一种用于牛结节性皮肤病病毒的荧光定量PCR检测的引物探针组和试剂盒

一种用于牛结节性皮肤病病毒的荧光定量pcr检测的引物探针组和试剂盒
技术领域
1.本发明属于病原微生物检测技术领域，具体涉及一种用于牛结节性皮肤病病毒的荧光定量pcr检测的引物探针组和试剂盒。


背景技术：

2.牛结节性皮肤病(lumpy skin disease，lsd)，又称牛结节疹、牛疙瘩皮肤病，是由牛结节性皮肤病病毒(lumpy skin disease virus，lsdv)引起的一种牛急性、亚急性或慢性传染病，以发烧、浅表淋巴结肿大和皮肤或粘膜上形成多个结节为主要病症。该病可对病畜皮肤造成永久性伤害，通常还会导致产奶量下降，生长发育迟缓，公畜不育以及孕畜流产等症状，对经济生产具有重要的影响。
3.lsdv与绵羊痘病毒(sheeppox virus，sppv)和山羊痘病毒(goatpox virus，gtpv)同属于羊痘病毒属(capripoxvirus，capv)，三者基因组同源性可达97％左右。因此，目前有许多国家使用羊痘疫苗对lsdv进行防控。lsdv主要通过蜱、蝇、蚊等昆虫传播，也可以通过唾液和精液等分泌物传播。目前，我国广泛采用山羊痘弱毒疫苗免疫羊来预防山羊痘和绵羊痘，采用5倍剂量山羊痘弱毒疫苗免疫牛来预防牛结节性皮肤病。但弱毒疫苗的广泛使用存在排毒污染环境的潜在风险，同时动物免疫后短期内可能出现注射部位肿胀、体表浅表结节及发热等局部或全身性反应。因此，实现lsdv病毒快速准确的诊断，对于区分流行毒株感染和弱毒疫苗免疫，从而制定防控策略具有重要指导意义。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种用于牛结节性皮肤病病毒的荧光定量pcr检测的引物探针组和试剂盒。本发明的引物探针组具有较高的敏感性和特异性，能够实现牛结节性皮肤病病毒的高效检测。
5.本发明提供了用于牛结节性皮肤病病毒的荧光定量pcr检测的引物探针组，包括核苷酸序列如seq id no.1所示的lsdv检测正向引物、核苷酸序列如seq id no.2所示的lsdv检测反向引物和核苷酸序列如seq id no.3所示的lsdv检测探针；所述探针的5'端修饰有荧光基团，3’端修饰有猝灭基团。
6.优选的是，所述荧光基团包括羧基荧光素；所述猝灭基团包括mgb。
7.本发明还提供了上述技术方案所述引物探针组在制备用于牛结节性皮肤病病毒的荧光定量pcr检测产品中的应用。
8.本发明还提供了用于牛结节性皮肤病病毒的荧光定量pcr检测的试剂盒，所述试剂盒包括含上述技术方案所述引物探针组的48
×
反应管溶液。
9.优选的是，所述试剂盒还包括qpcr enzyme、阳性对照和阴性对照。
10.本发明还提供了利用上述技术方案所述引物探针组或上述技术方案所述试剂盒的非疾病诊断目的地检测牛结节性皮肤病病毒的taqman-mgb荧光定量pcr方法，包括如下
步骤：配制反应体系；利用上述技术方案所述引物探针组进行荧光定量pcr反应；判定试验是否成立；结果判定。
11.优选的是，每25μl的反应体系包括17.5μl的液体48
×
反应管溶液、2.5μl的qpcr enzyme、5μl的样品或阳性对照或阴性对照。
12.优选的是，所述荧光定量pcr反应的反应条件为：第一阶段：95℃3分钟；第二阶段：95℃15秒、60℃30秒，共45个扩增循环。
13.优选的是，判定试验是否成立的标准包括：阳性对照ct值≤35并出现典型的扩增曲线，阴性对照无ct值并且无扩增曲线，则判为试验成立。
14.优选的是，所述结果判定包括：待检样品ct值≤35并出现典型的扩增曲线，判为阳性；待检样品35＜ct值≤40判定为疑似；待检样品无ct值并且无扩增曲线，判为阴性；对于判定为疑似的样品进行复检，若ct值≤40，则判定为阳性，否则判定为阴性。
15.本发明提供了一种用于牛结节性皮肤病病毒的荧光定量pcr检测的引物探针组。利用本发明所述引物探针组对牛结节性皮肤病病毒进行荧光定量pcr检测，具有以下有益效果：
16.(1)灵敏度高：lsdv核酸的最低检出限可达5copies/μl。
17.(2)特异性好：特异性针对lsdv基因组，产生相应的荧光扩增信号。经验证，对山羊痘病毒(gtpv)、牛疱疹病毒i型(bhv
‑ⅰ
)、牛病毒性腹泻病毒(bvdv)等相关反刍动物疫病病原微生物和健康动物的血液、唾液、皮肤样品，无交叉反应。
18.(3)快速高通量：检测速度快，加入样品后1h左右即可完成整个扩增检测过程，且根据荧光定量pcr仪的检测孔数量，可以一次性实现96～384个样品的同步检测。
