一种骨髓组织的预处理方法及应用与流程

1.本发明属于活检组织处理技术领域，具体涉及一种骨髓组织的预处理方法及应用。


背景技术：

2.荧光原位杂交技术(fish)是一种利用非放射性的英光信号对样本进行原位杂交的检测技术。fish可辅助诊断具有特征性遗传学血液疾病，临床与血液肿瘤相关的fish探针接近100种，经常用的60种左右。应用范围越来越多，包括急性白血病、慢性白血病、骨髓增生异常综合症(mds)、多发性骨髓瘤(mm)、淋巴瘤等多种血液肿瘤。fish检测的样本来源广泛，包括血液、骨髓液、组织、脱落细胞、羊水、腹水等。由于骨髓活检的组织切片之前需要固定脱钙预处理，而脱钙会对dna破坏，从而影响fish检测的结果，出现假阴性，所以一般脱钙预处理过的骨髓组织不适用fish检测。


技术实现要素：

3.本发明提出一种骨髓组织的预处理方法及应用，用于解决现有技术骨髓组织脱钙预处理破坏dna，导致假阴性的缺陷。
4.基于此，本发明的技术方案如下：
5.本发明的第一个目的在于提出一种骨髓组织的预处理方法，包括如下步骤：
6.s1.将穿刺组织放入固定液中固定16-24h，第一次流水冲洗；
7.s2.组织继续用edta脱钙液脱钙7-8h，第二次流水冲洗；
8.s3.对组织进行梯度脱水、石蜡包埋后粗修；
9.s4.对包埋后的组织用含甲醛的盐酸溶液浸泡15-30min。
10.在一个实施例中，所述含甲醛的盐酸溶液按体积比由盐酸10％、甲醛5％、蒸馏水85％配制而成。
11.在一个实施例中，所述edta脱钙液浓度为0.5mol/l，ph为8.0。
12.在一个实施例中，步骤s1中所述固定液用于保存细胞和组织的原有形态结构，包括但不限于bouin氏固定液或甲醛固定液。
13.在一个实施例中，步骤s3中所述梯度脱水步骤为：10％福尔马林浸泡1h后，依次经75％酒精浸泡1h，95％酒精浸泡1h、重复2次，无水酒精浸泡1h、重复3次，二甲苯浸泡40min、重复3次，石蜡浸泡1h、重复3次。
14.本发明的第二个目在于，提出以上所述预处理方法中的试剂在制备骨髓组织预处理试剂盒中的应用。
15.本发明的第三个目在于，提出一种骨髓组织石蜡切片的制作方法，包含以上所述的骨髓组织预处理方法。
16.在一个实施例中，所述骨髓组织石蜡切片的制作方法还包括对预处理后的组织进行切片的步骤。
17.本发明的第四个目在于，提出以上所述骨髓组织石蜡切片的制作方法得到的石蜡切片。
18.本发明的第五个目在于，提出所述石蜡切片在制备荧光原位杂交检测组织样本中的应用。
19.相比现有技术，本发明的有益效果在于：
20.本发明的预处理方法通过浸泡在edta脱钙液实现骨髓组织完全裸露脱钙，通过盐酸脱钙液进行第二次骨髓组织表面脱钙，脱钙效率高且可以实现好的脱钙效果；在不影响切片的同时也不破坏抗原，预处理后的骨髓组织可以进行fish检测，可有效避免假阴性。
附图说明
21.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
22.图1为本发明实施例1组织切片进行he染色、fish检测信号结果。
23.图2为本发明实施例2组织切片进行he染色、fish检测信号结果。
24.图3为本发明实施例3组织切片进行he染色、fish检测信号结果。
25.图4为本发明实施例3组织切片进行he染色、fish检测信号结果。
26.图5为本发明实施例3组织切片进行he染色、fish检测信号结果。
27.图6为本发明对比例1组织切片进行he染色、fish检测信号结果。
