忍冬花发酵物、含其的具保湿功效的皮肤外用组成物及其用途的制作方法

1.本发明是有关于一种忍冬花发酵物，特别是一种忍冬花发酵物、含此的具 保湿功效的皮肤外用组成物及其用途。


背景技术：

2.皮肤是身体最外层的器官，具有隔绝外部刺激、感知环境、调节体温、防 止水分蒸发、储存及/或合成的功能。皮肤的最外层是角质层，其中角质层是由 死去的角质细胞紧密排列后形成，因此角质层需频繁的代谢，以替换老化的角 质细胞。当角质层水分充足时，老化的角质细胞可顺利脱落，但当角质层的含 水量不足，老化的角质细胞无法完整脱落，导致皮肤有粗糙及/或脱屑等现象， 甚至造成皮肤发炎，使皮肤产生瘙痒及/或潮红等症状。如果角质层长期缺水， 角质层就会变得更加脆弱，导致皮肤保湿性更差。
3.忍冬(lonicera japonica)，又称为金银花，是忍冬科植物。根据《本草正义》， 忍冬以清热解毒见长。根据《草本纲目》，忍冬的茎部、叶部及花部的功用相同， 后世称其消肿、散毒、治疮为要药。因此，忍冬常用于改善皮肤湿疹、毛囊炎、 青春痘、粉刺及痱子等。现代研究则证实，忍冬具抑制病毒(如：疱疹病毒)及细 菌(如：金黄色葡萄球菌)活性，还具消炎作用，且可调节免疫力。然而，忍冬对 皮肤是否具保湿功效则少有研究。


技术实现要素：

4.因此，本发明的一态样是提供一种忍冬花发酵物，其利用酵母菌对含有忍 冬(lonicera japonica)花的发酵基质进行发酵步骤后制得。忍冬花发酵物富含绿 原酸及/或谷胱甘肽，且对皮肤具保湿功效。
5.本发明的又一态样是提供一种具保湿功效的皮肤外用组成物，可包含但不 限于忍冬花发酵物做为有效成分。
6.本发明的再一态样是提供一种忍冬花发酵物用于制备保湿的皮肤外用组成 物的用途，其中皮肤外用组成物可包含但不限于忍冬花发酵物做为有效成分。
7.根据本发明的上述态样，提出一种忍冬花发酵物，可包含但不限于30μg/ml 至50μg/ml的绿原酸及10μg/ml至30μg/ml的谷胱甘肽。此忍冬花发酵物可 例如为对发酵基质进行发酵步骤而制得。发酵基质可例如为由忍冬(lonicerajaponica)花及水所组成，其中忍冬花可例如为干燥花朵。发酵步骤可例如为利 用酵母菌于20℃至50℃的温度进行10小时至50小时。酵母菌可例如为酿酒 酵母(saccharomyces cerevisiae)c-lye-6，其于2021年03月16日保藏于中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，且保藏编号为cgmcc no. 22020。
8.根据本发明的一实施例，忍冬花发酵物可选择性包含4.0mg/ml至9.0 mg/ml的蛋白质、4.0mg/ml至10.0mg/ml的粗多糖、6.0mg/ml至16.0mg/ml 的总黄酮及/或1.0mg/ml至5.0mg/ml的总酚。根据本发明的一实施例，忍冬 花发酵物的ph值可例如为4.5至6.8。根据
本发明的一实施例，忍冬花发酵物 的粘度可例如为10厘泊(cp)至15cp。根据本发明的一实施例，发酵基质的忍 冬花及水的重量体积比(g:ml)可例如为2～10:100～300。根据本发明的一实施例， 酵母菌的菌体浓度可例如为105菌落形成单位(colony forming unit，cfu)/ml至 108cfu/ml。根据本发明的一实施例，发酵基质的忍冬花对酵母菌的重量体积 比(g:ml)可例如为2～20:5～10。根据本发明的一实施例，忍冬花发酵物可例如为 经发酵步骤、固液分离步骤以及灭菌步骤而制得。
9.根据本发明的上述态样，提出一种具保湿功效的皮肤外用组成物，可包含 但不限于上述忍冬花发酵物做为有效成分。
10.根据本发明的上述态样，提出一种忍冬花发酵物用于制备保湿的皮肤外用 组成物的用途，其中皮肤外用组成物可包含但不限于上述忍冬花发酵物做为有 效成分。
