一种诱导高FOXA2表达的细胞的方法与流程

一种诱导高foxa2表达的细胞的方法
技术领域
1.本发明属于生物医药领域，具体涉及一种诱导高foxa2表达的细胞的方法。


背景技术：

2.胰岛β细胞(即胰岛b细胞)是胰岛细胞的一种，属内分泌细胞，约占胰岛细胞总数的70％，主要位于胰岛中央部，能分泌胰岛素，起调节血糖含量的作用。胰岛β细胞功能受损，胰岛素分泌绝对或相对不足，会引发糖尿病，其中1型糖尿病的病因主要就是由于患者自身免疫系统的缺陷对产生胰岛素的胰岛β细胞造成破坏，导致身体无法产生足够的胰岛素。
3.胰岛细胞移植作为治疗糖尿病的方法，在以基础研究为指导的临床应用中，相对于胰腺移植、胰岛移植表现出独特的优势，但是其远期效果不尽理想。目前主要靠从脑死亡供体获得胰岛细胞移植给患者，但由于个体差异，从每个供体获得的胰岛细胞数量并不稳定，一般需要2-3个供体提取的胰岛细胞移植给一名患者，且由于排斥反应和胰岛血供、氧供不足等问题，移植到体内的胰岛细胞会随着时间不断流失。也就是说，胰岛细胞移植面临远期效果差和供体器官严重短缺的挑战。
4.诱导多能干细胞(ipsc)具有自我复制和分化为多种靶细胞的能力，将ipsc诱导分化为胰腺β细胞是治疗i型糖尿病的重要途径。但在诱导分化方案实施时，存在的一个关键问题是诱导分化的效率低，诱导产生的β细胞不成熟，不能较好的响应葡萄糖的刺激。
5.而foxa2是一种胰岛素敏感性转录因子，在胰岛素和糖脂代谢过程中起重要调控作用。有研究表明，foxa2可以作为先锋因子，参与启动内胚层程序调节胰腺发育。因此，在定型内胚层阶段诱导产生高foxa2表达的细胞对ips的诱导结局至关重要。


技术实现要素：

6.本发明为探究在定型内胚层阶段诱导产生高foxa2表达的细胞的诱导分化方案，根据qpcr结果分析内胚层及胰腺祖细胞分化标志基因表达，分析多种小分子组合在内胚层阶段和胰腺祖细胞阶段的表达差异，筛选出最优组合，以产生高比例的foxa2+阳性细胞、大量胰腺祖细胞，最终改善诱导结局。
7.诱导foxa2
+
阳性细胞的方法
8.第一方面，本发明提供了一种制备foxa2
+
阳性细胞的方法，所述方法包括使用第一培养基、第二培养基、第三培养基中任意一种或多种培养基诱导干细胞；
9.所述第一培养基中含有以下任意一种成分或多种成分的组合：
10.1)chir99021+gdf-8、
11.2)chir99021+activin-a+bmp4、
12.3)chir99021+gdf-8+activin-a+bmp4；
13.所述第二培养基中含有以下任意一种成分或多种成分的组合：
14.1)gdf-8、
15.2)activin-a+bmp4、
16.3)gdf-8+activin-a+bmp4；
17.所述第三培养基中含有以下任意一种成分或多种成分的组合：
18.1)fgf-7+抗坏血酸、
19.2)fgf-7。
20.优选地，第一培养基含有chir99021+activin-a+bmp4，第二培养基含有activin-a+bmp4，第三培养基含有fgf-7+抗坏血酸；
21.或者，所述诱导foxa2+阳性细胞的方法还可称为制备高foxa2+阳性比例的细胞(细胞群、细胞群体)的方法，又或者，称为诱导干细胞分化为foxa2+阳性细胞的方法。
22.本领域技术人员根据公知常识可根据细胞状态对应用各种不同浓度的以上任意成分。
23.例如所述chir99021浓度的可选范围包括1-5μm，所述gdf-8浓度的可选范围包括50-200ng/ml，所述activin-a浓度的可选范围包括50-200ng/ml，所述bmp-4浓度的可选范围包括5-40ng/ml，所述抗坏血酸浓度的可选范围包括0.1-0.5mm，所述fgf-7浓度的可选范围包括10-100ng/ml；
24.如本发明具体实施例所验证的各成分的最优工作浓度，所述chir99021浓度为3μm，所述gdf-8浓度为100ng/ml，所述activin-a浓度为100ng/ml，所述bmp-4浓度为20ng/ml，所述抗坏血酸浓度为0.25mm，所述fgf-7浓度为50ng/ml。
25.更准确地，本发明所述浓度是工作浓度或终浓度。
