一种防治茶炭疽病的菌株及应用

1.本发明涉及茶炭疽病生防菌株筛选技术领域，更具体地说是涉及一种防治茶炭疽病的菌株及应用。


背景技术：

2.茶炭疽病是茶树重要的叶部病害之一，为世界性病害，在我国主要茶区普遍发生。该病发生严重地区，茶树会大量落叶，对来年春茶的产量带来影响，严重影响茶叶产量和品质。茶炭疽菌刺盘孢菌colletotrichum camelliae被认定为危害我国茶树的主要优势种，在全我国大部分茶区均有分布，并且可以危害国内大多数品种的茶树。
3.目前，生产上对于茶炭疽病的防治仍以化学防治的方法为主，但大量农药的使用会导致病原菌的抗药性增强、环境污染严重和农药残留增加等问题。与化学防治相比，生物防治对环境没有破坏性，具有可持续的优点，其中以菌治菌-利用生防微生物防治植物病害具有安全、环保、无残留、不易产生抗性、不杀伤天敌、选择性强等优点，目前已成为生物防治的重要发展方向。
4.因此，如何筛选到一种茶炭疽病的生防菌株是本领域技术人员亟需解决的问题。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明提供了一种防治茶炭疽病的菌株及应用。
6.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
7.一种防治茶炭疽病的菌株，所述菌株为藤黄生孢链霉菌(streptomyces luteosporeus)js4-f，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2023年04月27日，保藏编号为cctcc no：m2023651，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，分类命名streptomyces luteosporeus js4-f。
8.作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护所述的菌株在制备防治茶炭疽病微生物菌剂中的应用。
9.作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护一种防治茶炭疽病的微生物菌剂，包括藤黄生孢链霉菌js4-f。
10.作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护所述的菌株在制备防治草莓疫病病菌的微生物制剂中的应用。
11.作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护所述的菌株在制备防治辣椒枯萎病菌的微生物制剂中的应用。
12.作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护所述的菌株在制备防治马铃薯早疫病病菌的微生物制剂中的应用。
13.作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护所述的菌株在制备防治马棉花枯萎病菌的微生物制剂中的应用。
14.作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护所述的菌株在制备防治
玉大斑病菌的微生物制剂中的应用。
15.作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护所述的菌株在制备防治稻瘟病菌的微生物制剂中的应用。
16.作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护所述的菌株在制备防治柑橘沙皮病菌和茄子褐纹病菌的微生物制剂中的应用。