19.(4)操作简便：配置好的taqman-mgb荧光定量pcr反应体系，直接加入待检dna。于荧光定量pcr仪中，即可完成整个扩增及结果判定过程，不需要通过琼脂糖凝胶电泳鉴定。
附图说明
20.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
21.图1为本发明提供的引物筛选结果图；
22.图2为本发明提供的扩增lsdv gpcr(orf011)基因部分序列的引物和探针示意图；
23.图3为本发明提供的阳性质粒制备电泳结果图；其中，m：2000 dna marker；1：pgem-t easy空载体对照；2：重组质粒扩增结果；
24.图4为本发明提供的荧光定量pcr阳性对照质粒标准曲线结果图；
25.图5为本发明提供的荧光定量pcr灵敏度试验结果图；
26.图6为本发明提供的荧光定量pcr特异性试验结果图；
27.图7为本发明提供的试剂盒批内重复性试验结果图；
28.图8为本发明提供的试剂盒批间重复性试验结果图；
29.图9为本发明提供的临床样品检测结果图。
具体实施方式
30.本发明提供了用于牛结节性皮肤病病毒的荧光定量pcr检测的引物探针组，包括核苷酸序列如seq id no.1所示的lsdv检测正向引物(f1)：ccaaaccaccatactaagtacaattcca、核苷酸序列如seq id no.2所示的lsdv检测反向引物(r5)：acctagctgtagttcacccagt，和核苷酸序列如seq id no.3所示的lsdv检测探针(p2)：tcaatgccgataagga；所述探针的5'端修饰有荧光基团，3’端修饰有猝灭基团。在本发明中，所述荧光基团优选包括羧基荧光素(fam)；所述猝灭基团优选包括mgb。
31.本发明还提供了上述技术方案所述引物探针组在制备用于牛结节性皮肤病病毒的荧光定量pcr检测产品中的应用。
32.本发明还提供了用于牛结节性皮肤病病毒的荧光定量pcr检测的试剂盒，所述试剂盒包括含上述技术方案所述引物探针组的48
×
反应管溶液。在本发明中，所述试剂盒优选还包括qpcr enzyme、阳性对照和阴性对照。
33.本发明所述48
×
反应管溶液包含引物、探针、dntp和10
×
dna聚合酶缓冲液：引物、探针由上海捷瑞生物工程有限公司合成；dntp(货号:ntp-025-1ml，购自天筛(上海)科技有限公司)；10
×
dna聚合酶缓冲液(货号:18067-017)，无核酸酶水(货号:4387936)购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司)。本发明所述qpcr enzyme为商品化dna聚合酶(货号:pcr-003-1000ku，购自天筛(上海)科技有限公司)。
34.在本发明中，48
×
反应管溶液中各物质的稀释后浓度(即各物质混合前的浓度)、体积添加比例和每管48
×
反应管溶液中各物质的终浓度具体如表1所示。
35.表1 48
×
反应管溶液中各组分配比情况
[0036][0037]
本发明基于taqman-mgb探针的荧光定量pcr方法，以lsdv基因组gpcr(orf011)基因上snp位点差异作为分子标记，设计引物、探针并建立检测方法，通过实时监测标记的荧光信号来实现牛结节性皮肤病病毒的鉴别检测目的。
[0038]
本发明还提供了利用上述技术方案所述引物探针组或上述技术方案所述试剂盒非疾病诊断目的地检测牛结节性皮肤病病毒的taqman-mgb荧光定量pcr方法，优选包括如下步骤：配制反应体系；利用上述技术方案所述引物探针组进行荧光定量pcr反应；判定试验是否成立；结果判定。
[0039]
在本发明中，配制反应体系的过程中，本发明每25μl的反应体系优选包括17.5μl的液体48
×
反应管溶液、2.5μl的qpcr enzyme和5μl的样品或阳性对照或阴性对照。
[0040]
在本发明中，荧光定量pcr反应的反应条件优选为第一阶段：95℃3分钟；第二阶段：95℃15秒、60℃30秒，共45个扩增循环。
[0041]
本发明优选根据以下标准判定试验是否成立：阳性对照ct值≤35并出现典型的扩增曲线，阴性对照无ct值并且无扩增曲线，则判为试验成立。
[0042]
在本发明中，结果的判定优选包括：待检样品ct值≤35并出现典型的扩增曲线，判为阳性；待检样品35＜ct值≤40判定为疑似；待检样品无ct值并且无扩增曲线，判为阴性；对于判定为疑似的样品进行复检，若ct值≤40，则判定为阳性，否则判定为阴性。
[0043]
