整合型质粒的制作方法

1.本公开文本提供用于生产病毒载体的质粒。本公开文本还提供由质粒生产的病毒载体及包含其的组合物。


背景技术：

2.为了基因治疗及疫苗疗法等，已开发了腺病毒载体(专利文献1)等各种病毒载体。
3.为了制备病毒载体，通常需要在生产细胞中导入病毒载体质粒。因此，需要进行病毒载体质粒的合成
·
构建。所设计的病毒载体质粒在大肠杆菌等中进行合成
·
构建的情况较多，并未在枯草杆菌(hay bacillus)中合成
·
构建。
4.现有技术文献
5.专利文献
6.专利文献1：国际公开第2001/090392号


技术实现要素：

7.用于解决课题的手段
8.本技术的发明人发现在枯草杆菌中能够生产病毒载体质粒。基于该见解，本公开文本提供能够在枯草杆菌中复制的病毒载体质粒。另外，本公开文本也提供包含病毒载体质粒的枯草杆菌、及由病毒载体质粒生产的病毒载体。
9.因此，本发明提供以下方案。
10.(项目a1)
11.质粒，其包含：
12.在枯草杆菌中促进质粒复制的核酸序列；和
13.构成病毒载体所必需的核酸序列中的至少一者。
14.(项目a2)
15.前述项目中的任一质粒，其中，前述构成病毒载体所必需的核酸序列包含：
16.编码前述病毒的衣壳蛋白的核酸序列；
17.编码对前述病毒的基因组进行包装、转录及复制的蛋白质的核酸序列；
18.前述病毒的2个末端重复序列；和
19.编码辅助基因(helper gene)的核酸序列。
20.(项目a3)
21.前述项目中的任一项的质粒，其包含下述核酸序列中的至少二者：
22.编码前述病毒的衣壳蛋白的核酸序列；
23.编码对前述病毒的基因组进行包装、转录及复制的蛋白质的核酸序列；
24.前述病毒的2个末端重复序列；以及
25.编码辅助基因的核酸序列。
26.(项目a4)
27.前述项目中的任一项的质粒，其包含下述核酸序列中的至少三者：
28.编码前述病毒的衣壳蛋白的核酸序列；
29.编码对前述病毒的基因组进行包装、转录及复制的蛋白质的核酸序列；
30.前述病毒的2个末端重复序列；以及
31.编码辅助基因的核酸序列。
32.(项目a5)
33.前述项目中的任一项的质粒，其包含：
34.编码前述病毒的衣壳蛋白的核酸序列；
35.编码对前述病毒的基因组进行包装、转录及复制的蛋白质的核酸序列；
36.前述病毒的2个末端重复序列；和
37.编码辅助基因的核酸序列。
38.(项目a6)
39.前述项目中的任一项的质粒，其中，前述构成病毒载体所必需的核酸序列为约10kb以上。
40.(项目a7)
41.前述项目中的任一项的质粒，其中，前述编码衣壳蛋白的核酸序列、前述编码对基因组进行包装、转录及复制的蛋白质的核酸序列及前述辅助基因中的至少一者位于被前述2个末端重复序列夹持的区域之外。
42.(项目a8)
43.前述项目中的任一项的质粒，其中，在枯草杆菌中促进质粒复制的前述核酸序列包含在枯草杆菌中工作的复制起点。
44.(项目a9)
45.前述项目中的任一项的质粒，其还包含在大肠杆菌中使质粒进行扩增的核酸序列。
46.(项目a10)
47.前述项目中的任一项的质粒，其中，编码前述病毒的衣壳蛋白的核酸序列包含l1、l2、l3、l4、l5、cap及gag中的至少一者。
48.(项目a11)
49.前述项目中的任一项的质粒，其中，编码对前述病毒的基因组进行包装、转录及复制的蛋白质的核酸序列包含e1a、e1b、e2a、e2b、e4、rep、ψ、app、maap、pol及rev中的至少一者。
50.(项目a12)
51.前述项目中的任一项的质粒，其中，前述末端重复序列为末端反向重复序列(itr)或长末端重复序列(ltr)。
52.(项目a13)
53.前述项目中的任一项的质粒，其中，前述辅助基因包含e1a、e1b、e2a、e4、va、env、tat、rpe、ppt、pre及pro中的至少一者。
54.(项目a14)
55.前述项目中的任一项的质粒，其中，编码前述病毒的衣壳蛋白的核酸序列及编码
对前述病毒的基因组进行转录及复制的蛋白质的核酸序列中的至少一者来源于腺病毒的血清型1～52或腺相关病毒的血清型1～12及它们的修饰体中的任一者。
56.(项目a15)
57.前述项目中的任一项的质粒，其中，前述质粒不包含前述病毒的全基因组中的至少一部分基因的序列。
58.(项目a16)
59.项目a1～15中任一项所述的质粒，其中，前述病毒为腺病毒、腺相关病毒、慢病毒、逆转录病毒或仙台病毒。
60.(项目a17)
61.前述项目中的任一项的质粒，其中，前述病毒为腺相关病毒或慢病毒。
62.(项目a18)
63.前述项目中的任一项的质粒，其中，前述病毒为腺相关病毒。
64.(项目a19)
65.前述项目中的任一项的质粒，其中，前述末端重复序列为来源于腺相关病毒的血清型1～12及其修饰体中的任一者的末端反向重复序列(itr)。
66.(项目a20)
67.前述项目中的任一项的质粒，其中，在5’itr与3’itr之间从上游起包含启动子、所期望的基因及终止子。
68.(项目a21)
69.前述项目中的任一项的质粒，其中，前述辅助基因包含e1a、e1b、e2a、e4及va中的至少一者。
70.(项目a22)
71.前述项目中的任一项的质粒，其中，前述辅助基因包含e2a、e4及va。
72.(项目a23)
73.前述项目中的任一项的质粒，其中，前述辅助基因各自来源于腺病毒的血清型1～52及其修饰体中的任一者。
74.(项目a24)
75.前述项目中的任一项的质粒，其中，编码对前述病毒的基因组进行包装、转录及复制的蛋白质的核酸序列包含rep。
76.(项目a25)
77.前述项目中的任一项的质粒，其中，前述rep来源于腺相关病毒的血清型1～12及其修饰体中的任一者。
78.(项目a26)
79.前述项目中的任一项的质粒，其中，编码前述病毒的衣壳蛋白的核酸序列包含cap。
80.(项目a27)
81.前述项目中的任一项的质粒，其中，前述cap来源于腺相关病毒的血清型1～12及其修饰体中的任一者。
82.(项目a28)
83.前述项目中的任一项的质粒，其中，在前述病毒的2个末端重复序列之间包含所期望的基因。
84.(项目a29)
85.前述项目中的任一项的质粒，其中，前述所期望的基因为2～100个基因。
86.(项目a30)
87.前述项目中的任一项的质粒，其中，前述所期望的基因为10～100个基因。
88.(项目a31)
89.前述项目中的任一项的质粒，其中，前述所期望的基因包含启动子序列。
90.(项目a32)
91.前述项目中的任一项的质粒，其中，前述质粒及生产细胞一同包含前述构成病毒载体所必需的核酸序列。
92.(项目a33)
93.前述项目中的任一项的质粒，其中，由导入有前述质粒的生产细胞所生产的全部病毒载体粒子中，不包含核酸的病毒载体粒子为65％以下。
94.(项目a34)
95.前述项目中的任一项的质粒，其中，在导入至生产细胞中的情况下，所生产的全部病毒载体粒子中，包含含有全部所期望的基因的核酸的病毒载体粒子为90％以上。
96.(项目a35)
97.前述项目中的任一项的质粒，其中，在导入至生产细胞中的情况下，所生产的全部病毒载体粒子中，包含除所期望的核酸以外的来源于前述质粒的核酸的病毒载体粒子为2％以下。
98.(项目a36)
99.前述项目中的任一项的质粒，其ccc(covalently closed circular，共价闭合环状)纯度为80％以上。
100.(项目a37)
101.用于表达所期望的基因的、包含前述项目中的任一项的质粒的组合物，前述所期望的基因在前述质粒上配置于前述病毒的2个末端重复序列之间。
102.(项目a38)
103.生产前述项目中的任一项的质粒的方法，其包括将前述项目中的任一项的核酸序列以可工作的方式连结的步骤。
104.(项目a39)
105.含有质粒的组合物，所述质粒是利用项目a38所述的方法生产的。
106.(项目a40)
107.前述项目中的任一项的含有质粒的组合物，其中，质粒的ccc(共价闭合环状)纯度为80％以上。
108.(项目a41)
109.试剂盒，其用于制作前述项目中的任一项的质粒，所述试剂盒包含至少一种核酸，所述至少一种核酸包含：
110.在枯草杆菌中促进质粒复制的核酸序列；和
111.构成病毒所必需的核酸序列。
112.(项目a42)
113.用于制备病毒载体的组合物，其包含前述项目中的任一项的质粒。
114.(项目a43)
115.用于制备病毒载体的方法，其包括使用前述项目中的任一项的质粒生产病毒载体的步骤。
116.(项目a44)
117.前述项目中的任一项的方法，其中，前述质粒中包含的核酸的至少一部分被整合到导入有前述质粒的生产细胞的染色体中。
118.(项目a45)
119.病毒载体，其是使用项目a1～36中任一项所述的质粒生产的，或者是使用项目a43或44所述的方法生产的。
120.(项目a46)
121.含有病毒载体的组合物，所述病毒载体是使用前述项目中的任一项的质粒生产的，或者是使用前述项目中的任一项的方法生产的。
122.(项目a47)
123.前述项目中的任一项的组合物，其中，全部病毒载体粒子中不包含核酸的病毒载体粒子为65％以下。
124.(项目a48)
125.前述项目中的任一项的组合物，其中，全部病毒载体粒子中，包含含有全部所期望的基因的核酸的病毒载体粒子为90％以上。
126.(项目a49)
127.前述项目中的任一项的组合物，其中，全部病毒载体粒子中，包含除所期望的核酸以外的来源于前述质粒的核酸的病毒载体粒子为2％以下。
128.(项目a50)
129.包含前述项目中的任一项的质粒的枯草杆菌或大肠杆菌。
130.(项目a51)
131.生产细胞，其为导入有前述项目中的任一项的质粒的生产细胞，其中，前述质粒中包含的核酸的至少一部分被整合到前述生产细胞的染色体中。
