一种微球共混生物3D打印凝胶材料及其制备方法和应用

一种微球共混生物3d打印凝胶材料及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明属于生物医用材料技术领域，具体涉及一种微球共混生物3d打印凝胶材料及其制备方法和应用。


背景技术：

2.骨关节炎泛指发生在人体关节及其周围组织，由炎症、感染、退化、创伤或其他因素引起的炎性疾病。临床表现为关节的红、肿、热、痛、功能障碍及关节畸形，严重者导致关节残疾、影响患者生活质量。因此，寻找一种合适的治疗骨关节炎方案成为了当今医学领域的研究热点。
3.虽然生物本身具有自愈能力，但这种自我修复的能力是有限的，当机体损伤超过一定限度时，自我修复将变得难以实现，而传统医学技术对此类病症的帮助甚微。随着医学的发展，再生医学和组织工程尝试将包埋细胞的支架植入患者损伤组织处，提高病变处的组织修复能力；或者体外培养人体组织，将健康的人工培养组织切块取代病变部位，以达到治疗效果。细胞在体外环境的功能表达往往不同于体内环境，为了实现体外组织培养，保持细胞在体外环境下的正常功能表达，常需要构建模拟体内环境的组织工程支架作为细胞载体。
4.在传统的多孔支架设计中，一般以甲基丙烯酰明胶等水凝胶材料与细胞浆液混合作为生物墨水，通过3d打印得到组织框架，虽然旨在实现体外培养三维的细胞模型，但是，以细胞浆料得到的生物墨水通过3d打印在细胞的微环境上也往往只是形成一种二维结构，二维细胞支架模型存在着无法模拟体内组织复杂的空间结构、导致细胞无法充分的基因和蛋白表达的问题；而且在紫外灯照射固化时也会严重降低细胞活性。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种微球共混生物3d打印凝胶材料及其制备方法和应用，本发明提供的生物3d打印凝胶材料得到的体外仿生组织在体外培养时能够提高细胞的存活率和细胞在体外的增殖和生长效果。
6.为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
7.本发明提供了一种生物3d打印凝胶材料，包括光固化水凝胶和负载有目标细胞的聚合物多孔微球；所述目标细胞负载于所述聚合物多孔微球的孔结构中。
8.优选的，所述聚合物多孔微球的材质包括聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乳酸及其衍生物、海藻酸及其衍生物、壳聚糖及其衍生物和透明质酸及其衍生物中的一种或多种。
9.优选的，所述聚合物多孔微球的制备方法包括以下步骤：
10.将油相和水相分别注入微流控装置中混合，在表面张力和水相的剪切作用下，得到聚合物微球；所述水相包括聚乙烯醇和水；所述油相包括可降解聚合物、致孔剂、水和有机溶剂；
11.将所述聚合物微球冷冻干燥，得到所述聚合物多孔微球。
12.优选的，所述水相中，所述聚乙烯醇的质量百分含量为0.04～2％；
13.所述油相中，所述致孔剂为明胶，所述有机溶剂包括二氯甲烷和/或三氟乙醇，所述聚合物和所述有机溶剂的质量比为1:(10～100)，所述致孔剂和所述水的质量比为(0.07～0.1):(1～1.5)；所述聚合物和所述致孔剂的质量比为1:(1～2)。
14.优选的，所述水相的注入速度为2ml/min；所述油相的注入速度为0.05ml/min；
15.所述混合的温度为0～10℃。
16.优选的，所述光固化水凝胶为甲基丙烯酰明胶水溶液、丙烯酰化海藻酸盐及其衍生物的水溶液、丙烯酰化透明质酸的水溶液和丙烯酰化壳聚糖水溶液中的一种或多种；
17.所述光固化水凝胶的质量浓度为50～150μg/ml。
18.优选的，所述目标细胞包括胚胎成骨细胞、胚胎软骨细胞、主动脉内皮细胞、骨原细胞和破骨细胞中的一种或多种。
19.本发明提供了上述技术方案所述的生物3d打印凝胶材料的制备方法，包括以下步骤：
20.将聚合物多孔微球浸渍于目标细胞悬液中，得到负载有目标细胞的聚合物多孔微球；
21.将所述光固化水凝胶和所述负载有目标细胞的聚合物多孔微球混合，得到所述生物3d打印凝胶材料。