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种用于牛结节性皮肤病病毒的荧光定量pcr检测的引物探针组和试剂盒进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
[0044]
实施例1
[0045]
引物及探针的筛选与设计
[0046]
首先，申请人根据genbank中收集的lsdv、gtpv、sppv基因组序列gpcr全长序列(genbank登录号：mt992618.1_cds_qoq86131.1_7、mn072619.1_cds_qej78556.1_10、kx683219.1_cds_aoe47587.1_11、af325528.1_cds_aak84972.1_11、mt134042.1_cds_qnn94321.1_9、af409138.1_cds_aan02735.1_11、mk441838.1_cds_qbf55487.1_11、mg972412.1_cds_avr51447.1_11、kx764645.1_cds_aoo78887.1_11、kx764644.1_cds_aoo78729.1_11、kx764643.1_cds_aoo78570.1_11、mn636843.1_cds_qks69261.1_11、mn636842.1_cds_qks69104.1_11、mn636839.1_cds_qks68646.1_11、mn636838.1_cds_qks68489.1_11、mn636841.1_cds_qks68947.1_11、mn636840.1_cds_qks68790.1_11、mt130502.1_cds_qim58693.1_142、mn642592.1_cds_qgm12463.1_11、af409137.1_cds_aan02577.1_11、mh893760.2_cds_azc86011.2_10、mh646674.1_cds_ayv61143.1_8、ky829023.3_cds_aro77318.1_11、kx894508.1_cds_atg80196.1_11、ky702007.1_cds_art89335.1_10、kx576657.1_cds_aoa32970.1_9、mn072624.1_cds_qej79310.1_8、mn072622.1_cds_qej79011.1_8、mn072625.1_cds_qej79460.1_8、mn072623.1_cds_qej79160.1_8、mw020570.1_cds_qok36449.1_8、mn072621.1_cds_qej78861.1_8、mn072620.1_cds_qej78711.1_8、mh381810.1_cds_axa19990.1_8、mn072629.1_cds_qej80053.1_8、kc951854.1_cds_agz95327.1_9、mn072628.1_cds_qej79904.1_8、mn072627.1_cds_qej79757.1_5、mg000156.1_cds_avi09510.1_7、mw020571.1_cds_qok36600.1_9、mn072631.1_cds_qej80351.1_8、mn072630.1_cds_qej80202.1_8、mn072626.1_cds_qej79611.1_9、kt438551.1_cds_aoe46523.1_142、kt438550.1_cds_aoe46373.1_142)，通过比对分析，选择牛结节性皮肤病病毒g-protein-coupled chemokine receptor(gpcr)基因的高度保守区部分序列(7309-7708bp；登录号af359137.1_cds_aan02577.1_11)的作为引物的设计区域，分别设计5对引物探针序列，具体序列如下：
[0047]
表2引物探针设计序列
[0048][0049]
经过灵敏性、特异性及荧光背景信号验证后，选取最小ct引物探针组合(图1)，采用以下方案所示的引物探针组合：
[0050]
lsdv检测正向引物forward：
[0051]
f1:ccaaaccaccatactaagtacaattcca(seq id no:1)
[0052]
lsdv检测反向引物reverse：
[0053]
r5:acctagctgtagttcacccagt(seq id no:2)
[0054]
lsdv检测probe：
[0055]
p2:tcaatgccgataagga(seq id no:3)
[0056]
其中，检测探针lsdvprobe的5'端进行羧基荧光素fam标记。引物及探针位置如图2所示，由上海捷瑞生物工程有限公司合成。
[0057]