28.图7为本发明对比例2组织切片进行he染色、fish检测信号结果。
29.图8为本发明对比例3组织切片进行he染色、fish检测信号结果。
30.图9为本发明对比例4组织切片进行he染色、fish检测信号结果。
31.图10为本发明对比例5组织切片进行he染色、fish检测信号结果。
具体实施方式
32.下面将结合本发明实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
33.以下实施例中使用的脱钙液成分如下：
34.edta脱钙液组成：浓度为0.5mol/l，用氢氧化钠调节ph至8.0。
35.盐酸脱钙液组成：盐酸(市售，含量36-38％)100ml+甲醛50ml+蒸馏水850ml。
36.若未特别指明，实施例中所用的操作手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
37.实施例1
38.1.1骨髓组织预处理方法：
39.骨髓组织固定-脱钙-脱水-包埋：穿刺后立即将穿刺组织放入bouin's固定液固定20h
→
取材
→
流水冲洗20min
→
edta脱钙液脱钙7h(完全脱钙)
→
流水冲洗15min
→
梯度脱水
→
石蜡包埋
→
粗修
→
盐酸脱钙液中浸泡20min(表面脱钙)
→
切片。
40.梯度脱水程序为：10％福尔马林1h
→
75％酒精1h
→
95％酒精1h*2
→
无水酒精1h*3
→
二甲苯40min*3
→
石蜡1h*3。
41.1.2he染色程序：3μm切片80℃烤片半小时
→
脱蜡剂10min*3
→
无水乙醇3min*3
→
95％乙醇3min*2
→
75％乙醇3min
→
流水冲洗2min
→
苏木素6min，流水冲洗2min
→
4％盐酸酒精分化3～5s，流水冲洗2min
→
1％氨水返蓝10s，流水冲洗2min
→
伊红3～5s，流水冲洗
→
梯度酒精脱水，吹干封片，待检。
42.1.3fish检测玻片预处理：切片脱蜡-预处理玻片-加热预处理-蛋白酶消化处理-梯度脱水。
43.(1)玻片脱蜡(玻片不得超过5张)：3μm玻片置于培养箱中，65℃，4h，室温下进行以下步骤，二甲苯(10min)
→
二甲苯(10min)
→
100％乙醇(5min)。
44.(2)预处理玻片：100％乙醇(2min)
→
85％乙醇(2min)
→
70％乙醇(2min)
→
蒸馏水3min。
45.(3)加热预处理：蒸馏水置于水浴锅中加热，90℃，30min，需提前1h加热。冷却至室温，用2
×
ssc清洗2次，每次各5min。
46.(4)蛋白酶消化处理：6mg/ml胃蛋白酶使用液(10mm hcl调制)消化，消化时间视片层厚度及组织而定，片层厚度2-3μm为宜，一般组织消化时间为20min左右，淋巴组织40min左右，孵育温度37℃。消化完成后，用2
×
ssc清洗2次，每次各5min。
47.(5)梯度脱水：70％乙醇(1min)
→
90％乙醇(1min)
→
100％乙醇(1min)，自然干燥，15min。
48.探针程序：上探针-变性杂交-杂交后脱水。
49.(1)上探针：在指定区域滴加5μl探针使用液，盖盖玻片，封胶。
50.(2)变性杂交：thermobrite system程序为：变性：83℃，5min；杂交：42℃，过夜。注意：封盖杂交前，确保湿度卡湿度饱和。
51.(3)杂交后处理
52.a.洗片(玻片不得超过5张)：玻片置于67℃，0.3％np-40/0.4x ssc中，漂洗1.5min。再置于常温下0.1％ np-40/2x ssc，0.5min后取出。
