肿瘤细胞仍无明显毒性；图10b表明pdnp/sinc复合物在光照的条件下对ct26细胞显示出强烈的细胞毒性，且呈剂量依赖关系。以上结果说明pdnp/sinc复合物本身并不具备杀伤肿瘤细胞的效果，生物安全性较好，在光动力激活后可产生活性氧来杀伤肿瘤细胞。
[0145]
测试例5药物组合物的基因沉默效果评价
[0146]
评价pdnp/sirna复合物介导的细胞pd-l1基因沉默效率，首先参照实施例4的方法，将sirna采用sipd-l1，以pdnp与sirna的重量比为50:1制得pdnp/sipd-l1复合物，将pdnp/sipd-l1、游离sirna(naked sipd-l1)和lipo/sipd-l1(将sipd-l1利用转染试剂lipofectamine 2000进行转染获得的复合物，作为阳性对照)分别按照测试例4中的方法进行ct26细胞系培养后，形成naked sipd-l1组、lipo/sipd-l1组、pdnp/sipd-l1组和pdnp/sipd-l1+l组，提取各组的总rna，使用nanodrop测定rna浓度；使用快速逆转录试剂盒合成cdna，配制gdna去除反应体系，模板mrna 1μg/管，在42℃下加热3min；然后配制逆转录反应体系，加入到gdna去除反应体系中，在42℃下加热15min，继续在95℃加热3min进行逆转录；qpcr：用superreal荧光定量预混试剂盒配制反应体系，设置反应程序为95℃，15min；95℃，3s；60℃，20s；循环40次，进行qpcr反应，以gapdh为内参，对靶基因pd-l1 mrna的相对含量进行检测。
[0147]
通过qrt-pcr检测pdnp/sipd-l1在ct26细胞系基因的沉默效果，结果如图11a所示。图11a表明，相比mock组来说，pdnp/sipd-l1能有效抑制/调节pd-l1的mrna的表达水平，pdnp/sipd-l1组的pd-l1 mrna表达较mock对照组下降60％。
[0148]
为了评价pdnp/sirna复合物在细胞水平介导靶基因的表达抑制的能力，考察不同处理后4t1-luc细胞的相对荧光素酶活性。采用针对荧光素酶luciferase的sirna(sifl)与实施例1制得的pdnp聚合物按照实施例4所述的方法(pdnp与sirna的重量比为50:1)进行复合形成pdnp/sifl，并将sifl利用转染试剂lipo 2000进行转染获得的复合物lipo/sifl，作为阳性对照；参照实施例4的方法进行细胞培养，铺板24h后，每孔转染含1μg sifl的pdnp/sifl或lipo/sifl(体系为25μlopti-mem)，每个考察样本设置三个复孔，转染后4h，每孔补加2ml新鲜的完全培养基dmem，继续培养，转染后24h，吸弃所有培养基，用预冷好的1xpbs轻洗细胞，然后吸弃pbs，每孔加入100μl 1x细胞裂解液，并在室温下震荡20min以使细胞充分
裂解，将细胞裂解液(已含裂解好的细胞)对应地分别转移至lml离心管，在室温下，以12000rpm离心30s，吸取5μl上清液至检测板中，检测板每孔加入50ul底物，使用用酶标仪检测，结果见图11b。相比mock来讲，pdnp/sipd-l1能够显著抑制/调节luciferase的mrna的表达水平。与商业化的脂质阳性lipo载体相比，mrna的表达水平类似，表明pdnp/sipd-l1可充当合适的载体用于降低mrna的表达水平。
[0149]
测试例6药物组合物的细胞胞吞及胞吞机制研究
[0150]