17.经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明采用稀释涂布平板法从茶园根际土壤中分离放线菌菌株，利用平板对峙法筛选具有较高拮抗活性的菌株；结合其形态特征、培养特征、生理生化特性和分子生物学对其进行种属鉴定；采用扫描电镜观察菌株js4-f对茶炭疽病菌的生长抑制作用，离体叶片法和盆栽防效测定其发酵液对茶炭疽病的室内防治效果，平板对峙法测定其抗菌谱。结果表明，分离筛选获得一株对茶炭疽病菌具有较好拮抗作用的放线菌菌株js4-f，根据该菌的形态特征、生理生化特性初步将其鉴定为链霉菌属，通过联合16srrna、gyrb、ropb、reca、trpb基因测序结果构建系统发育树，js4-f菌株被鉴定为藤黄生孢链霉菌streptomyces luteosporeus。菌株js4-f对茶炭疽病菌的拮抗效果达75.59％，扫描电镜表明其能使茶炭疽菌菌丝畸形、皱褶、菌丝之间相互缠绕；氮源利用试验表明菌株js4-f能利用l-精氨酸、l-甘氨酸、l-丙氨酸、l-色氨酸，能在6％nacl浓度下生长，ph的耐受范围为5-12。菌株js4-f发酵液原液室内离体叶片防治效果达52.54％，稀释10倍后防治效果为39.94％，稀释100倍后防治效果为30.56％；盆栽防效试验表明菌株js4-f发酵液原液对茶炭疽病的防治效果达44.59％；拮抗菌株js4-f对其它8种植物病原菌均具有较好的拮抗作用，抑制效果均大于60％。综上，菌株js4-f对茶炭疽病有较好的防治潜力，能给茶炭疽病的生物防治提供参考资源和技术依据。
附图说明
18.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
19.图1附图为本发明菌株js4-f在pda上对茶炭疽病菌的抑制作用图，左边为处理组，右边为对照组；
20.图2附图为菌株js4-f的形态特征图，a菌株js4-f菌落形态；b菌丝及孢子丝；c孢子梗及孢子；
21.图3附图为菌株js4-f基于多基因序列的系统发育树；
22.图4附图为菌株js4-f对茶炭疽病菌菌丝生长抑制作用图；
23.图5附图为菌株js4-f对8种植物病原菌的拮抗作用图，a棉花枯萎病菌verticillium dahlia，b茄子褐纹病菌phomopsis vexans，c玉米大斑病exserohilum turcicum，d稻瘟病菌magnaporthe oryzae，e柑橘沙皮病菌diaporthe citri，f马铃薯早疫病病菌alternaria alternate，g辣椒枯萎病菌fusarium oxysporum，h草莓疫病病菌phytophtherafragariae。
24.图6附图为菌株js4-f发酵液对茶炭疽病的离体叶片防效图；
25.图7附图为菌株js4-f对茶炭疽病的室内盆栽防效图。
具体实施方式
26.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
27.实施例1筛选拮抗茶炭疽病病菌的拮抗菌株
28.供试土壤
29.供试土壤采自湖南茶园根际土。
30.供试培养基
31.高氏一号培养基、马铃薯葡萄糖琼脂培养基、isp2培养基、isp4培养基，isp6培养基、察式琼脂培养基、bennett培养基，营养琼脂培养基(g/l)：蛋白胨10g，牛肉膏5g，nacl 5g，琼脂20g，ph7.2；以上培养基用于拮抗放线菌的培养特征观察试验。gy液体培养基用于拮抗放线菌的nacl耐受性试验和ph试验。氮源利用试验基础培养基：葡萄糖1g、mgso4·
7h2o 0.05g、nacl 0.05g、feso4·
7h2o 0.001g、k2hpo40.01g，各氮源以0.5％的量分别加入。
32.供试病原菌
33.9种供试植物病原菌均保存于湖南农业大学，分别为茶炭疽病菌c.camel liae、草莓疫病病菌phytophthera fragariae、辣椒枯萎病菌fusarium oxysporum、马铃薯早疫病病菌alternaria alternate、棉花枯萎病菌verticillium dahli a、玉米大斑病exserohilum turcicum、稻瘟病菌magnaporthe oryzae、柑橘沙皮病菌diaporthe citri、茄子褐纹病菌phomopsis vexans。
34.拮抗菌株的分离与筛选
35.采用稀释涂布平板法，取1g土壤加入到9ml无菌水中，振荡器振荡数分钟后，用无菌水分别倍比稀释10-1
～10-6