26.优选地，所述第一培养基、第二培养基、第三培养基的基础培养基可以是任意诱导ipsc分化的培养基。本领域技术人员皆可以借鉴本领域常用基础培养基和常见成分实现本发明所述培养基的功能。
27.优选地，所述第一培养基、第二培养基、第三培养基的基础培养基中包括mcdb131(培养基)、碳酸氢钠、谷氨酰胺(glutamax)、葡萄糖、脱脂bsa(胎牛白蛋白)(bsa)。
28.更优选地，所述第一培养基、第二培养基、第三培养基的基础培养基是由mcdb131、碳酸氢钠、谷氨酰胺(glutamax)、葡萄糖、脱脂bsa(胎牛白蛋白)(bsa)组成。
29.所述碳酸氢钠浓度的可选范围包括0.5-3g/l，所述谷氨酰胺(glutamax)浓度的可选范围包括0.5-2％，所述葡萄糖浓度的可选范围包括5-20mm，所述脱脂bsa(胎牛白蛋白)浓度的可选范围包括0.1-1％。
30.具体地，所述碳酸氢钠的浓度为1.5g/l，所述谷氨酰胺(glutamax)的浓度为1％，所述葡萄糖的浓度为10mm，所述脱脂bsa(胎牛白蛋白)的浓度为0.5％。
31.更优选地，所述第一培养基的培养时间为1天(也即约24小时)，所述第二培养基的培养时间为2天(也即约48小时)，所述第三培养基的培养时间为2天(也即约48小时)。
32.优选地，所述诱导foxa2
+
阳性细胞的方法的初始细胞是干细胞；更具体地如本发明具体实施例所验证的，所述干细胞是ipsc。
33.优选地，所述ipsc在实际应用中可以是自体细胞或异体细胞。
34.本发明所述ipsc细胞可以是商品化的细胞系，也可以是由供体细胞诱导而来，所述供体细胞包括绒毛细胞、皮肤(成纤维细胞和角质形成细胞)、羊水、胚外组织(胎盘和脐带)、脐带血、骨膜、牙组织、脂肪组织、神经干细胞、肝细胞、间质干细胞、外周血细胞、乳腺
上皮细胞、脂肪干细胞，脐带基质和胎盘中的一种或多种。
35.如本发明具体实施例所应用的，所述ipsc是经matrigel包被的ipsc。更具体地，所述ipsc的处理方法如本发明具体实施例所使用。
36.诱导胰腺祖细胞的方法
37.另一方面，本发明还提供了一种诱导(制备)胰腺祖细胞的方法，所述方法包括前述诱导foxa2+阳性细胞的步骤，所述方法还包括使用第四培养基、第五培养基、第六培养基中至少一种培养基进行细胞培养的步骤：
38.所述第四培养基中包含抗坏血酸、fgf-7、sant-1、视黄酸、ldn193189、tppb。
39.所述第四培养基中所述抗坏血酸的浓度可选范围包括0.1-0.5mm，fgf-7的浓度可选范围包括20-100ng/ml，sant-1的浓度可选范围包括0.1-0.5μm，视黄酸的浓度可选范围包括0.5-2μm，ldn193189的浓度可选范围包括50-200nm，tppb的浓度可选范围包括100-400nm。
40.优选地，所述第四培养基中所述抗坏血酸浓度为0.25mm，fgf-7浓度为50ng/ml，sant-1浓度为0.25μm，视黄酸浓度为1μm，ldn193189浓度为100nm，tppb浓度为200nm。
41.所述第五培养基中包含抗坏血酸、fgf-7、sant-1、视黄酸、ldn193189、tppb。
42.所述第五培养基中所述抗坏血酸的浓度可选范围包括0.1-0.5mm，所述fgf-7的浓度可选范围包括1-4ng/ml，所述sant-1的浓度可选范围包括0.1-0.5μm，所述视黄酸的浓度可选范围包括0.05-0.2μm，所述ldn193189的浓度可选范围包括100-400nm，所述tppb的浓度可选范围包括50-200nm。
43.优选地，所述第五培养基中所述抗坏血酸浓度为0.25mm，所述fgf-7浓度为2ng/ml，所述sant-1浓度为0.25μm，所述视黄酸浓度为0.1μm，所述ldn193189浓度为200nm，所述tppb浓度为100nm。
44.所述第六培养基中包含sant-1、视黄酸、ldn193189、t3+alk5i ii、硫酸锌。
45.优选地，所述第六培养基中所述sant-1的浓度可选范围包括0.1-0.5μm，所述视黄酸的浓度可选范围包括0.01-0.1μm，所述ldn193189的浓度可选范围包括50-200nm，所述t3的浓度可选范围包括0.5-2μm，所述alk5i ii的浓度可选范围包括5-20μm，所述硫酸锌的浓度可选范围包括5-20μm。