采用测试例4中的方法进行ct26细胞培养，采用cy5标记的sirna(cy5-sirna)与实施例1制得的pdnp聚合物按照实施例4所述的方法(pdnp与sirna的重量比为50:1)进行复合形成pdnp/sirna，并将cy5-sirna利用转染试剂lipofectamine 2000进行转染获得的复合物lipo/sirna，作为阳性对照，转染3h后，对pdnp/sirna组进行808nm光照/不光照处理，转染4h后，用流式细胞仪检测细胞摄取情况，结果如图12a-12b所示。如图12a和图12b所示，随着时间的延长，pdnp/sirna复合物的平均荧光强度和吞噬率逐渐增加，证明了其具有时间依赖性；pdnp/sirna复合物在经过4h的转染的平均荧光强度和吞噬率略弱于商业化试剂lipo2000，这可能是由于脂质化合物更容易进入细胞膜导致的。
[0151]
参照测试例4中的方法进行ct26细胞培养，采用多种抑制剂来阻断细胞内化通路，包括氯丙嗪(chlorpromazine，阻断网格蛋白介导的内吞作用)，阿米洛利(amiloride，阻断大胞饮作用)和染料木素(genistein，阻断囊泡介导的内吞作用)以期找到pdnp/sirna复合物进入细胞的依赖方式，同时将细胞置于4℃下，阻断细胞依赖能量的内化方式，不同内吞抑制剂预孵育的ct26细胞经过pdnp/sirna复合物处理4h后，采用共聚焦显微镜和流式细胞术检测cy5标记的sirna荧光，结果如图12c-12d所示。图12c-12d的结果与图12a-12b得到的结果类似，37℃时pdnp/sirna复合物的平均荧光强度和吞噬率弱于商业化试剂lipo2000，4℃和genistein表现出最显著的吞噬抑制，表明pdnp/sirna复合物的内吞作用主要是能量依赖型的，通过网格蛋白介导的途径，而使用小窝介导的内吞抑制剂chlorpromazine(cpz)和巨胞饮抑制剂amiloride(amr)证明部分的药物组合物也可通过小窝和巨胞饮作用进入肿瘤细胞发挥作用。
[0152]
测试例7药物组合物内涵体逃逸能力的测试
[0153]
参照测试例4中的方法进行ct26细胞培养，使用cy5标记的sirna定位pdnp/sinc复合物的具体位置，用核染料hoechst 33342染色细胞核，使用lysotracker标记溶酶体，使用激光共聚焦显微镜得到的pdnp/sinc复合物内涵体逃逸能力的测试，结果如图13所示。游离的sinc很难突破生理屏障进入肿瘤细胞中，使用商业化试剂lipo2000可以将sinc递送至肿瘤细胞中，由于肿瘤细胞的异质性和lipo2000的不稳定性，lipo2000在肿瘤细胞中分散不均一，可能导致在溶酶体中的不均匀富集。使用pdnp/sinc复合物用于递送sinc后，由于pdnp载体的稳定性，纳米颗粒在0.5h时就可以明显的观测到cy5的荧光在溶酶体的积累，且两者的荧光曲线分布相似，表明sinc与溶酶体有较强的共定位。在4h，cy5的荧光强度逐渐增强，两者的荧光曲线仍表现处相似的分布。在8h时，cy5的荧光曲线偏离绿色溶酶体的荧光曲线，表明pdnp/sinc复合物从溶酶体逃逸。在8h且外加激光照射时，可以从共聚焦图像中明显的观测到红色荧光从绿色荧光中的偏移，且两者的荧光曲线表现出不同的分布，表明光照可以促进rna从溶酶体中逃逸，这有助于rna在细胞质中发挥作用，进一步突出了材料的优势。
[0154]
测试例8药物组合物的免疫原性细胞死亡研究
[0155]
参照测试例4中的方法进行ct26细胞培养，然后依据萤光素产生萤光需要atp间接检测，具体步骤如下：将atp标准液用检测液稀释到适当的浓度梯度，配置atp检测工作液，每个样品和标准品各100μl，放置在冰上，向检测板里加入100μl atp检测工作液，室温下放置5min；取细胞培养皿中的悬液培养基和标准品各20μl，加入到检测孔中进行检测，结果如图14a所示。