132.(项目1)
133.质粒，其包含：
134.在枯草杆菌中促进质粒扩增的核酸序列；和
135.构成病毒载体所必需的核酸序列中的至少一者。
136.(项目2)
137.前述项目中的任一质粒，其中，前述构成病毒载体所必需的核酸序列包含：
138.编码前述病毒的衣壳蛋白的核酸序列；
139.编码对前述病毒的基因组进行包装、转录及复制的蛋白质的核酸序列；
140.前述病毒的2个末端重复序列；和
141.辅助基因。
142.(项目3)
143.前述项目中的任一项的质粒，其中，在枯草杆菌中促进质粒扩增的前述核酸序列包含在枯草杆菌中工作的复制起点。
144.(项目4)
145.前述项目中的任一项的质粒，其中，编码前述病毒的衣壳蛋白的核酸序列包含l2、l3、cap及gag中的至少一者。
146.(项目5)
147.前述项目中的任一项的质粒，其中，编码对前述病毒的基因组进行包装、转录及复制的蛋白质的核酸序列包含e1a、e1b、e2a、e2b、e4、rep、ψ、app、maap、pol及rev中的至少一者。
148.(项目6)
149.前述项目中的任一项的质粒，其中，前述末端重复序列为末端反向重复序列(itr)或长末端重复序列(ltr)。
150.(项目7)
151.前述项目中的任一项的质粒，其中，前述辅助基因包含e1a、e1b、e2a、e4、va、env、tat、rpe、ppt、pre及pro中的至少一者。
152.(项目8)
153.前述项目中的任一项的质粒，其中，编码前述病毒的衣壳蛋白的核酸序列及编码对前述病毒的基因组进行转录及复制的蛋白质的核酸序列中的至少一者来源于腺病毒的血清型1～51或腺相关病毒的血清型1～11中的任一者。
154.(项目9)
155.前述项目中的任一项的质粒，其中，前述病毒为腺病毒、腺相关病毒、慢病毒、逆转录病毒或仙台病毒。
156.(项目10)
157.前述项目中的任一项的质粒，其中，在前述病毒的2个末端重复序列之间包含所期望的基因。
158.(项目11)
159.前述项目中的任一项的质粒，其中，前述所期望的基因为2～100个基因。
160.(项目12)
161.前述项目中的任一项的质粒，其中，前述所期望的基因包含启动子序列。
162.(项目13)
163.前述项目中的任一项的质粒，其以在前述质粒及生产细胞包含前述构成病毒载体所必需的核酸序列的这样的生产细胞中发挥功能的方式构成。
164.(项目14)
165.前述项目中的任一项的质粒，其中，由导入有前述质粒的生产细胞所生产的全部病毒载体粒子中，不包含核酸的病毒载体粒子为65％以下。
166.(项目15)
167.前述项目中的任一项的质粒，其中，在导入至生产细胞中的情况下，所生产的全部病毒载体粒子中，包含含有全部所期望的基因的核酸的病毒载体粒子为90％以上。
168.(项目16)
169.前述项目中的任一项的质粒，其中，在导入至生产细胞中的情况下，所生产的全部病毒载体粒子中，包含除所期望的核酸以外的来源于前述质粒的核酸的病毒载体粒子为2％以下。
170.(项目17)
171.生产前述项目中的任一项的质粒的方法，其包括将前述项目中的任一项的核酸序列以可工作的方式连结的步骤。
172.(项目18)
173.含有质粒的组合物，所述质粒是利用前述项目中的任一项的方法生产的。
174.(项目19)
175.前述项目中的任一项的含有质粒的组合物，其中，质粒的ccc(共价闭合环状)纯度为80％以上。
176.(项目20)
177.试剂盒，其用于制作前述项目中的任一项的质粒，所述试剂盒包含至少一种核酸，所述至少一种核酸包含：
178.在枯草杆菌中促进质粒扩增的核酸序列；和
179.构成病毒所必需的核酸序列。
180.(项目21)
181.用于制备病毒载体的组合物，其包含前述项目中的任一项的质粒。
182.(项目22)
183.用于制备病毒载体的方法，其包括使用前述项目中的任一项的质粒生产病毒载体的步骤。
184.(项目23)
185.病毒载体，其是使用前述项目中的任一项的质粒生产的，或者是使用前述项目中的任一项的方法生产的。
186.(项目24)
187.含有病毒载体的组合物，所述病毒载体是使用前述项目中的任一项的质粒生产的，或者是使用前述项目中的任一项的方法生产的。
188.(项目25)
189.前述项目中的任一项的组合物，其中，全部病毒载体粒子中不包含核酸的病毒载体粒子为65％以下。
190.(项目26)
191.前述项目中的任一项的组合物，其中，全部病毒载体粒子中，包含含有全部所期望的基因的核酸的病毒载体粒子为90％以上。
192.(项目27)
193.前述项目中的任一项的组合物，其中，全部病毒载体粒子中，包含除所期望的核酸以外的来源于前述质粒的核酸的病毒载体粒子为2％以下。
194.(项目28)
195.包含前述项目中的任一项的质粒的枯草杆菌。
196.本发明中，上述的1个或多个特征意味着，除了明确示出的组合之外，还可进一步组合来提供。关于本发明的更进一步的实施方式及优点，本领域技术人员只要根据需要阅读以下的详细说明并加以理解即可获知。
197.发明效果
198.本公开文本提供能够在枯草杆菌中复制的病毒载体质粒。基于该病毒载体质粒，能够以前所未有的得到改善的方式生产病毒载体。
附图说明
199.[图1]示出paav-cmv质粒的结构。
[0200]
[图2]示出prc2-mi342质粒的结构。
[0201]
[图3]示出phelper质粒的结构。
[0202]
[图4]示出pgets103-av质粒的结构。
[0203]
[图5]示出pgets103-rc2质粒的结构。
[0204]
[图6]示出pgets103-aav-rc2质粒的结构。
[0205]
[图7]示出pgets103-aav-helper-rc2质粒的结构(一体化(all-in-one)结构)。
[0206]
[图8]示出pgets103-aav质粒的结构。
[0207]
[图9]示出pgets103-helper质粒的结构。
[0208]
[图10]示出通过ogab法由22个片段构建pgets103-aav-helper-rc2质粒的概要。点线的包围表示通过aari切割而被除去的部分(大写字母表示来源于接头的序列，小写字母表示来源于载体的序列)。第1、第3及第16个片段是通过化学合成及map法获得的。其他片段是通过pcr获得的。
[0209]
[图11]示出通过ogab法构建的pgets103-aav-helper-rc2质粒的电泳的结果。
[0210]
[图12]示出以pgets103δaari为基础构建而成的示例性的慢病毒载体质粒的结构。
[0211]
[图13]示出以pgets103δaari为基础构建而成的示例性的逆转录病毒载体质粒的结构。
[0212]
[图14]示出以pgets103δaari为基础构建而成的示例性的仙台病毒载体质粒的结构。
[0213]
[图15]示出以pgets103δaari为基础构建而成的示例性的腺病毒载体质粒的结构。
[0214]
[图16]示出质粒pgets118-aari的结构及核酸导入部位。点线包围部分表示通过aari切割而被除去的部分。
[0215]
[图17]示出导入至pgets118-aari中的用于生产aav载体的追加的7种一体化结构。各一体化结构的下方所示的空心方块表示构建中所使用的单位dna的数量及大致对应区域。
[0216]
[图18]示出即使在使用了追加的载体质粒(2～8)的情况下，也与pgets103-aav-helper-rc2质粒(1)同样地生产病毒载体。
[0217]
[图19]示出用于生产腺病毒载体的一体化结构。下方所示的空心方块表示构建中所使用的单位dna的数量及大致对应区域。goi表示所期望的基因。
[0218]
[图20]示出质粒pbet131-aari的结构及核酸导入部位。点线包围部分表示通过aari切割而被除去的部分。
[0219]
[图21]示出基于pgets103-δaari的使用aav1的rep及aav6的cap的aav病毒一体化载体质粒的结构。一体化结构的下方所示的空心方块表示构建中所使用的单位dna的数量及大致对应区域。
[0220]
[图22]示出基于pgets103-δaari的使用cag启动子、aav5的rep及aav1的cap的aav病毒一体化载体质粒的结构。一体化结构的下方所示的空心方块表示构建中所使用的单位dna的数量及大致对应区域。
[0221]
[图23]示出基于pgets103-δaari的使用ef1α启动子、aav8的rep及aav9的cap的aav病毒一体化载体质粒的结构。一体化结构的下方所示的空心方块表示构建中所使用的单位dna的数量及大致对应区域。
[0222]
[图24]示出基于pgets103-δaari、以不同顺序配置rep、cap及helper而成的aav病毒一体化载体质粒的结构。也是使用了sv40启动子的例子。一体化结构的下方所示的空心方块表示构建中所使用的单位dna的数量及大致对应区域。
[0223]
[图25]示出基于pbets131-aari、以不同顺序配置rep、cap及helper而成的aav病毒一体化载体质粒的结构。一体化结构的下方所示的空心方块表示构建中所使用的单位dna的数量及大致对应区域。
[0224]
[图26]示出基于pbets103-δaari、变更helper基因的要素的aav病毒一体化载体质粒的结构。一体化结构的下方所示的空心方块表示构建中所使用的单位dna的数量及大致对应区域。
[0225]
[图27]示出基于pgets103-δaari、使用aav1的rep及aav6的cap的冠状病毒一体化载体质粒的结构。是使所期望的基因(goi)与启动子一起位于结构蛋白区域的位置的例子。
具体实施方式
[0226]
