一种免组培获得茶树转基因根的高效诱导方法

1.本发明属于作物遗传育种技术领域，尤其涉及一种免组培获得茶树转基因发根的高效诱导方法。


背景技术：

2.茶树是重要经济作物，茶树遗传转化体系作为分子精准育种和基因功能研究的辅助工具，是茶树种质资源和创新领域的关键技术。传统茶树遗传转化是在组织培养条件下通过农杆菌共培养转化实现的。植物组织培养需要耗费大量时间、物质和人力，主要原因有以下几点：
3.1)实验条件严格：组织培养需要严格控制生长环境，包括ph值、氧气含量、营养盐浓度、激素浓度等，因此需要建立一个严格控制的实验室。
4.2)需要有高超的技术：植物组织培养需要技术娴熟的人员进行操作，需要对生物学、化学等学科有深刻的理解和掌握，熟练掌握组织培养技术和操作规范。
5.3)大量的试验设备和耗材：进行组织培养需要使用一系列的仪器设备和消耗品，如培养基、培养皿、洗涤溶液、试管、移液管等。
6.4)常常存在失败的风险：由于组织培养的复杂性和操作条件的严格要求，常常存在失败的风险，因此需要耗费大量时间和物质资源用于尝试不同的培养方案和操作方法。
7.5)研究周期长：植物组织培养是一项长周期的研究，需要在不同的生长阶段进行观察和分析，通常需要几个月甚至几年时间。
8.正因为上述不足，在茶树中往往存在以下问题：1、外植体因为消毒不彻底会导致污染率高；2、过度消毒则会因为茶树本身的多酚类物质发生氧化，导致植株褐化死亡；3、共培养阶段的抑菌剂在去除农杆菌的过程中也会对外植体产生负面作用。故而导致现有遗传转化体系培养周期长、操作繁琐、转化效率低，制约了研究的进展和应用的开发。
9.本发明实现了无需组织培养进行遗传转化的技术方案，将从大田获得的茶树枝条、叶片作为材料，在开放条件下扦插于蛭石培养基中，建立了非组培条件下发根农杆菌介导的茶树遗传转化体系。


技术实现要素：

10.本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种免组培获得转基因发根的高效诱导方法。
11.一种用茶树枝条或叶片免组培获得转基因发根的高效诱导方法，包括以下步骤：
12.步骤s1、植物材料预处理：
13.将茶树枝条或者茶树叶片作为植物材料浸没在同时携带荧光报告基因-目的基因的发根农杆菌菌液中，以保证茶树枝条基部或者茶树叶片的叶柄基部被菌液浸润到；将浸没在发根农杆菌菌液内的植物材料在真空环境下，浸润10-60分钟，得到浸润后的植物材料；
14.作为优选，所述茶树枝条为当年生木质化或半木质化的茶树枝条；
15.作为优选，所述茶树叶片为当年生萌展40天以上的叶片；
16.作为优选，所述茶树叶片在浸润发根农杆菌菌液前，所述茶树叶片进行划伤处理，叶片保持不断裂，且在浸泡时菌液需浸润叶片伤口位置；
17.更为优选，所述划伤处理采用米字型划伤方式；
18.步骤s2、转基因毛状根的诱导
19.将浸润后的植物材料扦插于育苗盘中，确保植物材料的枝条基部、叶柄基部、叶片伤口被育苗盘内基质覆盖，其余部分露出空气中；育苗盘保持基质湿润不积水，移至人工气候室内培养30-60天，生成毛细根；
20.作为优选，所述人工气候室内环境具体是光周期为16h光照/8h黑暗，温度保持在22-26℃，湿度保持在70％～90％。
21.作为优选，所述育苗盘内基质采用灭菌纯蛭石。培养时育苗盘采用清水浇灌。
22.所述同时携带荧光报告基因和目的基因的发根农杆菌中的发根农杆菌采用atcc15834，具体制备过程如下：