[0156]
参照测试例4中的方法进行ct26细胞培养，对于流式细胞术检测crt暴露，需要先将细胞消化下来，用4体积％的多聚甲醛固定细胞10min，对于hmgb1，需要使用0.5％的trito-100，将细胞通透20min，向培养皿中加入含有1％的bsa的1
×
pbs，在室温下封闭30min，加入含1％bsa的1
×
pbs稀释的抗体，流式细胞术检测细胞膜表面钙网蛋白(crt)暴露，将上述加过抗体的细胞放置于室温4h即可，将培养皿放置于4℃冰箱中，过夜孵育；用1
×
pbs洗涤细胞2-3次，加入crt和高迁移率族蛋白b1(hmgb1)相关的二抗溶液，室温避光孵育1h，对于流式细胞术检测，可直接当天孵育4h一抗后，直接孵育二抗，进行流式检测；而共聚焦检测需要对细胞核染色，加入dapi染料5min，使用1
×
pbs洗涤细胞2-3次，上述操作中，加入二抗后，需进行避光，结果如图14b-14d所示，g1:mock；g2:nakes sipd-l1；g3:lipo/sipd-l1；g4:pdnp/sinc；g5:pdnp/sinc+l；g6:pdnp/sipd-l1；g7:pdnp/sipd-l1+l。。
[0157]
atp，crt，hmgb1作为免疫原性死亡的重要生物标志物。如图14a所示，光照射pdnp/sinc复合物组(pdnp/sinc+l组)atp的胞外分泌量是未处理mock对照组的8.35倍，表明激光照射可以有效的肿瘤细胞发生生理活动促进atp的分泌。如图14b和14c的流式和共聚焦结果所得，可以明显的观测到pdnp/sinc复合物在外加激光照射后绿色钙网蛋白细胞外的暴露，钙网蛋白作为肿瘤细胞“eat me”的信号，可以促进t细胞对肿瘤细胞的吞噬。同时，在免疫原性死亡期间会发生hmgb1从细胞核释放到细胞外。如图14d所示，经过光照射后，细胞核中的红色荧光强度显著下降，从而加速了hmgb1的胞外释放，而在未加光照射的其余组中，细胞核中的荧光强度并无明显变化，说明只有肿瘤细胞产生了活性氧，才能够促进肿瘤细胞的免疫原性死亡。以上结果表明pdnp/sinc复合物可在近红外808nm光照射下下产生活性氧，活性氧可以对肿瘤细胞产生杀伤作用，从未促进肿瘤细胞发生免疫原性死亡，促进crt的表面暴露，hmgb1的释放和atp的分泌。
[0158]
测试例9药物组合物治疗结直肠癌模型中的研究
[0159]
在6-8周的雌/雄性balb/c小鼠的腋下接种小鼠结肠癌细胞ct26约100μl，或者移植3-5mm3的肿瘤块，当肿瘤长至100mm3左右时，将小鼠随机分成5组，g1：pbs组、g2：pdnp/sinc组、g3：pdnp/sinc+l组、g4：pdnp/sipd-l1组、g5：pdnp/sipd-l1+l组。在第1、4d将各组对应的药物瘤内注射到小鼠体内，剂量sirna为0.5mg/kg；6h后，使用808nm激光对肿瘤部位照射3min，1w/cm2，期间，每天记录小鼠体重和肿瘤体积，体积计算公式＝1/2
×
长
×
宽2；当pbs组小鼠的肿瘤体积达到2000mm3时安乐死小鼠，收集小鼠的肿瘤、心、肝、肺、肾、脾和血液，记录小鼠的肿瘤、脾、肝的重量，剩余小鼠留作生存时间观察；取一部分做血细胞分析，将剩余的全血经离心后取上清，做血清生化分析，将上述脏器多聚甲醛固定/oct胶包埋冷冻后进行苏木精/伊红染色分析。
[0160]
图15a为肿瘤治疗示意图和分组信息。给药6h后，光照组的肿瘤区域被808nm激光照射。图15b为治疗期间肿瘤体积生长曲线。g1组由于未加任何抑制，肿瘤生长较快，在14天