以下，示出最优方式来对本公开文本进行说明。在本说明书的全文中，只要没有特别说明，则单数形式的表达应理解为也包含其复数形式的概念。因此，只要没有特别说明，则单数形式的冠词(例如，在英语情况下，“a”、“an”、“the”等)应理解为也包含其复数形式的概念。另外，只要没有特别说明，则本说明书中所使用的术语应理解为以本领域中通常使用的含义使用。因此，只要不是另有定义，则本说明书中所使用的全部专业术语及科学技术术语具有与本公开文本所属领域的技术人员的通常理解相同的含义。存在冲突时，本说明书(包括定义)优先。
[0227]
以下，适宜地对本说明书中特别使用的术语的定义及/或基本的技术内容进行说明。
[0228]
本说明书中，所谓“枯草杆菌”，是在土壤、植物中普遍存在、并且在反刍动物、人的胃肠道中存在的、好氧性的革兰氏阳性的过氧化氢酶阳性细菌，大小为0.7～0.8
×
2～3μm，为中温性，最适生长温度为25～40℃，认为其能形成芽孢，是指包括学名为枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)或作为与其近缘的芽孢杆菌(bacillus)属细菌的解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)、地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis)、短小芽孢杆
菌(bacillus pumilus)等的、不具有病原性而具有自然转化能力的任意细菌。在优选的实施方式中，枯草杆菌是作为枯草芽孢杆菌中具有高自然转化能力的菌株的marburg 168株或其衍生株中的rm125株。168株是在遗传方面研究最多的革兰氏阳性菌，可与rm125株一同从atcc(american type culture collection，美国模式培养物研究所)等获得，其本身是人畜无害的，已判明可应用ogab法，从上述方面等考虑也可在本公开文本中优选使用。
[0229]
在本说明书中使用的情况下，所谓“质粒”，是指在细胞中与染色体分开存在、或者在导入至细胞的情况下与染色体分开存在的环状dna。
[0230]
本说明书中，所谓“促进质粒复制的核酸序列”，以与“促进质粒扩增的核酸序列”相同的含义使用，是指在导入至宿主细胞(例如，枯草杆菌)时促进存在于宿主细胞内的质粒的复制(在该上下文中，与扩增相同)的任意核酸序列。优选该促进质粒复制的核酸序列与编码作为对象的质粒的核酸序列以可工作的方式进行了连结，但并不限定于此。促进质粒复制的核酸序列、作为对象的质粒、它们的关系等的详情记载于本说明书的其他部分。作为促进质粒复制的核酸序列，可以举出包含在作为对象的宿主细胞(例如，枯草杆菌)中工作的复制起点的核酸序列等。例如，在枯草杆菌中促进质粒复制的核酸序列具有能促进枯草杆菌中的质粒复制的能力，也可以还具有能在除枯草杆菌以外的微生物(例如，大肠杆菌)中促进质粒复制的能力。在枯草杆菌及其他生物(例如，大肠杆菌)中促进质粒复制的核酸序列可以为在枯草杆菌及其他生物(例如，大肠杆菌)这两者中将相同的区域用于促进质粒复制的核酸序列，也可以为本公开文本的载体质粒上的连续序列，还可以为被定位于分隔开的部位的序列。例如，已明确了质粒pstk1(issay narumt等，生物技术快报(biotechnology letters)，第17期no.5(1995年5月)pp.475-480)、及质粒pbs195(molekuliarnaia genet ika等，1991年5月1日,(5)：26-29，pmid：1896058)能在枯草杆菌及大肠杆菌这两者中以相同的复制起始区域实现复制，这样的核酸序列可用作在枯草杆菌及大肠杆菌这两者中促进质粒复制的核酸序列。另外，将br322(大肠杆菌质粒)及pc194(枯草杆菌质粒)连结而制作的穿梭质粒(p trieu-cuot等，embo j.1985dec 16；4(13a)：3583-3587.)、以及由takara bio(滋贺县)提供的包含pubori及cole1 ori的枯草杆菌分泌蛋白表达系统(b.subt ilis secretory protein expression system)的质粒能在大肠杆菌及枯草杆菌这两者中实现复制，这样的隔开定位的核酸序列也可用作在枯草杆菌及大肠杆菌这两者中促进质粒复制的核酸序列。作为枯草杆菌中的核酸(质粒)的复制机制，可举出滚环型、θ型、oric、利用噬菌体的复制机制等，作为能在枯草杆菌内被复制的序列，可以使用利用任意机制的序列。滚环型的复制机制是在进行双链dna的单侧的单链的复制之后进行另一条链的复制的机制，由于核酸以单链dna的形式存在的时间长，因此有质粒变得不稳定的倾向。θ型的复制机制是以与细菌染色体的复制的情况相同的方式从复制起点沿着2个方向同时开始双链dna(质粒)的复制的机制，在本公开文本这样长的dna(例如，10kb以上)的复制时可优选使用(janniere,l.,a.gruss,和s.d.ehrlich.1993.plasmids,p.625-644.ina.l.sonenshein,j.a.hoch,和r.losick(ed.),枯草芽孢杆菌和其他革兰氏阳性菌：生物化学、生理学和分子遗传学(bacillus subtilis and othergram-positive bacteria：biochemistry,physiology and molecular genetics).美国微生物学会,华盛顿,d.c.)。oric的复制机制以与宿主细菌(例如，枯草杆菌)染色体的复制的情况相同的方式工作。作为在枯草杆菌内促进质粒复制的核酸序列，可举出已知能使滚环型、θ型、oric、
利用噬菌体等的复制机制工作的、质粒或其一部分或者复制起点、或者它们的修饰体等。作为滚环型质粒，已知有pub110、pc194、pe194、pt181等，作为θ型质粒，已知有pamβ1、ptb19、pls32、pls20等。在枯草杆菌内促进质粒复制的核酸序列可具有与已知的复制起始点相同或相似的序列(例如，90％以上、95％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.5％以上的序列同一性)。例如，在将使候选dna片段与耐药性基因等枯草杆菌中有效的筛选标记基因连结而成的dna片段导入枯草杆菌后进行(添加药剂等)培养之后、其在染色体外得以复制的情况下，可以判定该候选dna片段具有在枯草杆菌内促进质粒复制的核酸序列。促进质粒扩增的核酸序列是具有复制起始点的dna片段，是指能与染色体dna相独立地复制的dna片段。关于这些dna片段是否能复制，可以利用下述方法来确认：将耐药性基因等筛选标记基因连结至这些dna片段，在药剂等筛选条件下培养后，对质粒dna进行纯化，通过电泳对该dna的条带进行观察；等等。质粒除了包含复制起始点之外，也可以包含在复制起始点诱导宿主的dna复制酶的rep蛋白质的基因、用于可靠地进行质粒向子细胞中的分配的分配机构基因、筛选标记基因等。也可以在rep蛋白质的基因内融合有复制起始点。
[0231]
在本说明书中使用的情况下，所谓“包装细胞”，是指用于生产载体质粒的细胞。
[0232]
在本说明书中使用的情况下，所谓“载体质粒”或“病毒载体质粒”，是指包含搭载于病毒载体的基因的、用于在生产细胞中生产病毒载体的质粒。载体质粒在2个末端重复序列之间包含使其在病毒载体的靶细胞内表达的基因(所期望的基因)的序列，此外还可包含启动子，进一步可包含其他要素(例如，增强子、终止子等)。
[0233]
在本说明书中使用的情况下，所谓“生产细胞”，是指能够产生所期望的病毒载体的细胞，可以是利用染色体及导入的质粒使病毒载体的产生所必需的基因得以表达的细胞。通过向生产细胞中导入本公开文本的载体质粒，从而能生产所期望的病毒载体。例如，在aav病毒载体的情况下，其产生需要e1a和e1b，而hek293具有这些基因，因此，可以将这些基因从辅助质粒除去。即使是其他细胞，只要以具有这样的辅助因子的方式进行修饰，则也可以作为生产细胞来发挥功能。
[0234]
在本说明书中使用的情况下，所谓“病毒载体”，是指至少局部具有来源于病毒的结构、能够向靶细胞中导入核酸的构建物。典型而言，病毒载体为包含病毒的衣壳及含有异源基因的核酸的病毒粒子的形态。在本说明书中使用的情况下，所谓“起源病毒”，是指天然地具有病毒载体所具有的来源于病毒的结构的病毒。病毒载体中，衣壳内所含的核酸(搭载核酸)在2个末端重复序列之间包含使其在病毒载体的靶细胞内表达的基因(所期望的基因)序列，除此以外，也可以包含启动子、增强子、终止子等，还可以包含来源于起源病毒的基因。
[0235]
本说明书中，所谓“构成病毒载体所必需的核酸序列”，是指使包含其的生产细胞能够生产病毒载体的核酸序列(例如，核酸序列的组合)。在一个实施方式中，构成病毒载体所必需的核酸序列包含：编码病毒的衣壳蛋白的核酸序列；编码对病毒的基因组进行包装、转录及复制的蛋白质的核酸序列；病毒的2个末端重复序列；和辅助基因的核酸序列。所谓“辅助基因的核酸序列”，例如可包含或者本质上成为除了编码病毒的衣壳蛋白的核酸序列、编码对病毒的基因组进行包装、转录及复制的蛋白质的核酸序列、及病毒的2个末端重复序列以外的任意的构成病毒载体所必需的核酸序列。上述各种核酸序列可根据每个病毒载体而各不相同。它们的详情记载于本说明书的其他部分。在优选的实施方式中，构成病毒
载体所必需的核酸序列可利用在aav及腺病毒中通用的有利的序列，更优选可利用对aav有利的序列。这样的在aav及腺病毒中通用的有利的序列具有在末端反向重复序列(itr)之间包含所期望的基因、也可以包含辅助基因、rep、cap或l1、l2、l3、l4、l5这样的特征，对aav有利的序列在itr之间包含所期望的基因，也可以包含辅助基因、rep、cap。具有辅助基因、rep、cap的配置也可以在2个itr的外侧这样的特征。例如，作为这样的例子，可举出特定的辅助基因e1a、e1b、e2a、e2b、e3、e4的序列，但并不限定于此。