53.b.脱水：70％乙醇(1min)
→
90％乙醇(1min)
→
100％乙醇(1min)，自然干燥20min。
54.c.盖片：加5μl dapi，盖片镜检。
55.信号分析：利用奥林巴斯bx53trf荧光显微镜对反应后的颜色信号进行分析。
56.1.4结果：
57.如图1所示，he染色后切片组织结构显示清晰，核质对比鲜明，背景干净。fish检测可见信号且信号足够分析出结果。
58.1.5实验结论：骨髓组织预处理用edta脱钙液脱钙7h可完全脱钙，石蜡包埋后再在盐酸脱钙液中浸泡20min可实现表面脱钙。这种组合脱钙的方法，使得骨髓组织切片he染色佳，且可进行fish检测。
59.实施例2
60.1.1骨髓组织预处理方法：
61.骨髓组织固定-脱钙-脱水-包埋：穿刺后立即将穿刺组织放入bouin's固定液固定16h
→
取材
→
流水冲洗15min
→
edta脱钙液脱钙8h(完全脱钙)
→
流水冲洗20min
→
梯度脱水
→
石蜡包埋
→
粗修
→
盐酸脱钙液中浸泡15min(表面脱钙)
→
切片。
62.梯度脱水程序为：10％福尔马林1h
→
75％酒精1h
→
95％酒精1h*2
→
无水酒精1h*3
→
二甲苯40min*3
→
石蜡1h*3。
63.1.2he染色程序：3μm切片80℃烤片半小时
→
脱蜡剂10min*3
→
无水乙醇3min*3
→
95％乙醇3min*2
→
75％乙醇3min
→
流水冲洗2min
→
苏木素6min，流水冲洗2min
→
4％盐酸酒精分化3～5s，流水冲洗2min
→
1％氨水返蓝10s，流水冲洗2min
→
伊红3～5s，流水冲洗
→
梯度酒精脱水，吹干封片，待检。
64.1.3fish检测玻片预处理：切片脱蜡-预处理玻片-加热预处理-蛋白酶消化处理-梯度脱水。
65.(1)玻片脱蜡(玻片不得超过5张)：3μm玻片置于培养箱中，65℃，4h，室温下进行以下步骤，二甲苯(10min)
→
二甲苯(10min)
→
100％乙醇(5min)。
66.(2)预处理玻片：100％乙醇(2min)
→
85％乙醇(2min)
→
70％乙醇(2min)
→
蒸馏水3min。
67.(3)加热预处理：蒸馏水置于水浴锅中加热，90℃，30min，需提前1h加热。冷却至室温，用2
×
ssc清洗2次，每次各5min。
68.(4)蛋白酶消化处理：6mg/ml胃蛋白酶使用液(10mm hcl调制)消化，消化时间视片层厚度及组织而定，片层厚度2-3μm为宜，一般组织消化时间为20min左右，淋巴组织40min左右，孵育温度37℃。消化完成后，用2
×
ssc清洗2次，每次各5min。
69.(5)梯度脱水：70％乙醇(1min)
→
90％乙醇(1min)
→
100％乙醇(1min)，自然干燥，20min。
70.探针程序：上探针-变性杂交-杂交后脱水。
71.(1)上探针：在指定区域滴加5μl探针使用液，盖盖玻片，封胶。
72.(2)变性杂交：thermobrite system程序为：变性：83℃，5min；杂交：42℃，过夜。注意：封盖杂交前，确保湿度卡湿度饱和。
73.(3)杂交后处理
74.a.洗片(玻片不得超过5张)：玻片置于67℃，0.3％np-40/0.4x ssc中，漂洗1.5min。再置于常温下0.1％np-40/2x ssc，0.5min后取出。
75.b.脱水：70％乙醇(1min)
→
90％乙醇(1min)
→
100％乙醇(1min)，自然干燥，15min。
76.c.盖片：加5μl dapi，盖片镜检。