时，肿瘤的体积相较于最初增加了40倍。与图10a的细胞实验结果类似，g2组在未加激光照射时，肿瘤生长表现出与g1组相似的生长行为。由于g4组中释放的sipd-l1能够抑制肿瘤细胞中表的的pl-l1，增强t细胞对肿瘤细胞的吞噬，因此g4组的肿瘤生长会受到一定的抑制。相较于g3组，由于光动力过程中产生的活性氧诱导的肿瘤原性死亡以及sipd-l1增强的t细胞对肿瘤细胞的吞噬，两者协同改善了肿瘤微环境的，g5组有效抑制了肿瘤生长。以上结果也从图15d中解剖下来的肿瘤的质量得到了进一步的证实。在整个治疗期间，小鼠的体重并无明显的变化，说明pdnp作为载体的安全性。图15e和15f是对肝和脾称重得到肝/体重比和脾/体重比，可以观测到肝/体重比和脾/体重比并没有明显的变化，进一步说明pdnp的生物安全性以及在外加激光的照射下，不会造成肝脏和脾脏发生应激型免疫反应，对正常机体造成损伤。如图15g生存曲线所示，发现g5治疗组在35天的观测期内，五只小鼠中仅有一只小鼠死亡，而其余各组全部小鼠在35天内相继死亡。
[0161]
测试例10
[0162]
在对小鼠治疗时，采用肿瘤光动力方法和免疫检查点抑制方法，取测试例9中治疗后第6d的小鼠肿瘤、脾、引流淋巴结进行免疫分析。具体步骤如下：取治疗第6d小鼠的肿瘤、脾、引流淋巴结，放置于1
×
pbs缓冲液中，使用剪刀把上述组织剪碎，放置于200目分子筛中研磨，制备单细胞悬液，收集上述各组织的研磨液，300g，离心5min，倒掉上清液，保留底部细胞沉淀，加入1-3ml红细胞裂解液，静置20min；加入两倍裂解液体积的1
×
pbs，使用吸管混合均匀，300g，离心5min，倒掉上清液，保留细胞沉淀，确保红细胞去除干净，若未去除干净，重复操作；加入3-5ml 1
×
pbs缓冲液，转移到新的分子筛，收集过滤单细胞悬液，300g，离心5min；加入含有1％bsa的1
×
pbs 1-3ml，室温下放置在摇床上封闭1h，随后，用各种抗体对细胞进行染色，用于区分免疫细胞群的抗体如下：cd3+、cd4+、cd8-，cd3+、cd4-、cd8+，cd11c+、cd80+、cd86+，室温避光1h，用1
×
pbs缓冲液洗涤细胞2-3次，加入300μl 1
×
pbs缓冲液进行流式细胞仪分析，评估pdnp/sirna复合物治疗后肿瘤微环境和免疫器官的免疫状态变化结果如图16所示。
[0163]
图16a和图16b分别为肿瘤和淋巴结中cd80+cd86+dc细胞的统计结果，在808激光照射后产生的活性氧促进肿瘤免疫死亡，释放的atp、hmgb1以及crt会促进dc细胞的成熟，因此在g5组肿瘤和淋巴结中我们检测到了成熟的dc细胞明显高于其余各组，淋巴结的成熟dc的定量结果还表明sipd-l1也可增强dc细胞的成熟，这可能与免疫原性死亡促进肿瘤微环境的改善进一步增强淋巴结中dc吞噬肿瘤相关抗原有关。图16c和图16e分别为肿瘤和淋巴结中cd3+cd4+t细胞的变化情况，图16d和图16f分别为肿瘤和淋巴结中cd3+cd8+t细胞的变化情况。由于光动力诱导的肿瘤免疫原性死亡和sipd-l1的双重协同作用，g5组中的细胞毒性t淋巴细胞数量明显高于其余各组，因此对肿瘤的杀伤最强，这也从肿瘤生长曲线和解剖下来的肿瘤质量上得到了展现。以上结果表明pdnp/sinc复合物可在光照射下诱导ct26荷瘤小鼠产生全身的免疫应答，结合免疫检查点sipd-l1疗法能够进一步的发达机体的免疫调节作用，发挥抗肿瘤免疫能力。
[0164]
测试例11
[0165]
为评价经过pdnp/sirna复合物治疗后小鼠的恢复正常水平，在参照测试例9中的方法治疗的第11d后，采集荷瘤小鼠的全血进行血液分析，评价pdnp/sirna复合物体内安全系数，结果如图17所示。如图17所示，包括wbc(白细胞计数)、rbc(红细胞计数)、lym(淋巴细