[0236]
本说明书中，所谓“对病毒的基因组进行包装、转录及复制的蛋白质”，包括将病毒的基因组内包于衣壳中的蛋白质、进行转录的蛋白质、对病毒的基因组进行复制的蛋白质、具有这两者的功能的蛋白质，可以举出e1a、e1b、e2a、e2b、e4、rep、pol、ψ、app、maap及rev等。虽非意在限定，但对病毒的基因组进行包装、转录及复制的蛋白质可利用来源于腺病毒的血清型1～52或腺相关病毒的血清型1～12、或者其修饰体(rh10、dj、dj/8、php.eb、php.s、aav2-retro、aav2-quadyf、aav2.7m8、aav6.2、rh.74、aav2.5、aav-tt、anc80等)中的任一者的蛋白质。该蛋白质可以为天然的蛋白质，也可以为人工导入突变而得到的蛋白质。“人工导入突变”而得到的蛋白质可以通过下述方式来制作：针对例如已知的文献中记载的天然的蛋白质的序列，导入适宜的突变。
[0237]
在本说明书中使用的情况下，“衣壳”是指由病毒或存在于病毒载体表面的(根据需要被封入包膜中的)病毒所具有的基因生产的蛋白质，也称为“衣壳蛋白”。衣壳会担负对细胞的感染性。作为衣壳蛋白，可以举出l2、l3、cap及gag，但并不限定于这些。虽非意在限定，但编码病毒的衣壳蛋白的核酸序列可利用来源于腺病毒的血清型1～52或腺相关病毒的血清型1～12、或者其修饰体(rh10、dj、dj/8、php.eb、php.s、aav2-retro、aav2-quadyf、aav 2.7m8、aav6.2、rh.74、aav2.5、aav-tt、anc80等)中的任一者的核酸序列。衣壳可以为天然的衣壳，也可以为人工导入突变而得到的衣壳。“人工导入突变”而得到的衣壳可以通过下述方式来制作：针对例如已知的文献中记载的天然的衣壳的序列，导入适宜的突变。
[0238]
本说明书中，所谓“重复序列”或“串联重复”(的核酸序列)，是生物基因组的核酸序列中相同的序列重复(尤其是数次以上)呈现的核酸序列的统称。本公开文本中可以使用本领域中所使用的任意重复序列。典型而言，启动子序列重复出现。
[0239]
本说明书中，“末端重复序列”是生物基因组的核酸序列中相同的序列重复(尤其是数次以上)呈现的核酸序列中的、存在于末端的核酸序列的统称。作为末端重复序列，可以举出末端反向重复序列(itr)或长末端重复序列(ltr)等，但并不限定于这些。末端重复序列可利用来源于腺病毒的血清型1～52或腺相关病毒的血清型1～12、或者其修饰体(rh10、dj、dj/8、php.eb、php.s、aav2-retro、aav2-quadyf、aav2.7m8、aav6.2、rh.74、aav2.5、aav-tt、anc80等)中的任一者的末端重复序列。作为末端重复序列，可以为天然的末端重复序列，也可以为人工导入突变而得到的末端重复序列。“人工导入突变”而得到的末端重复序列可以通过下述方式来制作：针对例如已知的文献中记载的天然的末端重复序列的序列，导入适宜的突变。
[0240]
本说明书中，所谓“辅助基因”，是指对单独无法增殖的病毒的扩增进行援助的基因。本公开文本中，作为辅助基因，例如，可举出除了编码该病毒的衣壳蛋白的核酸序列、编码对该病毒的基因组进行包装、转录及/或复制的蛋白质的核酸序列、以及该病毒的2个末端重复序列以外的任意的对于构成病毒载体、使病毒载体增殖、活性提高、毒性降低而言必
需的核酸序列，但并不限定于这些。作为可使用的辅助基因，例如，可以举出e1a、e1b、e2a、e2b、e4、rpe、wrpe、ppt、opre、增强子、绝缘子、沉默子序列等，但并不限定于这些。
[0241]
在本说明书中使用的情况下，所谓“搭载(loaded)核酸”，是指担载于病毒载体的核酸。关于是否为搭载核酸，可以通过下述方式来确认：对病毒载体制备物进行dnase处理，将衣壳外的核酸分解后，将dnase灭活，然后对从衣壳提取出的核酸进行确认。关于是否为搭载核酸，也可以通过调查所得到的核酸产物的序列(优选为全长或接近于全长的长度的序列)来确认。
[0242]
在本说明书中使用的情况下，所谓“宿主细胞”，是指导入有外源性的核酸或蛋白质或病毒或病毒载体的细胞(包括这样的细胞的后代)。
[0243]
本说明书中，“蛋白质”、“多肽”及“肽”以相同的含义使用，是指任意长度的氨基酸的聚合物。该聚合物可以为直链，也可以具有支链，还可以为环状。氨基酸可以为天然的氨基酸，也可以为非天然的氨基酸，还可以为经修饰的氨基酸。另外，该术语也包括天然或经人工修饰的聚合物。作为这样的修饰，例如，包括二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任意的其他操作或修饰(例如，与标记成分的结合体化)。
[0244]
本说明书中，“多核苷酸”及“核酸”以相同的含义使用，是指任意长度的核苷酸的聚合物。作为核酸的例子，可举出dna、rna、cdna、mrna、rrna、trna、微rna(mirna)、lncrna。该术语还包括“多核苷酸衍生物”。所谓“多核苷酸衍生物”，是指包含核苷酸衍生物、或者是指核苷酸间键与通常不同的多核苷酸。所谓“核苷酸衍生物”，是指具有与天然的dna或rna中所使用的通常的核苷酸不同的结构的核苷酸，例如，可举出锁核酸(lna)、2
’‑
o,4
’‑
c-亚乙基桥联核酸(2
’‑
o,4
’‑
c-ethylene bridged nucleic acid，ena)等亚乙基核酸、其他桥联核酸(bridged nucleic acid，bna)、己糖醇核酸(hexitol nucleic acid，hna)、酰胺基桥联核酸(amido-bridged nucleic acid，amna)、吗啉基核酸、三环-dna(tcdna)、聚醚核酸(例如，参见美国专利第5,908,845号)、环己烯核酸(cena)等。作为核苷酸间键与通常不同的例子，例如，可举出将磷酸二酯键转化为硫代磷酸酯键而成的寡核苷酸间键、将磷酸二酯键转化为n3
’‑
p5’氨基磷酸酯键而成的寡核苷酸间键、将核糖与磷酸二酯键转化为肽核酸键而成的寡核苷酸间键等。
[0245]
只要没有另外表明并非如此，则可预期特定的核酸序列与明确示出的序列同样地，还包括其经保守性修饰的修饰体(例如，简并密码子替换体)及互补序列。具体而言，简并密码子替换体可通过制作1个或超过1个的所选择的(或全部的)密码子的第3个位置被混合碱基及/或脱氧肌苷残基取代而成的序列来达成。例如，在基于腺病毒的血清型1～52及腺相关病毒的血清型1～12等具体的野生型序列的修饰体中，除了已知的修饰体(例如，rh10、dj、dj/8、php.eb、php.s、aav2-retro、aav2-quadyf、aav2.7m8、aav6.2、rh.74、aav2.5、aav-tt、anc80等)以外，还包括包含与成为基础的序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％的序列同一性的序列的核酸。
[0246]
本说明书中，所谓“基因”，是指发挥一定的生物学功能的核酸部分。作为该生物学功能，可举出：编码多肽或蛋白质；编码蛋白质非编码功能性rna(rrna、trna、微rna(mirna)、lncrna等)；控制多肽、蛋白质或蛋白质非编码功能性rna的生产；与特定的蛋白质特异性地结合；控制核酸的切割或复制。因此，在本说明书中的基因中，除了编码蛋白质或
蛋白质非编码功能性rna的核酸部分以外，还包括启动子、终止子、增强子、绝缘子、沉默子、复制起点、内部核糖体进入位点等转录翻译调控序列、及包装至病毒粒子中所必需的核酸部分。本说明书中，所谓“基因产物”，可以是指基因所编码的多肽、蛋白质、或蛋白质非编码功能性rna。
[0247]
本说明书中，所谓2个基因为顺式，是指在同一核酸分子或互补链(双链核酸的情况下)的核酸分子上存在这些基因。另外，本说明书中，所谓2个基因为反式，是指在(某种生物中的)某种细胞中、这些基因不存在于同一核酸分子或互补链(双链核酸的情况下)的核酸分子上。例如，存在于基因组上的基因、与利用病毒载体导入的核酸上的基因可以为反式。根据需要，可在2个基因变得同时存在于细胞中(例如，向细胞中导入核酸)的时间点的状态下判断2个基因是否为反式。
[0248]
本说明书中，在提及基因的数量的情况下，1个基因是指以在某种生物的基因组上通常(最高的频率或50％以上的概率)存在的形态具有连续序列的基因。例如，编码某种蛋白质的2个外显子可以为2个基因。例如，在启动子序列与编码蛋白质的序列形成了连续序列的情况下，包含启动子序列及编码蛋白质的序列的核酸部分可以为1个基因。例如，在通过切割而变得具有功能的蛋白质在基因组上由连续序列编码的情况下，该蛋白质可由1个基因编码。在从功能方面提及基因的情况下，核酸序列不必为连续序列，例如，编码某种蛋白质的多个外显子可总体作为该蛋白质的基因而被提及。
[0249]
在本说明书中使用的情况下，所谓“缺失”基因，是指核酸不包含该基因，或者包含以不发挥该基因的正常功能(例如，生产功能性的蛋白质的功能)的方式修饰而成的基因。
[0250]
在本说明书中使用的情况下，所谓“以可工作的方式进行了连结(进行连结)”，是指所期望的序列的表达(工作)配置在某种转录翻译调控序列(例如，启动子、增强子等)或翻译调控序列的控制下。为了将启动子与基因以可工作的方式进行连结，通常在该基因的紧上游配置启动子，但未必需要邻接配置。
[0251]