46.优选地，所述第六培养基中所述sant-1浓度为0.25μm，所述视黄酸浓度为0.05μm，所述ldn193189浓度为100nm，所述t3浓度为1μm，所述alk5iii浓度为10μm，所述硫酸锌浓度为10μm。
47.优选地，所述第四培养基或第五培养基的基础培养基，各自独立地，是第二基础培养基，所述第二基础培养基中包括mcdb131、碳酸氢钠、谷氨酰胺(glutamax)、葡萄糖、脱脂bsa(胎牛白蛋白)(bsa)、its-x。
48.优选地，所述第二基础培养基由mcdb131、碳酸氢钠、谷氨酰胺(glutamax)、葡萄糖、脱脂bsa(胎牛白蛋白)(bsa)、its-x组成。
49.所述第二基础培养基中所述碳酸氢钠的浓度可选范围包括1.5-5g/l，谷氨酰胺(glutamax)的浓度可选范围包括0.5-2％，葡萄糖的浓度可选范围包括5-20mm，脱脂bsa(胎牛白蛋白)的浓度可选范围包括1-4％，its-x的浓度可选范围包括0.25-1％。
50.优选地，所述第二基础培养基中所述碳酸氢钠浓度为2.5g/l，谷氨酰胺
(glutamax)浓度为1％，葡萄糖浓度为10mm，脱脂bsa(胎牛白蛋白)浓度为2％，its-x浓度为0.5％。
51.优选地，所述第六培养基的基础培养基是第三基础培养基，所述第三基础培养基中包括mcdb131、碳酸氢钠、谷氨酰胺(glutamax)、葡萄糖、脱脂bsa(胎牛白蛋白)(bsa)、its-x。
52.优选地，所述第三基础培养基是由mcdb131、碳酸氢钠、谷氨酰胺(glutamax)、葡萄糖、脱脂bsa(胎牛白蛋白)(bsa)、its-x组成。
53.在所述第三基础培养基中所述碳酸氢钠的浓度可选范围包括0.5-3g/l，谷氨酰胺(glutamax)的浓度可选范围包括0.5-2％，葡萄糖的浓度可选范围包括10-40mm，脱脂bsa(胎牛白蛋白)的浓度可选范围包括1-4％，its-x的浓度可选范围包括0.25-1％。
54.优选地，在所述第三基础培养基中所述碳酸氢钠浓度为1.5g/l，谷氨酰胺(glutamax)浓度为1％，葡萄糖浓度为20mm，脱脂bsa(胎牛白蛋白)浓度为2％，its-x浓度为0.5％。
55.如本发明所述应用的，以上任意方法所进行的细胞培养在37℃、5％ co2的条件下进行，本领域技术人员根据细胞状态和培养需求可进行调节。
56.优选地，所述使用第四培养基进行细胞培养的步骤持续2天(约48小时)。
57.优选地，所述使用第五培养基进行细胞培养的步骤持续3天(约72小时)，
58.优选地，所述使用第六培养基进行细胞培养的步骤持续3天(约72小时)，培养基组合
59.另一方面，本发明提供了一种培养基组合，所述培养基组合包括前述任意一种第一培养基、前述任意一种第二培养基、前述任意一种第三培养基中任意多种或全部；
60.优选地，所述培养基组合还可以是前述任意一种第四培养基、前述任意一种第五培养基、前述任意一种第六培养基中任意多种或全部；
61.最优选地，所述培养基组合是由前述任意一种第一培养基、前述任意一种第二培养基、前述任意一种第三培养基、前述任意一种第四培养基、前述任意一种第五培养基、前述任意一种第六培养基组成。
62.细胞培养成分组合及其应用
63.另一方面，本发明提供了细胞培养成分chir99021、gdf-8、fgf-7、抗坏血酸、activin-a、bmp4中一种或多种的组合。
64.同时，本发明提供了上述细胞培养成分组合、培养基组合在诱导foxa2
+
阳性细胞、诱导胰腺祖细胞中的应用。
65.细胞及其应用
66.另一方面，本发明提供了前述诱导foxa2+阳性细胞的方法所制备得到的细胞或细胞群。
67.同时，本发明提供了所述细胞或细胞群在制备胰腺祖细胞、胰岛细胞中的应用。
68.更优选地，本发明所述胰岛细胞是胰岛β细胞。
69.具体地，如本发明具体实施例中验证的，本发明可制备得到foxa2+阳性细胞高比例的细胞群体。
70.另一方面，本发明提供了前述诱导胰腺祖细胞的方法所制备得到的细胞或细胞
群。
71.优选地，所述细胞或细胞群中，sox9、nkx6.1、ngn3、pdx-1基因高表达。
