一种用于建立皮肤再生耗竭啮齿动物模型的扩张器及其系统和方法

1.本技术涉及皮肤扩张技术，特别涉及一种用于建立皮肤再生耗竭模型的系统和方法。


背景技术：

2.皮肤缺损的修复是临床外科的最常见问题之一，随着外科技术的发展目前我国的手术量逐年增加，皮肤缺损修复的需求也随之极大增长。目前各类皮肤替代品尚不能重建完整的生理性皮肤，自体皮肤移植仍是临床上最有效的疗法。对于大面积皮肤缺损的主要修复手段，仍是依靠皮肤软组织牵张技术诱导额外的皮肤软组织生长，加以皮片移植和皮瓣转移修复技术为主要手段，是少数临床实用化的人类组织原位再生技术。但对于皮肤软组织牵张术这一优秀的治疗方法，但传统“皮肤牵张技术”的牵张再生多局限在原有皮肤面积的2-4倍，且缺少对相关临床参数的定量标准，手术的成功几乎依靠于整形外科医生的技能和经验。因此，在模式动物中建立表皮扩张再生标准范式，有助于推动皮肤在张力诱导下的有效再生以及皮肤缺损修复技术的发展。
3.皮肤是人体最外层器官。在生理状态下，发育阶段的表皮要不断适应骨骼的体积变化，妊娠期皮肤要适应胚胎发育后的表面积增长，以及肌肉和关节运动时皮肤张力的震荡性变化，均能诱导皮肤实现原位再生。病理状态下，愈伤过程、瘢痕产生、以及大疱性表皮松解征等疾病的发生均与皮肤张力变化密切相关。既往对张力的分子机制研究多集中于对细胞的短期张力刺激反应。体外研究表明，机械应力能够通过拉伸细胞、改变细胞外基质硬度等方式激活细胞机械转导机制感知周围环境变化，同时将机械力形变转化为生物化学信号，最终在细胞核内参与基因转录，调节细胞功能和命运。而对模式动物的张力响应研究，目前多集中于体型较大的大鼠背部进行张力研究。这些研究绝大多数都集中在张力刺激触发皮肤上皮细胞再生响应的早期阶段，而皮肤机械牵张再生极限的成因目前仍是待解之谜。同时，由于大鼠背部皮肤较松软，扩张器移动空间较大，难以固定，并发症发生率更高，故研究空间和效率均较局限。在更成熟的遗传工具且体型较小的小鼠中建立标准化扩张范式，并模拟人类牵张再生极限的形成，会为皮肤牵张再生的理论研究与干预技术开发提供重要基础。。


技术实现要素：

4.本技术的目的在于提供一种用于建立皮肤再生耗竭模型的扩张器及其系统和方法，用于细致定量描述皮肤再生全过程，高度模拟人类皮肤牵张诱导皮肤原位再生全过程，为今后研究张力刺激诱导皮肤原位再生提供全新研究模型，同时为可能的临床干预靶点、增加和改进扩张效率、延缓再生耗竭拐点提供重要的理论依据和实操模型，是具有极大的临床实用价值的技术体系。
5.本技术公开了一种用于建立皮肤再生耗竭啮齿动物模型的扩张器，所述扩张器包
括：扩张囊、注水壶和连接管；其中，
6.所述扩张囊用以植入啮齿动物皮下并注入实验液体扩张，以此耗竭对应位置皮肤的再生能力，所述扩张囊与所述连接管一端相连；所述扩张囊不产生张力的情况下可容纳v0ml的实验液体，预定耗竭终点状态下可容纳v1ml的实验液体，其中，v1为4-6；的值为8-15，所述不产生张力的情况是指所述扩张囊未被过量注入液体，发生膨胀，即未扩张的状态，所述预定耗竭终点状态是指所述扩张囊的体积达到了临界值，即扩张终止状态，该临界值使得所述扩张囊所扩张的皮肤的再生能力达到耗竭；
7.所述连接管两端分别与所述扩张囊与所述注水壶连接；
8.所述注水壶与所述连接管另一端相连，开有注水口，用于接受外部注入的实验液体。
9.在一个优选例中，所述注水壶为圆台状。
10.在一个优选例中，所述注水壶上底面半径为0.5-0.6cm,下底面半径为 0.6-0.7cm，高为0.8-0.9cm。
