多功能羧甲基壳聚糖/透明质酸水凝胶及制备方法和应用

1.本发明属于医药水凝胶制备领域，涉及多功能羧甲基壳聚糖/透明质酸水凝胶及制备方法和应用。


背景技术：

2.药物传输系统在生物医学领域中应用较为广泛，因为它们能够在需要时提供药物分子的控制和持续释放到靶点。此外，理想的局部给药输送系统需要具有良好的优异的机械性和生物相容性，并可以以微创的方式与受创部位接触，从而达到治疗疾病的目的。近年来，在局部给药系统的研发中，水凝胶因其独特的性质而受到了广泛的关注。水凝胶是由物理或化学交联制备的三维聚合物网络，它可以模拟天然细胞外基质(ecm)或组织的物理化学性质，并且它能够在保持原始结构的同时保持和保留大量的水，因此它可以很容易的将水溶性药物分子包载其中，而不影响药物的治疗效果。此外，可以通过改变水凝胶交联类型、聚合物的浓度以及化学成分来赋予水凝胶不同的性能，比如机械性能，ph响应性能，溶胀性能，降解性能和载药能力等。
3.目前，名称为《壳聚糖/无机金属盐水凝胶复合水凝胶及其制备方法》的中国专利，采用甲醛或乙醛水溶液作为交联剂，得到壳聚糖/无机金属盐/交联剂水溶液水凝胶。名称为《壳聚糖/氧化石墨烯水凝胶及其制备方法》的中国专利，以戊二醛为交联剂制备得到用于新型复合止血材料的水凝胶。名称为《一种可注射载双药物复合壳聚糖水凝胶及其制备方法》的中国专利，包括壳聚糖溶液/脂质体/抗生素/羟基磷灰石，采用钙离子和戊二醛进行交联得到。名称为《一种双键白芨多糖-羧甲基壳聚糖凝胶和制备方法及其应用》的中国专利，其凝胶具有止血快、与创面贴合牢度好、适用于不规则创口、安全、环保、可降解的优势，适合作为医用材料，包括白芨多糖-羧甲基壳聚糖，在紫外光下进行原位固化制得双键白芨多糖-羧甲基壳聚糖凝胶。
4.然而，以上这些方法制备的水凝胶在药物传输系统的应用中有许多局限性，比如制备工艺复杂，凝胶化时间长；因其具有固定的形状导致无法准确匹配缺陷组织的形状；并且机械性能较差，又无法立即自愈合从而导致功能丧失。除此之外，当水凝胶与受损部位接触时也会引起体内的感染和炎症的发生，这些问题极大地限制了水凝胶在药物传输系统领域的应用。


技术实现要素：

5.为了得到可注射多功能性水凝胶，本发明提供多功能羧甲基壳聚糖/透明质酸水凝胶及制备方法和应用，原料简单易得，具有可注射性、优异的机械性能、自愈合性，ph响应性、抗菌性能、高载药量以及高药物持续释放量。
6.为达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
7.多功能羧甲基壳聚糖/透明质酸水凝胶的制备方法，包括如下步骤：
8.s1，将季铵化羧甲基壳聚糖溶液、醛基化改性的透明质酸溶液、己二酸二酰肼酸溶
液和氯化钙溶液混合均匀，其中季铵化羧甲基壳聚糖、醛基化改性的透明质酸、己二酸二酰肼酸和氯化钙的质量比为6:18：(1-3)：1，得到混合液；
9.s2，将混合液在25-37℃下自然冷却成型，得到多功能羧甲基壳聚糖/透明质酸水凝胶。
10.优选的，s1中，季铵化羧甲基壳聚糖溶液、醛基化改性的透明质酸溶液和己二酸二酰肼酸溶液的溶剂均为pbs磷酸缓冲液。
11.进一步，s1中，季铵化羧甲基壳聚糖溶液的浓度为60mg/ml，醛基化改性的透明质酸溶液的浓度为90mg/ml，己二酸二酰肼酸溶液和氯化钙溶液的浓度均为100mg/ml。
12.优选的，s1中，季铵化羧甲基壳聚糖按如下过程制备得到：
13.在浓度为21.8g/l的羧甲基壳聚糖水溶液中三甲基缩水甘油酯氯化铵，所述羧甲基壳聚糖和三甲基缩水甘油酯氯化铵的质量比为21.8：4.5，在50-60℃下反应44-52h，之后将得到的反应液依次进行透析、冷冻干燥，得到季铵化羧甲基壳聚糖。
14.优选的，s1中，醛基化改性的透明质酸按如下过程制备得到：
15.在浓度为10mg/ml的透明质酸溶液中加入浓度为0.3m的高碘酸钠溶液，高碘酸钠溶液和透明质酸溶液的体积比为(5-10)：100，之后于避光的条件下室温反应2-6h，之后将得到的反应液依次进行透析、冷冻干燥，得到醛基化改性的透明质酸。