11.应用本发明的忍冬花发酵物，其利用酵母菌对含忍冬花的发酵基质进行发 酵步骤而制得，可包含但不限于丰富的绿原酸及/或谷胱甘肽，且对皮肤具保湿 功效，而可做为皮肤外用组成物的有效成分。
附图说明
12.为让本发明的上述和其他目的、特征、优点与实施例能更明显易懂，所附 图式的详细说明如下：
13.图1a至图1c分别为绘示根据本发明的一实施例的绿原酸标准品、实验样 本及对照样本的色谱图。
14.图2a至图2c分别为绘示根据本发明的一实施例的谷胱甘肽标准品、实验 样本及对照样本的色谱图。
15.图3为绘示根据本发明一实施例的不同时间的不同区域的皮肤含水量的柱 形图。
具体实施方式
16.本发明所提到的单数形式“一”、“一个”和“所述”包含复数引用，除非上下文 另有明确规定。数值范围(如10％～11％的a)若无特定说明皆包含上、下限值(即 10％≤a≤11％)；数值范围若未界定下限值(如低于0.2％的b，或0.2％以下的 b)，则皆指其下限值可能为0(即0％≤b≤0.2％)。上述用语是用以说明及理解 本发明，而非用以限制本发明。
17.如前所述，本发明提供一种忍冬花发酵物、含其的具保湿功效的皮肤外用 组成物及其用途，其利用酵母菌对含有忍冬(lonicera japonica)花的发酵基质进 行发酵步骤后获得，其中忍冬花发酵物含有丰富的绿原酸(chlorogenic acid)及谷 胱甘肽(glutathione)，且对皮肤具保湿功效。
18.详细而言，上述发酵基质可例如为由忍冬(salvia rosmarinus)花及水所组成。 在一实施例中，忍冬花可例如为忍冬的干燥花朵或新鲜花朵。上述干燥处理的 方法不限，可利用现有的方法进行，如：阴干法、热干燥法、冷冻干燥法、真 空干燥法及喷雾干燥法等。在一具体例中，干燥方法可例如为在70℃至80℃ 进行烘干处理。
19.上述酵母菌可为任何酵母菌菌株。在一具体例中，酵母菌可例如为酿酒酵 母(saccharomyces cerevisiae)c-lye-6，其于2021年03月16日保藏于中国微生 物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)(地址：中国北京市朝阳区北 辰西路1号院3号中国科
2.0wt％的可溶性固形物。在一实施例中，忍冬花发酵物可选择性包含4.0mg/ml 至9.0mg/ml的蛋白质、4.0mg/ml至10.0mg/ml的粗多糖、6.0mg/ml至16.0 mg/ml的总黄酮及/或1.0mg/ml至5.0mg/ml的总酚。蛋白质、粗多糖、总黄 酮及/或总酚的含量在上述范围中，可使忍冬花发酵物对皮肤具有较佳的保湿功 效。
26.在一实施例中，上述忍冬花发酵物的ph值可例如为4.5至6.8，接近皮肤 表面的ph值，可维持皮肤表面的正常菌相之平衡，对皮肤温和不刺激。在一实 施例中，忍冬花发酵物的粘度可例如为10cp至15cp，以避免忍冬花发酵物起 屑或析出沉淀物，且使忍冬花发酵物的触感清爽不粘腻。
27.经管柱层析分析，未经发酵步骤的忍冬花萃取物无法检测出绿原酸含量， 但经发酵步骤制得的忍冬花发酵物的绿原酸含量可例如为30μg/ml至50 μg/ml。其次，相对于未经发酵步骤的忍冬花萃取物，经发酵步骤制得的忍冬花 发酵物的谷胱甘肽含量增加至少1倍，证实发酵步骤可提高绿原酸及谷胱甘肽 含量。
28.上述“保湿”功效是指皮肤含水量上升。在一实施例中，相对于皮肤未涂 抹忍冬花发酵物，皮肤持续涂抹忍冬花发酵物至少3天后的皮肤含水量增加约 6％至7％。在一实施例中，相对于皮肤未涂抹忍冬花发酵物，皮肤持续涂抹忍 冬花发酵物至少7天后的皮肤含水量增加约8％至9％，高于皮肤持续涂抹忍冬 花萃取物7天后的皮肤含水量的增加幅度(约7.49％)，证明忍冬花以酵母菌进行 发酵步骤后获得的忍冬花发酵物对皮肤具保湿功效。