11.在一个优选例中，所述注水口位于所述注水壶顶部，并且所述注水口设置有止回单向阀。
12.在一个优选例中，所述扩张囊包括一个平坦的底面与一个弧面，注射时，所述弧面优先膨胀，其中，所述地面与弧面定义了整个扩张囊的内腔。
13.在一个优选例中，所述扩张器为一体成型结构。
14.在一个优选例中，所述扩张器整体采用不透水的生物相容性材料。
15.本技术还公开了一种用于判断皮肤再生耗竭的装置所述装置包括：输入装置、处理器和输出装置，其中，
16.所述输入装置用于输入判断再生能力的数值，其中所述数值包括下组：所述扩张器所扩张的皮肤部分的表面积、所述扩张器所扩张的皮肤部分的毛发数量等；
17.所述处理器用于根据所述输入装置获得的数据判断皮肤再生能力是否已经耗竭；
18.所述输出装置用于输出所述处理器中得到的结果。
19.在一个优选例中，所述连接管长度为2-5cm，由非弹性材料构成。
20.本技术还公开了一种用于建立皮肤耗竭模型的系统所述系统包括：
21.扩张器，所述扩张器为前文描述的扩张器；
22.张力检测装置，所述张力检测装置用于测量皮肤的张力；
23.注射部件，所述注射部件包括：注射器。
24.皮肤再生能力耗竭判断装置，所述皮肤再生能力耗竭判断装置为前文描述装置。
25.在一个优选例中，所述系统还包括：面积测量装置，用于检测所述扩张器所扩张的皮肤部分的表面积的变化。
26.在一个优选例中，所述系统还包括：毛发镜，用于观测所述扩张器所扩张的皮肤部分的毛发数量。
27.在一个优选例中，所述注射部件还包括计量瓶，所述计量瓶装有定量的实验液体。
28.本技术还公开了一种用于判断皮肤再生耗竭的装置所述装置包括：输入装置和处理器，其中，
29.所述输入装置用于输入前文描述系统中所获得的数值；
30.所述处理器用于根据所述输入装置获得的数据判断再生能力是否已经耗竭。
31.在一个优选例中，所述扩张器用于制备一种器械，所述器械用于建立再生能力耗竭啮齿动物模型。
32.在一个优选例中，所述扩张器用于制备一种器械，所述器械用于建立再生能力耗竭啮齿动物模型。在一个优选例中，所述扩张器用于制备一种器械，所述器械用于建立再生能力耗竭模型。
33.在一个优选例中，所述的判断再生能力地根据包括：micro-ct三维建模定量、扩展倍率计算、表皮厚度变化、增殖细胞数量变化。
34.在一个优选例中，所述的代表性的细胞增殖标记物或标志包括(但并不限于)：表皮增殖细胞ki67。
35.本技术的说明书中记载了大量的技术特征，分布在各个技术方案中，如果要罗列出本技术所有可能的技术特征的组合(即技术方案)的话，会使得说明书过于冗长。为了避免这个问题，本技术上述发明内容中公开的各个技术特征、在下文各个实施方式和例子中公开的各技术特征、以及附图中公开的各个技术特征，都可以自由地互相组合，从而构成各种新的技术方案(这些技术方案均应该视为在本说明书中已经记载)，除非这种技术特征的组合在技术上是不可行的。例如，在一个例子中公开了特征a+b+c，在另一个例子中公开了特征a+b+d+e，而特征c和d是起到相同作用的等同技术手段，技术上只要择一使用即可，不可能同时采用，特征e技术上可以与特征c相组合，则，a+b+c+d的方案因技术不可行而应当不被视为已经记载，而 a+b+c+e的方案应当视为已经被记载。
附图说明
36.图1为本发明所述扩张器空置时的正视图。
37.图2为本发明所述扩张器满置时的侧视图。
