一种杂种落叶松LaLBD1基因、蛋白及应用

一种杂种落叶松lalbd1基因、蛋白及应用
技术领域
1.本发明涉及植物育种技术领域，具体涉及到一种杂种落叶松lalbd1基因、蛋白及应用。


背景技术：

2.落叶松属松科(pinaceae)落叶松属(larix spp.)，是一种高大的落叶乔木，广泛分布于北半球的温带山区、寒温带地区以及高山地区，是我国东北地区高山针叶林的主要组成树种之一。落叶松属难生根树种，扦插生根率较低，这是目前制约落叶松扦插繁殖获得大量优良无性系苗木的瓶颈。因此对落叶松的生根发育进行研究是解决落叶松无性系生根困难的重要途径。
3.lbd(lateral organ boundaries domain)基因家族，又名asl(asymmetric leaves2-like)，是植物特有的一类基因家族，对植物器官根、花、叶的形成具有重要的影响。近期研究发现该基因家族与植物再生、植物愈伤组织的形成、根的发育、植物二次生长等过程密切相关。目前对于落叶松转录因子的研究仍较少，这限制了落叶松基因的功能应用。


技术实现要素：

4.本发明提供一种杂种落叶松lalbd1基因、蛋白及应用。所述基因过表达的遗传转化能够促进不定根数量以及长度的增加，这为促进落叶松不定根的发育提供了帮助。
5.本发明提供了一种杂种落叶松lalbd1基因，所述基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。
6.本发明还提供了杂种落叶松lalbd1基因编码的蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示。
7.本发明扩增所述的一种杂种落叶松lalbd1基因的引物，所述引物包括正向引物和反向引物，正向引物的核苷酸序列如seq id no.3所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.4所示。
8.本发明的一种杂种落叶松lalbd1基因的表达载体，所述的表达载体含有杂种落叶松lalbd1基因，所述的表达载体骨架为vb191104-gfp。
9.进一步地，所述的表达载体的宿主菌为大肠杆菌或农杆菌。
10.本发明的一种杂种落叶松lalbd1基因编码的应用，所述的lalbd1基因在植物不定根发育中的应用。
11.进一步地，所述的植物为84k杨。
12.本发明包含以下有益效果：
13.本发明提供的一个克隆木本植物长白落叶松lalbd1基因，将其转入到84k杨树中过量表达，可提高转基因84k杨树的不定根发育能力，转基因不定根数量较多且根系较长，生根率也较对照组高。
附图说明
14.图1为本发明提供的电泳结果图；其中，a为本发明中长白落叶松总rna提取结果，b为lalbd1基因pcr产物电泳图，其中m为dl2000 dna marker；
15.图2为本发明所提供的杂种落叶松lalbd1基因的核苷酸和氨基酸序列；
16.图3为本发明所提供的杂种落叶松lalbd1蛋白的亲/疏水性分析预测；
17.图4为本发明所提供的杂种落叶松lalbd1蛋白的二级结构预测；
18.图5为本发明所提供的杂种落叶松lalbd1蛋白的三级结构预测；
19.图6为本发明所提供的杂种落叶松lalbd1蛋白的结构域预测及与其他同源性较高植物的氨基酸序列比对；
20.图7为本发明所提供的杂种落叶松lalbd1蛋白与其他同源性较高的植物的系统进化树分析；
21.图8为本发明所提供的vb191104-gfp表达载体；
22.图9为本发明中利用pcr对转基因84k杨树进行dna水平检测的电泳图，其中m：dl2000；1-5：转基因植株；6：阳性对照；7：阴性对照；
23.图10为本发明中野生型与过表达84k杨的对比图；其中a为根系生长对比图，b为不定根数量统计图，c为不定根长度统计图。
具体实施方式
24.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面将详细叙述本发明所揭示内容的精神，任何所属技术领域技术人员在了解本发明内容的实施例后，当可由本发明内容所教示的技术，加以改变及修饰，其并不脱离本发明内容的精神与范围。
25.本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，但并不作为对本发明的限定。
26.本发明提供了一种杂种落叶松lalbd1基因，所述基因的核苷酸序列如seq id no.1所示：
27.atggcgtcttcatccaattctccttgcgctgcctgcaagtttcttcgaaggaagtgc
28.actctcgagtgcgtgtttgctccgtattttccaccggaccaaccccataagtttgcc
29.aatgttcataagatattcggagcgagcaacgtgacgaagctgctgaatgaattgcct
30.ccccaccagagagaagatgcggtgaattcattggcctacgaggcggacgcgagagt
31.gaaggatccggtctatgggtgcgtgggagcaatttcgatcttgcagcaccaggtga
32.aacagctccagacagagctgcatcatgcgcgctcggagctttctaagtttataaatg
33.cggggattgcaatccctccgatgggggcgggatctggaataggaatgggattggca
34.ggatcttcgagggaccaaattttcagggatcagaatatcatggagtcgcatatttca
35.agggaccatatactccgcgccagtaattatgaccagaccgacattgttaggcttagc
36.ggacacagctatgatccaaactatctagccatttccgggagcctagctcaggttcag
37.gcccaggctcaagctcaagctcaagctcaggcacaagctcaggttttcaacccata
38.tcctagaacaggaagctcaagcgatgaacgcaactgcatcagcccccattacttgcatccggagaagagggaggaatag。lalbd1基因蛋白分子式为c
2079h3458n702o862s174