23.将携带荧光报告基因-目的基因的atcc15834农杆菌菌株接种至含有100mg/l硫酸卡那霉素的ty固体培养基中划线培养，28℃恒温培养箱活化培养2天；分别挑取若干单菌落接种至含有100mg/l硫酸卡那霉素的ty液体培养基中，28℃，200rpm震荡培养12小时；随后将菌液按1:100的比例扩大培养至菌液od600＝1.0～1.2，5000rpm离心10分钟后收集菌液，弃上清，加入mes缓冲液重悬，调节od600＝0.8，黑暗28℃静置3-4小时备用。
24.本发明的另一个目的是提供一种茶树转基因植物，通过所述的方法构建而成。
25.本发明的有益效果是：
26.本发明只需要两个月即可获得转基因发根，多种茶树品种的叶片中均可成功转化。本发明方法操作简单，免组培方式大大减少了组培的繁琐流程；采用茶树枝条和叶片作为植物材料不受时间限制，不受品种限制；纯蛭石培养基、清水浇灌，具备操作简单、成本低、通量高、周期短等优点。此外，利用gfp标记基因配合手持激发光源，可实现转化子的批量、快速、低成本无损检测。
附图说明
27.图1免组培发根农杆菌介导的茶树遗传转化体系的建立(枝条)。
28.图21380-ovgfp质粒图谱。
29.图3
‘
水仙’茶树野生型(wt)、转基因(gfp)枝条不同发育时期。sx：品种为“水仙’茶树’的茶树(c.sinensis cv.fenghuangshuixian)
30.图4野生型和转基因毛状根中使用激光扫描共聚焦显微镜进行gfp验证(横、纵切面)(10倍镜)。
31.图5转基因毛状根中使用激光扫描共聚焦显微镜进行gfp亚细胞定位a：40倍、b：160倍。
32.图6
‘
水仙’茶树转基因毛状根常规pcr验证结果(1380-ovgfp)(目的片段460bp)。
33.图7(a)
‘
水仙’茶树毛状根rna提取，(b)
‘
水仙’茶树转基因毛状根rt-qpcr验证结果(1380-ovgfp)。
34.图8免组培发根农杆菌介导的茶树遗传转化体系的建立(叶片)。
35.图9
‘
水仙’茶树(sx)野生型(wt)、转基因(gfp)叶片不同发育时期。
36.图10
‘
水仙’茶树枝条不同部位划伤获得转基因愈伤或毛状根。
37.图11福鼎大白茶叶片不同部位划伤获得转基因毛状根(1-3叶片中部，4-6叶片底部)。
38.图12不同茶树品种野生型(wt)、转基因(gfp)叶片不同发育时期；(a)：fd即
‘
福鼎大白茶’(c.sinensis cv.fudingdabaicha)，(b)：hg即
‘
黄观音’(c.sinensis cv.huangguanyin)，(c)：lj即
‘
龙井1号’(c.sinensis cv.longjing 1)。
具体实施方式
39.下面结合具体实施例对本发明做进一步的分析。
40.实施例1：转基因植株
41.①
农杆菌转化
42.采用冻融法转化k599发根农杆菌感受态，采用电转法转化atcc15834发根农杆菌感受态，加入700μl无抗生素的ty液体培养基，28℃，200rpm振荡培养2h，6000rpm离心1min收菌。留取100μl左右上清轻轻吹打重悬菌块涂布于含相应抗生素的ty平板上(携带1380-ovgfp质粒的k599抗生素采用50mg/l硫酸卡那霉素和50mg/l链霉素，携带1380-ovgfp质粒的atcc15834抗生素采用100mg/l硫酸卡那霉素)，倒置放于28℃培养箱培养2-3d。挑取单菌落，经pcr鉴定和测序检测验证正确，摇菌后保存备用；
43.②
农杆菌活化及浸润液制备
44.将-80℃冰箱中保存的携带1380-ovgfp载体的k599和atcc15834农杆菌菌株接种至含有对应抗生素的ty固体培养基中划线培养，28℃恒温培养箱活化培养2天。分别挑取若干单菌落接种至含有不同抗生素的ty液体培养基中。28℃，200rpm震荡培养12h。随后将菌液按1:100的比例扩大培养至菌液od