16.进一步，得到的反应液均用去离子水透析2-4天，每天更换2-5次去离子水，然后再冷冻干燥。
17.进一步，所述的冷冻干燥均在-50℃至-30℃下进行40-48h。
18.优选的，s2中所述的混合液在25-37℃下于模具中自然冷却1-5min。
19.一种由上述任意一项所述的多功能羧甲基壳聚糖/透明质酸水凝胶的制备方法得到的多功能羧甲基壳聚糖/透明质酸水凝胶。
20.多功能羧甲基壳聚糖/透明质酸水凝胶在负载阿司匹林中的应用。
21.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
22.本发明多功能羧甲基壳聚糖/透明质酸水凝胶的制备方法，己二酸二酰肼和ca
2+
充当交联剂，而季铵化羧甲基壳聚糖和醛基化改性的透明质酸充当基材，在自然冷却成型中通过动态席夫碱(亚胺键、酰腙键)以及醛基化改性的透明质酸中的羧基和无水氯化钙的钙离子形成的离子键之间的相互作用得到该水凝胶，具有可注射性、优异的机械性能、自愈合性，ph响应性、抗菌性能、高载药量以及高药物持续释放量，可以满足药物传输系统对材料和结构的要求。可注射性和自愈合性主要是由于在生理条件下通过季铵化羧甲基壳聚糖的氨基和醛基化改性的透明质酸的醛基基团之间可逆的亚胺键，以及醛基化改性的透明质酸中的醛基和己二酸二酰肼中的氨基形成的酰腙键之间相互作用构建的动态网络，酰腙键有助于ph响应性和保证优异的机械性能，抗菌性能是由于羧甲基壳聚糖中季铵基的存在使得水凝胶具有良好的抗菌性能。
23.本发明的多功能羧甲基壳聚糖/透明质酸水凝胶，以动态席夫碱(亚胺键，酰腙键)和离子键为主体，使得水凝胶具有优异的机力学性能，自愈合性能和抗菌性能，是一种很有前途的药物递送载体，可以用作药物输送系统的载体。该水凝胶具有显著的力学性能(压缩应力可达896.30kpa)、可控的孔隙结构、良好的自愈能力(可达94％)和良好的ph响应性。此外，该水凝胶在体内可以自然降解，降解产物无毒副作用。
24.本发明的多功能羧甲基壳聚糖/透明质酸水凝胶在负载阿司匹林时，具有较高载药量和缓释性能。
附图说明
25.图1为本发明制备出的水凝胶结构示意图；
26.图2a是实施例4所得的可注射多功能羧甲基壳聚糖/透明质酸水凝胶的可从针管中注射实物图。
27.图2b是实施例4所得的可注射多功能羧甲基壳聚糖/透明质酸水凝胶的可注射到小瓶中的实物图。
28.图2c是实施例4所得的可注射多功能羧甲基壳聚糖/透明质酸水凝胶的可书写sust字样实物图。
29.图2d为本发明实施例4的溶液混合过程示意图；
30.图3是实施例4所得的可注射多功能羧甲基壳聚糖/透明质酸水凝胶实物图。
31.图4是实施例4所得的可注射多功能羧甲基壳聚糖/透明质酸水凝胶自愈合实物图。
32.图5a是实施例1所得的可注射多功能羧甲基壳聚糖/透明质酸水凝胶500μm下的sem图。
33.图5b是实施例2所得的可注射多功能羧甲基壳聚糖/透明质酸水凝胶500μm下的sem图。
34.图5c是实施例3所得的可注射多功能羧甲基壳聚糖/透明质酸水凝胶500μm下的sem图。
35.图5d是实施例4所得的可注射多功能羧甲基壳聚糖/透明质酸水凝胶500μm下的sem图。
36.图6是实施例1-4所得的可注射多功能羧甲基壳聚糖/透明质酸水凝胶的压缩测试图。
37.图7是实施例1-4所得的可注射多功能羧甲基壳聚糖/透明质酸水凝胶的载药量图。
38.图8a是本发明实施例1-4所得的可注射多功能羧甲基壳聚糖/透明质酸水凝胶载药后在ph＝4下的药物释放量图。
39.图8b为是本发明实施例1-4所得的可注射多功能羧甲基壳聚糖/透明质酸水凝胶载药后在ph＝7.4下的药物释放量图。
40.图8c为是本发明实施例1-4所得的可注射多功能羧甲基壳聚糖/透明质酸水凝胶载药后在ph＝10下的药物释放量图。