38.图3为本发明所述鼠张力诱导皮肤原位再生的标准化范式流程图以及小鼠扩张模型范式示意图和代表性小鼠扩张变化侧面图。
39.图4为本发明所述micro-ct三维重建后皮肤扩张再生表面积计算示意图。
40.图5为本发明所述小鼠扩张再生皮肤面积定量和相对倍率统计图。
41.图6为本发明所述扩张倍率曲线的变化图。
42.图7为本发明所述每个时间点的小鼠皮肤石蜡切片图，括号处代表所示表皮的厚度。
43.图8为本发明所述代表性时间点的扩张表皮进行冰冻荧光切片后的代表性展示图，其中红色荧光所示为正在增殖的表皮细胞。
44.图9为本发明所述增殖的表皮细胞信号占总表皮细胞个数的百分比的统计图。
具体实施方式
45.本发明人经过细致深入的研究，首次开发了一种用于建立皮肤再生耗竭模型的扩张器及其系统和方法。本发明方法通过将扩张器中扩张囊的极限张力膨胀体积扩大到无张力状态下极限体积的10倍，从而保证了达到皮肤再生耗竭的标准，从而得以通过本发明的
系统建立张力诱导模型，高度模拟处人来再生耗竭的相似特征，并通过该皮肤再生耗竭模型验证，干预再生衰竭，从而计算相关方法的可能性。
46.本发明的主要优点在于：
47.1.首次在更成熟的遗传工具且体型较小的啮齿类小鼠中建立张力诱导模型，开发评价张力诱导再生耗竭的技术体系；
48.2.高度模拟出人类牵张再生极限形成过程的相似表征，明确再生耗竭的时间拐点；
49.3.首次在动物层面上提供了验证、干预再生衰竭的途径，明确提供计算再生耗竭的可行性办法；
50.4.为临床开发干预靶点测试、延缓再生耗竭时间拐点、筛选促进皮肤有效牵张手段提供切实可行的研究手段；
51.实施例
52.如图1至图9所示，一种用于在小鼠身上建立皮肤再生耗竭模型的扩张器及其系统和方法，该方法包括以下步骤：
53.1.选择小鼠扩张器使用参数
54.该小鼠扩张器由扩张囊、注水壶、连接管三部分组成，材质为医用硅胶，密封性能良好，最终使用参数经过实验调整，在空置时正视图如图1所示，根据注射生理盐水的体积不同，其扩张囊的体积会随之变化，侧视图如图2所示。所有模具均由环己烷灭菌后使用。
55.2.小鼠扩张器的动物模型构建
56.本专利中使用7周龄c57bl/6野生型小鼠作为实验动物来建立模式动物皮肤扩张标准范式。所有c57bl/6野生型小鼠购买自上海斯莱克实验动物有限责任公司，并饲养于中科院营养与健康研究所spf屏障环境内。手术具体操作流程包括：将麻醉后的小鼠置于手术操作台上，于两耳下方1cm处置一长度1cm 的横形切口，并利用持针器沿头侧和尾侧方向分别将皮肤和下方组织分开，形成腔隙；利用持针钳将空置的扩张器扩张囊沿小鼠头侧方向植入皮下至其中点与两耳连线平行且不会随意移动，再将注水壶沿背侧放置植于皮下；最终将切口采用间断垂直褥式缝合法缝合。手术过程中应遵循无菌原则，尽量减少对小鼠的额外创伤。对照组小鼠除安置扩张器注水步骤外，均施加相同处理。
57.3.小鼠扩张表皮再生流程建立
58.如图2中显示，手术完成后，需通过注射器吸取0.6ml生理盐水通过注水壶注射膨大扩张囊。经过大量实验验证，每4天为一个时段，注射0.25ml体积的生理盐水增加扩张体积为最优张力诱导参数。实验设计可按需模拟人类短期(8天)和长期(36天)张力诱导后的变化。
59.4.micro-ct定量及重建
60.小鼠麻醉后，于上海市第六人民医院骨质疏松科按标准实验步骤操作，经micro-ct(型号：skyscan1176)图像扫描并利用mimics v17软件进行三维重建，计算扩张后再生皮肤表面积变化倍率。