72.同时，本发明提供了所述细胞或细胞群在制备治疗糖尿病药物中的应用。所述糖尿病包括1型糖尿病或2型糖尿病。
附图说明
73.图1是本发明的研发流程图。
74.图2是第二阶段得到的细胞的形态图。
75.图3是第二阶段得到的细胞在foxa2表达量的检测结果图。
76.图4是第五阶段得到的细胞中胰腺祖细胞标志物表达量的检测结果图。
具体实施方式
77.下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
78.本发明任一所述tryple express、mcdb131、dmem/f12、dpbs、谷氨酰胺(glutamax)、trizol均为thermofisher公司的产品；本发明任一所述matrigel为corning公司的产品；本发明任一所述y-27632、兔源foxa2一抗、驴抗兔二抗均为abcam公司的产品；本发明任一所述e8 medium、activin-a为stemcell公司的产品；本发明任一所述chir99021为miltenyi公司的产品；本发明任一所述gdf-8、bmp-4、t3均为peprotech公司的产品；本发明任一所述碳酸氢钠、葡萄糖、抗坏血酸、sant-1、视黄酸、ldn193189、硫酸锌均为sigma公司的产品；本发明任一所述脱脂bsa(胎牛白蛋白)为proliant biologicals公司的产品；本发明任一所述fgf-7为r&d公司的产品；本发明任一所述tppb为tocris公司的产品；本发明任一所述alk5i ii为enzolifesciences公司的产品；本发明任一所述多聚甲醛为北京雷根生物技术有限公司的产品；本发明任一所述rna提取试剂盒为北京百泰克生物技术有限公司的产品；本发明任一所述transscript one-step gdna removal and cdna synthesis supermix、transstart top green qpcr supermix均为北京全式金生物技术有限公司的产品；本发明任一所述tritonx-100为solarbio公司的产品。
79.实施例1、foxa2
+
阳性胰腺祖细胞诱导方法及比较
80.1、ipsc细胞准备
81.1、从液氮罐中取出冻存的ipsc细胞，快速投入38-39℃水浴锅中不断来回摇晃60-90s，待冻存管内的细胞彻底融化后，加至37℃预热的e8完全培养基中，轻轻吹打2～3次，200g，5min离心，离心后弃上清，使用添加10μm y-27632的e8完全培养基重悬细胞，对重悬细胞进行计数。
82.2、根据计数细胞量，将ipsc传至相应的培养瓶中，此处以t75瓶为例，一般t75瓶ipsc接种量为100-200万，从37℃、5％co2细胞培养箱中取出0.83％matrigel包被的t75瓶，吸弃包被液，将12ml的细胞悬液沿未包被面轻轻加入，培养瓶放置培养箱内继续培养。
83.3、ipsc自复苏后至诱导前至少传代两次。当ipsc生长聚合度达70％-80％时，进行
传代及铺板处理。细胞用dpbs洗2遍，随后用tryple express消化3
–
5min，37℃。用dmem/f12按5:1比例中和后离心，200g，5min。用含10μmy-27632的适量e8完全培养基重悬细胞。12孔细胞板提前24-48h用1.66％matrigel包被，包被方式：12ml dmem/f12+200μl matrigel。
84.4、根据12孔板底面积调整细胞接种密度约1.8-2.2
×
105cells/cm2，12孔板使用dpbs洗1遍，将2ml的细胞重悬液加入准备好的12孔板的孔中。
85.5、每加好12孔板的一板后十字晃动板子保证细胞在孔内分布均匀，将细胞板放入37℃、5％ co2细胞培养箱中过夜培养。
86.5 6、24h后观察ipsc细胞接种聚合度，此时聚合度至少达70％。细胞弃去旧液，更换新鲜的37℃预热的e8完全培养基。细胞持续换液2天后，观察细胞聚合度，至细胞聚合度达90％以上时，可开始诱导分化。
87.2、诱导ipsc分化(流程如图1所示，各阶段培养基组成如表1所示)
88.表1.各阶段培养基组成