41.图9是对照组和本发明实施例1-4所得的可注射多功能羧甲基壳聚糖/透明质酸水凝胶细胞增殖率图。
42.图10是实施例1-4所得的可注射多功能羧甲基壳聚糖/透明质酸水凝胶的抗菌性能图。
具体实施方式
43.下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
44.本发明一种可注射多功能羧甲基壳聚糖/透明质酸水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
45.步骤1，将羧甲基壳聚糖溶解在100ml去离子水中，得到浓度为21.8g/l的羧甲基壳聚糖溶液，然后加入三甲基缩水甘油酯氯化铵，使其浓度为4.5g/l，在50-60℃下反应44-52h，然后将反应产物透析，即用去离子水透析2-4天，透析过程中每天更换2-5次去离子水。最后透析液在-50℃至-30℃的冷冻干燥机中冷冻干燥40-48h，得到季铵化羧甲基壳聚糖。
46.季铵化羧甲基壳聚糖的化学结构式如下式所示：
[0047][0048]
步骤2，将0.06g步骤1得到的季铵化羧甲基壳聚糖溶解于1ml pbs磷酸缓冲液中，完全溶解后得到浓度为60mg/ml的季铵化羧甲基壳聚糖溶液(即qcs)。
[0049]
步骤3，将透明质酸溶解到100ml去离子水中，得到浓度为10mg/ml的透明质酸溶液，加入浓度为0.3m，5-10ml的高碘酸钠水溶液，在避光的条件下于室温中反应2-6h，之后加入乙二醇停止反应，再搅拌1h，然后将反应产物用去离子水透析2-4天，透析过程中每天更换2-5次去离子水，最后将得到的透析液在-50℃至-30℃的冷冻干燥机中冷冻干燥40-48h，得到醛基化改性的透明质酸。
[0050]
醛基化改性的透明质酸的化学结构式如下式所示：
[0051][0052]
步骤4，将0.18g步骤3得到的醛基化改性的透明质酸溶解于2ml pbs磷酸缓冲液中，完全溶解后得到浓度为90mg/ml的醛基化改性的透明质酸溶液(即oha)。
[0053]
步骤5，将0.02g己二酸二酰肼酸溶解于200μl pbs磷酸缓冲液中，完全溶解后得到浓度为100mg/ml的己二酸二酰肼酸溶液(即adh)。
[0054]
步骤6，将0.01g无水氯化钙溶解于100μl去离子水中，完全溶解后得到浓度为100mg/ml的氯化钙溶液。
[0055]
步骤7，按1：2：(0.1-0.3)：0.1的体积比，将步骤2得到的季铵化羧甲基壳聚糖溶液和步骤4得到的醛基化改性的透明质酸溶液加入由步骤5得到的己二酸二酰肼酸溶液和步骤6得到的氯化钙溶液组成的混合液中，在25-37℃反应1-5min后置于模具中，然后在室温下自然冷却成型，获得可注射多功能羧甲基壳聚糖/透明质酸水凝胶。
[0056]
参见图1所展示的水凝胶交联机理，以季铵化羧甲基壳聚糖和醛基化改性的透明质酸为基材，以己二酸二酰肼和无水氯化钙为交联剂，通过季铵化羧甲基壳聚糖中的氨基
和醛基化改性的透明质酸中的醛基形成的动态亚胺键、醛基化改性的透明质酸中的醛基和己二酸二酰肼中的氨基形成的酰腙键以及醛基化改性的透明质酸中的羧基和无水氯化钙的钙离子形成的离子键的相互作用制备得到了具有可注射性、优异的机械性能、自愈合性，ph响应性、抗菌性能、高载药量以及药物持续释放的羧甲基壳聚糖/透明质酸水凝胶，其中可注射性和自愈合性主要是由于在生理条件下通过季铵化羧甲基壳聚糖的氨基和醛基化改性的透明质酸的醛基基团之间可逆的亚胺键、酰腙键和离子键之间相互作用构建的动态网络，而酰腙键有助于ph响应性和保证优异的机械性能，抗菌性能是由于季铵化羧甲基壳聚糖中季铵基团的存在使得水凝胶具有良好的抗菌性能。
[0057]
实施例1
[0058]
本发明一种可注射多功能羧甲基壳聚糖/透明质酸水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
[0059]