61.5.毛发镜观察分析
62.为了准确计算小鼠张力诱导模型的扩张倍率，我们在装置小鼠扩张器前使用脱毛膏(品牌：薇婷)对小鼠进行脱毛处理。在实验过程中，选取扩张球部中心位置，利用中国台
湾cbs皮肤分析仪(型号：cbs-802)的紫外线50倍放大倍率摄像头对可反射荧光的毛发进行拍摄，随后对所拍摄照片中的毛发数量进行统计。
63.1.6.扩张倍率曲线计算方法
64.假定注射囊为标准球体，其体积为v=4/3πr3，表面积为a＝4πr
2 (r为半径)。以每轮注射生理盐水的体积为标准，计算所得扩张后的表面积，需要按体积的2/3次方换算出相应的表面积倍率变化，按首次注射的体积换算后的表面积为初始表面积，将各个时间点的计算值与此相除，得到理论的表面积变化倍率，即为扩张理论倍率变化曲线，如图6(theoretic曲线)所示。同时，既往研究提示，扩张过程中，毛囊个数不会发生变化，但间距会随皮肤表面积增加而加大。故，步骤5中得到的单位面积的毛囊个数与扩张表面积成反比变化，按首次注射的毛囊个数倒数为初始扩张后的拟定初始表面积，将各个时间点由毛囊个数倒数换算得到的表面积与此相除，得到本模型的实际表面积的变化倍率，即为扩张实际倍率变化曲线，如图6(exp曲线)。在与实验组小鼠相同时间点时，对未进行处理的对照组小鼠的毛囊个数进行同步定量，以其开始时间点的毛囊个数倒数为基准，得到对照组小鼠的表面积变化倍率曲线，如图6(ctrl曲线)。
65.7.切片石蜡分析
66.我们首先用4％多聚甲醛固定小鼠张力诱导标本24小时后，用自来水冲洗过夜，常规乙醇梯度脱水，二甲苯透明化处理，石蜡包埋切片。切片脱蜡入水后，进行h&e染色和masson染色，观察皮肤组织形态和结构的变化。
67.8.切片免疫荧光分析
68.我们首先将冰冻组织切片置于4％多聚甲醛中固定15分钟，再将切片置于封闭液(2.5％驴血清，2.5％山羊血清，1％牛血清血蛋白，0.3％triton x
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100)中进行封闭和通透。之后将抗体稀释到相应浓度滴加至切片上，并于4℃中过夜孵育。并于第二日选择相应荧光二抗孵育显色，并用含dapi抗荧光淬灭封片剂(碧云天，c1002)进行封片。染色完成后，利用zeiss axio imagera2(zeiss)显微镜进行拍摄。抗体选择：ki67(abcam15580，1：500)，krt10 (abcam76318，1：500)，cd49f(biolegend313616，1：100)。
69.9.统计分析
70.实验中出现的厚度统计均为划定面积除以长度得到平均厚度计算的。利用 prism 8软件进行双尾t检验检测两组数据的差异显著性。本研究中的统计图中每个点均代表一个小鼠个体，统计值均以平均值(average)
±
标准误 (standard error of mean)表示。p值以95％或99％的置信区间计算。p《 0.05认为有显著的统计学差异。*：p《0.05；**：p＜0.01；***：p＜ 0.001。
71.10.给出结论