22.本发明提供了上述技术方案所述的生物3d打印凝胶材料或上述技术方案所述的制备方法制备得到的生物3d打印凝胶材料在制备体外仿生组织中的应用。
23.本发明提供了一种体外仿生组织，由生物墨水经3d打印后，在紫外光照射的条件下进行光固化得到；
24.所述生物墨水包括上述技术方案所述的生物3d打印凝胶材料或上述技术方案所述的制备方法制备得到的生物3d打印凝胶材料和光引发剂。
25.本发明提供了一种生物3d打印凝胶材料，包括光固化水凝胶和负载有目标细胞的聚合物多孔微球；所述目标细胞负载于所述聚合物多孔微球的孔结构中。本发明提供的生物3d打印凝胶材料利用聚合物多孔微球的三维孔结构负载目标细胞，形成“细胞球微组织”，能够使目标细胞在聚合物多孔微球中形成三维结构的微观生存环境，有效模拟目标细胞在体内的生存环境；同时聚合物多孔微球作为载体，在紫外灯照射固化下，多空结构能保护微球内的目标细胞降低紫外线的损伤，使其保持良好的细胞活性。由实施例的结果表明，本发明提供的生物3d打印凝胶材料作为生物墨水打印得到的外仿生组织中的目标细胞具有良好的增殖和生长效果。
26.进一步的，在本发明中，所述聚合物多孔微球的制备方法包括以下步骤：将油相和水相分别注入微流控装置中混合，通过水相的剪切作用，得到聚合物微球；所述水相包括聚乙烯醇和水；所述油相包括可降解聚合物、致孔剂、水和有机溶剂；将所述聚合物微球冷冻干燥，得到所述聚合物多孔微球。本发明采用微流控的方法制备聚合物多孔微球，制备方法和流程简单、易于操作、反应条件温和、周期短。
附图说明
27.图1为本发明实施例制备生物3d打印凝胶材料和3d打印分层骨软骨模型的制备流
程图；
28.图2为实施例1制得的分层骨软骨模型的sem图像；
29.图3为实施例2制得的分层骨软骨模型，细胞粘附生长情况的clsm图像；
30.图4为实施例3制得的分层骨软骨模型，利用h&e染色观察细胞在plga微球上的分布图像；
31.图5为本发明制备的3d肿瘤模型和2d培养模型细胞活性的对比结果图。
具体实施方式
32.本发明提供了一种生物3d打印凝胶材料，包括光固化水凝胶和负载有目标细胞的聚合物多孔微球；所述目标细胞负载于所述聚合物多孔微球的孔结构中。
33.在本发明中，若无特殊说明，所有制备原料/组分均为本领域技术人员熟知的市售产品。
34.本发明提供的生物3d打印凝胶材料包括光固化水凝胶。
35.在本发明中，所述光固化水凝胶优选为甲基丙烯酰明胶水溶液、丙烯酰化海藻酸盐及其衍生物的水溶液、丙烯酰化透明质酸的水溶液和丙烯酰化壳聚糖水溶液中的一种或多种；更优选为甲基丙烯酰明胶水溶液、丙烯酰化海藻酸盐水溶液、丙烯酰化透明质酸的水溶液和丙烯酰化壳聚糖水溶液中的一种或多种；更优选为甲基丙烯酰明胶水溶液。
36.在本发明中，所述光固化水凝胶的质量浓度优选为50～150μg/ml，具体优选为50μg/ml、75μg/ml、100μg/ml或150μg/ml。
37.本发明提供的生物3d打印凝胶材料包括负载有目标细胞的聚合物多孔微球；所述目标细胞负载于所述聚合物多孔微球的孔结构中。
38.在本发明中，所述聚合物多孔微球的材质优选包括聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乳酸及其衍生物、海藻酸及其衍生物、壳聚糖及其衍生物和透明质酸及其衍生物中的一种或多种；更优选包括聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乳酸、海藻酸、壳聚糖和透明质酸中的一种或多种；进一步优选为聚乳酸-羟基乙酸共聚物(plga)。
39.在本发明中，所述聚合物多孔微球的粒径约为450～550μm。
40.在本本发明中，所述聚合物多孔微球的比表面积优选为200～500m2/g，空孔隙率优选为20～50％，平均孔径优选为20～50μm。
41.在本发明中，所述聚合物多孔微球的制备方法优选包括以下步骤：
42.将油相和水相混合，在表面张力和水相的剪切作用下，得到聚合物微球；所述水相包括聚乙烯醇和水；所述油相包括聚合物、致孔剂、水和有机溶剂；
43.将所述聚合物微球冷冻干燥，得到所述聚合物多孔微球。