29.其次，与忍冬花萃取物相比，其中忍冬花萃取物以忍冬花及水为基质，于 100℃以上进行加热15分钟以上后获得未进行发酵步骤，皮肤持续涂抹忍冬花 发酵物至少3天的皮肤含水量的增加幅度(约6％至7％)高于皮肤持续涂抹忍冬 花萃取物至少3天的皮肤含水量的增加幅度(约3.14％)，且皮肤持续涂抹忍冬花 发酵物至少7天的皮肤含水量的增加幅度(约8％至9％)高于皮肤持续涂抹忍冬 花萃取物至少7天的皮肤含水量的增加幅度(约7.49％)，意味着发酵步骤可自忍 冬花保留及/或产生皮肤可吸收并利用的成分(如：绿原酸及/或谷胱甘肽)，因此 可做为皮肤外用组成物的有效成分。
30.值得注意的是，上述制造步骤排除使用有机溶剂，因此没有有机溶剂残留 的疑虑。其次，经皮肤斑贴实验证实，忍冬花发酵物对皮肤具低致敏性。上述
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低致敏性”是指忍冬花发酵物涂抹皮肤经一段时间后，不引起皮肤的红斑、 浸润、水肿、丘疹及疱疹等发炎及/或过敏等症状。
31.在一实施例中，忍冬花发酵物可做为具保湿功效的皮肤外用组成物的有效 成分。在一实施例中，上述皮肤外用组成物的剂型可例如为溶液、乳液、乳霜、 悬浮液、粉剂、凝胶或浴盐。在一实施例中，上述皮肤外用组成物可例如乳液、 化妆水、精华液、隔离霜、洗面奶、面膜或防晒乳，惟本发明不限于此处所举。
32.以下利用数个实施例以说明本发明的应用，然其并非用以限定本发明，本 发明技术领域中技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作各种的更 动与润饰。
33.实施例一、制备忍冬花发酵物
34.首先，于37℃在pdb中对酿酒酵母c-lye-6(保藏编号为cgmcc no.22020) 进行第一液态培养，以获得第一菌液。接着，将第一菌液涂布于pda上进行培 养，以获得单一菌落。然后，将单一菌落接种于pdb中，并于37℃进行第二 液态培养，以获得酿酒酵母c-lye-6的
第二菌液，其中第二菌液的600nm下 光密度为0.5至1.0，相当于含有105至108cfu/ml的酿酒酵母c-lye-6的活 菌。补充说明的是，酿酒酵母c-lye-6的菌落为点状，表面边缘光滑，且颜色 呈乳白色而不透明。上述酿酒酵母c-lye-6以是细胞形式单独存在。
35.将忍冬花于75℃
±
5℃烘干，以获得忍冬干燥花朵。接着，将5g的忍冬干 燥花朵及300ml的水混合成基质后，加入5ml的酿酒酵母c-lye-6的第二菌 液，再于30℃下进行发酵步骤48小时，从而获得忍冬花发酵物。接下来，以 121℃、1.1kg/cm2的水蒸气对忍冬花发酵物进行灭菌达15分钟，再以4500rpm 的离心速率进行离心20分钟，确保忍冬花发酵物无致病菌检出，且活菌数为小 于50cfu/ml，符合化妆品对于生物安全性的规定。
36.上述忍冬花发酵物为浅褐色的半透明液体。利用现有的方法(如：利用旋转 粘度测定计及酸碱度计定法)测量上述忍冬花发酵物的粘度及ph值，忍冬花发 酵物的粘度为10cp至15cp，且忍冬花发酵物的ph值为4.5至6.8。其次，基 于上述忍冬花发酵物为100wt％，忍冬花发酵物包含0.9wt％至2.0wt％的可溶 性固形物。再者，忍冬花发酵物含有4.0mg/ml至9.0mg/ml的蛋白质、4.0 mg/ml至10.0mg/ml的粗多糖、6.0mg/ml至16.0mg/ml的总黄酮及/或1.0 mg/ml至5.0mg/ml的总酚。值得说明的是，不同株忍冬花具个体差异，因此 不同批次的忍冬花发酵物的粘度、ph值和蛋白质、粗多糖、总黄酮及总酚的含 量略有不同，但是在上述范围内。
37.实施例二、评估忍冬花发酵物的绿原酸含量
38.以上述忍冬花发酵物做为实验样本，并以未发酵的基质(5g的忍冬干燥花 及300ml的水混合)经灭菌(以121℃、1.1kg/cm2达15分钟)及离心(4500rpm、 20分钟)后制得的忍冬花萃取物做为对照样本。将实验样本及对照样本以甲醇 配制为5重量％的溶液，进行超音波处理后，再利用0.45μm滤膜过滤。