[0089][0090]
10说明：所述第一*代表第一基础培养基，此列同理。
[0091]
1、阶段一，ipsc向定型内胚层分化，第一阶段诱导的时间为3d。
[0092]
基础培养基由mcdb131、碳酸氢钠、谷氨酰胺(glutamax)、葡萄糖、脱脂bsa(胎牛白蛋白)(bsa)组成。在该培养基中，碳酸氢钠浓度为1.5g/l，
[0093]
谷氨酰胺(glutamax)浓度为1％，葡萄糖浓度为10mm，脱脂bsa(胎牛白蛋15白)浓度为0.5％。
[0094]
实验组划分为四组，包括a1、a2、b、c组。
[0095]
在诱导第1天，培养基中添加成分如下：
[0096]
a1组，a2组，添加chir99021浓度为3μm，gdf-8浓度为100ng/ml；
[0097]
b组，添加chir99021浓度为3μm，activin-a浓度为100ng/ml，bmp-420浓度为20ng/ml；
[0098]
c组，添加chir99021浓度为3μm，gdf-8浓度为100ng/ml，activin-a浓度为100ng/ml，bmp-4浓度为20ng/ml。
[0099]
在诱导day2-3d，培养基中添加成分如下：
[0100]
a1组，a2组，添加gdf-8浓度为100ng/ml；
[0101]
b组，添加activin-a浓度为100ng/ml，bmp-4浓度为20ng/ml；
[0102]
c组，添加gdf-8浓度为100ng/ml，activin-a浓度为100ng/ml，bmp-4浓度为20ng/ml。
[0103]
2、阶段二，ipsc向原肠管分化，基础培养基同阶段一基础培养基。接续阶段一继续划分组别，第二阶段诱导的时间为2d。
[0104]
在诱导day4-5，培养基中添加成分如下：
[0105]
a1组，b组，c组，添加抗坏血酸浓度为0.25mm，fgf-7浓度为50ng/ml；
[0106]
a2组，添加fgf-7浓度为50ng/ml。
[0107]
3、阶段三，ipsc向后前肠分化，基础培养基由mcdb131、碳酸氢钠、谷氨酰胺(glutamax)、葡萄糖、脱脂bsa(胎牛白蛋白)(bsa)、its-x组成。在该培养基中，碳酸氢钠浓度为2.5g/l，谷氨酰胺(glutamax)浓度为1％，葡萄糖浓度为10mm，脱脂bsa(胎牛白蛋白)浓度为2％，its-x浓度为0.5％。
[0108]
接续阶段二继续划分组别，第三阶段诱导的时间为2d，在诱导day6-7，培养基中添加成分如下：
[0109]
a1组，a2组，b组，c组，添加抗坏血酸浓度为0.25mm，fgf-7浓度为50ng/ml，sant-1浓度为0.25μm，视黄酸浓度为1μm，ldn193189浓度为100nm，tppb浓度为200nm。
[0110]
4、阶段四，ipsc向胰腺祖细胞分化，基础培养基同阶段三基础培养基。接续阶段三继续划分组别，第四阶段诱导的时间为3d，在诱导day8-10，
[0111]
培养基中添加成分如下：a1组，a2组，b组，c组，添加抗坏血酸浓度为0.25mm，fgf-7浓度为2ng/ml，sant-1浓度为0.25μm，视黄酸浓度为0.1μm，ldn193189浓度为200nm，tppb浓度为100nm。
[0112]
5、阶段五，ipsc向内分泌前体细胞分化，基础培养基由mcdb131、碳酸氢钠、谷氨酰胺(glutamax)、葡萄糖、脱脂bsa(胎牛白蛋白)(bsa)、its-x组成。在该培养基中，碳酸氢钠浓度为1.5g/l，谷氨酰胺(glutamax)浓度为1％，葡萄糖浓度为20mm，脱脂bsa(胎牛白蛋白)浓度为2％，its-x浓度为0.5％。
[0113]
继续阶段四继续划分组别，第五阶段诱导的时间为3d，在诱导day11-13，培养基中添加成分如下：a1组，a2组，b组，c组，添加sant-1浓度为0.25μm，视黄酸浓度为0.05μm，ldn193189浓度为100nm，t3浓度为1μm，alk5i ii浓度为10μm，硫酸锌浓度为10μm。
[0114]
3、对ipsc细胞分化效果的验证
[0115]
3.1细胞形态观察
[0116]
使用光学显微镜观察第一阶段末诱导细胞形态，并使用4x物镜拍照记录，观察细胞突起情况。