600
＝1.0～1.2，5000rpm离心10min后收集菌液，弃上清，加入mes缓冲液重悬，调节od
600
＝0.8，黑暗28℃静置3-4h备用。
45.③
材料准备及真空浸润
46.采集不同基因型的茶树枝条和叶片进行实验。枝条选取生命力旺盛的、当年生、2/3以上半木质化枝条，沿斜角45
°
剪下，保持上端切口平整，插穗不破裂，插穗长度约为4～5cm，并携带1片叶子和1个芽；叶片选取成熟度较高(第4-6片真叶)、生长状态一致、无病虫害，保持叶柄完整，视叶片大小剪除1/3-1/2叶片，留下带叶柄部分。
47.将枝条切口或叶柄浸没在菌液中，以保证伤口处被菌液浸润到。将盛有菌液和材料的烧杯放置于连接有旋片式真空泵的真空干燥器中，抽至真空度为2pa，保持30min，之后将浸润过的材料扦插于灭菌蛭石中，育苗盘保持蛭石湿润不积水，移至人工气候室(光周期16h光照/8h黑暗，温度(24
±
2)℃，湿度70％～80％)培养。
48.实施例2：转基因植株阳性鉴定
49.①
手电筒式激发光源验证
50.实施例1典型的毛细根形成后，洗净材料，用大面积手电筒式激发光源通过滤光片观察毛状根是否有绿色荧光信号，来判定是否转化成功并进行统计。遗传转化效率用以下公式计算：【(具有gfp阳性根或愈伤组织的植株数量)/(存活的总植株数)】
×
100％。
51.②
激光扫描共聚焦显微镜验证
52.用去离子水洗净材料，以野生型
‘
水仙’茶树毛状根为对照，制作
‘
水仙’茶树转基因毛状根切片，使用激光扫描共聚焦显微镜(olympus fv3000)在明场通道和egfp通道下分别拍摄毛状根的横切面和纵切面扫描图，激发波长为488nm，发射波长为505-550nm，物镜为10倍、40倍。
53.③
pcr检测基因片段
54.提取茶树毛状根dna(ctab法)
55.(1)新鲜植物样品放入研钵，加入适量液氮，快速研磨成均匀粉末。
56.(2)加入1000μl ctab分离缓冲液，上下颠倒离心管，混合均匀。
57.(3)将装有样品的离心管金属浴65℃保持2小时。
58.(4)室温12,000rpm离心10min，取上清液700μl转移至新的离心管中，等体积700μl氯仿：异戊醇混合液(24：1)，颠倒混匀。
59.(5)室温12,000rpm离心10min，取上清液600μl转移至600μl异丙醇，轻轻混匀，-20℃或者冰上静置5min。
60.(6)室温12,000rpm离心10min，弃上清液，加入1ml 70％乙醇洗涤，室室温12,000rpm离心5min，去上清液，倒置离心管至dna干燥。加入30μl ddh2o充分溶解混匀。
61.对提取的dna进行pcr(dna聚合酶链式反应技术)扩增(表1、2)。使用特异性引物(1380-ovgfp-f、r)对1380-ovgfp载体进行验证；使用特异性引物(1380-ovmyb73-f、r)对1380-ovmyb73载体进行验证；使用特异性引物(1300-editmyb73-f、r)对1300-editmyb73载体进行验证。
62.表1pcr 50μl反应体系
[0063][0064][0065]
表2 pcr反应条件
[0066][0067]
pcr产物由1％琼脂糖凝胶检测目的基因条带是否符合预期。琼脂糖凝胶电泳胶：称取0.20g琼脂糖，加入20ml 1
×
tae中，加热煮沸至琼脂糖完全熔化后，重复加热步骤三次后取出，待冷却至不烫手，加入适量核酸染料，倒入放有适当梳子的电泳槽。
[0068]
④
rt-qpcr检测基因表达量
[0069]