44.本发明将油相和水相分别注入微流控装置中混合，在表面张力和水相的剪切作用下，得到聚合物微球；所述水相包括聚乙烯醇和水；所述油相包括可降解聚合物、致孔剂、水和有机溶剂。
45.在本发明中，所述水相中，所述水优选为超纯水；所述聚乙烯醇(pva)的质量百分含量优选为0.04～2％，更优选为0.05～1.8％。
46.在本发明中，所述水相的制备方法优选包括以下步骤：将所述聚乙烯醇和水混合，得到所述水相。所述混合的温度优选为20～80℃，更优选为20～50℃；所述混合在搅拌的条
件下进行，所述搅拌的时间优选为0.2～1h。在本发明中，所述水相优选包括于4℃环境条件下。
47.在本发明中，所述油相中，所述水优选为超纯水；所述致孔剂优选为明胶(gel)，所述有机溶剂优选包括二氯甲烷(dcm)和/或三氟乙醇，更优选为dmc；所述可降解聚合物优选包括聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乳酸及其衍生物、海藻酸及其衍生物、壳聚糖及其衍生物和透明质酸及其衍生物中的一种或多种；更优选包括聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乳酸、海藻酸、壳聚糖和透明质酸中的一种或多种；进一步优选为聚乳酸-羟基乙酸共聚物(plga)。
48.在本发明中，所述可降解聚合物和所述有机溶剂的质量比优选为1:(10～100)，更优选为1:(11～95)；所述致孔剂和所述水的质量比优选为(0.07～0.1):(1～1.5)；所述聚合物和所述致孔剂的质量比优选为1:(1～2)。
49.在本发明中，所述油相的制备方法优选包括以下步骤：将所述可降解聚合物第一溶解于有机溶剂中，得到可降解聚合物溶液；将所述致孔剂第二溶解于水中，得到致孔剂溶液；将所述可降解聚合物溶液和所述致孔剂溶液混合。在本发明中，所述致孔剂溶液和所述可降解聚合物溶液的体积比优选为1:(1～5)。在本发明中，所述第二溶剂的温度优选为30～40℃，更优选为35℃；所述第二溶剂优选在搅拌的条件下进行，所述搅拌的时间优选为40～45min。在本发明中，所述混合优选在超声的条件下进行。
50.在本发明中，所述水相的注入速度优选为2ml/min；所述油相的注入速度优选为0.05ml/min。
51.在本发明中，所述混合的温度优选为0～10℃，更优选为0～5℃。
52.得到聚合物微球后，本发明将所述聚合物微球冷冻干燥，得到所述聚合物多孔微球。
53.在本发明中，所述冷冻干燥之前，本发明优选讲所述聚合物微球进行水洗，本发明对所述水洗的具体实施过程没有特殊要求。
54.在本发明中，所述目标细胞优选包括胚胎成骨细胞、胚胎软骨细胞、主动脉内皮细胞、骨原细胞和破骨细胞中的一种或多种，更优选包括胚胎成骨细胞、胚胎软骨细胞、主动脉内皮细胞、骨原细胞和破骨细胞中的至少两种；进一步优选包括胚胎成骨细胞、胚胎软骨细胞和主动脉内皮细胞中的至少两种。
55.在本发明中，所述目标细胞的负载量(即所述目标细胞占所述负载有目标细胞的聚合物多孔微球的质量百分含量)优选为20～50％。
56.在本发明中，所述负载有目标细胞的聚合物多孔微球和所述光固化水凝胶的质量比优选为(1:10)～(1:100)，更优选为(2:8)～(1:100)。
57.本发明提供的生物3d打印凝胶材料具有生物相容性好、尺寸均一、生物可降解性好、低细胞毒性等特点。
58.本发明提供了上述技术方案所述的生物3d打印凝胶材料的制备方法，包括以下步骤：
59.将聚合物多孔微球浸渍于目标细胞悬液中，得到负载有目标细胞的聚合物多孔微球；
60.将所述光固化水凝胶和所述负载有目标细胞的聚合物多孔微球混合，得到所述生物3d打印凝胶材料。
61.本发明将聚合物多孔微球浸渍于目标细胞悬液中，得到负载有目标细胞的聚合物多孔微球。
62.在本发明中，所述浸渍之前，本发明优选将所述聚合物多孔微球进行消毒处理，本发明对所述消毒处理的具体实施过程没有特殊要求。
63.在本发明中，所述目标细胞悬液中细胞的浓度优选为1.6
×
10-4
～2
×
10-4
个/ml。