[0117]
结果分析：
[0118]
如图2所示，经过第二阶段诱导分化的ips细胞形态发生改变，内胚层细胞核质比降低，细胞结合更为紧密。在四种内胚层分化组合条件下，b、c组细胞起团较多，预示本发明实施最终会获得更高产量的islet小球。
[0119]
3.2标志基因mrna水平检测
[0120]
第二阶段诱导结束后，使用tryple express消化每组12孔板的2孔细胞，dmem/f12中和后离心，200g，5min，弃上清收集细胞沉淀，加1ml的trizol常温消化细胞5min，-20℃冰箱暂存样品用于后续提取rna；
[0121]
同样，第五阶段诱导结束后，使用tryple express消化每组12孔板的2孔细胞，dmem/f12中和后离心，200g，5min，弃上清收集细胞沉淀，加1ml的trizol常温消化细胞
5min，-20℃冰箱暂存样品用于后续提取rna。
[0122]
上述trizol消化后收集的第二，五阶段细胞样品加入200μl氯仿，剧烈振荡混匀15s，室温孵育3min，4℃，12000rpm离心10min，将水相转移到新管中，然后按照rna提取试剂盒说明的步骤提取rna。rna提取完成后，取1μl rna样品，在核酸蛋白检测仪上测定od值，od260/od280的比值为2，说明制备的rna较纯，无蛋白质污染。
[0123]
根据总rna浓度按1μg进行反转，按照transscript one-step gdna removal and cdna synthesis supermix试剂盒说明的操作进行。对各组样品cdna实施qpcr，阴性对照组为ips，按照transstart top green qpcr supermix试剂盒说明的步骤配置反应体系及上机，检测标志基因mrna表达。qpcr数据使用-2
△△
ct法进行分析。
[0124]
结果分析：
[0125]
对第二阶段诱导结束后的细胞进行检测定型内胚层阶段标志基因foxa2mrna表达，结果如图3所示。ips经诱导后，检测内胚层相关基因foxa2 mrna表达，foxa2 mrna表达水平约为ips的80倍。
[0126]
对第五阶段诱导结束后的细胞进行检测，结果如图4所示，诱导至内分泌前体细胞阶段，检测胰腺祖细胞相关基因sox9、nkx6.1、ngn3、pdx-1的mrna表达，其中，sox9的表达水平约为ips的2倍，nkx6.1的表达水平约为ips的3倍，ngn3的表达水平约为ips的5倍，pdx-1的表达水平约为ips的6倍。
[0127]
以上具体实施例表明，第一培养基的成分采用chir-99021、activin-a、bmp4联合对ips进行诱导，诱导的效率更高，所得内胚层细胞的数量大、foxa2的阳性率更高，继续诱导至内分泌前体细胞阶段，sox9、nkx6.1、ngn3、pdx-1的表达水平更高，显著高于使用gdf8的其他组，p《0.05。

技术特征：
1.一种制备foxa2+阳性细胞的方法，所述方法包括使用第一培养基、第二培养基、第三培养基中任意一种或多种培养基诱导干细胞；所述第一培养基中含有以下任意一种成分或多种成分的组合：1)chir99021+gdf-8、2)chir99021+activin-a+bmp4、3)chir99021+gdf-8+activin-a+bmp4；所述第二培养基中含有以下任意一种成分或多种成分的组合：1)gdf-8、2)activin-a+bmp4、3)gdf-8+activin-a+bmp4；所述第三培养基中含有以下任意一种成分或多种成分的组合：1)fgf-7+抗坏血酸、2)fgf-7；优选地，第一培养基中含有chir99021+activin-a+bmp4，第二培养基中含有activin-a+bmp4，第三培养基中含有fgf-7+抗坏血酸；优选地，所述chir99021浓度的可选范围包括1-5μm，所述gdf-8浓度的可选范围包括50-200ng/ml，所述activin-a浓度的可选范围包括50-200ng/ml，所述bmp-4浓度的可选范围包括5-40ng/ml，所述抗坏血酸浓度的可选范围包括0.1-0.5mm，所述fgf-7浓度的可选