，基因长度在702bp，如图2偶数行所示。分子质量为57.66kda，理论等电点为5.12偏酸性，平均疏水性系数为0.824，不稳定系数为26.07，推测其为稳定疏水性蛋白。属于lbd家族，包含lob保守结构域，且系统进化分
析表明，杂种落叶松和红豆杉的距离最为接近，和其他植物均相差较远。根据亚细胞结构定位预测该基因位于核细胞，表明本发明所述基因功能具有重要的生物学意义。
39.本发明还提供了杂种落叶松lalbd1基因编码的蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示：
40.masssnspcaackflrrkctlecvfapyfppdqphkfanvhkifgasnvtkllnelpph
41.qredavnslayeadarvkdpvygcvgaisilqhqvkqlqtelhharselskfinagiai
42.ppmgagsgigmglagssrdqifrdqnimeshisrdhilrasnydqtdivrlsghsydpnylaisgslaqvqaqaqaqaqaqaqaqvfnpyprtgsssderncisphylhpekree*。杂种落叶松lalbd1基因编码的蛋白由233个氨基酸组成，如图2奇数行所示。二级结构预测含有112个a螺旋(alpha helix)，占48.7％；4个β转角(beta turn)，占1.72％；93个无规则卷曲(random coil)，占39.91％；24个延伸链(extended strand)，占10.30％，a螺旋和无规则卷曲是落叶松该蛋白的主要组成部分。三级结构如图5所示。
43.本发明利用生物信息学分析网站及软件对杂种落叶松lalbd1基因编码蛋白的结构和功能进行预测，生物信息学网站及软件如表1所示。
44.表1生物信息学分析软件和网址
[0045][0046][0047]
本发明还提供了用于扩增杂种落叶松lalbd1基因的引物，所述引物包括正向引物lalbd1-f和反向引物lalbd1-r，所述lalbd1-f的核苷酸序列如seq id no.3所示：gggtctagaatggcgtcttcatccaatt，所述lalbd1-r的核苷酸序seq id no.4所示：cccaagcttctattcctccctcttctccg。本发明使用上述引物进行目的基因扩增时，选用以长白落叶松整株cdna为模板，优选使用kod-fx pcr酶进行扩增，反应体系如下表2所示
[0048]
表2 kod反应体系
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[0050]
pcr反应体系扩增温度为94℃2min；98℃10s，55℃30s，68℃2min，33个循环；68℃10min；16℃保温。反应体系中所用的kod fx酶的来源没有特殊限定要求，采用本领域技术人员熟知的常规市售kod-fx pcr的酶均可。
[0051]
本发明还提供了一种包含上述技术方案所述杂种落叶松lalbd1基因的过表达载体。在本项发明中，表达载体选用的是实验室前期改造的含有gfp标签vb191104-gfp载体，如图8所示。本发明对载体构建的方法没有特殊限制，使用本领域技术常用过表达载体即可。
[0052]
本发明所提供的上述表达载体的宿主菌选择包括大肠杆菌和农杆菌。
[0053]
本发明还提供了上述技术方案所述基因过表达在植株不定根发育中的应用。在本发明中，所述植株包括84k杨。本发明利用农杆菌介导法进行了lalbd1基因在84k杨中的遗传转化，通过测定转基因植株的表型特征，最终得出lalbd1基因能够促进植株不定根数量的增加以及根系的增长。
[0054]
以下结合具体例对本发明所述杂种落叶松lalbd1基因、蛋白及应用进行详细的展示介绍，本发明的实施方案包括但不限于以下技术
[0055]
实施例1
[0056]
1.长白落叶松总rna提取与cdna合成
[0057]
长白落叶松整株rna提取方法按照rna提取试剂盒(bioteke)的说明书进行，获得的rna模板经检测质量较好(如图1a)，可用于反转录。采用反转录试剂盒(takara)，将提取到的长白落叶松整株rna反转录成cdna，实验步骤依照说明书进行。
[0058]
2.lalbd1基因的克隆
[0059]
以长白落叶松cdna为模版，kod-fx pcr获得全长lalbd1基因cdna序列。反应体系(50μl)：2
×
pcr buffer for kod fx 25μl，2mm dntps10μlprimer f 1.5μl，primer r 1.5μl，cdna1μl，water 10μl，kod fx 1μl。反应温度为94℃2min；98℃10s，55℃30s，68℃2min，33个循环；68℃10min；16℃保温。
[0060]
3.植物过表达载体的构建
[0061]
将得到pcr产物进行1.5％的凝胶电泳检测(如图1中的b)，目的条带正确后进行胶回收，胶回收(omega)方法按照试剂盒说明进行。胶回收后利用限制性内切酶xba i和hindⅲ，将目的基因与载体进行同时双酶切，之后将目的基因片段与vb191104-gfp载体连接，转化到大肠杆菌中，37℃过夜培养后，提取阳性质粒进行pcr检测，将条带位置正确的菌株送至生物公司测序。经公司测序验证正确后，提取构建成功的重组质粒。采用液氮冻融法将重组质粒转入农杆菌gv1301中，选取单克隆菌落进行菌液pcr检测，条带位置正确且单一则表明重组质粒已成功转入农杆菌gv1301中。
[0062]
4.目的基因的遗传转化
[0063]
利用农杆菌介导法将lalbd1基因转入84k杨中，侵染后对转基因植株经过共培养、抗性筛选、获得抗性芽、分离抗性芽诱导生根。共获得5个转基因株系，对获得的转基因84k杨叶片提dna，用基因特异性引物以及载体引物进行pcr检测，结果显示转基因84k杨与阳性对照的片段长度一致(如图9)，表明lalbd1基因已经成功整合到了84k杨中。
[0064]
5.转基因植株表型分析
[0065]
转基因植株扦插形成的在扦插7天后就已经出现不定根，而野生型在扦插10天左
右才出现不定根，在扦插第12天时转基因植株的生根率为88.9％，野生型生根率为44％。
[0066]
通过对比3个转基因株系与对照组在3周时的生长情况发现(图10)，转基因株系的不定根数量比野生型多，并且转基因株系不定根长度均高于野生型说明lalbd1基因的过表达可以促进84k杨不定根数量的增加和不定根的伸长。