在本说明书中使用的情况下，“转录翻译调控序列”是启动子序列、多聚腺苷酸化信号、转录终止序列、上游调控结构域、复制起点、增强子、ires等的统称，它们协同使得能够在受体细胞中进行编码序列的复制、转录及翻译。只要所选择的编码序列的复制、转录及翻译能在适当的宿主细胞中进行即可，未必需要这些转录翻译调控序列全部存在。本领域技术人员可以根据公开信息而容易地鉴定调控核酸序列。此外，本领域技术人员可以鉴定例如能以体内(in vivo)、离体(ex vivo)或体外(in vitro)的方式应用于使用目的的转录翻译调控序列。
[0252]
在本说明书中使用的情况下，“启动子”是指对以可工作的方式进行了连结的核酸序列的转录加以控制的核酸序列的片段。启动子包含对于利用rna聚合酶的识别、结合及转录开始而言充分的特定序列。启动子也可以包含对rna聚合酶的识别、结合或转录开始进行调控的序列。
[0253]
在本说明书中使用的情况下，“增强子”是指具有提高目标基因的表达效率的功能的核酸序列的片段。
[0254]
在本说明书中使用的情况下，“沉默子”是指与增强子相反地具有使目标基因的表达效率降低的功能的核酸序列的片段。
[0255]
在本说明书中使用的情况下，“绝缘子”是指具有进行位于dna的序列上的相隔位
置的基因的表达的调控的顺式调控功能的核酸序列的片段。
[0256]
在本说明书中使用的情况下，“终止子”是指位于编码蛋白质的区域的下游、与核酸被转录为mrna时的转录的终止相关的核酸序列的片段。
[0257]
在本说明书中使用的情况下，“复制起点”是指由于识别该核酸序列的蛋白质(例如，起始子dnaa蛋白质等)结合、合成rna而部分地使dna双螺旋解旋并开始复制的核酸序列的片段。
[0258]
在本说明书中使用的情况下，内部核糖体进入位点(“ires”)是指在其下游的核酸序列的翻译时促进核糖体的进入或保持的核酸片段。
[0259]
本说明书中，所谓核酸的“同源性”，是指2个以上的核酸序列的、相对于彼此而言的同一性的程度，通常所谓具有“同源性”，是指同一性或相似性的程度高。因此，某2个核酸的同源性越高，则这些序列的同一性或相似性越高。“相似性”是除了同一性之外还将相似的碱基也引入计算中而得到的数值，此处所谓相似的碱基，是指在混合碱基(例如，r＝a+g，m＝a+c，w＝a+t，s＝c+g，y＝c+t，k＝g+t，h＝a+t+c，b＝g+t+c，d＝g+a+t，v＝a+c+g，n＝a+c+g+t)中有一部分一致的情况。关于2种核酸是否具有同源性，可通过序列的直接比较、或严格条件下的杂交法来调查。将2个核酸序列直接比较的情况下，在其核酸序列间代表性地有至少50％相同时，优选至少70％相同时，更优选至少80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同时，这些基因具有同源性。
[0260]
氨基酸可利用其通常已知的三字母符号、或由iupac-iub生物化学命名委员会(biochemical nomenclature commission)推荐的单字母符号中的任一者而在本说明书中提及。核苷酸也同样地，可利用通常所认定的单字母代码而提及。本说明书中，关于氨基酸序列及碱基序列的相似性、同一性及同源性的比较，使用作为序列分析用工具的blast，采用默认参数算出。同一性的检索可以使用例如ncbi的blast 2.10.1+(2020.6.18发行)来进行。本说明书中的同一性的值通常是指使用上述blast在默认的条件下进行比对时的值。其中，由于参数的变更而出现更高的值的情况下，将最高的值作为同一性的值。在多个区域评价同一性的情况下，将其中的最高值作为同一性的值。相似性是除了同一性之外还将相似的氨基酸也引入计算中而得到的数值。
[0261]
本说明书中，只要没有特别说明，则对于某种生物学物质(例如，蛋白质、核酸、基因)的提及也可理解为对于发挥与该生物学物质的生物学功能同样的功能(可以并非相同的程度)的该生物学物质的变体(例如，在氨基酸序列中具有修饰的变体)的提及。这样的变体中可包括下述分子：在原来的分子的片段、相同大小的原来的生物学物质的氨基酸序列或核酸序列内、或者利用本领域中已知的计算机同源性程序进行比对而与对齐的原来的分子的序列比较时，至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％相同的分子。变体中可包括具有经修饰的氨基酸(例如，通过二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化或磷酸化进行的修饰)或经修饰的核苷酸(例如，通过甲基化进行的修饰)的分子。
[0262]
本说明书中，所谓“严格条件”，是指本领域中常用的公知的条件。严格条件例如可以采用以下的条件。(1)为了清洗而采用低离子强度及高温度(例如，于50℃，0.015m的氯化钠/0.0015m的柠檬酸钠/0.1％的十二烷基硫酸钠)，(2)在杂交中使用甲酰胺等变性剂(例如，于42℃，50％(v/v)甲酰胺与0.1％牛血清白蛋白/0.1％ficoll/0.1％的聚乙烯吡咯烷酮/50mm的ph6.5的磷酸钠缓冲液，以及750mm的氯化钠，75mm柠檬酸钠)，或者(3)在包含
20％甲酰胺、5
×
ssc、50mm磷酸钠(ph7.6)、5
×
denhardt’s溶液、10％硫酸葡聚糖、及20mg/ml的变性剪切鲑精dna的溶液中，于37℃孵育一夜，接着，于约37-50℃，以1
×
ssc对过滤器进行清洗。需要说明的是，甲酰胺浓度也可以为50％或超过50％。清洗时间可以为5、15、30、60或120分钟、或者超过它们。作为影响杂交反应的严格性的要素，可考虑到温度、盐浓度等多个要素，详情可以参照ausubel等,现代分子生物学实验方法(current protocols in molecular biology),wiley interscience出版社,(1995)。“高严格条件”的例子为：0.0015m氯化钠、0.0015m柠檬酸钠、65～68℃；或者，0.015m氯化钠、0.0015m柠檬酸钠、及50％甲酰胺、42℃。杂交可以依照《分子克隆》第二版(molecular cloning 2nd ed.)、《现代分子生物学实验方法》,附录1-38、《dna克隆1：核心技术实用方法》第二版(dna cloning 1：core techniques,a practical appr oach,second edition),牛津大学出版社(1995)等实验书中记载的方法进行。此处，优选地，从在严格条件下进行杂交的序列中排除仅包含a序列或包含t序列的序列。中等程度的严格条件例如可以由本领域技术人员基于dna的长度而容易地确定，示于sambrook等，分子克隆：实验室指南(molecular cloning：a laboratory manual)，第3号，vol.1，7.42-7.45冷泉港实验室出版社(cold spring harbor laboratory press),2001中，而且，关于硝基纤维素过滤器，包括5
×
ssc、0.5％ sds、1.0mm edta(ph8.0)的预清洗溶液、约40-50℃下的约50％甲酰胺、2
×
ssc-6
×
ssc(或者约42℃下的约50％甲酰胺中的、stark溶液(stark’s solution)等其他同样的杂交溶液)的杂交条件、以及约60℃、0.5
×
ssc、0.1％ sds的清洗条件的使用。因此，在本公开文本中使用的多肽中，也包括由以高度或中等程度在严格条件下与编码本公开文本中特别记载的多肽的核酸分子进行杂交的核酸分子所编码的多肽。
[0263]
本说明书中，所谓“对应的”氨基酸或核酸，是指在某种多肽分子或多核苷酸分子中具有或者预测具有与成为比较基准的多肽或多核苷酸中的规定的氨基酸或核苷酸同样的作用的氨基酸或核苷酸，尤其是在酶分子中，是指存在于活性部位中的同样位置、对催化活性作出同样的贡献的氨基酸。例如，若为反义分子，则可以为与该反义分子的特定部分对应的直系同源(ortholog)中的同样的部分。对应的氨基酸例如可以为进行了半胱氨酸化、谷胱甘肽化、s-s键形成、氧化(例如，甲硫氨酸侧链的氧化)、甲酰化、乙酰化、磷酸化、糖链附加、肉豆蔻基化等的特定氨基酸。或者，对应的氨基酸可以为担负二聚体化的氨基酸。这样的“对应的”氨基酸或核酸也可以为遍及一定范围的区域或结构域。因此，在这样的情况下，本说明书中称为“对应的”区域或结构域。
[0264]
本说明书中，所谓“对应的”基因(例如，多核苷酸序列或分子)，是指在某个物种中具有或者预测具有与成为比较基准的物种中的规定基因同样的作用的基因(例如，多核苷酸序列或分子)，在存在多个具有这样的作用的基因的情况下，是指在进化学上具有相同起源的基因。因此，与某种基因对应的基因可以为该基因的直系同源。例如，血清型1的aav的cap可与血清型2的aav的cap对应。例如，某种病毒中的对应的基因可以通过使用成为对应的基因的基准的病毒的基因序列作为查询序列(query sequence)来检索该病毒的序列数据库从而找出。
[0265]
按照本发明，术语“活性”在本说明书中是指最广义上的分子的功能。活性大体上包括分子的生物学功能、生物化学功能、物理功能或化学功能，但并非意在限定。活性例如包括：酶活性；与其他分子相互作用的能力；以及，使其他分子的功能得以活化、促进、稳定
化、阻碍、抑制、或者不稳定化的能力；稳定性；局部存在于特定的细胞内位置的能力。在可适用的情况下，该术语还与最广义上的蛋白质复合体的功能相关。
[0266]