胞比例)、hct(红细胞压积)、mcv(平均红细胞体积)、mch(平均红细胞血红蛋白含量)、mchc(平均红细胞血红蛋白浓度)、rdw-cv(红细胞分布宽度变异系数)等参数。经治疗后的小鼠全血检测发现接受pdnp/sinc复合物外加激光的照射下，小鼠的各项生理指标相较于pbs组无明显变化，进一步说明了其生物安全性，可作为一种优良的rna递送载体而不引起全身的免疫毒性，这可能是由于pdnp在正常生理环境中的惰性以及在肿瘤微环境中的特异性释放。
[0166]
测试例12
[0167]
为评价经过pdnp/sirna复合物治疗后小鼠组织脏器的安全水平，在参照测试例9中的方法治疗的第11d后，采集荷瘤小鼠的心、肝、脾、肺、肾组织做h&e染色分析，pdnp/sirna复合物体内抗肿瘤安全系数评价结果如图18所示。从图18可以看出，小鼠的各项组织脏器未见异常，进一步说明pdnp/sinc复合物优异的生物安全性和作为rna递送载体的潜力。
[0168]
测试例13
[0169]
参照测试例9中的方法，进行pdnp/sirna复合物在治疗复发性乳腺癌模型中的研究，乳腺癌肿瘤细胞为小鼠乳腺癌细胞4t1，实验分为5组，g1：pbs组、g2：pdnp/sinc组、g3：pdnp/sinc+l组、g4：pdnp/sipd-l1组、g5：pdnp/sipd-l1+l组，结果如图19所示。
[0170]
图19a为肿瘤治疗示意图和分组信息。在-7天时对小鼠接种4t1-luc肿瘤细胞，待肿瘤体积达到500mm3，切除肿瘤，并对切除的肿瘤部位进行缝合。在15天和18天注射不同药物并施加光照后，通过活体成像追踪病灶部位荧光并记录肿瘤体积。图19b为在复发模型中肿瘤的体积生长变化，由于4t1肿瘤模型易复发，因此在g1和g2组中发现肿瘤生长不受抑制，而由于g4组sipd-l1可以屏蔽肿瘤细胞表面表达的pd-l1，增强免疫系统对肿瘤的吞噬，肿瘤的复发得到一定程度的缓解。g3组由于光动力过程中产生的活性氧诱导肿瘤细胞发生免疫原性死亡，复发肿瘤的生长受到明显的抑制。g5组在光动力和免疫检查点阻断sipd-l1的双重作用下，几乎无复发的肿瘤发生，证明了光动力联合免疫检查点阻断疗法在肿瘤治疗中的优越性。图19c为不同治疗期间小鼠体重的变化，经过不同治疗后，小鼠体重无明显的变化，并且相较于治疗前体重有一定的上升，这也和之前在ct26抗肿瘤模型中得到的结果类似。图19d为治疗后解剖的肿瘤的质量，得到的结果和图19b的肿瘤生长曲线类似，g5在光动力和rna疗法的双重作用下，几乎检测不到解剖下的肿瘤。图19e为不同治疗后小鼠生存期的测量，在治疗期间，未加激光组在40天内几乎全部死亡，而在加激光照射的g3组和g5组可以观察到显著延长的生存期，这可能与二区光动力疗法较强的穿透深度有关。图19f和图19g分别为治疗后肿瘤pd-l1的表达情况和灰度定量，与预期的结果相似，使用pdnp/sinc复合物携带sipd-l1可以降低肿瘤中表达的pd-l1，这有助于增强光动力对于肿瘤细胞的杀伤能力和敏感性，延长小鼠的存货时间。图19h为治疗后各组生化指标的变化，包括包括alt(谷丙转氨酶)、ast(谷草转氨酶)、ck-mb(肌酸激酶)、urea(尿素氨)等参数。各参数与pbs组相比无明显变化，更接近正常范围，说明手术切除后使用pdnp/sinc复合物来预防肿瘤复发中的重要潜力。
[0171]
测试例14
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参照实施例4的方法，将sirna采用siplk1，以pdnp与sirna的重量比为50:1制得pdnp/siplk1复合物。参照测试例9中的方法，进行pdnp/sirna复合物在治疗pdx患者来源肝