39.关于绿原酸含量的检测，请参阅中国国家药典委员编写的《中华人民共和 国药典》2020年版第一部的〈忍冬藤〉及第四部的〈高效液相色谱法〉(通则 0512)，简述如下：利用市售的硅胶层析管柱(商品名：shim-pack gist c18，货 号：227-30017-08，生产商：岛津科学仪器股份有限公司，日本京都)进行高效 液相色谱法(high performance liquid chromatography，hplc)，其中高效液相色谱 法的条件为：流动相a为0.4％磷酸水溶液，流动相b为乙腈，流动相a与流 动相b的体积比为90:10，流速为1ml/分钟，检测波长为327nm，进样量为 10μl，且柱温为40℃。
40.图1a至图1c分别为绘示根据本发明的一实施例的绿原酸标准品(图1a)、 实验样本(图1b)及对照样本(图1c)的色谱图，其中横轴表示滞留时间，且纵轴 表示信号强度。如图1a所示，依照高效液相色谱法的条件，绿原酸的滞留时间 为15.973分钟，且标准曲线方程式如式i所示：
41.y＝29246x-31506.8，r2＝0.9997
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(i)，
42.其中x为绿原酸的浓度，且y为波峰面积(peak area)。如图1b所示，实验 样本的绿原酸的滞留时间为16.031分钟，且经式i的换算，实验样本的绿原酸 含量为37.871μg/ml。如图1c所示，对照样本的色谱图在滞留时间为15.973 分钟至16.031分钟处无波峰，说明未检出绿原酸。图1b的结果证明忍冬花经 酿酒酵母c-lye-6的发酵步骤后，可提高绿原酸含量。
43.实施例三、检测忍冬花发酵物的谷胱甘肽含量
敏性。选择适合的受试者30人，其中受试者年龄是在18岁至60岁间随机选 择。首先，利用无刺激性的胶带于每位受试者的背部固定2个斑试器达24小 时，使斑试器的鳍状室(fin-chamber)中的滤纸片贴附于受试者的背部皮肤上，期 间不移除斑试器，也避免斑试器碰到水。以滤纸片含有0.20ml至0.25ml的 忍冬花发酵物做为实验组，以滤纸片含有0.20ml至0.25ml的蒸馏水做为控 制组。经24小时后，取下斑试器，并分别于0.5小时、24小时及48小时后观 察斑试器下的皮肤(以下称为受试区域)及受试区域周围的皮肤是否出现红斑、 浸润、水肿、丘疹及/或疱疹等症状。
55.将结果记录于表1中，其中图号
“‑”
表示皮肤为阴性，即皮肤没有出现红 斑、浸润、水肿、丘疹及/或疱疹等症状，
“±”
表示可疑反应，即受试区域的皮 肤出现轻微的红斑，“+”表示弱阳性反应(也称为红斑反应)，即受试区域的皮肤 出现红斑、浸润、水肿及/或丘疹，“++”表示强阳性反应(也称为疱疹反应)，即 受试区域的皮肤出现红斑、浸润、水肿、丘疹、疱疹，且受试区域周围的皮肤 也出现上述疱疹反应的症状，“+++”表示皮肤出现极强阳性反应(也称为融合性 疱疹反应)，即受试区域的皮肤出现明显红斑、严重浸润、水肿、融合性疱疹， 且受试区域周围的皮肤也出现上述融合性疱疹反应(n＝30)。
56.表1
[0057][0058]
如表1所示，在取下斑试器后0.5小时、24小时或48小时后，受试者在受 试区域及其周围的皮肤皆呈阴性，表示无红斑、浸润、水肿、丘疹、疱疹及融 合性疱疹等反应，显示忍冬花发酵物对皮肤具低致敏性。
[0059]
综言之，上述特定菌株的酵母菌、特定的混合比例、特定的工艺或特定的 评估方法仅用于例示说明本发明的忍冬花发酵物、含此的具保湿功效的皮肤外 用组成物及其用途。然而，本发明所属技术领域中技术人员应可理解，在不脱 离本发明的精神及范围内，其他菌株的酵母菌、其他混合比例以及其他的工艺 或其他的评估方法也可用于忍冬花发酵
物、含此的具保湿功效的皮肤外用组成 物及其用途，并不限于上述。举例而言，在不影响忍冬花发酵物的保湿功效的 前提下，也可使用其他菌株的酵母菌或其他混合比例，以获得忍冬花发酵物。
[0060]