本说明书中，所谓“生物学功能”，在提及某种基因或者与其相关的核酸分子或多肽时，是指该基因、核酸分子或多肽在生物体内能具有的特定功能，对此，例如可以举出特异性的细胞表面结构识别能力、酶活性、与特定的蛋白质的结合能力等，但并不限定于这些。本公开文本中，例如可以举出某种启动子在特定的宿主细胞中被识别的功能等，但并不限定于这些。本说明书中，生物学功能可通过“生物学活性”得以发挥。本说明书中，所谓“生物学活性”，是指某种因子(例如，多核苷酸、蛋白质等)在生物体内能具有的活性，包括发挥各种功能(例如，转录促进活性)的活性，例如，也包括通过与某种分子的相互作用而使其他分子活化或失活的活性。例如，某种因子为酶的情况下，其生物学活性包括其酶活性。在其他例子中，某种因子为配体的情况下，包括该配体向对应的受体的结合。这样的生物学活性可以利用本领域中公知的技术进行测定。因此，“活性”是指显示或表明结合(直接结合或间接结合中的任一种)、或者影响响应(即，具有对一些曝露或刺激作出响应的可测定的影响)的各种可测定的指标，例如可举出宿主细胞中的上游或下游的蛋白质的量或者其他相似的功能的标准。
[0267]
在本发明中使用的情况下，所谓病毒或病毒载体的“感染性”，是指通过病毒或病毒载体向细胞的粘附或膜融合而将病毒或病毒载体内的核酸导入细胞内的能力。仙台病毒载体可以具有与野生型载体相同的复制能力，另外，也可以通过基因变异而变弱。所谓病毒或病毒载体的“复制能力”，是指在感染细胞内产生感染性的病毒粒子或病毒载体粒子的能力。
[0268]
在本说明书中使用的情况下，关于术语“转化”、“转导”及“转染”，只要没有特别说明则可互换使用，是指核酸向宿主细胞中的导入(根据需要介由病毒或病毒载体)。作为转化方法，只要是向宿主细胞中导入核酸的方法即可，可以使用任意方法，例如，可举出感受态化细胞的使用、电穿孔法、使用粒子枪(基因枪)的方法、磷酸钙法等各种公知的技术。
[0269]
本说明书中，所谓“经纯化的”物质或生物学因子(例如，核酸或蛋白质等)，是指将天然伴随着该生物学因子的因子中的至少一部分除去而得到的物质。因此，通常，经纯化的生物学因子中的该生物学因子的纯度高于该生物学因子通常存在的状态(即，被浓缩)。本说明书中使用的术语“经纯化的”是指：存在优选至少75重量％、更优选至少85重量％、更进一步优选至少95重量％、而且最优选至少98重量％的同型的生物学因子。本发明中使用的物质优选为“经纯化的”物质。
[0270]
本说明书中，所谓“医药成分”，是指可构成医药的任意成分，例如，可以例示有效成分(其本身显示药效的成分)、添加成分(其本身未被期待药效、但在以医药的形式被包含的情况下可期待发挥一定的作用(例如，赋形剂、润滑剂、表面活性剂等)的成分)等。医药成分可以为单独的物质，也可以为多种物质、试剂的组合。也可包括有效成分与添加成分的组合、佐剂与有效成分的组合等任意组合。
[0271]
本说明书中，“有效成分”是指发挥所期望的药效的成分，可由单独或多种成分担当。
[0272]
本说明书中，所谓“添加成分”，是指虽未期待药效但在以医药的形式被包含的情况下发挥一定的作用的任意成分，例如，可以举出药学上可接受的担载体、稳定剂、(辅)助
剂、溶解度改善剂、增溶剂、稀释剂、赋形剂、缓冲剂、粘结剂、稀释剂、香料、润滑剂。
[0273]
本说明书中，“药剂”、“试剂”或“因子”(在英语中均相当于agent)在广义上可互换使用，只要能够达成期望的目的，则可以为任何物质或其他要素(例如，光、放射能、热、电等能量)。作为这样的物质，例如，可举出蛋白质、多肽、寡肽、肽、多核苷酸、寡核苷酸、核苷酸、核酸(例如，包括cdna、基因组dna这样的dna、mrna这样的rna)、多糖、寡糖、脂质、有机低分子(例如，激素、配体、信息传递物质、有机低分子、利用组合化学方式合成的分子、可用作医药品的低分子(例如，低分子配体等)等)、它们的复合分子及它们的混合物，但并不限定于这些。
[0274]
在本说明书中使用的情况下，所谓“复合体”或“复合分子”，是指包含2个以上的部分的任意构成体。例如，一个部分为多肽的情况下，另一个部分可以为多肽，也可以为除此以外的物质(例如，基材、糖、脂质、核酸、其他烃等)。本说明书中，构成复合体的2个以上的部分可以通过共价键结合，也可以通过除此以外的键(例如，氢键、离子键、疏水性相互作用、范德华力等)结合。
[0275]
本说明书中，所谓“标记”，是指用于由其他物质识别成为目标的分子或物质的存在(例如，物质、能量、电磁波等)。作为这样的标记方法，可以举出ri(放射性同位素)法、荧光法、生物素法、化学发光法等。在通过荧光法对多种靶标蛋白质或者捕捉其的因子或手段进行标记的情况下，利用荧光发光极大波长彼此不同的荧光物质进行标记。荧光发光极大波长之差优选为10nm以上。可以使用不对功能造成影响的任意标记，作为荧光物质，可举出alexa
tm
fluor。alexa
tm
fluor是对香豆素、罗丹明、荧光素、菁等进行修饰而得到的水溶性的荧光色素，是与宽范围的荧光波长对应的系列，与其他的相应波长的荧光色素相比，非常稳定、明亮，另外，ph敏感性低。作为荧光极大波长为10nm以上的荧光色素的组合，可以举出alexa
tm
555与alexa
tm
633的组合、alexa
tm
488与alexa
tm
555的组合等。作为其他荧光标记，可举出菁色素(例如，cydye
tm
系列的cy3、cy5等)、罗丹明6g试剂、n-乙酰氧基-n2-乙酰基氨基芴(aaf)、aaif(aaf的碘衍生物)等。本公开文本中，可以利用这样的标记，以能被所使用的检测手段检测到的方式对作为目标的对象进行修饰。这样的修饰在本领域中是已知的，本领域技术人员可以根据标记及作为目标的对象而适宜地实施这样的方法。
[0276]
本说明书中，所谓“试剂盒”，是指通常分为2个以上的区块、提供应当提供的部分(例如，病毒载体、说明书等)的单元。在目的是提供基于稳定性等目的而不应混合提供、优选在即将使用之前混合后使用这样的组合物时，该试剂盒的形态是优选的。有利的是，这样的试剂盒优选具备记载如何使用所提供的部分、或者应当如何处理试剂的指示书或说明书。本说明书中，在试剂盒以试剂套件的形式使用的情况下，试剂盒中通常包含记载有病毒载体等的用法等的指示书等。
[0277]
本说明书中，“指示书”是记载有将利用本公开文本的方法向医生或其他使用者的说明的文件。该指示书记载了指示施予本公开文本的医药等的内容。另外，在指示书中，也可以记载指示施予形态的内容。该指示书可按照实施本公开文本的国家的监督机关(例如，若是日本，则为厚生劳动省，若是美国，则为食品医药品局(fda)等)所规定的样式而制成，并明确记载已获得该监督机关认可的主旨。指示书是所谓的包装附页(package insert)，通常以纸介质来提供，但并不限定于此，例如，也可以以电子介质(例如，通过网络提供的网页、电子邮件)这样的形态提供。
[0278]
术语“约”是指所示的值加或减10％。“约”在针对温度而使用的情况下，是指所示的温度加或减5℃，“约”在针对ph而使用的情况下，是指所示的ph加或减0.5。
[0279]
(优选的实施方式)
[0280]
以下对本公开文本的优选的实施方式进行说明。以下所提供的实施方式是为了更充分地理解本公开文本而提供的，可理解本公开文本的范围不应当限定于以下的记载。因此，本领域技术人员可以参考本说明书中的记载而在本公开文本的范围内适宜地进行改变，这是显而易见的。另外，可理解以下的实施方式可以单独使用或者将它们组合而使用。
[0281]
(载体质粒)
[0282]
在一个方面，本公开文本提供能够在枯草杆菌中复制的病毒载体质粒。在一个实施方式中，本公开文本提供能够在枯草芽孢杆菌中复制的病毒载体质粒。可预期用于达成其的任意手段均在本公开文本的范围内。例如，即使没有明示性的记载，使用某种成分的方法的记载也同时预期到包含相同成分的组合物、相同成分的用途及用于相同方法的相同成分等反映出其他手段的实施方式。
[0283]
在一个方面，本公开文本提供质粒，其包含：在枯草杆菌中促进质粒复制的核酸序列；和构成病毒载体所必需的核酸序列。在一个实施方式中，在枯草杆菌中促进质粒复制的核酸序列可包含在枯草杆菌中工作的复制起点、例如oric及ptb19(imanaka,t.等j.gen.microbioi.130,1399-1408.(1984))、pls32(tanaka,t和ogra,m.febs lett.422,243-246.(1998))、pamβ1(swinfield,t.j.等gene 87,79-90.(1990))等质粒中包含的复制起点。作为在枯草杆菌中促进质粒复制的核酸序列，可举出已知能使滚环型、θ型、oric、利用噬菌体等的复制机制工作的、质粒或其一部分或者复制起点、或者它们的修饰体等。在一个实施方式中，在枯草杆菌中促进质粒复制的核酸序列可具有与已知的复制起始点相同或相似的序列(例如，90％以上、95％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.5％以上的序列同一性)。
[0284]
在一个实施方式中，本公开文本的载体质粒可具有在枯草杆菌中工作的启动子及/或增强子。例如，作为枯草杆菌的启动子，可举出能利用iptg(isopropyl s-d-thiogalactopyranoside)控制表达的pspac(yansura,d.和henner,d.j.pro.natl.acad.sci,usa 81,439-443.(1984.))、或pr启动子(itaya,m.biosci.biotechnol.biochem.63,602-604.(1999))等。在枯草杆菌中工作的核酸元件不需要来源于枯草杆菌，可选择高效率地工作的核酸元件等。在一个实施方式中，载体质粒中的在枯草杆菌中工作的复制起点、启动子及/或增强子被定位于编码病毒载体的起源病毒的基因组(也可包含修饰)或其一部分的区域的外侧。
[0285]