癌模型中的研究，肝癌肿瘤细胞为患者来源的异种移植肝癌细胞，实验分为5组：g1：pbs组、g2：pdnp/sinc组、g3：pdnp/sinc+l组、g4：pdnp/siplk1组、g5：pdnp/siplk1+l组，结果如图20所示。
[0173]
图20a为肿瘤治疗示意图。图20b为治疗期间不同药物治疗后各组肿瘤的生长曲线，由于pdx在裸鼠中生长速度较快，因此将治疗在第六天终止，在治疗期间，每天记录小鼠肿瘤体积。由于光动力和rna干扰疗法的协同作用，g5组肿瘤生长受到明显的抑制，g1组的肿瘤在6天的治疗期间，肿瘤体积高达2000mm3，其余各组肿瘤生长也受到了一定的抑制。图20c为治疗结束后切除的小鼠肿瘤的质量，从定量结果发现由于光动力和rna干扰的协同作用，g5组的肿瘤大小明显弱于其他组。图20d为治疗期间裸鼠生存率的变化，在40天的观察期内，g1，g2，g4组肿瘤在15天左右已经完全死亡，而g3组肿瘤在40天中，仅有1/5的裸鼠存活，g5组表现处明显的存活率，40天的观察期内仅有两只老鼠死亡。图20e为治疗后裸鼠肿瘤中plk1 mrna的表达情况，在光动力和rna干扰的协同作用下，g5组的plk1 mrna表达降低。图20f为治疗过程后各组小鼠肝/体重指数均无显著差异，g5组小鼠脾脏相较于其余各组有明显的降低，这可能与光动力疗法和rna干扰疗法抑制了肿瘤的转移有关。
[0174]
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种核酸递送载体，其特征在于，该核酸递送载体的结构如式(i)所示，式(i)，其中，m、n、p各自独立地为3-15的正整数，q为40-120的正整数。2.一种核酸递送载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)在反应溶剂i存在的条件下，将式(ii)所示的化合物、2,2-双(溴甲基)-1,3-丙二醇、双(2-羟乙基)二硫化物与l-赖氨酸二异氰酸酯混合进行反应i，再与甲氧基聚乙二醇-羟基混合进行反应ii得到式(iii)所示的反应物p1；(2)在反应溶剂ii存在的条件下，将反应物p1与式(iv)所示的化合物混合进行反应iii，得到式(i)所示的核酸递送载体；
其中，m、n、p各自独立地为3-15的正整数，q为40-120的正整数。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述式(ii)所示的化合物、2,2-双(溴甲基)-1,3-丙二醇、双(2-羟乙基)二硫化物、l-赖氨酸二异氰酸酯与甲氧基聚乙二醇-羟基的重量比为1:0.8-1.2:0.6-0.9:2-2.4:4.5-5.5；优选地，所述甲氧基聚乙二醇-羟基的分子量为2000-5000；优选地，所述反应i的条件包括：温度为45-55℃，时间为10-15h；优选地，所述反应ii的条件包括：温度为45-55℃，时间为10-15h。4.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中式(iii)所示的反应物p1与式(iv)所示的化合物的重量比为2.5-3.5:1；优选地，所述反应iii的条件包括：温度为45-55℃，时间为10-15h。5.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于，所述反应溶剂i和所述反应溶剂ii分别独立地选自无水n，n-二甲基甲酰胺、无水二氯甲烷、无水四氢呋喃和无水二甲基亚砜中的至少一种；优选地，所述步骤(1)还包括：将所述反应ii得到的反应液进行透析i得到透析液i，将