步骤1，取一定量羧甲基壳聚糖溶解到100ml去离子水中，得到100ml浓度为21.8g/l羧甲基壳聚糖溶液，然后加入0.45g三甲基缩水甘油酯氯化铵，在55℃下反应48h，然后将反应产物透析，即用去离子水透析3天，透析过程中每天更换3次去离子水。最后透析液在-40℃的冷冻干燥机中冷冻干燥48h，得到季铵化羧甲基壳聚糖。
[0060]
步骤2，将0.06g步骤1得到的季铵化羧甲基壳聚糖溶解于1ml pbs磷酸缓冲液中，完全溶解后得到浓度为60mg/ml的季铵化羧甲基壳聚糖溶液。
[0061]
步骤3，取一定量透明质酸溶解到100ml去离子水中，得到100ml浓度为10mg/ml透明质酸溶液，加入5ml，浓度为0.3m高碘酸钠水溶液，避光室温反应6h后加入1ml乙二醇停止反应，继续搅拌1h，然后将反应产物透析，即用去离子水透析3天，透析过程中每天更换3次去离子水。最后透析液在-40℃的冷冻干燥机中冷冻干燥48h，得到醛基化改性的透明质酸。
[0062]
步骤4，将0.18g步骤3得到的醛基化改性的透明质酸溶解于2ml pbs磷酸缓冲液中，完全溶解后得到浓度为90mg/ml的醛基化改性的透明质酸溶液。
[0063]
步骤5，取步骤2中制得的溶液加入步骤4所得的溶液中，混合体积比为1：2，于37℃下反应3min后转移到模具中，然后在室温下自然冷却成型，得到羧甲基壳聚糖/透明质酸水凝胶(qcs+oha)。
[0064]
实施例2
[0065]
本发明一种可注射多功能羧甲基壳聚糖/透明质酸水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
[0066]
步骤1，取一定量羧甲基壳聚糖溶解到100ml去离子水中，得到100ml浓度为21.8g/l羧甲基壳聚糖溶液，然后加入0.45g三甲基缩水甘油酯氯化铵，在55℃下反应48h，然后将反应产物透析，即用去离子水透析3天，透析过程中每天更换3次去离子水。最后透析液在40℃的冷冻干燥机中冷冻干燥48h，得到季铵化羧甲基壳聚糖。
[0067]
步骤2，将0.06g步骤1得到的季铵化羧甲基壳聚糖溶解于1ml pbs磷酸缓冲液中，完全溶解后得到浓度为60mg/ml的季铵化羧甲基壳聚糖溶液。
[0068]
步骤3，取一定量透明质酸溶解到100ml去离子水中，得到100ml浓度为10mg/ml透明质酸溶液，加入5ml，浓度为0.3m高碘酸钠水溶液，避光室温反应6h后加入乙二醇停止反应，继续搅拌1h，然后将反应产物透析，即用去离子水透析3天，透析过程中每天更换3次去离子水。最后透析液在-40℃至-30℃的冷冻干燥机中冷冻干燥48h，得到醛基化改性的透明
质酸。
[0069]
步骤4，将0.18g步骤3得到的醛基化改性的透明质酸溶解于2ml pbs磷酸缓冲液中，完全溶解后得到浓度为90mg/ml的醛基化改性的透明质酸溶液。
[0070]
步骤5，将0.01g无水氯化钙溶解于100μl去离子水中，完全溶解后得到无水氯化钙的浓度为100mg/ml。
[0071]
步骤6，取步骤2制得的溶液和步骤5中制得的溶液依次加入步骤4所得的溶液中，混合体积比为1：0.1：2，于37℃下充分反应2min后转移到模具中，然后在室温下自然冷却成型，得到羧甲基壳聚糖/透明质酸水凝胶(qcs+oha+ca
2+
)。
[0072]
实施例3
[0073]
本发明一种可注射多功能羧甲基壳聚糖/透明质酸水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
[0074]
步骤1，取一定量羧甲基壳聚糖溶解到100ml去离子水中，得到100ml浓度为21.8g/l羧甲基壳聚糖溶液，然后加入0.45g三甲基缩水甘油酯氯化铵，在55℃下反应48h，然后将反应产物透析纯化，即用去离子水透析3天，透析过程中每天更换3次去离子水。最后透析液在-40℃的冷冻干燥机中冷冻干燥48h，得到季铵化羧甲基壳聚糖。
[0075]
步骤2，将0.06g步骤1得到的季铵化羧甲基壳聚糖溶解于1ml pbs磷酸缓冲液中，完全溶解后得到浓度为60mg/ml的季铵化羧甲基壳聚糖溶液。