77.信号分析：利用奥林巴斯bx53trf荧光显微镜对反应后的颜色信号进行分析。
78.1.4结果：如图2所示，he染色后切片组织结构显示清晰，核质对比鲜明，背景干净。fish检测可见信号且信号足够分析出结果。
79.1.5实验结论：骨髓组织预处理用edta脱钙液脱钙8h可完全脱钙，石蜡包埋后再在盐酸脱钙液中浸泡15min可实现表面脱钙。这种组合脱钙的方法，使得骨髓组织切片he染色佳，且可进行fish检测。
80.实施例3
81.1.1骨髓组织预处理方法：
82.骨髓组织固定-脱钙-脱水-包埋：穿刺后立即将穿刺组织放入bouin's固定液固定
24h
→
取材
→
流水冲洗20min
→
edta脱钙液脱钙7h(完全脱钙)
→
流水冲洗20min
→
梯度脱水
→
石蜡包埋
→
粗修
→
盐酸脱钙液中浸泡15min(表面脱钙)
→
切片。
83.梯度脱水程序为：10％福尔马林1h
→
75％酒精1h
→
95％酒精1h*2
→
无水酒精1h*3
→
二甲苯40min*3
→
石蜡1h*3。
84.1.2he染色程序：3μm切片80℃烤片半小时
→
脱蜡剂10min*3
→
无水乙醇3min*3
→
95％乙醇3min*2
→
75％乙醇3min
→
流水冲洗2min
→
苏木素6min，流水冲洗2min
→
4％盐酸酒精分化3～5s，流水冲洗2min
→
1％氨水返蓝10s，流水冲洗2min
→
伊红3～5s，流水冲洗
→
梯度酒精脱水，吹干封片，待检。
85.1.3fish检测玻片预处理：切片脱蜡-预处理玻片-加热预处理-蛋白酶消化处理-梯度脱水。
86.(1)玻片脱蜡(玻片不得超过5张)：3μm玻片置于培养箱中，65℃，4h，室温下进行以下步骤，二甲苯(10min)
→
二甲苯(10min)
→
100％乙醇(5min)。
87.(2)预处理玻片：100％乙醇(2min)
→
85％乙醇(2min)
→
70％乙醇(2min)
→
蒸馏水3min。
88.(3)加热预处理：蒸馏水置于水浴锅中加热，90℃，30min，需提前1h加热。冷却至室温，用2
×
ssc清洗2次，每次各5min。
89.(4)蛋白酶消化处理：6mg/ml胃蛋白酶使用液(10mm hcl调制)消化，消化时间视片层厚度及组织而定，片层厚度2-3μm为宜，一般组织消化时间为20min左右，淋巴组织40min左右，孵育温度37℃。消化完成后，用2
×
ssc清洗2次，每次各5min。
90.(5)梯度脱水：70％乙醇(1min)
→
90％乙醇(1min)
→
100％乙醇(1min)，自然干燥，15min。
91.探针程序：上探针-变性杂交-杂交后脱水。
92.(1)上探针：在指定区域滴加5μl探针使用液，盖盖玻片，封胶。
93.(2)变性杂交：thermobrite system程序为：变性：83℃，5min；杂交：42℃，过夜。注意：封盖杂交前，确保湿度卡湿度饱和。
94.(3)杂交后处理
95.a.洗片(玻片不得超过5张)：玻片置于67℃，0.3％np-40/0.4x ssc中，漂洗1.5min。再置于常温下0.1％np-40/2x ssc，0.5min后取出。
96.b.脱水：70％乙醇(1min)
→
90％乙醇(1min)
→
100％乙醇(1min)，自然干燥，至少10min。
97.c.盖片：加5μl dapi，盖片镜检。
98.信号分析：利用奥林巴斯bx53trf荧光显微镜对反应后的颜色信号进行分析。
99.1.4结果：如图3所示，he染色后切片组织结构显示清晰，核质对比鲜明，背景干净。fish检测可见信号且信号足够分析出结果。