所述透析液i进行干燥得到所述式(iii)所示的反应物p1；优选地，所述步骤(2)还包括：将所述反应iii得到的反应液进行透析ii得到透析液ii，将所述透析液ii进行干燥得到所述式(i)所示的核酸递送载体。6.一种功能协同的药物组合物，其特征在于，该药物组合物含有sirna以及根据权利要求1所述的核酸递送载体和/或根据权利要求2至5中任意一项所述的制备方法制得的核酸递送载体。7.根据权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述核酸递送载体与所述sirna的重量比为10-100:1；优选地，所述sirna含有完全反向互补的正义链和反义链，所述正义链和所述反义链的核苷酸序列分别如seq id no.1和seq id no.2、seq id no.3和seq id no.4以及seq id no.5和seq id no.6中的任意一对所示。8.一种制备功能协同的药物组合物的方法，其特征在于，包括以下步骤：将根据权利要求1所述的核酸递送载体和/或根据权利要求2至5中任意一项所述的制备方法制得的核酸递送载体与胶束剂进行混合反应i得到核酸递送载体胶束，将所述核酸递送载体胶束与sirna进行混合反应ii。9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述核酸递送载体与所述sirna的重量比为10-100:1；优选地，所述sirna含有完全反向互补的正义链和反义链，所述正义链和所述反义链的核苷酸序列分别如seq id no.1和seq id no.2、seq id no.3和seq id no.4以及seq id no.5和seq id no.6中的任意一对所示；优选地，所述胶束剂为超纯水；相对于1mg所述核酸递送载体，所述胶束剂的用量为0.1-0.3ml；优选地，所述混合反应i的过程包括：将所述核酸递送载体溶于溶剂后，滴入所述胶束剂中，再在温度为5-40℃、转速为80-150rpm的条件下搅拌25-35min得到混合反应液，将所述混合反应液进行透析iii得到核酸递送载体胶束；优选地，所述混合反应ii的条件包括：温度为5-40℃，时间为25-35min。10.根据权利要求1所述的核酸递送载体、根据权利要求2至5中任意一项所述的制备方法制得的核酸递送载体、根据权利要求6或7所述的药物组合物和根据权利要求8或9所述的方法制得的药物组合物中的至少一者在制备抗肿瘤药物中的应用；优选地，所述肿瘤的类型选自结直肠癌、乳腺癌和肝癌中的至少一种。

技术总结
本发明涉及医药技术领域，公开了一种核酸递送载体及功能协同的药物组合物应用。该载体的结构如式(I)所示，其制备方法包括：在反应溶剂I存在的条件下，将式(II)所示的化合物、2,2-双(溴甲基)-1,3-丙二醇、双(2-羟乙基)二硫化物与L-赖氨酸二异氰酸酯混合进行反应I，再与甲氧基聚乙二醇-羟基混合进行反应II得到反应物P1；在反应溶剂II存在的条件下，将反应物P1与式(IV)所示的化合物混合进行反应III。药物组合物含有siRNA以及核酸递送载体。该载体在光刺激下可有效诱发免疫源性细胞死亡效应，药物组合物具有内涵体逃逸能力，进行核酸高效递送，实现基因治疗、光动力和免疫治疗的有机协同，有效抑制多种肿瘤细胞的增殖。有效抑制多种肿瘤细胞的增殖。有效抑制多种肿瘤细胞的增殖。有效抑制多种肿瘤细胞的增殖。


技术研发人员：黄渊余 张天
受保护的技术使用者：苏州炫景生物科技有限公司
技术研发日：2022.07.21
技术公布日：2023/7/11