在一个实施方式中，本公开文本的载体质粒可在除枯草杆菌以外的生物的细胞中制作或使用，因此可包含在这些生物中工作的复制起点、启动子、转录终止序列等转录翻译调控序列。每种生物的转录翻译调控序列是已知的，本领域技术人员可以适宜地选择。在一个实施方式中，本公开文本的载体质粒可在大肠杆菌、酵母等中制作或复制，因此可包含在这些微生物中工作的转录翻译调控序列。在一个实施方式中，本公开文本的载体质粒可导入至生产细胞中，因此可包含在生产细胞中工作的转录翻译调控序列。在一个实施方式中，本公开文本的载体质粒不包含病毒的全基因组中的至少一部分基因的序列。
[0286]
在一个实施方式中，构成病毒所必需的核酸序列配置于载体质粒上的集中区域。
通过将包含构成病毒所必需的核酸序列的核酸片段整合到成为基础的质粒中，可形成这样的结构的载体质粒。在一个实施方式中，构成病毒所必需的核酸序列存在于载体质粒的总碱基长度的约50％以下、约40％以下、约30％以下、约25％以下、约20％以下、约15％以下、约10％以下、或约5％以下的碱基长度的连续区域内。在一个实施方式中，能在枯草杆菌内被复制的序列可以配置于存在构成病毒所必需的核酸序列的连续区域内，也可以配置于该连续区域外。在一个实施方式中，构成病毒所必需的核酸序列的除末端重复序列以外的要素(例如，编码病毒的衣壳蛋白的核酸序列、编码对病毒的基因组进行包装、转录及复制的蛋白质的核酸序列及辅助基因中的一者或多者)各自可以配置于2个末端重复序列之间，也可以配置于外侧。本公开文本的载体质粒中，构成病毒所必需的核酸序列的各要素可以以任意的顺序及位置进行配置，可理解为可以使用除了在附图等中具体示出的配置以外的各种配置。辅助基因等以特定的功能记载的核酸序列包含多个要素的情况下，只要没有特别记载，则载体质粒中的各要素的顺序及位置可以是任意的，也可以将任意的要素(例如，va、e2a、e4)彼此连续地(其间不夹持其他基因)配置。
[0287]
在一个实施方式中，构成病毒所必需的核酸序列包含病毒的2个末端重复序列，被2个末端重复序列夹持的区域的碱基长度(不包括末端重复序列自身)可以为约5kb以上、约10kb以上、约20kb以上、约30kb以上、约40kb以上、约50kb以上、约70kb以上、或约100kb以上。在一个实施方式中，构成病毒所必需的核酸序列包含病毒的2个末端重复序列及其他部分，其他部分位于被前述2个末端重复序列夹持的区域之外的位置。在一个实施方式中，构成病毒所必需的核酸序列包含：编码病毒的衣壳蛋白的核酸序列(例如，cap，可来源于腺相关病毒的血清型1～12或其修饰体中的任一者)；编码对病毒的基因组进行包装、转录及复制的蛋白质的核酸序列(例如，rep，可来源于腺相关病毒的血清型1～12或其修饰体8中的任一者)；病毒的2个末端重复序列(例如，来源于血清型1～12或其修饰体中的任一者)；和辅助基因(例如，e1a、e1b、e2a、e4及va中的至少一者，可来源于腺病毒的血清型1～52或其修饰体中的任一者)。在一个实施方式中，在5’itr与3’itr之间从上游起包含启动子、所期望的基因及终止子。尤其是，可预期编码病毒的衣壳蛋白的核酸序列也可以为野生型序列(例如，腺相关病毒的血清型1～12)的修饰体。
[0288]
在一个实施方式中，本公开文本的载体质粒包含所期望的基因。在一个实施方式中，所期望的基因可配置于2个末端重复序列之间。在一个实施方式中，本公开文本的载体质粒中的所期望的基因最终可包含于病毒载体的搭载核酸中。对于这样的所期望的基因而言，可以编码治疗用蛋白质，可以编码基因治疗用基因，可以编码用于cart疗法等基因细胞治疗的基因，也可以编码蛋白质非编码功能性rna(rrna、trna、微rna(mirna)、lncrna等)，还可以与它们组合地或独立地包含启动子、终止子、绝缘子、增强子、沉默子、复制起点等转录翻译调控序列。在一个实施方式中，所期望的基因包含巨细胞病毒启动子、cag启动子、sv40启动子、rsv启动子等病毒启动子(根据需要，在蛋白质编码基因的上游)。在一个实施方式中，所期望的基因包含ires(根据需要，在蛋白质编码基因的上游)。在一个实施方式中，所期望的基因可被整合到施予病毒载体的受试体的染色体中。在该实施方式中，所期望的基因可以具备控制受试体原来具有的基因的表达的功能，也可以引起蛋白质在长期内的表达。例如，基于腺相关病毒、逆转录病毒等的病毒载体可被整合到受试体的染色体中。在一个实施方式中，所期望的基因可被整合到治疗用细胞(例如，染色体)中(例如，通过在体
dystrophin)、肌肉生长抑制素前肽、卵泡抑素、活化素ii型可溶性受体、igf-1、抗炎性多肽、肌长蛋白(sarcospan)、抗肌萎缩蛋白相关蛋白(utrophin)、小抗肌萎缩蛋白相关蛋白(mini-utrophin)、凝血因子(例如，viii因子、ix因子、x因子等)、红细胞生成素、血管抑素、内皮抑素、过氧化氢酶、酪氨酸羟化酶、超氧化物歧化酶、瘦素、ldl受体、脂蛋白脂酶、鸟氨酸转氨甲酰酶、β-珠蛋白、α-珠蛋白、血影蛋白、α1-抗胰蛋白酶、腺苷脱氨酶、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶、β-葡糖脑苷脂酶、鞘磷脂酶、溶酶体氨基己糖苷酶a、支链酮酸脱氢酶、rp65蛋白、细胞因子(例如，α-干扰素、β-干扰素、干扰素-γ、白介素-2、白介素-4、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、淋巴毒素等)、肽生长因子、神经营养因子及激素(例如，生长激素、胰岛素、胰岛素样生长因子1及胰岛素样生长因子2、血小板源性生长因子、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、神经生长因子、神经营养因子-3及神经营养因子-4、脑源性神经营养因子、骨形态发生蛋白、胶质源性生长因子、转化生长因子-α及转化生长因子-β等)、溶酶体酸性α-葡糖苷酶、α-半乳糖苷酶a、肿瘤坏死生长因子α可溶性受体、s100a1、小白蛋白、腺苷酸环化酶6型、抗炎性因子、抗肌肉生长抑制素蛋白、天冬氨酸酰化酶、自杀基因产物(例如，胸苷激酶、胞嘧啶脱氨酶、白喉毒素、肿瘤坏死因子)、肿瘤抑制基因产物(例如，p53、rb、wt-1)、trail、fas-配体等。
[0292]
作为病原体多肽，可举出细菌、真菌、寄生虫等病原生物的细胞表面蛋白质、及在病毒的表面表达的蛋白质(例如，刺突蛋白、包膜蛋白、衣壳蛋白等)。作为病原体多肽的具体例，可举出正粘病毒免疫原(例如，流行性感冒病毒血细胞凝集素(ha)、核蛋白)、慢病毒免疫原(例如，hiv或siv的包膜gp160蛋白、基质/衣壳蛋白、gag、pol、env基因产物)、沙粒病毒免疫原(例如，拉沙热病毒核衣壳蛋白、包膜糖蛋白)、痘病毒免疫原(例如，牛痘l1或l8基因产物)、黄病毒免疫原(例如，黄热病病毒或日本脑炎病毒免疫原)、丝状病毒免疫原(例如，np及gp基因产物等埃博拉病毒或马尔堡病毒免疫原)、布尼亚病毒免疫原(例如，rvfv、cchf、sfs病毒免疫原)、冠状病毒免疫原(例如，人冠状病毒包膜糖蛋白等人冠状病毒免疫原)、脊髓灰质炎免疫原、疱疹病毒免疫原(例如，cmv、ebv、hsv免疫原)、腮腺炎病毒免疫原、麻疹病毒免疫原、风疹病毒免疫原、白喉毒素或其他白喉免疫原、百日咳抗原、及肝炎(例如，甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎等)免疫原等。
[0293]
作为癌抗原多肽，可举出brca1基因产物、brca2基因产物、gp100、酪氨酸酶、gage-1/2、bage、rage、lage、ny-eso-1、cdk-4、β-连环蛋白、mum-1、半胱天冬酶-8、kiaa0205、hpve、sart-1、prame、p15、黑色素瘤肿瘤抗原、mart-1、gp100 mage-1、mage-2、mage-3、cea、trp-1、trp-2、p-15、酪氨酸酶、her-2/neu基因产物、ca125、lk26、fb5(内皮唾液酸蛋白)、tag72、afp、ca19-9、nse、du-pan-2、ca50、span-1、ca72-4、hcg、stn(唾液酸tn抗原)、c-erbb-2蛋白、psa、l-canag、雌激素受体、乳脂球蛋白、p53肿瘤抑制蛋白、粘蛋白抗原、端粒酶、核基质蛋白、前列腺酸性磷酸酶、乳头状瘤病毒抗原等。
[0294]
在一个实施方式中，所期望的基因可以为用于治疗特定疾病的基因(例如，基因治疗基因)。关于应针对特定疾病选择的基因，本领域技术人员可适宜地选择。作为这样的疾病，例如，可举出由各种病原体导致的感染症、囊性纤维症、a型血友病、b型血友病、地中海贫血、贫血、阿尔茨海默病、多发性硬化症、帕金森病、亨廷顿氏病、肌萎缩侧索硬化症、脊髓型肌萎缩症、癫痫、癌(黑色素瘤、腺癌、胸腺瘤、淋巴瘤、肉瘤、肺癌、肝癌、结肠癌、白血病、子宫癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、膀胱癌、肾癌、胰腺癌、脑癌等)、糖尿病、肌营养
不良症、戈谢病、hurler病、腺苷脱氨酶缺乏症、糖原贮积病、先天性肺气肿、莱-尼二氏(lesch-nyhan)综合征、尼曼-皮克病、泰萨克斯病、安格尔曼(angelman)综合征、枫糖尿症、老年黄斑变性、黑内障、糖尿病性视网膜病、视网膜变性疾病、星形细胞瘤、胶质母细胞瘤、心力衰竭、外周动脉疾病、关节炎、关节病症、内膜增生、aids、肌萎缩、肾虚、肝炎、ldl受体缺乏症、高氨血症、克拉伯病、巴滕病、脊髓大脑性共济失调、苯丙酮尿症、自身免疫性疾病、氨基酸代谢紊乱、有机酸代谢紊乱、脂肪酸代谢紊乱、线粒体病、碳水化合物代谢紊乱、溶酶体病、过氧化物酶体病(peroxisomal disease)、金属代谢紊乱、嘌呤嘧啶代谢紊乱、维生素代谢紊乱、神经递质紊乱、脂质代谢紊乱、结缔组织异常疾病、先天性卟啉症、α1-抗胰蛋白酶缺损症、溶酶体贮积病、粘多糖贮积症、法布里病、卡纳万病、利氏病、雷弗素姆病、图雷特综合征、原发性侧索硬化症、进行性肌萎缩、皮克氏病、肌营养不良症、重症肌无力症、宾斯万格病、脑梗塞、精神障碍、抑郁症、双相情感障碍、持续性情感障碍、继发性情感障碍、精神分裂症、药物依赖、焦虑、强迫症、躯体形式障碍、分离性障碍、悲伤、产后抑郁症、幻觉、妄想、痴呆、偏执狂、孤独症谱系障碍、注意力缺陷障碍、性心理障碍、睡眠障碍、疼痛障碍、进食障碍、体重病症、肥胖症、恶病质、神经性厌食症、贪食症等。在一个实施方式中，所期望的基因可被整合到cart疗法等中使用的治疗用细胞(例如，染色体)中(例如，通过在体外利用病毒载体进行的细胞处理)。