实施例2
[0058]
阳性对照的制备
[0059]
(1)阳性质粒的制备
[0060]
将牛结节性皮肤病病毒gpcr基因部分片段插入到pgem-t easy质粒，转化至重组大肠埃希氏菌dh5α株中，构建重组质粒pgem-gpcr。以提取的重组质粒为模板，利用pgem-t easy载体通用引物m13f/m13r，以反应程序94℃，2min；94℃，30s，56℃，30s，72℃，30s，共35
个循环；72℃，10min扩增目的基因，根据载体说明书，载体自连长度为230bp，目的基因片段长度为899bp，产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定，目的条带的大小应1129bp，结果如图3。pcr产物测序结果在ncbi上进行blast分析显示，与genbank中登录的lumpy skin disease virus nw-lwisolateneethlingwarmbaths lw株gpcr基因序列同源性为100％。
[0061]
插入基因序列如下(注：下标“_”部分为产品靶序列)：
[0062]5’‑
catgaactgcaaggttgacaaatcttaacgccatacatccactaaaaacatttaacaaatacaacgatgaaacaaatacagttacactaaatgggagtaaaaacaatactgaacagataacaatcaaaaacaccatctttatggctttcttattctttgtttgtgatgtttttaaagtatttaagattttataataacaatatagcaaaatagttagcggtataatcattccaaatatgtttatttcaaaatttataaataatttccaaatttttgcattatcgttataaaatacatgacaatacgttattccatatactttttttgtttcataaaataacattattggaaaggattcaatagttgagacaatccaaaccaccatactaagtacaattccatatcgttttgtccttatcggcattgattttactgggtgaactacagctaggtatctatcaatactcatcaatgttataaatgacatgctattgtaaaaaccaacaaagtaaaacatagctttaaatttacacaaacaatctcctaaactccattgtttagcgatactatcgtataaattaaaaggaaacaccaacacgaaaattaaatcagacagtgtcaaattaagcaaaaacatatcctgtattgtttttatcttatatttacgaagaacagttaacacaattatatttccaaataatccaagaaagaatatagtcgaatataaagtaatcagtccaaaacttgtagtatccacaccatcatcacaatgtgggatatcgactatgctcacttcataatcatcataatcatcgctataataagttgtattatatgcggttgtataattagatatcgttgttgtattttcataagttgaaggcgttgtaacattattt-3’(seq id no.4)。
[0063]
(2)阳性质粒标准品的制备
[0064]
用分光光度计测定质粒pgem-gpcr的od
260nm
/od
280nm
比值和浓度，重复测定5次，以5次测得拷贝数的算数平均值作为该质粒的拷贝数。利用紫外分光光度计检测已制备的牛结节性皮肤病病毒重组质粒溶液的od
260
值，根据公式换算质粒拷贝数，计算公式如下：
[0065][0066]
经测定，pt-lsdv阳性质粒0d
260
/0d
280
比值为1.95，初始浓度为100.21ng/μl，拷贝数为2.54
×
10
10
copies/μl。对上述质粒进行10倍梯度稀释，测定标准曲线，结果如图4。
[0067]
实施例3
[0068]
灵敏度试验
[0069]
采用实施例l中筛选的引物、探针制备反应体系。为减少试验误差，通过对重组大肠杆菌dh5α/pgem-gpcr生产种子批的活化和培养，提取重组质粒，采用紫外分光亮度法测定重组质粒的浓度，并调整至104拷贝/μl，进行倍比稀释，制备敏感性质控样品，每个样品重复检测3次，具体步骤如下：
[0070]
(1)反应体系配制如表3。
[0071]
表3反应体系
[0072]
反应成分体积/反应48
×
反应管溶液17.5μlqpcr enzyme2.5ul核酸样本5μl
总体积25μl
[0073]