64.在本发明中，所述目标细胞悬液的制备方法优选包括以下步骤：将所述目标细胞接种在培养基中进行培养，得到所述细胞悬液。在本发明中，所述培养基优选包括胎牛血清(fbs)和青霉素-链霉素；所述培养基中，所述胎牛血清(fbs)的体积百分含量优选为5～10％(v/v)；所述青霉素-链霉素的体积百分含量优选为2％(v/v)。在本发明中，所述培养的温度优选为37℃，所述培养的相对湿度优选为90％。
65.在本发明中，所述浸渍优选在于96孔板的孔中进行，本发明对所述浸渍的体实施过程没有特殊要求。
66.得到负载有目标细胞的聚合物多孔微球后，本发明将所述光固化水凝胶和所述负载有目标细胞的聚合物多孔微球混合，得到所述生物3d打印凝胶材料。本发明对所述混合的具体实施过程没有特殊要求。
67.本发明提供了上述技术方案所述的生物3d打印凝胶材料或上述技术方案所述的制备方法制备得到的生物3d打印凝胶材料在制备体外仿生组织中的应用。
68.本发明提供了一种体外仿生组织，由生物墨水经3d打印后，在紫外光照射的条件下进行光固化得到；
69.所述生物墨水包括上述技术方案所述的生物3d打印凝胶材料或上述技术方案所述的制备方法制备得到的生物3d打印凝胶材料和光引发剂。
70.在本发明中，所述光引发剂具体优选为蓝光引发剂(lap)。本发明对所述光引发剂的用量没有特殊要求，确保所述光固化反应顺利进行即可。
71.在本发明中，所述3d打印的工作参数优选包括：压力优选为0.3～0.4mpa、平台冷却温度优选为4℃，喷头温度优选为12℃。
72.在本发明中，所述光固化的时间优选为10s。
73.在本发明中，所述光固化后得到初始仿生组织，本发明优选将所述初始仿生组织干燥，得到所述体外仿生组织。在本发明中，所述干燥优选为冷冻干燥。
74.在本本发明中，所述体外仿生组织具体优选为的分层骨软骨模型。
75.在本发明中，分层骨软骨模型优选包括层叠设置的内皮成骨细胞模型单元和软骨细胞模型单元。在本发明中，所述内皮成骨细胞模型单元由第一生物墨水经3d打印后，在紫外光照射的条件下进行光固化得到。所述软骨细胞模型单元由第二生物墨水经3d打印后，在紫外光照射的条件下进行光固化得到。在本发明中，所述第一生物墨水包括光固化水凝胶和第一负载有目标细胞的聚合物多孔微球，所述第一负载有目标细胞的聚合物多孔微球中负载的目标细胞为胚胎成骨细胞和主动脉内皮细胞。在本发明中，所述第二生物墨水包括光固化水凝胶和第二负载有目标细胞的聚合物多孔微球，所述第二负载有目标细胞的聚合物多孔微球中负载的目标细胞为胚胎软骨细胞。
76.本发明提供的分层骨软骨模型优选具有多层结构，其层数与所用生物墨水的种类与比例可以根据所需要构建的骨软骨模型进行调整，且在紫外灯照射固化下，多层结构能
保护微球内细胞，使其保持良好的细胞活性。同时，发明提供的分层骨软骨模型在3d的打印的压力范围内，多层结构也能保护微球不受到严重挤压，以保证细胞活力不受压力变化影响，且多层结构利于在紫外灯固化以及3d打印下保持细胞活性。
77.本发明利用微流控方法制备具有良好的生物相容性和生物可降解性等生物学性能聚合物多孔微球，并负载软骨细胞和内皮-成骨细胞以分别形成软骨和内皮-成骨细胞的“微组织”。最后，本发明再将载满细胞的微球分散在明胶中构成生物墨水，进行3d打印，以生成分层的骨软骨3d模型。本发明制备的体外仿生组织具有生物相容性好、尺寸均一、生物可降解性好、低细胞毒性等优势，可适用于药物筛选，组织工程等领域。
78.为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
79.实施例1
80.按照图1所示生物3d打印凝胶材料和3d打印分层骨软骨模型的制备流程：(1)称取5克聚乙烯醇(pva)，加入500ml的超纯水，然后在80℃条件下搅拌1h，使其完全溶解，得到pva溶液，冷却至室温后将其置于4℃环境下保存。称取0.07克明胶(gel)，加入1ml的超纯水，然后在35℃条件下搅拌45min，使其完全溶解，得到明胶溶液。再称取0.04克聚乳酸-羟基乙酸共聚物(plga)装入另一烧杯中，加入2ml二氯甲烷(dcm)得到plga的二氯甲烷溶液。将明胶溶液加入plga的二氯甲烷溶液中，经超声乳化后作为油相，以pva溶液作为水相，利用微流控装置，在4℃条件下，水相的注入速度为2ml/min，油相的注入速度为0.05ml/min，制备得到大小均一的乳白色微球。微球通过水洗涤，冻干得到多孔微球。