技术特征：
1.一种杂种落叶松lalbd1基因，其特征在于所述的lalbd1基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。2.如权利要求1所述的一种杂种落叶松lalbd1基因编码的蛋白，其特征在于所述的蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示。3.扩增权利要求1所述的一种杂种落叶松lalbd1基因的引物，其特征在于所述引物包括正向引物和反向引物，正向引物的核苷酸序列如seq id no.3所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.4所示。4.如权利要求1所述的一种杂种落叶松lalbd1基因的表达载体，其特征在于所述的表达载体含有杂种落叶松lalbd1基因，所述的表达载体骨架为vb191104-gfp。5.根据权利要求4所述的一种杂种落叶松lalbd1基因的表达载体，其特征在于所述的表达载体的宿主菌为大肠杆菌或农杆菌。6.如权利要求1所述的一种杂种落叶松lalbd1基因编码的应用，其特征在于所述的lalbd1基因在植物不定根发育中的应用。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述的植物为84k杨。

技术总结
一种杂种落叶松LaLBD1基因、蛋白及应用，它涉及植物育种技术领域，本发明的目的在于提供一种杂种落叶松LaLBD1基因、蛋白及应用。所述基因过表达的遗传转化能够促进不定根数量以及长度的增加，这为促进落叶松不定根的发育提供了帮助。本发明的一种杂种落叶松LaLBD1基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明杂种落叶松LaLBD1基因编码的蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明的杂种落叶松LaLBD1基因可提高转基因84K杨树的不定根发育能力，转基因不定根数量较多且根系较长，生根率也较对照组高。生根率也较对照组高。生根率也较对照组高。


技术研发人员：张磊 秦若凡 张含国 王绪 吴军 孙国飞 李金泉
受保护的技术使用者：东北林业大学
技术研发日：2023.05.17
技术公布日：2023/7/7