[0076]
步骤3，取一定量透明质酸溶解到100ml去离子水中，得到100ml浓度为10mg/ml透明质酸溶液，加入5ml，浓度为0.3m高碘酸钠水溶液，避光室温反应6h后加入乙二醇停止反应，继续搅拌1h，然后将反应产物透析，即用去离子水透析3天，透析过程中每天更换3次去离子水。最后透析液在-40℃的冷冻干燥机中冷冻干燥48h，得到醛基化改性的透明质酸。
[0077]
步骤4，将0.18g步骤3得到的醛基化改性的透明质酸溶解于2ml pbs磷酸缓冲液中，完全溶解后得到浓度为90mg/ml的醛基化改性的透明质酸溶液。
[0078]
步骤5，将0.02g己二酸二酰肼溶解于200μlpbs磷酸缓冲液中，完全溶解后得到浓度为100mg/ml的己二酸二酰肼溶液。
[0079]
步骤6，取步骤2制得的溶液和步骤5中制得的溶液依次加入步骤4所得的溶液中，混合体积比为1：0.2：2，于37℃下充分反应2min后转移到模具中，然后在室温下自然冷却成型，得到羧甲基壳聚糖/透明质酸水凝胶(qcs+oha+adh)。
[0080]
实施例4
[0081]
本发明一种可注射多功能羧甲基壳聚糖/透明质酸水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
[0082]
步骤1，取一定量羧甲基壳聚糖溶解到100ml去离子水中，得到100ml浓度为21.8g/l羧甲基壳聚糖溶液，然后加入0.45g三甲基缩水甘油酯氯化铵，在55℃下反应48h，然后将反应产物透析纯化，即用去离子水透析3天，透析过程中每天更换3次去离子水。最后透析液在-40℃的冷冻干燥机中冷冻干燥48h，得到季铵化羧甲基壳聚糖。
[0083]
步骤2，将0.06g步骤1得到的季铵化羧甲基壳聚糖溶解于1ml pbs磷酸缓冲液中，完全溶解后得到浓度为60mg/ml的季铵化羧甲基壳聚糖溶液。
[0084]
步骤3，取一定量透明质酸溶解到100ml去离子水中，得到100ml浓度为10mg/ml透明质酸溶液，加入5ml，浓度为0.3m高碘酸钠水溶液，避光室温反应6h后加入乙二醇停止反
应，继续搅拌1h，然后将反应产物透析纯化，即用去离子水透析3天，透析过程中每天更换3次去离子水。最后透析液在-40℃的冷冻干燥机中冷冻干燥48h，得到醛基化改性的透明质酸。
[0085]
步骤4，将0.18g步骤3得到的醛基化改性的透明质酸溶解于2ml pbs磷酸缓冲液中，完全溶解后得到浓度为90mg/ml的醛基化改性的透明质酸溶液。
[0086]
步骤5，将0.02g己二酸二酰肼溶解于200μlpbs磷酸缓冲液中，完全溶解后得到浓度为100mg/ml的己二酸二酰肼溶液。
[0087]
步骤6，将0.01g无水氯化钙溶解于100μl去离子水中，完全溶解后得到浓度为100mg/ml的氯化钙溶液。
[0088]
步骤7，取步骤2，步骤5和步骤6中制得的溶液依次加入步骤4所得的溶液中，如图2d所示，混合体积比为1：0.2：0.1：2，于37℃下充分反应2min后转移到模具中，然后在室温下自然冷却成型，得到可注射多功能羧甲基壳聚糖/透明质酸水凝胶(qcs+oha+adh+ca
2+
)。
[0089]
实施例5
[0090]
本发明一种可注射多功能羧甲基壳聚糖/透明质酸水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
[0091]
步骤1，取一定量羧甲基壳聚糖溶解到100ml去离子水中，得到100ml浓度为21.8g/l羧甲基壳聚糖溶液，然后加入0.45g三甲基缩水甘油酯氯化铵，在55℃下反应48h，然后将反应产物透析纯化，即用去离子水透析3天，透析过程中每天更换3次去离子水。最后透析液在-40℃的冷冻干燥机中冷冻干燥48h，得到季铵化羧甲基壳聚糖。
[0092]