100.1.5实验结论：骨髓组织预处理用edta脱钙液脱钙7h可完全脱钙，石蜡包埋后再在盐酸脱钙液中浸泡15min可实现表面脱钙。这种组合脱钙的方法，使得骨髓组织切片he染色佳，且可进行fish检测。
101.实施例4
102.1.1骨髓组织预处理方法：
103.骨髓组织固定-脱钙-脱水-包埋：穿刺后立即将穿刺组织放入bouin's固定液固定18h
→
取材
→
流水冲洗20min
→
edta脱钙液脱钙8h(完全脱钙)
→
流水冲洗15min
→
梯度脱水
→
石蜡包埋
→
粗修
→
盐酸脱钙液中浸泡18min(表面脱钙)
→
切片。
104.梯度脱水程序为：10％福尔马林1h
→
75％酒精1h
→
95％酒精1h*2
→
无水酒精1h*3
→
二甲苯40min*3
→
石蜡1h*3。
105.1.2he染色程序：3μm切片80℃烤片半小时
→
脱蜡剂10min*3
→
无水乙醇3min*3
→
95％乙醇3min*2
→
75％乙醇3min
→
流水冲洗2min
→
苏木素6min，流水冲洗2min
→
4％盐酸酒精分化3～5s，流水冲洗2min
→
1％氨水返蓝10s，流水冲洗2min
→
伊红3～5s，流水冲洗
→
梯度酒精脱水，吹干封片，待检。
106.1.3fish检测玻片预处理：切片脱蜡-预处理玻片-加热预处理-蛋白酶消化处理-梯度脱水。
107.(1)玻片脱蜡(玻片不得超过5张)：3μm玻片置于培养箱中，65℃，4h，室温下进行以下步骤，二甲苯(10min)
→
二甲苯(10min)
→
100％乙醇(5min)。
108.(2)预处理玻片：100％乙醇(2min)
→
85％乙醇(2min)
→
70％乙醇(2min)
→
蒸馏水3min。
109.(3)加热预处理：蒸馏水置于水浴锅中加热，90℃，30min，需提前1h加热。冷却至室温，用2
×
ssc清洗2次，每次各5min。
110.(4)蛋白酶消化处理：6mg/ml胃蛋白酶使用液(10mm hcl调制)消化，消化时间视片层厚度及组织而定，片层厚度2-3μm为宜，一般组织消化时间为20min左右，淋巴组织40min左右，孵育温度37℃。消化完成后，用2
×
ssc清洗2次，每次各5min。
111.(5)梯度脱水：70％乙醇(1min)
→
90％乙醇(1min)
→
100％乙醇(1min)，自然干燥15min。
112.探针程序：上探针-变性杂交-杂交后脱水。
113.(1)上探针：在指定区域滴加5μl探针使用液，盖盖玻片，封胶。
114.(2)变性杂交：thermobrite system程序为：变性：83℃，5min；杂交：42℃，过夜。注意：封盖杂交前，确保湿度卡湿度饱和。
115.(3)杂交后处理
116.a.洗片(玻片不得超过5张)：玻片置于67℃，0.3％np-40/0.4x ssc中，漂洗1.5min。再置于常温下0.1％np-40/2x ssc，0.5min后取出。
117.b.脱水：70％乙醇(1min)
→
90％乙醇(1min)
→
100％乙醇(1min)，自然干燥，至少10min。
118.c.盖片：加5μl dapi，盖片镜检。
119.信号分析：利用奥林巴斯bx53trf荧光显微镜对反应后的颜色信号进行分析。
120.1.4结果：如图4所示，he染色后切片组织结构显示清晰，核质对比鲜明，背景干净。fish检测可见信号且信号足够分析出结果。