使用universal plant total rnaisolation kit试剂盒提取根的总
rna，利用核酸定量仪和琼脂糖凝胶电泳检测总rna质量；按照hiscript ii 1st strand cdna synthesis kit试剂盒操作方法，将样品总rna反转录合成cdna第一链；cdna产物按照taq pro universal sybr qpcr master mix试剂盒体系，使用primer premier 5设计定量引物，1380-ovgfp-qpcr-f、r检测目的基因gfp表达量，csmyb73-qpcr-f、r检测目的基因csmyb73表达量，gapdh-qpcr-f、r检测内参基因gapdh表达量。
[0070]
将cdna 5倍稀释液作为模板进行定量实验，在ct值具备有效性的前提下，果利用2
–
δδct
的方法计算基因的表达量。
[0071]
表3 qpcr 20μl反应体系
[0072][0073][0074]
结果与分析
[0075]
1.发根农杆菌介导的茶树免组培遗传转化体系的建立及阳性鉴定
[0076]
以往的研究表明，传统的组织培养的手段对茶树进行遗传转化是困难且费时的，本发明提出无组织培养进行遗传转化，将从大田获得的茶树枝条作为受试植物材料，通过真空浸润的方式使发根农杆菌侵染植物材料基部伤口，在蛭石中培养一定周期后，利用便捷式手持激发光对转基因毛状根进行快速鉴定，成功建立了一个简单而快速的茶树遗传转化系统。简而言之，转化方案主要包括三个步骤：植物材料和农杆菌的制备、真空浸润和转基因毛状根的诱导，见图1。
[0077]
由于本发明中使用的农杆菌菌株含有gfp编码基因的双元表达载体1380-ovgfp(图2)，所以转基因组织依据gfp绿色荧光进行识别。荧光愈伤组织在蛭石中培养第3周后开始发育，并继续生长，直到第5-6周转基因毛状根出现。转基因根在第8周最终发展成一个完整和健康的根系(图3)。
[0078]
对转基因毛状根进行验证，通过激光扫描共聚焦显微镜观察发现，gfp的荧光在1380-ovgfp转基因
‘
水仙’茶树(sxgfp)根部中普遍分布。相反，在野生型
‘
水仙’茶树(sxwt)的根部没有发现gfp信号(图4)。在40倍物镜下，可以观察到细胞层面，发现1380-ovgfp载体定位在内质网上，与预期结果一致(图5)。
[0079]
另外通过分子层面的检测，提取转基因
‘
水仙’茶树毛状根的dna和rna，使用常规pcr可以扩增出具有预期长度的特异性片段(460bp)(图6)。rt-qpcr结果显示，gfp基因在转
基因
‘
水仙’茶树根中高度表达(图7)。在野生型
‘
水仙’茶树中，gfp序列不能被扩增，也不能检测到gfp的转录。
[0080]
以上实验结果证明，本发明利用发根农杆菌在免组培条件下转化茶树获得转基因植株的技术路径是可行的，gfp基因在毛状根内稳定表达，此外，本发明所开发的转化方案效率很高，因不需要组织培养，而是使用真空泵对植物材料进行批量处理。通过使用手持式荧光手电筒识别转化材料也是非常高效、省时和省力的。
[0081]
2.发根农杆菌k599、atcc15834介导的
‘
水仙’茶树的遗传转化效率分析
[0082]
为分析不同菌株的发根农杆菌的遗传转化效率是否不同，本发明使用2种菌株(atcc15834和k599)对
‘
水仙’茶树的枝条进行遗传转化。如表5所示，atcc1583的转化效率相较k599更高，达到10.00％，atcc15834介导的转化效率分别是k599的8.9倍。为分析不同浸润方法的遗传转化效率是否不同，本发明使用2种浸润方法(浸泡菌液30s或抽真空渗透30min)对
‘