步骤2，将0.06g步骤1得到的季铵化羧甲基壳聚糖溶解于1ml pbs磷酸缓冲液中，完全溶解后得到浓度为60mg/ml的季铵化羧甲基壳聚糖溶液。
[0093]
步骤3，取一定量透明质酸溶解到100ml去离子水中，得到100ml浓度为10mg/ml透明质酸溶液，加入5ml，浓度为0.3m高碘酸钠水溶液，避光室温反应6h后加入乙二醇停止反应，继续搅拌1h，然后将反应产物透析纯化，即用去离子水透析3天，透析过程中每天更换3次去离子水。最后透析液在-40℃的冷冻干燥机中冷冻干燥48h，得到醛基化改性的透明质酸。
[0094]
步骤4，将0.18g步骤3得到的醛基化改性的透明质酸溶解于2ml pbs磷酸缓冲液中，完全溶解后得到浓度为90mg/ml的醛基化改性的透明质酸溶液。
[0095]
步骤5，将0.02g己二酸二酰肼溶解于200μlpbs磷酸缓冲液中，完全溶解后得到浓度为100mg/ml的己二酸二酰肼溶液。
[0096]
步骤6，将0.01g无水氯化钙溶解于100μl去离子水中，完全溶解后得到浓度为100mg/ml的氯化钙溶液。
[0097]
步骤7，取步骤2，步骤5和步骤6中制得的溶液依次加入步骤4所得的溶液中，混合体积比为1：0.1：0.1：2，于25℃下充分反应5min后转移到模具中，然后在室温下自然冷却成型，得到可注射多功能羧甲基壳聚糖/透明质酸水凝胶(qcs+oha+adh+ca
2+
)。
[0098]
实施例6
[0099]
本发明一种可注射多功能羧甲基壳聚糖/透明质酸水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
[0100]
步骤1，取一定量羧甲基壳聚糖溶解到100ml去离子水中，得到100ml浓度为21.8g/
l羧甲基壳聚糖溶液，然后加入0.45g三甲基缩水甘油酯氯化铵，在50℃下反应48h，然后将反应产物透析纯化，即用去离子水透析3天，透析过程中每天更换5次去离子水。最后透析液在-45℃的冷冻干燥机中冷冻干燥40h，得到季铵化羧甲基壳聚糖。
[0101]
步骤2，将0.06g步骤1得到的季铵化羧甲基壳聚糖溶解于1ml pbs磷酸缓冲液中，完全溶解后得到浓度为60mg/ml的季铵化羧甲基壳聚糖溶液。
[0102]
步骤3，取一定量透明质酸溶解到100ml去离子水中，得到100ml浓度为10mg/ml透明质酸溶液，加入5ml，浓度为0.3m高碘酸钠水溶液，避光室温反应6h后加入乙二醇停止反应，继续搅拌1h，然后将反应产物透析纯化，即用去离子水透析3天，透析过程中每天更换3次去离子水。最后透析液在-40℃的冷冻干燥机中冷冻干燥48h，得到醛基化改性的透明质酸。
[0103]
步骤4，将0.18g步骤3得到的醛基化改性的透明质酸溶解于2ml pbs磷酸缓冲液中，完全溶解后得到浓度为90mg/ml的醛基化改性的透明质酸溶液。
[0104]
步骤5，将0.02g己二酸二酰肼溶解于200μlpbs磷酸缓冲液中，完全溶解后得到浓度为100mg/ml的己二酸二酰肼溶液。
[0105]
步骤6，将0.01g无水氯化钙溶解于100μl去离子水中，完全溶解后得到浓度为100mg/ml的氯化钙溶液。
[0106]
步骤7，取步骤2，步骤5和步骤6中制得的溶液依次加入步骤4所得的溶液中，混合体积比为1：0.3：0.1：2，于37℃下充分反应2min后转移到模具中，然后在室温下自然冷却成型，得到可注射多功能羧甲基壳聚糖/透明质酸水凝胶(qcs+oha+adh+ca
2+
)。
[0107]
图2a、图2b和图2c为水凝胶的可注射性能实物图，可以看出水凝胶有明显的可注射性，胶凝时间(～54s)保证了良好的注射性，图2a可以看出水凝胶可以从针管中挤出线形形状，图2b可以看出水凝胶可以从针管中挤出注射到小瓶中，图2c可以看出水凝胶可以从针管中挤出并可以书写成sust，即可形成任意形状，这写都说明了水凝胶具有良好的可注射性能。
[0108]
图3为水凝胶形成的圆形薄片实物图，可以看到其外观结构比较完整且弹性较好。