范围包括10-100ng/ml；优选地，所述chir99021浓度为3μm，所述gdf-8浓度为100ng/ml，所述activin-a浓度为100ng/ml，所述bmp-4浓度为20ng/ml，所述抗坏血酸浓度为0.25mm，所述fgf-7浓度为50ng/ml；优选地，所述第一培养基、第二培养基、第三培养基的基础培养基中包括mcdb131、碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胎牛白蛋白；更优选地，所述第一培养基、第二培养基、第三培养基的基础培养基是由mcdb131、碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胎牛白蛋白组成；优选地，所述碳酸氢钠浓度的可选范围包括0.5-3g/l，所述谷氨酰胺浓度的可选范围包括0.5-2％，所述葡萄糖浓度的可选范围包括5-20mm，所述胎牛白蛋白浓度的可选范围包括0.1-1％；优选地，所述碳酸氢钠的浓度为1.5g/l，所述谷氨酰胺的浓度为1％，所述葡萄糖的浓度为10mm，所述胎牛白蛋白的浓度为0.5％。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述诱导foxa2+阳性细胞的方法的初始细胞是干细胞；优选地，所述干细胞是ipsc；优选地，所述ipsc包括自体细胞或异体细胞；优选地，所述ipsc细胞包括商品化的细胞系或由供体细胞诱导而来的自制细胞，所述供体细胞包括绒毛细胞、成纤维细胞和角质形成细胞、羊水、胚外组织、脐带血、骨膜、牙组织、脂肪组织、神经干细胞、肝细胞、间质干细胞、外周血细胞、乳腺上皮细胞、脂肪干细胞，脐带基质和胎盘中的一种或多种。
3.一种诱导胰腺祖细胞的方法，所述方法包括权利要求1所述的方法诱导foxa2+阳性细胞的步骤，所述方法还包括使用第四培养基、第五培养基、第六培养基中至少一种培养基进行细胞培养的步骤：所述第四培养基中包含抗坏血酸、fgf-7、sant-1、视黄酸、ldn193189、tppb；优选地，所述第四培养基中所述抗坏血酸的浓度可选范围包括0.1-0.5mm，fgf-7的浓度可选范围包括20-100ng/ml，sant-1的浓度可选范围包括0.1-0.5μm，视黄酸的浓度可选范围包括0.5-2μm，ldn193189的浓度可选范围包括50-200nm，tppb的浓度可选范围包括100-400nm；优选地，所述第四培养基中所述抗坏血酸浓度为0.25mm，fgf-7浓度为50ng/ml，sant-1浓度为0.25μm，视黄酸浓度为1μm，ldn193189浓度为100nm，tppb浓度为200nm；所述第五培养基中包含抗坏血酸、fgf-7、sant-1、视黄酸、ldn193189、tppb；优选地，所述第五培养基中所述抗坏血酸的浓度可选范围包括0.1-0.5mm，所述fgf-7的浓度可选范围包括1-4ng/ml，所述sant-1的浓度可选范围包括0.1-0.5μm，所述视黄酸的浓度可选范围包括0.05-0.2μm，所述ldn193189的浓度可选范围包括100-400nm，所述tppb的浓度可选范围包括50-200nm；优选地，所述第五培养基中所述抗坏血酸浓度为0.25mm，所述fgf-7浓度为2ng/ml，所述sant-1浓度为0.25μm，所述视黄酸浓度为0.1μm，所述ldn193189浓度为200nm，所述tppb浓度为100nm；优选地，所述第六培养基中包含sant-1、视黄酸、ldn193189、t3+alk5iii、硫酸锌；优选地，所述第六培养基中所述sant-1的浓度可选范围包括0.1-0.5μm，所述视黄酸的浓度可选范围包括0.01-0.1μm，所述ldn193189的浓度可选范围包括50-200nm，所述t3的浓度可选范围包括0.5-2μm，所述alk5i ii的浓度可选范围包括5-20μm，所述硫酸锌的浓度可选范围包括5-20μm；优选地，所述第六培养基中所述sant-1浓度为0.25μm，所述视黄酸浓度为0.05μm，所述ldn193189浓度为100nm，所述t3浓度为1μm，所述alk5iii浓度为10μm，所述硫酸锌浓度为10μm。