121.1.5实验结论：骨髓组织预处理用edta脱钙液脱钙8h可完全脱钙，石蜡包埋后再在盐酸脱钙液中浸泡18min可实现表面脱钙。这种组合脱钙的方法，使得骨髓组织切片he染色佳，且可进行fish检测。
122.实施例5
123.1.1骨髓组织预处理方法：
124.骨髓组织固定-脱钙-脱水-包埋：穿刺后立即将穿刺组织放入bouin's固定液固定18h
→
取材
→
流水冲洗15min
→
edta脱钙液脱钙7h(完全脱钙)
→
流水冲洗20min
→
梯度脱水
→
石蜡包埋
→
粗修
→
盐酸脱钙液中浸泡20min(表面脱钙)
→
切片。
125.梯度脱水程序为：10％福尔马林1h
→
75％酒精1h
→
95％酒精1h*2
→
无水酒精1h*3
→
二甲苯40min*3
→
石蜡1h*3。
126.1.2he染色程序：3μm切片80℃烤片半小时
→
脱蜡剂10min*3
→
无水乙醇3min*3
→
95％乙醇3min*2
→
75％乙醇3min
→
流水冲洗2min
→
苏木素6min，流水冲洗2min
→
4％盐酸酒精分化3～5s，流水冲洗2min
→
1％氨水返蓝10s，流水冲洗2min
→
伊红3～5s，流水冲洗
→
梯度酒精脱水，吹干封片，待检。
127.1.3fish检测玻片预处理：切片脱蜡-预处理玻片-加热预处理-蛋白酶消化处理-梯度脱水。
128.(1)玻片脱蜡(玻片不得超过5张)：3μm玻片置于培养箱中，65℃，4h，室温下进行以下步骤，二甲苯(10min)
→
二甲苯(10min)
→
100％乙醇(5min)。
129.(2)预处理玻片：100％乙醇(2min)
→
85％乙醇(2min)
→
70％乙醇(2min)
→
蒸馏水3min。
130.(3)加热预处理：蒸馏水置于水浴锅中加热，90℃，30min，需提前1h加热。冷却至室温，用2
×
ssc清洗2次，每次各5min。
131.(4)蛋白酶消化处理：6mg/ml胃蛋白酶使用液(10mm hcl调制)消化，消化时间视片层厚度及组织而定，片层厚度2-3μm为宜，一般组织消化时间为20min左右，淋巴组织40min左右，孵育温度37℃。消化完成后，用2
×
ssc清洗2次，每次各5min。
132.(5)梯度脱水：70％乙醇(1min)
→
90％乙醇(1min)
→
100％乙醇(1min)，自然干燥，15min。
133.探针程序：上探针-变性杂交-杂交后脱水。
134.(1)上探针：在指定区域滴加5μl探针使用液，盖盖玻片，封胶。
135.(2)变性杂交：thermobrite system程序为：变性：83℃，5min；杂交：42℃，过夜。注意：封盖杂交前，确保湿度卡湿度饱和。
136.(3)杂交后处理
137.a.洗片(玻片不得超过5张)：玻片置于67℃，0.3％np-40/0.4x ssc中，漂洗1.5min。再置于常温下0.1％np-40/2x ssc，0.5min后取出。
138.b.脱水：70％乙醇(1min)
→
90％乙醇(1min)
→
100％乙醇(1min)，自然干燥20min。
139.c.盖片：加5μl dapi，盖片镜检。
140.信号分析：利用奥林巴斯bx53trf荧光显微镜对反应后的颜色信号进行分析。
141.1.4结果：
142.如图5所示，he染色后切片组织结构显示清晰，核质对比鲜明，背景干净。fish检测可见信号且信号足够分析出结果。
143.1.5实验结论：骨髓组织预处理用edta脱钙液脱钙7h可完全脱钙，石蜡包埋后再在盐酸脱钙液中浸泡20min可实现表面脱钙。这种组合脱钙的方法，使得骨髓组织切片he染色佳，且可进行fish检测。
144.对比例1