水仙’茶树的枝条进行遗传转化。如表5所示，atcc15834通过真空浸润的转化效率提升了1.13倍，达到11.39％。k599通过真空浸润的转化效率提升了3.02倍，达到3.39％。因此，在后续的转化实验中，统一采用发根农杆菌atcc15834介导的真空浸润遗传转化。
[0083]
表5不同农杆菌菌株和处理方式对
‘
水仙’茶树枝条转化效率的影响注a：发根阳性率＝发根阳性数/植物材料总数
[0084][0085]
3.发根农杆菌介导的转化适用于茶树不同组织部位
[0086]
叶插法是花卉繁殖的常用方法，而在木本植物的扦插繁殖中，枝插是最为普遍的繁殖方法。而茶树叶片扦插存活率较其他木本植物普遍要高，叶柄伤口处容易形成愈伤组织(图8)，采用本发明的发根农杆菌介导的转化技术对
‘
水仙’茶树叶片进行处理，结果同样获得了转基因毛状根(图9)。
[0087]
比较
‘
水仙’茶树不同植物材料的转化效率(表6)，叶片(12.09％)明显高于枝条(5.82％)。在总结评价不同植物材料的优劣时，我们发现在生长速度上，叶片明显快于枝条，枝条30天左右形成愈伤组织，40天愈伤组织膨大，60天长出大量根，而叶片只需20天左右便可形成愈伤组织，30天愈伤组织膨大，40-45天长出根，这缩短了整个遗传转化的时间间隔；在转化效率上，叶片高于枝条，有利于完善整个遗传转化体系，为下一步基因功能研究提供大量、方便的转化材料；在发育成完整植株方面，枝条优于叶片，枝条扦插可以凭借短穗携带的腋芽继续发育成完整的茶树植株，而叶片在持续生长过程中，因为地上部缺少生长点最终会衰老死亡，但对基因功能验证完全满足需求；在获取便利上，骨干枝上叶片生长数量显著多于枝条数量，因为叶片的生长萌发较快，而枝条材料的选取更为苛刻，木质化程度太高茎段生根部位形成层细胞分裂活性下降，太嫩则会面临材料失水快，扦插成活率低。
[0088]
表6不同植物材料类型对
‘
水仙’茶树转化效率的影响
[0089][0090]
注a：发根阳性率＝发根阳性数/植物材料总数
[0091]
另外我们发现通过划伤多处伤口，并将整棵植物材料枝条的浸没在菌液中，结果表明这些伤口均可产生转基因愈伤组织或根，枝条不同部位的转化效率高低为：枝条基部＞中部皮层＞枝条顶端(表7)，而在叶片中划伤多处伤口，这些伤口也能以一定概率生成毛状根，通过扩大伤口数量的方法可以显著提升单株材料的阳性诱导率(45.58％)。
[0092]
表7
‘
水仙’茶树枝条不同部位的转化效率比较
[0093][0094]
注a：占比＝发根阳性数/(枝条基部+中部皮层+枝条顶部)
[0095]
图10
‘
水仙’茶树枝条不同部位划伤获得转基因愈伤或毛状根。图11福鼎大白茶叶片不同部位划伤获得转基因毛状根(1-3叶片中部，4-6叶片底部)。
[0096]
4.发根农杆菌介导的转化适用于不同基因型的茶树品种
[0097]
不同茶树品种对同一种发根农杆菌的敏感性不一，为了分析我们开发的转化体系对不同茶叶基因型的适用性，除
‘
水仙’茶树外，我们分析了三个常见茶树品种的叶片：福鼎大白茶(c.sinensis cv.fuding dabaicha)、黄观音(c.sinensiscv.huangguanyin)、龙井1号(c.sinensis cv.longjing 1)。实验结果表明不同基因型叶片均获得了不同水平的转化效率(表8)，效率高低为黄观音(14.23％)＞福鼎大白茶(13.69％)＞
‘
水仙’茶树(12.09％)＞龙井1号(4.20％)。所有测试的茶树品种都在2个月内获得了具有gfp荧光的转基因毛状根，表明农杆菌介导的转化对这些基因型是有效的(图12)，本发明体系可兼容比较广泛的茶树品种。尽管不同茶树基因型的转化效率不一，但由于符合实验要求的叶片植物材料很容易从大田中获得，研究人员可以同时对数百片叶片进行转化，且劳动强度较低，因此转基因毛状根很容易获得。