(2)荧光定量pcr反应条件如表4。
[0074]
表4反应条件
[0075][0076]
(3)试验成立条件。阳性对照ct值≤35并出现典型的扩增曲线，阴性对照无ct值并且无扩增曲线，则判为试验成立。
[0077]
(4)结果判定。待检样品ct值≤35并出现典型的扩增曲线，判为阳性；待检样品35＜ct值≤40判定为疑似；待检样品无ct值并且无扩增曲线，判为阴性；对于判定为疑似的样品进行复检，若ct值≤40，则判定为阳性，否则判定为阴性。
[0078]
表5敏感性质控样品检测结果
[0079][0080]
注：“no ct”表示未检出信号。
[0081]
结果如表5和图5(灵敏度质控样品检测3次扩增曲线分别如图5的三个图所示)，104拷贝/μl、103拷贝/μl、102拷贝/μl、101拷贝/μl、5拷贝/μl的检出率为100％，1拷贝/μl的检出2次，因此以5拷贝/μl作为估计检测限。
[0082]
实施例4
[0083]
特异性试验
[0084]
采用实施例l中设计的引物、探针制备反应体系，对特异性质控样品山羊痘病毒(gtpv)、牛疱疹病毒i型(bhv
‑ⅰ
)、牛病毒性腹泻病毒(bvdv)、健康牛组织基因组、pgem-t easy载体进行3次重复检测。具体步骤如下：
[0085]
(1)反应体系配制如表3。
[0086]
(2)荧光定量pcr反应条件如表4。
[0087]
(3)试验成立条件。阳性对照ct值≤35并出现典型的扩增曲线，阴性对照无ct值并且无扩增曲线，则判为试验成立。
[0088]
(4)结果判定。待检样品ct值≤35并出现典型的扩增曲线，判为阳性；待检样品35
＜ct值≤40判定为疑似；待检样品无ct值并且无扩增曲线，判为阴性；对于判定为疑似的样品进行复检，若ct值≤40，则判定为阳性，否则判定为阴性。
[0089]
表6特异性质控样品检测结果
[0090][0091]
注：“no ct”表示未检出信号。
[0092]
结果如表6和图6(特异性质控样品检测3次扩增曲线)，检测结果均为阴性，核酸均未出现扩增信号，表明本发明方法检测相关病毒及健康动物来源样品无交叉反应，具有良好特异性。
[0093]
实施例5
[0094]
重复性试验
[0095]
采用实施例l中设计的引物、探针制备反应体系，分3批次生产150盒检测试剂盒，每批次50盒。采用同批次生产的试剂盒对实施例3和实施例4中制备的敏感性质控样品和特异性质控样品进行5次重复检测，计算批内变异系数(表7，图7)；采用不同批次生产的试剂盒对实施例3和实施例4中制备的敏感性质控样品和特异性质控样品进行3次重复检测，计算批间变异系数(表8，图8)。具体步骤如下：
[0096]
(1)反应体系配制如表3。
[0097]
(2)荧光定量pcr反应条件如表4。
[0098]
(3)试验成立条件。阳性对照ct值≤35并出现典型的扩增曲线，阴性对照无ct值并且无扩增曲线，则判为试验成立。
[0099]
(4)结果判定。待检样品ct值≤35并出现典型的扩增曲线，判为阳性；待检样品35＜ct值≤40判定为疑似；待检样品无ct值并且无扩增曲线，判为阴性；对于判定为疑似的样品进行复检，若ct值≤40，则判定为阳性，否则判定为阴性。
[0100]
结果(表7)显示，103拷贝/μl、102拷贝/μl、101拷贝/μl批内变异系数分别为0.57％、1.10％、1.12％、0.40％，说明该试剂盒的批内重复性良好。
[0101]
表7试剂盒批内重复性试验结果
[0102][0103]
注：“no ct”表示未检出信号。
[0104]
结果(表8)显示样品的批间变异系数分别为0.26％、0.46％、0.83％、0.56％均小于5％，说明本制品的批间重复性良好。
[0105]
表8试剂盒批间重复性试验结果
[0106][0107]
注：“no ct”表示未检出信号。
[0108]
实施例6
[0109]
实际临床样本的检测
[0110]
采用实施例l中设计的引物、探针制备反应体系，对采集自临床疑似感染动物的皮肤结节等类型临床样品进行检测，并对pcr产物进行测序鉴定。临床疑似感染牛结节性皮肤病牛的全血、唾液、皮肤结节、粪便、垫料等样品共计55份，由山东省动物疫病预防与控制中
心采集与提供。
[0111]
表9临床样品信息
[0112][0113]
采用商品化dna提取试剂盒于全自动核酸提取仪上提取核酸，获得的核酸样本于-20℃保存备用。检测具体步骤如下：
[0114]
(1)反应体系配制如表3。
[0115]
(2)荧光定量pcr反应条件如表4。
[0116]
(3)试验成立条件。阳性对照ct值≤35并出现典型的扩增曲线，阴性对照无ct值并且无扩增曲线，则判为试验成立。