[0109]
图4中，将水凝胶切成相同的两块，用亚甲基蓝染色其中的一块，将它们放在模具中，当接触120min后两者逐渐结合，用镊子将两端夹紧拉伸后新的水凝胶没有断开，因此该水凝胶具有良好的自愈性能。
[0110]
从图5a、图5b、图5c和图5d的扫描电镜图可以发现水凝胶呈现均匀多孔结构，使水凝胶有较高的载药量和持续的药物释放能力。从图5a，5b，5c可以看出，水凝胶的孔洞结构较大，壁薄且不均匀，从图5d的孔洞结构较均匀。
[0111]
图6的压缩测试是通过万能试验机在传感器3000n，速率为5mm/min时测得的应应力-压缩应变曲线。实施例1，实施例2，实施例3，实施例4分别代表qcs+oha，qcs+oha+ca
2+
，qcs+oha+adh，qcs+oha+adh+ca
2+
条件下得到的水凝胶。从图6中可以看出，qcs+oha+adh+ca
2+
条件下得到的水凝胶的应力-压缩应变最高，说明席夫碱(亚胺键，酰腙键)和离子键之间的相互作用可以提高水凝胶的压缩性能。
[0112]
参见图7，以乙酰水杨酸(即阿司匹林，asa)为药物模型负载到水凝胶中，并探究其药物分子在水凝胶的载药量和释放行为。实施例1，实施例2，实施例3，实施例4分别代表qcs+oha，qcs+oha+ca
2+
，qcs+oha+adh，qcs+oha+adh+ca
2+
条件下得到的水凝胶，是通过溶剂吸
附法将阿司匹林负载到水凝胶上，从图中可以看出，由于qcs+oha，qcs+oha+ca
2+
，qcs+oha+adh三个条件下的得到的水凝胶内部孔洞结构较大，壁薄且不均匀导致其药物更容易负载其中，而qcs+oha+adh+ca
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得到的水凝胶内部孔洞结构较其他三组得到的水凝胶的孔洞结构较小且比较均匀，因此药物负载稍低于其他三组，各个条件下的水凝胶对药物阿司匹林的负载量都超过120mg/g，说明水凝胶对药物阿司匹林有良好的负载能力。
[0113]
图8a、图8b和图8c中阿司匹林的释放在温度为37℃、转速为120rpm的水浴摇床中进行。具体是将阿司匹林负载的水凝胶分别置于ph＝4、ph＝7.4和ph＝10的pbs溶液中，每间隔1h后取2ml释放后的混合溶液，用紫外光谱法得到释放量，加入2ml的pbs溶液，以保持整个溶液的体积保持恒定。由于酸性环境中亚胺键和酰腙键的水解速率非常快，因此在ph为4的环境中，药物释放速率最高，之后依次为ph＝7.4和ph＝10。在ph＝4时、72h时，qcs+oha水凝胶的药物释放量为90.82％，qcs+oha+ca
2+
水凝胶的药物释放量为84.37％，qcs+oha+adh水凝胶的药物释放量为78.60％，qcs+oha+ca
2+
+adh水凝胶的药物释放量为75.18％。在ph＝7.4时、72h时，qcs+oha水凝胶的药物释放量为78.63％，qcs+oha+ca
2+
水凝胶的药物释放量为75.92％，qcs+oha+adh水凝胶的药物释放量为70.42％，qcs+oha+ca
2+
+adh水凝胶的药物释放量为66.83％。在ph＝10、72h时，qcs+oha水凝胶的药物释放量为75.84％，qcs+oha+ca
2+
水凝胶的药物释放量为71.83％，qcs+oha+adh水凝胶的药物释放量为66.00％，qcs+oha+ca
2+
+adh水凝胶的药物释放量为61.36％。因此图8a、图8b和图8c说明实施例1、实施例2、实施例3和实施例4制备的水凝胶在ph为4、7.4和10的环境中有持续的药物释放行为(≥72h)。
[0114]
图9是通过mtt直接接触法检测小鼠成纤维细胞(l929)的细胞增殖情况，从图中可以看出，在分别细胞培养1天、3天、5天后，加入本发明制备的水凝胶的实验组与未加入本发明水凝胶的对照组的细胞活力od值无明显差异，细胞增殖率超过98％，因此表明本发明制备的水凝胶具有良好的细胞相容性。