，各梯度菌悬液分别取100μl涂布于高氏一号培养基平板上。将拮抗放线菌株js4-f分别划线接种于高氏一号培养基、酵母膏燕麦膏培养基、无机盐淀粉琼脂培养基、察氏培养基、isp6、bennett培养基、营养琼脂培养基、pda培养基上，28℃恒温箱中倒置培养7-14d，观察菌株的生长情况、基生菌丝、气生菌丝、菌落特征以及有无可溶性色素产生。菌株js4-f在高氏一号培养基上生长迅速，菌落致密，气生菌丝发达，基生菌丝黄灰色，气生菌丝粉灰色，孢子丝为螺旋状，前期不产可溶性色素，后期产可溶性色素，颜色为粉红色，在不同培养基上培养生长时，除在isp4和营养琼脂培养基上生长较弱外，在其他培养基上均生长良好，在isp2和营养琼脂培养基上不产可溶性色素，其他培养基均产可溶性色素，见图1；
36.每个稀释梯度3次重复，28℃恒温箱中倒置培养7d，待平板上长出菌落后，挑取单菌落进行纯化并保存。采用平板对峙法对分离的放线菌进行拮抗菌筛选，将已纯化的放线菌划线接种在距离培养皿中心位置2cm处的pda培养基上，于28℃恒温箱中培养2d后，在中央接种直径为0.5cm的病原菌菌饼，设3组重复，以只接种病原菌菌饼的培养皿作为对照，继续培养5d后测量抑菌圈直径，根据以下公式计算其抑菌率。
37.抑制率(％)＝(对照组菌落直径—处理组菌落直径)/对照组菌落直径
×
100％
38.结果为：菌株js4-f对茶炭疽病菌c.camelliae的抑菌圈直径为1.66cm，抑菌率达75.59％，见图2。
39.生理生化试验：参照《链霉菌鉴定手册》，进行明胶液化试验、甲基红试验、过氧化氢酶试验、v.p试验、牛奶的凝固与胨化试验、h2s的产生试验、酪蛋白水解试验、精氨酸脱羧酶试验、硝酸盐还原试验，用刚果红染色法测定拮抗菌株产纤维素酶的能力；氮源利用试验采用普戈二氏的唯一氮源法，拮抗菌株耐盐性试验的nacl浓度调节范围为0-10％，ph试验的ph调节范围为3-12，测定方法是将粘有菌株孢子的无菌白枪头打入到装有5mlgy液体培养基的试管中，28℃恒温箱中培养7d，观察不同nacl浓度和不同ph环境下菌株是否生长及生长情况，见表1；
40.表1生理生化性能
41.ꢀ
1492rtacggctaccttgttacgacttgyrbgyrb-fgtggccgattccggcaaccccaacg gyrb-rtcagatgtcgaggaagcggacgtrecareca-fgcsaggtcggggttgtccttsaggaagttgcg reca-rgcsaggtcggggttgtccttsaggaagttgcgropbropb-fgagcgcatgaccacccaggacgtcgaggc ropb-rcctcgtagttgtaccctcccacggcatgatrpbtrpb-fgcgcgaggacctgaaccacaccggctcacacaagatcaaca trpb-rtcgatggccgggatgatgccctcggtgcgcgacagcaggc
47.实施例2拮抗放线菌株js4-f的抑菌性能
48.拮抗放线菌株js4-f对茶炭疽菌的菌丝生长抑制作用
49.将拮抗菌株js4-f与茶炭疽病原菌进行对峙培养5d后，挑取因拮抗菌形成的抑菌圈边缘处的茶炭疽病菌菌丝通过扫描电镜进行形态观察，以不接拮抗菌自然生长5d的茶炭疽病菌为对照。
50.扫描电镜可以看出，在有拮抗菌株js4-f的存在下，茶炭疽病菌c.camelliae菌丝生长会受到一定的抑制作用，与对照组相比，处理组的茶炭疽菌菌丝畸形、皱褶、菌丝之间互相缠绕，这说明菌株js4-f对茶炭疽菌菌丝生长具有抑制作用，见图4。
51.拮抗放线菌株js4-f抗菌能力测定
52.拮抗菌株js4-f的抗菌谱测定采用平板对峙法，用打孔器取直径为0.5cm的各供试病原菌菌饼置于培养皿中央，用无菌接种环挑取拮抗菌在距病原菌1.5cm两侧划线，以只接种各病原菌为对照，每个处理3次重复，于28℃恒温箱培养7d后，测量抑菌圈直径，计算拮抗菌株js4-f对8种植物病原菌的抑菌率。
53.拮抗菌株抗菌谱测定试验结果表明，菌株js4-f对草莓疫病病菌、辣椒枯萎病菌、马铃薯早疫病病菌、棉花枯萎病菌、玉大斑病菌、稻瘟病菌、柑橘沙皮病菌、茄子褐纹病菌均有抑制作用，其中对稻瘟病菌的抑制效果最佳，达(72.24
±
0.21)％，并且对8种植物病原菌的抑制率均大于60％，对稻瘟病菌、茄子褐纹病菌、棉花枯萎病菌均大于70％，说明该拮抗菌株拮抗效果较好，且具有广谱抑菌活性，见图5和表3。
54.表3
[0055][0056]
拮抗放线菌株js4-f发酵液对茶炭疽病的防效