由上述实施例可知，本发明忍冬花发酵物、含此的具保湿功效的皮肤外用 组成物及其用途，其优点在使用酵母菌对忍冬花进行发酵步骤，不仅可保留及/ 或产生皮肤可吸收且对皮肤有益的成分(如：绿原酸及谷胱甘肽)，且忍冬花发酵 物对皮肤具保湿功效，而可应用于皮肤外用组成物。
[0061]
虽然本发明已以数个特定实施例公开如上，但可对前述公开内容进行各种 润饰、各种更动及替换，而且应可理解的是，在不脱离本发明的精神和范围内， 某些情况将采用本发明实施例的某些特征但不对应使用其他特征。因此，本发 明的精神和权利要求书范围不应限于以上例示实施例所述。
[0062]
【符号说明】
[0063]
301,303:柱形。
[0064]
【生物材料保藏】
[0065]
酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)c-lye-6是于2021年03月16日保藏 于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)(地址：中国北京 市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编号：100101)， 且保藏编号为cgmcc no.22020。

技术特征：
1.一种忍冬花发酵物，其特征在于，包含30μg/ml至50μg/ml的绿原酸及10μg/ml至30μg/ml的谷胱甘肽，其中该忍冬花发酵物对发酵基质进行发酵步骤而制得，该发酵基质由忍冬(lonicera japonica)花及水所组成，该忍冬花为干燥花朵，该发酵步骤利用酵母菌于20℃至50℃的温度进行10小时至50小时，且该酵母菌是于2021年03月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，且保藏编号为cgmcc no.22020的酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)c-lye-6。2.根据权利要求1所述的忍冬花发酵物，其特征在于，还包含4.0mg/ml至9.0mg/ml的蛋白质、4.0mg/ml至10.0mg/ml的粗多糖、6.0mg/ml至16.0mg/ml的总黄酮及/或1.0mg/ml至5.0mg/ml的总酚。3.根据权利要求1所述的忍冬花发酵物，其特征在于，其中该忍冬花发酵物的ph值为4.5至6.8。4.根据权利要求1所述的忍冬花发酵物，其特征在于，其中该忍冬花发酵物的粘度为10厘泊(cp)至15cp。5.根据权利要求1所述的忍冬花发酵物，其特征在于，其中该发酵基质的该忍冬花及该水的重量体积比(g:ml)为2～10:100～300。6.根据权利要求1所述的忍冬花发酵物，其特征在于，其中该酵母菌的菌体浓度为105菌落形成单位(colony forming unit，cfu)/ml至108cfu/ml。7.根据权利要求1所述的忍冬花发酵物，其特征在于，其中该发酵基质的该忍冬花对该酵母菌的重量体积比(g:ml)为2～20:5～10。8.根据权利要求1所述的忍冬花发酵物，其特征在于，其中该忍冬花发酵物经该发酵步骤、固液分离步骤以及灭菌步骤而制得。9.一种具保湿功效的皮肤外用组成物，其特征在于，包含根据权利要求1至8任一项所述的忍冬花发酵物做为有效成分。10.一种忍冬花发酵物用于制备保湿的皮肤外用组成物的用途，其特征在于，其中该皮肤外用组成物包含根据权利要求1至8任一项所述的忍冬花发酵物做为有效成分。

技术总结
本发明是有关于一种忍冬花发酵物、含此的具保湿功效的皮肤外用组成物及其用途，其中忍冬花发酵物利用酵母菌对忍冬花进行发酵步骤而制得。忍冬花发酵物富含绿原酸及谷胱甘肽，具保湿功效，可做为皮肤外用组成物的有效成分。分。分。


技术研发人员：方祥铭 方晓薇
受保护的技术使用者：上海仙萃生物科技有限公司
技术研发日：2021.12.27
技术公布日：2023/7/11