145.常规实验室骨髓组织预处理方法：
146.1.1固定-脱钙梯度脱水-包埋过程如下：标本用bouin's固定液固定20h后经盐酸脱钙液处理60min
→
10％福尔马林1h
→
75％酒精1h
→
95％酒精1h*2
→
无水酒精1h*3
→
二甲苯40min*3
→
石蜡1h*3
→
石蜡包埋
→
粗修
→
盐酸脱钙液中浸泡30min
→
切片。
147.其他步骤同实施例1。
148.1.2信号分析：利用奥林巴斯bx53trf荧光显微镜对反应后的颜色信号进行分析。
149.结果如图6所示，he染色切片组织结构显示清晰，核质对比鲜明，背景干净。fish检测：无信号或信号很弱。
150.1.3实验结论：以上常规脱钙方法he染色佳，但不可以用于fish检测。
151.对比例2
152.1.1固定-脱钙梯度脱水-包埋过程如下：穿刺后立即将穿刺组织放入bouin's固定液固定18h
→
取材
→
流水冲洗15min
→
盐酸脱钙液中浸泡60min
→
流水冲洗20min
→
10％福尔马林1h
→
75％酒精1h
→
95％酒精1h*2
→
无水酒精1h*3
→
二甲苯40min*3
→
石蜡1h*3
→
石蜡包埋
→
粗修
→
盐酸脱钙液中浸泡20min
→
切片。
153.其他步骤同实施例2。
154.1.2信号分析：利用奥林巴斯bx53trf荧光显微镜对反应后的颜色信号进行分析。
155.结果：如图7所示he染色：切片组织结构显示清晰，核质对比鲜明，背景干净。fish检测：无信号或信号很弱。
156.1.3实验结论：以上脱钙方法he染色佳，但不可以用于fish检测。
157.对比例3
158.1.1固定-脱钙梯度脱水-包埋过程如下：穿刺后立即将穿刺组织放入bouin's固定液固定24h
→
取材
→
流水冲洗20min
→
盐酸脱钙液中浸泡60min
→
流水冲洗20min
→
10％福尔马林1h
→
75％酒精1h
→
95％酒精1h*2
→
无水酒精1h*3
→
二甲苯40min*3
→
石蜡1h*3
→
石蜡包埋
→
粗修
→
盐酸脱钙液中浸泡15min
→
切片。
159.其他步骤同实施例3。
160.1.2信号分析：利用奥林巴斯bx53trf荧光显微镜对反应后的颜色信号进行分析。
161.结果：如图8所示he染色：切片组织结构显示清晰，核质对比鲜明，背景干净。fish检测：无信号或信号很弱。
162.1.3实验结论：以上常规脱钙方法he染色佳，但不可以用于fish检测。
163.对比例4
164.1.1固定-脱钙梯度脱水-包埋过程如下：穿刺后立即将穿刺组织放入bouin's固定液固定18h
→
取材
→
流水冲洗20min
→
盐酸脱钙液中浸泡60min
→
流水冲洗15min
→
10％福尔马林1h
→
75％酒精1h
→
95％酒精1h*2
→
无水酒精1h*3
→
二甲苯40min*3
→
石蜡1h*3
→
石蜡包埋
→
粗修
→
盐酸脱钙液中浸泡60min
→
切片。
165.其他步骤同实施例4。
166.1.2信号分析：利用奥林巴斯bx53trf荧光显微镜对反应后的颜色信号进行分析。
167.结果如图9所示，he染色切片组织结构显示清晰，核质对比鲜明，背景干净。fish检测：无信号或信号很弱。
168.1.3实验结论：以上脱钙方法he染色佳，但不可以用于fish检测。
169.对比例5
170.1.1固定-脱钙梯度脱水-包埋过程如下：穿刺后立即将穿刺组织放入bouin's固定液固定24h
→
取材
→
流水冲洗15min
→
盐酸脱钙液中浸泡60min