[0057]
离体叶片防效：培养皿中放入无菌滤纸，并加入无菌水浸湿，选取新鲜健康的茶树叶片，表面经75％酒精消毒，无菌水冲洗3次后，用无菌针头刺伤叶片，将拮抗菌株js4-f发酵液均匀涂抹在叶片上，待其晾干后，在伤口处接种直径为0.5cm的茶炭疽菌菌饼，以不经拮抗菌发酵液处理的叶片作为对照，每个处理6组重复，于28℃恒温箱中保湿培养，5d后观察其发病情况。
[0058]
拮抗菌株js4-f离体叶片防效试验表明，叶片接种病原菌5d后，菌株js4-f的无菌发酵液原液对茶炭疽病的离体防治效果达52.54％，其防治效果随着稀释倍数的增大而降低，将无菌发酵液稀释10倍后防治效果为39.94％，稀释100倍后防治效果为30.56％，见图6。
[0059]
拮抗放线菌发酵液对茶炭疽病的室内盆栽防效
[0060]
室内盆栽防效：选用两年生的易感茶树品种龙井作为试验材料，拮抗菌发酵液中加入表面活性剂混匀备用。选取茶树上新鲜健康无病斑的茶树叶片，用无菌针头将叶片刺伤，将拮抗菌株js4-f发酵液喷洒在茶树叶片上，待其晾干后，在伤口处接种直径为0.5cm的茶炭疽病菌菌饼，用棉花进行保湿，以不经拮抗菌发酵液处理作为对照，每个处理重复3组，每组4株茶苗，于自然条件下培养，观察其发病情况，待发病后将菌饼去掉，第7d时处理组再喷一次拮抗菌液，14d后调查。拮抗菌株js4-f的盆栽试验表明，接种病原菌14d后调查发现，对照组病情指数为30.83；处理组原液的病情指数为17.08％，对茶炭疽病的防治效果为44.59％；稀释10倍后病情指数为20.00，防治效果为35.13％，随着稀释倍数的增大，病情指数增大，防治效果降低，稀释100倍后，病情指数为23.33，防治效果为24.32％，见图7。
[0061]
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
[0062]
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明
将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

技术特征：
1.一种防治茶炭疽病的菌株，其特征在于，所述菌株为藤黄生孢链霉菌(streptomycesluteosporeus)js4-f，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2023年04月27日，保藏编号为cctccno：m2023651，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，分类命名streptomycesluteosporeusjs4-f。2.权利要求1所述的菌株在制备防治茶炭疽病微生物菌剂中的应用。3.一种防治茶炭疽病的微生物菌剂，其特征在于，包括藤黄生孢链霉菌js4-f。4.权利要求1所述的菌株在制备防治草莓疫病病菌的微生物制剂中的应用。5.权利要求1所述的菌株在制备防治辣椒枯萎病菌的微生物制剂中的应用。6.权利要求1所述的菌株在制备防治马铃薯早疫病病菌的微生物制剂中的应用。7.权利要求1所述的菌株在制备防治马棉花枯萎病菌的微生物制剂中的应用。8.权利要求1所述的菌株在制备防治玉大斑病菌的微生物制剂中的应用。9.权利要求1所述的菌株在制备防治稻瘟病菌的微生物制剂中的应用。10.权利要求1所述的菌株在制备防治柑橘沙皮病菌和茄子褐纹病菌的微生物制剂中的应用。

技术总结
本发明公开了一种防治茶炭疽病的菌株，所述菌株为藤黄生孢链霉菌(Streptomycesluteosporeus)JS4-F，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2023年04月27日，保藏编号为CCTCCNO：M2023651，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，分类命名StreptomycesluteosporeusJS4-F。F。F。


技术研发人员：胡秋龙 张玉丹 刘仲华 谭琳 王玉生 杨学宇 杨艺帅
受保护的技术使用者：湖南农业大学
技术研发日：2023.05.17
技术公布日：2023/7/7