81.(2)将小鼠胚胎成骨细胞(mc3t3-e1)和小鼠主动脉内皮细胞(maec)共同置于10％(v/v)胎牛血清(fbs)和2％(v/v)青霉素-链霉素的培养基中，在温度为37℃、相对湿度为90％的条件下进行培养，得到同时含有小鼠胚胎成骨细胞(mc3t3-e1)和小鼠主动脉内皮细胞(maec)的细胞悬液，mc3t3-e1和maec的浓度均为1.6
×
10-4
ml-1
。将小鼠胚胎软骨细胞(c518)置于10％(v/v)胎牛血清(fbs)和2％(v/v)青霉素-链霉素的培养基中，在温度为37℃、相对湿度为90％的条件下进行培养，得到含有小鼠胚胎软骨细胞(c518)的细胞悬液，c518的浓度为1.6
×
10-4
ml-1
。
82.(3)将微球消毒后置于96孔板的孔中，加入300μl浓度为1.6
×
10-4
ml-1
的小鼠胚胎软骨细胞c518细胞悬液，得到负载有软骨细胞的聚合物微球(记为3d-cs)。将微球消毒后置于96孔板的孔中，加入300μl浓度分别为1.6
×
10-4
ml-1
的小鼠胚胎成骨细胞mc3t3-e1和小鼠主动脉内皮细胞maec经共同培养产生的细胞悬液，得到同时负载有成骨细胞和内皮细胞的聚合物微球(记为eo-mt)。
83.(4)取出eo-mt和gelma水凝胶(浓度为100μg/ml)的混合物(其中eo-mt和gelma水凝胶的质量比为1:10)，然后在6孔细胞培养皿中进行生物3d打印(压力为0.3～0.4mpa、平台冷却温度为4℃，喷头温度为12℃)，用紫外光照射10秒后水凝胶发生固化。在eo-mt层上继续通过生物3d打印(压力为0.3～0.4mpa、平台冷却温度为4℃，喷头温度为12℃)，印刷3d-cs与gelma水凝胶(100μg/ml)的混合物(其中3d-cs和gelma水凝胶的质量比为1:10)，同样用紫外光照射10秒对其进行固化处理。仿生骨软骨组织模型经冷冻干燥后，得到分层骨软骨模型。
84.将本实施例制备的分层骨软骨模型进行sem表征，结果如图2所示，本实施例制备
的分层骨软骨模型具有15
×
15
×
3mm3的长方体网格结构，可用于运输营养物质、氧气和代谢废物，这对于细胞的生长和增殖是十分必要的。为了研究微球在gelma中的分布，同样借助sem图像观察冻干后的微球和gelma复合水凝胶的结构。
85.实施例2
86.按照图1所示生物3d打印凝胶材料和3d打印分层骨软骨模型的制备流程：(1)称取4.5克聚乙烯醇(pva)，加入400ml的超纯水，然后在80℃条件下搅拌1h，使其完全溶解，得到pva溶液，冷却至室温后将其置于4℃环境下保存。称取0.1克明胶(gel)，加入1.5ml的超纯水，然后在35℃条件下搅拌40min，使其完全溶解，得到明胶溶液。再称取0.1克聚乳酸-羟基乙酸共聚物(plga)装入另一烧杯中，加入5ml二氯甲烷(dcm)得到plga的二氯甲烷溶液。将明胶溶液加入plga的二氯甲烷溶液中，经超声乳化后作为油相，以pva溶液作为水相，利用微流控装置，在4℃条件下，水相的注入速度为2ml/min，油相的注入速度为0.05ml/min，制备得到大小均一的乳白色微球。微球通过水洗涤，冻干得到多孔微球。
87.(2)将小鼠胚胎成骨细胞(mc3t3-e1)和小鼠主动脉内皮细胞(maec)共同置于5％(v/v)胎牛血清(fbs)和2％(v/v)青霉素-链霉素的培养基中，在温度为37℃、相对湿度为90％的条件下进行培养，得到同时含有小鼠胚胎成骨细胞(mc3t3-e1)和小鼠主动脉内皮细胞(maec)的细胞悬液，mc3t3-e1和maec的浓度均为2
×
10-4
ml-1
。将小鼠胚胎软骨细胞(c518)置于10％(v/v)胎牛血清(fbs)和2％(v/v)青霉素-链霉素的培养基中，在温度为37℃、相对湿度为90％的条件下进行培养，得到含有小鼠胚胎软骨细胞(c518)的细胞悬液，c518的浓度为2