72.在新型标准小鼠扩张范式中，我们先后经历9次干预，具体为：初始植入扩张器后立即注射0.6ml生理盐水至扩张囊中，后每间隔4天为一个周期注射生理盐水0.25ml，持续8轮共计32天后，对小鼠皮肤进行持续张力诱导 (图3)。在经历了长达32天的持续张力诱导后，小鼠扩张并发症，诸如：表皮破溃、缺血坏死等症状发生率并无发生，小鼠扩张效果良好，且在扩张起始和终末阶段，其体积相比较有较大的差异。同时我们对扩张后的表面积变化进行了精确的定量计算，经过micro-ct三维重建后，计算出其皮肤表面积均值由223.06mm2变化至1103.29mm2，变化倍率为4.95倍(每组有三个小鼠个体) (图4、图5),远超
过现有研究中证明的张力诱导能力多局限于2-4倍的不足。通过具体参数定量描述了该小鼠张力诱导范式的扩张能力变化。
73.为了明确扩张过程中再生倍率的变化情况，我们通过单位面积的毛囊个数变化的倒数计算出扩张倍率曲线的变化(图6)，发现在扩张32天之前，实际扩张曲线和理论扩张曲线倍率变化基本一致，证明在此阶段，小鼠的皮肤再生能力与扩张速度相当；而在36天后，小鼠的实际扩张能力逐渐下降，至扩张 40天时远低于理论倍率值，说明在第36天后，小鼠的皮肤再生能力无法弥补实际扩张体积带来的皮肤表面积变化，需要由其他部位的皮肤补充才能维持。初步证明了张力诱导后皮肤发生再生能力耗竭的时间点。随后为了探明在张力诱导过程中，表皮发生的变化，我们对不同时间点的小鼠皮肤进行取样，切片观察(图7)，计算表皮厚度和单位基底膜长度的再生细胞个数，发现小鼠表皮厚度在扩张0-12天后不断增加，单位长度的细胞个数也在不断增加；而在16
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32天内，小鼠的表皮厚度不会继续增加，单位长度的细胞个数有先维持后下降的变化；在36天时，表皮厚度下降至最薄，再生单位长度的细胞个数降至最低。同时，如图8、图9所示，ki67阳性的细胞个数代表着小鼠扩张模型中细胞增殖能力的变化，以其阳性的细胞数量为判断标准，发现增殖细胞在早期(第8 天)和中期(第20天)不断增多，晚期(第36天)数量下降，说明在晚期其增殖能力远低于前期的变化水平。综上,我们认为：张力诱导初步分为三阶段：一阶段0-12d：表面积稳定增长，表皮厚度显著增长，表皮细胞个数不断增殖变多；二阶段12-28d：扩张表面积稳定增长，但表皮厚度基本不变，增殖能力尚能维持扩张表面积的增长；三阶段28-36d：扩张表面积增长显著延缓，表皮厚度出现下降，从第36天开始出现显著意义上的下降，增殖能力尚不足以维持表面积的增长。故：一阶段代表早期扩张反应，二阶段是皮肤适应扩张出现的新稳态，三阶段时皮肤再生能力不断耗竭，张力诱导再生能力拐点发生在扩张后的第36天。
74.以上研究结果表明，经过大量动物实验设计和验证，在更成熟的遗传工具且体型较小的小鼠中建立可操作性很强的张力诱导皮肤原位再生的模型是完全可行的，为今后研究张力对表皮再生影响意义深远，具有实用价值。同时，建立快速诱导再生耗竭模型会为今后研究再生功能紊乱的疾病提供具有实用意义的研究模型，具有深刻研究意义。
75.需要说明的是，在本专利的申请文件中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。本专利的申请文件中，如果提到根据某要素执行某行为，则是指至少根据该要素执行该行为的意思，其中包括了两种情况：仅根据该要素执行该行为、和根据该要素和其它要素执行该行为。多个、多次、多种等表达包括2个、2次、2种以及2个以上、2次以上、2种以上。