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述第四培养基或第五培养基的基础培养基，各自独立地，是第二基础培养基，所述第二基础培养基中包括mcdb131、碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胎牛白蛋白、its-x；优选地，所述第二基础培养基由mcdb131、碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胎牛白蛋白、its-x组成；所述第二基础培养基中所述碳酸氢钠的浓度可选范围包括1.5-5g/l，谷氨酰胺的浓度可选范围包括0.5-2％，葡萄糖的浓度可选范围包括5-20mm，胎牛白蛋白的浓度可选范围包括1-4％，its-x的浓度可选范围包括0.25-1％；优选地，所述第二基础培养基中所述碳酸氢钠浓度为2.5g/l，谷氨酰胺浓度为1％，葡萄糖浓度为10mm，胎牛白蛋白浓度为2％，its-x浓度为0.5％；优选地，所述第六培养基的基础培养基是第三基础培养基，所述第三基础培养基中包括mcdb131、碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胎牛白蛋白、its-x；优选地，所述第三基础培养基是由mcdb131、碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胎牛白蛋白、
its-x组成；在所述第三基础培养基中所述碳酸氢钠的浓度可选范围包括0.5-3g/l，谷氨酰胺的浓度可选范围包括0.5-2％，葡萄糖的浓度可选范围包括10-40mm，胎牛白蛋白的浓度可选范围包括1-4％，its-x的浓度可选范围包括0.25-1％；优选地，在所述第三基础培养基中所述碳酸氢钠浓度为1.5g/l，谷氨酰胺浓度为1％，葡萄糖浓度为20mm，胎牛白蛋白浓度为2％，its-x浓度为0.5％。5.一种培养基或培养基组合，所述培养基包括权利要求1或2所述任意一种第一培养基、权利要求1或2所述任意一种第二培养基、权利要求1或2所述任意一种第三培养基中任意多种或全部；优选地，所述培养基组合还包括权利要求3或4所述任意一种第四培养基、权利要求3或4所述任意一种第五培养基、权利要求3或4所述任意一种第六培养基中任意多种或全部；最优选地，所述培养基组合是由权利要求1或2所述任意一种第一培养基、权利要求1或2所述任意一种第二培养基、权利要求1或2所述任意一种第三培养基、权利要求3或4所述任意一种第四培养基、权利要求3或4所述任意一种第五培养基、权利要求3或4所述任意一种第六培养基组成。6.chir99021、gdf-8、fgf-7、抗坏血酸、activin-a、bmp4中一种或多种的细胞培养成分的组合物。7.权利要求5所述培养基或培养基组合、chir99021、gdf-8、fgf-7、抗坏血酸、activin-a、bmp4中一种或多种在诱导foxa2+阳性细胞、诱导胰腺祖细胞、诱导胰岛细胞中的应用。8.权利要求1所述诱导foxa2+阳性细胞的方法所制备得到的细胞或细胞群。9.权利要求3所述诱导胰腺祖细胞的方法所制备得到的细胞或细胞群；优选地，所述细胞或细胞群中，sox9、nkx6.1、ngn3、pdx-1基因高表达。10.一种应用，所述应用是以下任意一种：1)权利要求8所述细胞或细胞群在制备胰腺祖细胞、胰岛细胞中的应用；优选地，所述胰岛细胞是胰岛β细胞；2)权利要求9所述细胞或细胞群在制备治疗糖尿病药物中的应用；优选地，所述糖尿病包括1型糖尿病或2型糖尿病。

技术总结
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种诱导高FOXA2表达的细胞的方法。具体地所述方法包括使用Activin-A和/或BMP4提高诱导得到的细胞中FOXA2+阳性细胞的比例，从而大量制备胰岛细胞，应用于治疗糖尿病。应用于治疗糖尿病。应用于治疗糖尿病。


技术研发人员：苗艳平 顾雨春 安翠平 吴理达
受保护的技术使用者：呈诺再生医学科技(北京)有限公司
技术研发日：2023.04.07
技术公布日：2023/7/7