×
10-4
ml-1
。
88.(3)将微球消毒后置于96孔板的孔中，加入200μl浓度为2
×
10-4
ml-1
的小鼠胚胎软骨细胞c518细胞悬液，得到负载有软骨细胞的聚合物微球(记为3d-cs)。将微球消毒后置于96孔板的孔中，加入300μl浓度分别为1.6
×
10-4
ml-1
的小鼠胚胎成骨细胞mc3t3-e1和小鼠主动脉内皮细胞maec经共同培养产生的细胞悬液，得到同时负载有成骨细胞和内皮细胞的聚合物微球(记为eo-mt)。
89.(4)取出eo-mt和gelma水凝胶(浓度为50μg/ml)的混合物(其中eo-mt和gelma水凝胶的质量比为1:100)，然后在6孔细胞培养皿中进行生物3d打印(压力为0.3～0.4mpa、平台冷却温度为4℃，喷头温度为12℃)，用紫外光照射10秒后水凝胶发生固化。在eo-mt层上继续通过生物3d打印(压力为0.3～0.4mpa、平台冷却温度为4℃，喷头温度为12℃)，印刷3d-cs与丙烯酸改性透明质酸(100μg/ml)的混合物(其中3d-cs和丙烯酸改性透明质酸的质量比为1:100)，同样用紫外光照射10s对其进行固化处理。仿生骨软骨组织模型经冷冻干燥后，得到分层骨软骨模型。
90.将本实施例制备的分层骨软骨模型通过核染色表征细胞增殖水平，可以证实细胞在微球上的粘附和生长的情况。结果如图3所示：mc3t3-e1和maec这两种细胞在最初的5天内均呈现良好的增殖效果。3d-css中的软骨细胞也呈现出良好的增殖效果。证实这三种类型的细胞都能够在plga微球中良好增殖及生长。
91.实施例3
92.按照图1所示生物3d打印凝胶材料和3d打印分层骨软骨模型的制备流程：
93.(1)参考实施例2制得的聚乳酸-羟基乙酸共聚物多孔微球。
94.(2)将小鼠胚胎成骨细胞(mc3t3-e1)和小鼠主动脉内皮细胞(maec)共同置于5％
(v/v)胎牛血清(fbs)和2％(v/v)青霉素-链霉素的培养基中，在温度为37℃、相对湿度为90％的条件下进行培养，得到同时含有小鼠胚胎成骨细胞(mc3t3-e1)和小鼠主动脉内皮细胞(maec)的细胞悬液，mc3t3-e1和maec的浓度均为2
×
10-4
ml-1
。将小鼠胚胎软骨细胞(c518)置于10％(v/v)胎牛血清(fbs)和2％(v/v)青霉素-链霉素的培养基中，在温度为37℃、相对湿度为90％的条件下进行培养，得到含有小鼠胚胎软骨细胞(c518)的细胞悬液，c518的浓度为2
×
10-4
ml-1
。
95.(3)将微球消毒后置于96孔板的孔中，加入200μl浓度为2
×
10-4
ml-1
的小鼠胚胎软骨细胞c518细胞悬液，得到负载有软骨细胞的聚合物微球(记为3d-cs)。将微球消毒后置于96孔板的孔中，加入300μl浓度分别为1.6
×
10-4
ml-1
的小鼠胚胎成骨细胞mc3t3-e1和小鼠主动脉内皮细胞maec经共同培养产生的细胞悬液，得到同时负载有成骨细胞和内皮细胞的聚合物微球(记为eo-mt)。
96.(4)取出eo-mt和丙烯酰化海藻酸(浓度为75μg/ml)的混合物(其中eo-mt和丙烯酰化海藻酸的质量比为1:100)，然后在6孔细胞培养皿中进行生物3d打印(压力为0.3～0.4mpa、平台冷却温度为4℃，喷头温度为12℃)，用紫外光照射10秒后水凝胶发生固化。在eo-mt层上继续通过生物3d打印(压力为0.3～0.4mpa、平台冷却温度为4℃，喷头温度为12℃)，印刷3d-cs与丙烯酰化海藻酸(浓度100μg/ml)的混合物(其中3d-cs和gelma水凝胶的质量比为1:100)，同样用紫外光照射10s对其进行固化处理。仿生骨软骨组织模型经冷冻干燥后，得到分层骨软骨模型。
97.本实施例制备得到的分层骨软骨模型利用h&e染色能够更好地观察细胞在plga微球上的分布。结果如图4所示，微球上已形成了具有高细胞密度和有序排列的组织。
98.实施例4
99.按照图1所示生物3d打印凝胶材料和3d打印分层骨软骨模型的制备流程：
100.(1)参考实施例2制得的聚乳酸-羟基乙酸共聚物多孔微球。