76.本说明书包括本文所描述的各种实施例的组合。对“一个实施例”或特定实施例等的单独提及不一定是指相同的实施例；然而，除非指示为是互斥的或者本领域技术人员很清楚是互斥的，否则这些实施例并不互斥。应当注意的是，除非上下文另外明确指示或者要求，否则在本说明书中以非排他性的意义使用“或者”一词。
77.在本技术提及的所有文献都被认为是整体性地包括在本技术的公开内容中，以便在必要时可以作为修改的依据。此外应理解，在阅读了本技术的上述公开内容之后，本领域技术人员可以对本技术作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所要求保护的范围。

技术特征：
1.一种用于建立皮肤再生耗竭啮齿动物模型的扩张器，其特征在于，所述扩张器包括：扩张囊、注水壶和连接管；其中，所述扩张囊用以植入啮齿动物皮下并注入实验液体扩张，以此耗竭对应位置皮肤的再生能力，所述扩张囊与所述连接管一端相连，所述扩张囊不产生张力的情况下可容纳v0ml的实验液体，预定耗竭终点状态下可容纳v1ml的实验液体，其中，v1为4-6；的值为8-15；所述连接管两端分别与所述扩张囊与所述注水壶连接；所述注水壶与所述连接管另一端相连，开有注水口，用于接受外部注入的实验液体。2.根据权利要求1所述的扩张器，其特征在于，所述注水壶为圆台状。3.根据权利要求2所述的扩张器，其特征在于，所述注水壶上底面半径为0.5-0.6cm,下底面半径为0.6-0.7cm，高为0.8-0.9cm。4.根据权利要求2所述的扩张器，其特征在于，所述注水口位于所述注水壶顶部，并且所述注水口设置有止回单向阀。5.根据权利要求1所述的扩张器，其特征在于，所述扩张囊包括一个平坦的底面与一个弧面，注射时，所述弧面优先膨胀。6.根据权利要求1所述的扩张器，其特征在于，所述扩张器为一体成型结构。7.根据权利要求1所述的扩张器，其特征在于，所述扩张器整体采用不透水的生物相容性材料。8.一种用于判断皮肤再生耗竭的装置，其特征在于，所述装置包括：输入装置、处理器和输出装置，其中，所述输入装置用于输入判断再生能力的数值；所述处理器用于根据所述输入装置获得的数据判断皮肤再生能力是否已经耗竭；所述输出装置用于输出所述处理器中得到的结果。9.一种用于建立皮肤耗竭模型的系统，其特征在于，所述系统包括：扩张器，所述扩张器为权利要求1-7任一所述的扩张器；张力检测装置，所述张力检测装置用于测量皮肤的张力；注射部件，所述注射部件包括：注射器；皮肤再生能力耗竭判断装置，所述皮肤再生能力耗竭判断装置为权利要求8所述装置。10.一种权利要求1所述的扩张器的用途，其特征在于，所述扩张器用于制备一种器械，所述器械用于建立再生能力耗竭啮齿动物模型。

技术总结
本申请涉及一种用于建立皮肤再生耗竭啮齿动物模型的扩张器及其系统和方法，所述扩张器包括：扩张囊、注水壶和连接管；其中，所述扩张囊与所述连接管一端相连；所述扩张囊用于在植入皮下后扩张皮肤，使再生能力耗竭；所述连接管一端与所述扩张囊连接；所述注水壶与所述连接管另一端相连，顶部开有注水口，用于接受外部注入的实验液体。本发明的优势在于首次在更成熟的遗传工具且体型较小的啮齿类小鼠中建立张力诱导模型并为临床开发干预靶点测试、延缓再生耗竭时间拐点、筛选促进皮肤有效牵张手段提供切实可行的研究手段。手段提供切实可行的研究手段。手段提供切实可行的研究手段。


技术研发人员：孙一丹 刘蔡钺 徐露文 韦坤辰 李海洲 黄晓璐 高雅姗 张亮 李青峰
受保护的技术使用者：上海交通大学医学院附属第九人民医院
技术研发日：2021.12.27
技术公布日：2023/7/11