[0117]
(4)结果判定。待检样品ct值≤35并出现典型的扩增曲线，判为阳性；待检样品35＜ct值≤40判定为疑似；待检样品无ct值并且无扩增曲线，判为阴性；对于判定为疑似的样品进行复检，若ct值≤40，则判定为阳性，否则判定为阴性。
[0118]
结果如表10和图9，本方法共检测样品阳性9份，阴性46份。将所有检测阳性的pcr产物送上海捷瑞生物工程有限公司测序，结果经blast比对，符合预期。
[0119]
表10临床样本检测结果
[0120]
[0121][0122]
注：“no ct”表示未检出信号。
[0123]
综上，本发明的引物、探针及使用该引物、探针的taqman-mgb荧光定量pcr方法具有较高的敏感性和特异性，且操作简便快速，适用于我国牛结节性皮肤病病毒的检测鉴定。
[0124]
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

技术特征：
1.用于牛结节性皮肤病病毒的荧光定量pcr检测的引物探针组，其特征在于，包括核苷酸序列如seq id no.1所示的lsdv检测正向引物、核苷酸序列如seq id no.2所示的lsdv检测反向引物和核苷酸序列如seq id no.3所示的lsdv检测探针；所述探针的5'端修饰有荧光基团，3’端修饰有猝灭基团。2.根据权利要求1所述的引物探针组，其特征在于，所述荧光基团包括羧基荧光素；所述猝灭基团包括mgb。3.权利要求1或2所述引物探针组在制备用于牛结节性皮肤病病毒的荧光定量pcr检测产品中的应用。4.用于牛结节性皮肤病病毒的荧光定量pcr检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括含权利要求1或2所述引物探针组的48
×
反应管溶液。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括qpcr enzyme、阳性对照和阴性对照。6.利用权利要求1或2所述引物探针组或权利要求4或5所述试剂盒的非疾病诊断目的地检测牛结节性皮肤病病毒的taqman-mgb荧光定量pcr方法，包括如下步骤：配制反应体系；利用权利要求1或2所述引物探针组进行荧光定量pcr反应；判定试验是否成立；结果判定。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，每25μl的反应体系包括17.5μl的液体48
×
反应管溶液、2.5μl的qpcr enzyme和5μl的样品或阳性对照或阴性对照。8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述荧光定量pcr反应的反应条件为：第一阶段：95℃3分钟；第二阶段：95℃15秒、60℃30秒，共45个扩增循环。9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，判定试验是否成立的标准包括：阳性对照ct值≤35并出现典型的扩增曲线，阴性对照无ct值并且无扩增曲线，则判为试验成立。10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述结果判定包括：待检样品ct值≤35并出现典型的扩增曲线，判为阳性；待检样品35＜ct值≤40判定为疑似；待检样品无ct值并且无扩增曲线，判为阴性；对于判定为疑似的样品进行复检，若ct值≤40，则判定为阳性，否则判定为阴性。

技术总结
本发明属于病原微生物检测技术领域，涉及一种用于牛结节性皮肤病病毒的荧光定量PCR检测的引物探针组和试剂盒。本发明提供了用于牛结节性皮肤病病毒的荧光定量PCR检测的引物探针组，包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的LSDV检测正向引物、核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的LSDV检测反向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的LSDV检测探针；所述探针的5'端修饰有荧光基团，3’端修饰有猝灭基团。本发明的引物探针组具有较高的敏感性和特异性，能够实现牛结节性皮肤病病毒的高效检测。实现牛结节性皮肤病病毒的高效检测。实现牛结节性皮肤病病毒的高效检测。


技术研发人员：彭辰 许冠龙 谢士杰 吴文学 崔连新 王爽
受保护的技术使用者：中国农业大学
技术研发日：2022.10.13
技术公布日：2023/7/11