[0115]
图10是通过打孔法，用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌测试水凝胶的抗菌性能，可以看出每个水凝胶周围都有明显的抑菌圈，但是实例4中的水凝胶中的抑菌圈明显高于其他三组，抑菌圈越大说明抑菌效果越好，因此可以表明本发明制备的水凝胶具有良好的抗菌性能。

技术特征：
1.多功能羧甲基壳聚糖/透明质酸水凝胶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：s1，将季铵化羧甲基壳聚糖溶液、醛基化改性的透明质酸溶液、己二酸二酰肼酸溶液和氯化钙溶液混合均匀，其中季铵化羧甲基壳聚糖、醛基化改性的透明质酸、己二酸二酰肼酸和氯化钙的质量比为6:18：(1-3)：1，得到混合液；s2，将混合液在25-37℃下自然冷却成型，得到多功能羧甲基壳聚糖/透明质酸水凝胶。2.根据权利要求1所述的多功能羧甲基壳聚糖/透明质酸水凝胶的制备方法，其特征在于，s1中，季铵化羧甲基壳聚糖溶液、醛基化改性的透明质酸溶液和己二酸二酰肼酸溶液的溶剂均为pbs磷酸缓冲液。3.根据权利要求2所述的多功能羧甲基壳聚糖/透明质酸水凝胶的制备方法，其特征在于，s1中，季铵化羧甲基壳聚糖溶液的浓度为60mg/ml，醛基化改性的透明质酸溶液的浓度为90mg/ml，己二酸二酰肼酸溶液和氯化钙溶液的浓度均为100mg/ml。4.根据权利要求1所述的多功能羧甲基壳聚糖/透明质酸水凝胶的制备方法，其特征在于，s1中，季铵化羧甲基壳聚糖按如下过程制备得到：在浓度为21.8g/l的羧甲基壳聚糖水溶液中三甲基缩水甘油酯氯化铵，所述羧甲基壳聚糖和三甲基缩水甘油酯氯化铵的质量比为21.8：4.5，在50-60℃下反应44-52h，之后将得到的反应液依次进行透析、冷冻干燥，得到季铵化羧甲基壳聚糖。5.根据权利要求1所述的多功能羧甲基壳聚糖/透明质酸水凝胶的制备方法，其特征在于，s1中，醛基化改性的透明质酸按如下过程制备得到：在浓度为10mg/ml的透明质酸溶液中加入浓度为0.3m的高碘酸钠溶液，高碘酸钠溶液和透明质酸溶液的体积比为(5-10)：100，之后于避光的条件下室温反应2-6h，之后将得到的反应液依次进行透析、冷冻干燥，得到醛基化改性的透明质酸。6.根据权利要求4或5所述的多功能羧甲基壳聚糖/透明质酸水凝胶的制备方法，其特征在于，得到的反应液均用去离子水透析2-4天，每天更换2-5次去离子水，然后再冷冻干燥。7.根据权利要求6所述的多功能羧甲基壳聚糖/透明质酸水凝胶的制备方法，其特征在于，所述的冷冻干燥均在-50℃至-30℃下进行40-48h。8.根据权利要求1所述的多功能羧甲基壳聚糖/透明质酸水凝胶的制备方法，其特征在于，s2中所述的混合液在25-37℃下于模具中自然冷却1-5min。9.一种由权利要求1-8中任意一项所述的多功能羧甲基壳聚糖/透明质酸水凝胶的制备方法得到的多功能羧甲基壳聚糖/透明质酸水凝胶。10.如权利要求9所述的多功能羧甲基壳聚糖/透明质酸水凝胶在负载阿司匹林中的应用。

技术总结
本发明提供多功能羧甲基壳聚糖/透明质酸水凝胶及制备方法和应用，所述方法包括如下步骤：将季铵化羧甲基壳聚糖溶液、醛基化改性的透明质酸溶液、己二酸二酰肼酸溶液和氯化钙溶液混合均匀，其中季铵化羧甲基壳聚糖、醛基化改性的透明质酸、己二酸二酰肼酸和氯化钙的质量比为6:18：(1-3)：1，得到混合液；将混合液在25-37℃下自然冷却成型，得到多功能羧甲基壳聚糖/透明质酸水凝胶。该水凝胶具有可注射性、优异的机械性能、自愈合性，pH响应性、抗菌性能、高载药量以及高药物持续释放量。高载药量以及高药物持续释放量。高载药量以及高药物持续释放量。


技术研发人员：张素风 张凤娇 崔书源 林瑞 景小凯
受保护的技术使用者：陕西科技大学
技术研发日：2023.05.11
技术公布日：2023/7/7