101.(2)将人sv40转染成骨细胞(hfob)和微血管内皮细胞(hmec-1)共同置于5％(v/v)胎牛血清(fbs)和2％(v/v)青霉素-链霉素的培养基中，在温度为37℃、相对湿度为90％的条件下进行培养，得到同时含有人sv40转染成骨细胞(hfob)和微血管内皮细胞(hmec-1)的细胞悬液，hfob和hmec-1的浓度均为2
×
10-4
ml-1
。将人胚胎软骨细胞置于10％(v/v)胎牛血清(fbs)和2％(v/v)青霉素-链霉素的培养基中，在温度为37℃、相对湿度为90％的条件下进行培养，得到含有人胚胎软骨细胞的细胞悬液，人胚胎软骨细胞的浓度为2
×
10-4
ml-1
。
102.(3)将微球消毒后置于96孔板的孔中，加入200μl浓度为2
×
10-4
ml-1
的含有人胚胎软骨细胞的细胞悬液，得到负载有人胚胎软骨细胞的聚合物微球(记为3d-cs)。将微球消毒后置于96孔板的孔中，加入300μl浓度分别为1.6
×
10-4
ml-1
的人sv40转染成骨细胞(hfob)和微血管内皮细胞(hmec-1)经共同培养产生的细胞悬液，得到同时负载有hfob和hmec-1的聚合物微球(记为eo-mt)。
103.(4)取出eo-mt和gelma水凝胶(150μg/ml)的混合物(其中eo-mt和gelma水凝胶的质量比为1:100)，然后在6孔细胞培养皿中进行生物3d打印(压力为0.3～0.4mpa、平台冷却温度为4℃，喷头温度为12℃)，用紫外光照射10秒后水凝胶发生固化。在eo-mt层上继续通过生物3d打印(压力为0.3～0.4mpa、平台冷却温度为4℃，喷头温度为12℃)，印刷3d-cs与gelma水凝胶(100μg/ml)的混合物(其中3d-cs和gelma水凝胶的质量比为1:100)，同样用紫
外光照射10s对其进行固化处理。仿生骨软骨组织模型经冷冻干燥后，得到分层骨软骨模型。
104.对比例1
105.(1)将小鼠胚胎成骨细胞(mc3t3-e1)和小鼠主动脉内皮细胞(maec)共同置于10％(v/v)胎牛血清(fbs)和2％(v/v)青霉素-链霉素的培养基中，在温度为37℃、相对湿度为90％的条件下进行培养，得到同时含有小鼠胚胎成骨细胞(mc3t3-e1)和小鼠主动脉内皮细胞(maec)的细胞悬液，mc3t3-e1和maec的浓度均为1.6
×
10-4
ml-1
。将小鼠胚胎软骨细胞(c518)置于10％(v/v)胎牛血清(fbs)和2％(v/v)青霉素-链霉素的培养基中，在温度为37℃、相对湿度为90％的条件下进行培养，得到含有小鼠胚胎软骨细胞(c518)的细胞悬液，c518的浓度为1.6
×
10-4
ml-1
。
106.(3)取300μl浓度为1.6
×
10-4
ml-1
的小鼠胚胎软骨细胞c518细胞悬液，300μl浓度分别为1.6
×
10-4
ml-1
的小鼠胚胎成骨细胞mc3t3-e1和小鼠主动脉内皮细胞maec经共同培养产生的细胞悬液，和gelma水凝胶(浓度为100μg/ml)的混合物(其中细胞悬液和gelma水凝胶的质量比为1:10)，然后在6孔细胞培养皿中进行生物3d打印(压力为0.3～0.4mpa、平台冷却温度为4℃，喷头温度为12℃)，用紫外光照射10秒后水凝胶发生固化。在eo-mt层上继续通过生物3d打印(压力为0.3～0.4mpa、平台冷却温度为4℃，喷头温度为12℃)，印刷细胞与gelma水凝胶(100μg/ml)的混合物(其中上述细胞悬液的总质量和gelma水凝胶的质量比为1:10)，同样用紫外光照射10秒对其进行固化处理。仿生骨软骨组织模型经冷冻干燥后，得到2d培养模型。
107.应用例
108.本发明制备的分层骨软骨模型更适用于骨关节炎的药物筛选研究，将抗炎药物(如姜黄素)加入到本发明实施例1所制备的3d支架模型和对比例1制备的2d培养模型中培养24h，在12h和24h分别检测细胞存活率，分析不同培养条件和不同药物浓度对两种模型中细胞的药物毒性。如图5所示，在2d培养，即培养皿培养下，加入姜黄素后，12h和24h后药物浓度100μg ml-1