[0098]
表8不同茶树品种叶片对转化效率的影响
[0099]
[0100]
上述实施例中使用的引物见表9。
[0101]
表9引物
[0102]

技术特征：
1.一种免组培获得茶树转基因根的高效诱导方法，包括以下步骤：步骤s1、植物材料预处理：将茶树枝条或者茶树叶片作为植物材料浸没在同时携带荧光报告基因-目的基因的发根农杆菌菌液中，以保证茶树枝条基部或者茶树叶片的叶柄基部被菌液浸润到；将浸没在发根农杆菌菌液内的植物材料在真空环境下，浸润10-60分钟，得到浸润后的植物材料；步骤s2、转基因毛状根的诱导将浸润后的植物材料扦插于育苗盘中，确保植物材料的枝条基部、叶柄基部、叶片伤口被育苗盘内基质覆盖，其余部分露出空气中；育苗盘保持基质湿润不积水，移至人工气候室内培养30-60天，生成毛细根。2.根据权利要求1所述方法，其特征在于步骤s1中，所述茶树枝条为当年生木质化或半木质化的茶树枝条。3.根据权利要求1所述方法，其特征在于步骤s1中，所述茶树叶片为当年生萌展40天以上的叶片。4.根据权利要求1所述方法，其特征在于步骤s1中，所述茶树叶片在浸润发根农杆菌菌液前，所述茶树叶片进行划伤处理，叶片保持不断裂，且在浸泡时菌液需浸润叶片伤口位置。5.根据权利要求4所述方法，其特征在于步骤s1中，所述划伤处理采用米字型划伤方式。6.根据权利要求1所述方法，其特征在于步骤s2中，所述人工气候室内环境具体是光周期为16h光照/8h黑暗，温度保持在22～26℃，湿度保持在70％～90％。7.根据权利要求1所述方法，其特征在于步骤s2中，所述育苗盘内基质采用灭菌纯蛭石。8.根据权利要求1所述方法，其特征在于步骤s2中，培养时育苗盘采用清水浇灌。9.根据权利要求1所述方法，其特征在于步骤s1中，所述同时携带荧光报告基因和目的基因的发根农杆菌中的发根农杆菌采用atcc15834，具体制备过程如下：将携带荧光报告基因-目的基因的atcc15834农杆菌菌株接种至含有100mg/l硫酸卡那霉素的ty固体培养基中划线培养，28℃恒温培养箱活化培养2天；分别挑取若干单菌落接种至含有100mg/l硫酸卡那霉素的ty液体培养基中，28℃，200rpm震荡培养12小时；随后将菌液按1:100的比例扩大培养至菌液od600＝1.0～1.2，5000rpm离心10分钟后收集菌液，弃上清，加入mes缓冲液重悬，调节od600＝0.8，黑暗28℃静置3-4小时备用。10.一种茶树转基因植物，通过权利要求1-9任一项所述的方法构建而成。

技术总结
本发明公开一种免组培获得茶树转基因根的高效诱导方法。该方法通过真空渗透法或浸染法，用带荧光报告基因和目的基因的发根农杆菌侵染茶树枝条、叶片基部或叶片划伤切口，两个月即可获得转基因根，建立了快速高效稳定的茶树叶片转基因发根体系。本发明方法操作简单，免组培方式大大减少了组培的繁琐流程；材料茶树枝条和叶片的获得不受时间限制，不受品种限制；纯蛭石培养基、清水浇灌，具备操作简单、成本低、通量高、周期短等优点。此外，利用荧光报告基因配合手持激发光源，可实现转化子的批量、快速、低成本无损检测。本方法大大提高了茶树获得转基因根的效率，可应用于茶树根系的基因功能研究与精准育种。因功能研究与精准育种。因功能研究与精准育种。


技术研发人员：梁慧玲 毛霆锋 刘宁鸽 马海杰 朱梦铃 蒋浩哲 李春芳
受保护的技术使用者：浙江农林大学
技术研发日：2023.04.14
技术公布日：2023/7/7