→
流水冲洗20min
→
10％福尔马林1h
→
75％酒精1h
→
95％酒精1h*2
→
无水酒精1h*3
→
二甲苯40min*3
→
石蜡1h*3
→
石蜡包埋
→
粗修
→
盐酸脱钙液中浸泡60min
→
切片。
171.其他步骤同实施例5。
172.1.2信号分析：利用奥林巴斯bx53trf荧光显微镜对反应后的颜色信号进行分析。
173.结果如图10所示，he染色切片组织结构显示清晰，核质对比鲜明，背景干净。fish检测：无信号或信号很弱。
174.1.3实验结论：以上脱钙方法he染色佳，但不可以用于fish检测。
175.实验例
176.使用同一穿刺组织样本采用实施例1-5及对比例1-5提供的预处理方法进行脱钙，并制备组织切片，将所有切片在光镜下观察。由五位病理医师共同对实施例1-5及对比例1-5使用的脱钙液进行满意度评价。评价指标包括切片完整率、he染色清晰率、fish检测信号强度合格率(有较强荧光信号视为合格)等。满意度效果由五位病理医师一致满意为满意，一位以上病理医师不满意则为不满意。评价结果如表1所示。
177.表1：
[0178][0179]
从表1不难看出，实施例1-5采用的脱钙方法he染色和fish检测信号情况显著提高，充分说明了相对于单一脱钙液或传统预处理方式的优势。
[0180]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种骨髓组织的预处理方法，其特征在于，包括如下步骤：s1.将穿刺组织放入固定液中固定16-24h，第一次流水冲洗；s2.组织继续用edta脱钙液脱钙7-8h，第二次流水冲洗；s3.对组织进行梯度脱水、石蜡包埋后粗修；s4.对包埋后的组织用含甲醛的盐酸溶液浸泡15-30min。2.根据权利要求1所述的骨髓组织预处理方法，其特征在于，所述含甲醛的盐酸溶液按体积比由盐酸10％、甲醛5％、蒸馏水85％配制而成。3.根据权利要求1所述的骨髓组织预处理方法，其特征在于，所述edta脱钙液浓度为0.5mol/l，ph为8.0。4.根据权利要求1所述的骨髓组织预处理方法，其特征在于，步骤s1中所述固定液为bouin氏固定液或甲醛固定液。5.根据权利要求1所述的骨髓组织预处理方法，其特征在于，步骤s3中所述梯度脱水步骤为：10％福尔马林浸泡1h后，依次经75％酒精浸泡1h，95％酒精浸泡1h、重复2次，无水酒精浸泡1h、重复3次，二甲苯浸泡40min、重复3次，石蜡浸泡1h、重复3次。6.权利要求1-5任意一项所述预处理方法中的试剂在制备骨髓组织预处理试剂盒中的应用。7.一种骨髓组织石蜡切片的制作方法，其特征在于，包含权利要求1-5任意一项所述的骨髓组织预处理方法。8.根据权利要求7所述的制作方法，其特征在于，还包括对预处理后的组织进行切片的步骤。9.权利要求7或8所述骨髓组织石蜡切片的制作方法得到的石蜡切片。10.权利要求9所述石蜡切片在制备荧光原位杂交检测组织样本中的应用。

技术总结
本发明提出了一种骨髓组织的预处理方法及应用；所述预处理方法通过浸泡在EDTA脱钙液实现第一次骨髓组织完全裸露脱钙，通过盐酸脱钙液进行第二次骨髓组织表面脱钙，既能够实现好的的脱钙效果，又能够不影响切片的同时不破坏抗原，预处理后的骨髓组织可以进行FISH检测，可有效避免假阴性。可有效避免假阴性。可有效避免假阴性。


技术研发人员：邱雪冰 李鸿瑞 郑金娥 张平 贺艳丽 邱学奎 陈芳 张玉 钟剑平
受保护的技术使用者：武汉益特医疗技术咨询有限公司
技术研发日：2023.04.07
技术公布日：2023/7/7