时，细胞存活率分别为21.1％和14.0％。而3d培养(所制备3d打印凝胶支架)条件下，加入姜黄素后，12h和24h后药物浓度100μg ml-1
时，细胞存活率分别为46.1％和31.3％，在3d培养条件下，细胞对药物的耐受性更好，更接近于体内病灶部位的实际情况。
109.尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

技术特征：
1.一种生物3d打印凝胶材料，其特征在于，包括光固化水凝胶和负载有目标细胞的聚合物多孔微球；所述目标细胞负载于所述聚合物多孔微球的孔结构中。2.根据权利要求1所述的生物3d打印凝胶材料，其特征在于，所述聚合物多孔微球的材质包括聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乳酸及其衍生物、海藻酸及其衍生物、壳聚糖及其衍生物和透明质酸及其衍生物中的一种或多种。3.根据权利要求1或2所述的生物3d打印凝胶材料，其特征在于，所述聚合物多孔微球的制备方法包括以下步骤：将油相和水相分别注入微流控装置中混合，在表面张力和水相的剪切作用下，得到聚合物微球；所述水相包括聚乙烯醇和水；所述油相包括可降解聚合物、致孔剂、水和有机溶剂；将所述聚合物微球冷冻干燥，得到所述聚合物多孔微球。4.根据权利要求3所述的生物3d打印凝胶材料，其特征在于，所述水相中，所述聚乙烯醇的质量百分含量为0.04～2％；所述油相中，所述致孔剂为明胶，所述有机溶剂包括二氯甲烷和/或三氟乙醇，所述聚合物和所述有机溶剂的质量比为1:(10～100)，所述致孔剂和所述水的质量比为(0.07～0.1):(1～1.5)；所述聚合物和所述致孔剂的质量比为1:(1～2)。5.根据权利要求3或4所述的生物3d打印凝胶材料，其特征在于，所述水相的注入速度为2ml/min；所述油相的注入速度为0.05ml/min；所述混合的温度为0～10℃。6.根据权利要求1所述的生物3d打印凝胶材料，其特征在于，所述光固化水凝胶为甲基丙烯酰明胶水溶液、丙烯酰化海藻酸盐及其衍生物的水溶液、丙烯酸改性透明质酸的水溶液和丙烯酰化壳聚糖水溶液中的一种或多种；所述光固化水凝胶的质量浓度为50～150μg/ml。7.根据权利要求1所述的生物3d打印凝胶材料，其特征在于，所述目标细胞包括胚胎成骨细胞、胚胎软骨细胞、主动脉内皮细胞、骨原细胞和破骨细胞中的一种或多种。8.权利要求1～7任一项所述的生物3d打印凝胶材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将聚合物多孔微球浸渍于目标细胞悬液中，得到负载有目标细胞的聚合物多孔微球；将所述光固化水凝胶和所述负载有目标细胞的聚合物多孔微球混合，得到所述生物3d打印凝胶材料。9.权利要求1～7任一项所述的生物3d打印凝胶材料或权利要求8所述的制备方法制备得到的生物3d打印凝胶材料在制备体外仿生组织中的应用。10.一种体外仿生组织，其特征在于，由生物墨水3d打印后，在紫外光照射的条件下进行光固化得到；所述生物墨水包括权利要求1～7任一项所述的生物3d打印凝胶材料或权利要求8所述的制备方法制备得到的生物3d打印凝胶材料和光引发剂。

技术总结
本发明属于生物医用材料技术领域，具体涉及一种微球共混生物3D打印凝胶材料及其制备方法和应用。本发明提供的生物3D打印凝胶材料，包括光固化水凝胶和负载有目标细胞的聚合物多孔微球；所述目标细胞负载于所述聚合物多孔微球的孔结构中。本发明提供的生物3D打印凝胶材料利用聚合物多孔微球的三维孔结构负载目标细胞，形成“细胞球微组织”，能够使目标细胞在聚合物多孔微球中形成三维结构的微观生存环境，有效模拟目标细胞在体内的生存环境；同时聚合物多孔微球作为载体，在紫外灯照射固化下，多孔结构能保护微球内的目标细胞降低紫外线的损伤和3D打印造成的细胞损伤，使其保持良好的细胞活性。良好的细胞活性。良好的细胞活性。


技术研发人员：傅超萍 蔡幸妤 黄伟森 陈斯琳 陈爱政 王士斌
受保护的技术使用者：华侨大学
技术研发日：2023.04.07
技术公布日：2023/7/7