[0295]
(病毒载体)
[0296]
本公开文本的载体质粒可用于生产病毒载体。在一个实施方式中，本公开文本提供使用本公开文本的载体质粒制作病毒载体的方法。在一个实施方式中，本公开文本提供含有如上所述地制作的病毒载体的组合物或病毒载体。作为病毒载体，可举出基于逆转录病毒、慢病毒、腺相关病毒、腺病毒或仙台病毒的病毒载体。
[0297]
在一个实施方式中，本公开文本的载体质粒被导入生产细胞中从而生产病毒载体。作为生产细胞的例子，例如，可举出911细胞、per.c6细胞、e1转化的羊水细胞、e1转化的a549细胞、gh329：hela细胞、hek293细胞、it293sf细胞、hek293t、hek293f、vero细胞、cho细胞、sf9细胞、freestyle(商标)293-f、expi293-f(商标)、expi293 inducible、expi293 ngt-viral production cells 1.0、viral production cells 2.0、aavpro(注册商标)293t cell line、lenti-x(商标)293t cell line、freestyle(商标)cho-s cells、expicho-s(商标)等，但并不限定于这些。可根据生产的病毒载体的种类而选择任意已知的合适的生产细胞。在一个实施方式中，本公开文本的载体质粒可以缺失病毒载体的起源病毒的基因中的少数(例如，1个、2个、3个、4个或5个)，而包含其他的所有基因。在一个实施方式中，本公开文本的载体质粒缺失生产病毒载体所必需的基因集合(set)中的一部分，基因集合之中为载体质粒所缺失的基因在生产细胞中与载体质粒呈反式地得到供给。在一个实施方式中，本公开文本的载体质粒可以不与其他质粒组合地单独导入生产细胞中，由此能够生产病毒载体。在一个实施方式中，本公开文本的载体质粒可被导入表达生产病毒载体所必需的基因集合之中为载体质粒所缺失的全部基因的生产细胞。例如，可将包含aav的cap及rep、以及腺病毒的e2a、e4及va的本公开文本的载体质粒单独导入表达腺病毒的e1a及e1b的hek293细胞中，由此生产病毒载体。在一个实施方式中，本公开文本的载体质粒可与包含生产病毒载体所必需的基因集合之中为载体质粒所缺失的基因的其他核酸或其基因的产物(例如，病毒粒子)一同导入生产细胞中。
[0298]
在一个实施方式中，病毒载体可以通过将载体质粒导入感染了病毒载体的起源病毒的生产细胞中、在该细胞中进行同源重组从而制作。该实施方式中使用的病毒载体质粒包含所期望的基因及与起源病毒的基因组中的任一区域(例如，基因间的区域)具有同源性的核酸序列。在一个实施方式中，载体质粒可具有在生产的病毒载体的起源病毒的基因组中的任意基因之间包含所期望的基因的结构。在一个实施方式中，载体质粒中包含的核酸的至少一部分被整合到生产细胞的染色体中。
[0299]
在一个实施方式中，本公开文本的载体质粒包含用于切出生产的病毒载体的起源病毒的搭载核酸的片段(逆转录病毒中的ltr、aav病毒中的itr等)，在一个实施方式中，在该片段之间包含所期望的基因。在一个实施方式中，本公开文本的载体质粒在该片段之间包含所期望的基因以及以可工作的方式与其连结的启动子及/或终止子(例如，能在病毒载体的靶标对象中工作)。在一个实施方式中，本公开文本的载体质粒在该片段之间不包含病毒载体的起源病毒的复制所必需的基因。在一个实施方式中，本公开文本的载体质粒包含生产的病毒载体的起源病毒的包装信号。
[0300]
所生产的病毒载体具有衣壳，衣壳可参与与组织或细胞的结合。因此，通过对衣壳进行修饰来改变与组织或细胞(或其表面结构)的结合性，能够调整病毒载体针对组织或细胞的靶向化。在一个实施方式中，本公开文本的载体质粒可以具有编码衣壳的基因，该衣壳也可以进行修饰。例如，作为调整组织或细胞靶向化的衣壳修饰，可举出与其他蛋白质(其他病毒衣壳(例如，其他血清型的病毒的衣壳、vsv-g)、抗体的抗原结合区域、受试体生物的配体蛋白质(针对癌抗原的配体)等)的替换或融合。另外，具有包膜的病毒载体可在包膜中包含生产细胞的细胞膜成分。因此，通过改变生产细胞的细胞膜成分，能够调整具有包膜的病毒载体向组织或细胞的靶向化。在一个实施方式中，病毒载体可以以将神经细胞(外周神经系统或中枢神经系统的细胞、神经元及少突胶质细胞等脑细胞等)、肺细胞、眼细胞(视网膜细胞、视网膜色素上皮、角膜细胞等)、上皮细胞(例如，肠或呼吸道的上皮细胞)、肌肉细胞(例如，骨骼肌细胞、心肌细胞、平滑肌细胞、膈肌细胞)、树突状细胞、胰腺细胞(岛细胞等)、肝细胞、心肌细胞、骨细胞(例如，骨髓干细胞)、造血干细胞、脾细胞、角化细胞、成纤维细胞、内皮细胞、前列腺细胞、生殖细胞、癌细胞等作为靶标的方式设计。各种细胞上特异性的表面结构(受体等)是已知的，本领域技术人员可以适宜地选择与该表面结构牢固地或特异性地结合的蛋白质。
[0301]
在一个实施方式中，本公开文本的载体质粒也可以包含编码将生产的病毒载体的起源病毒的蛋白质弱毒化而成的蛋白质的基因。本公开文本的载体质粒可以包含编码任意已知的弱毒化病毒蛋白质的基因。
[0302]
在一个实施方式中，本公开文本提供含有质粒的组合物，其包含本公开文本的载体质粒的集群。在一个实施方式中，对于含有质粒的组合物而言，质粒的ccc(共价闭合环状)纯度可以为约60％以上、约70％以上、约75％以上、约80％以上、约85％以上、约90％以上或约95％以上。
[0303]
·
腺病毒载体
[0304]
腺病毒是腺病毒科哺乳动物腺病毒属的病毒，病毒粒子由核衣壳及双链线状dna基因组构成，具有90～100nm的正二十面体的结构。腺病毒的感染通过病毒衣壳吸附至细胞表面的腺病毒受体(coxackie-adenovirus receptor，car)而开始，接着，病毒可介由细胞
表面的整合素而侵入细胞内。然后，从溶酶体脱出的病毒基因组到达细胞核内，可引起病毒基因组的复制。首先表达e1a蛋白，将作为其他早期蛋白的e1b、e2、e3、e4的表达活化，由此开始病毒复制。对于病毒基因组而言，由e2表达的末端蛋白(tp)与脱氧胞苷共价键合，在其上进一步结合聚合酶而形成复合体，从而开始复制。另外，基因组编码包含五邻体蛋白(penton)(l2)、六邻体蛋白(hexon)(l3)、骨骼蛋白(l4)、及纤维蛋白(l5)的结构蛋白，还包含处于单一启动子的控制下的、5个后期转录单位(l1、l2、l3、l4及l5)。基因组的两端包含病毒的复制所必需的反向末端序列(inverted terminal repeat：itr)。病毒的结构蛋白在细胞质中被翻译后，移至细胞核内而构成病毒粒子，识别病毒基因组的包装信号(ψ)而对基因组进行包装。另外，腺病毒生产蛋白质非编码varna，其是由va基因编码的。腺病毒粒子可具有l2及l3的衣壳。
[0305]
到目前为止，已鉴定出52种人腺病毒的抗原型，其基于血细胞凝集反应的性质和序列同源性而分为6个亚群：亚群a(例如，血清型12、18及31)、亚群b(例如，血清型3、7、11、14、16、21、34、35及50)、亚群c(例如，血清型1、2、5及6)、亚群d(例如，血清型8、9、10、13、15、17、19、20、22～30、32、33、36～39及42～48)、亚群e(例如，血清型4)、亚群f(例如，血清型40及41)、及未分类的血清型群(例如，血清型49及51)。
[0306]
在一个实施方式中，腺病毒载体质粒包含构成腺病毒载体所必需的核酸序列中的至少一者及所期望的基因。在一个实施方式中，腺病毒载体质粒在5’itr与3’itr之间包含所期望的基因。在一个实施方式中，腺病毒载体质粒在5’itr与3’itr之间包含所期望的基因、启动子及终止子。在一个实施方式中，腺病毒载体质粒在5’itr与3’itr之间不包含构成腺病毒载体所必需的核酸序列中的一者或多者(例如全部)。在一个实施方式中，腺病毒载体质粒以在载体质粒及生产细胞包含构成腺病毒载体所必需的核酸序列的这样的生产细胞中发挥功能的方式构成。在一个实施方式中，构成腺病毒载体所必需的核酸序列中未包含于载体质粒中的基因中的一者或多者(例如，全部)可以由生产细胞的染色体编码。
[0307]
在一个实施方式中，构成腺病毒载体所必需的核酸序列可包含编码e1a、e1b、e2a、e2b、e3、e4、l1、l2、l3、l4、l5、ix、iva2的基因。在一个实施方式中，构成腺病毒载体所必需的核酸序列可以为除e3以外的腺病毒的全部基因。在一个实施方式中，构成腺病毒载体所必需的核酸序列可包含：编码衣壳蛋白的核酸序列(l2、l3)；编码对基因组进行包装、转录及复制的蛋白质的核酸序列(e1a、e1b、e2a、e2b、e4)；2个末端重复序列(5’itr、3’itr)；和辅助基因的核酸序列。在一个实施方式中，辅助基因的核酸序列可以为除l2、l3、e1a、e1b、e2a、e3、e2b、e4、5’itr、3’itr以外的全部腺病毒基因。在一个实施方式中，腺病毒载体质粒可以不包含va、e1a、e1b、e2a、e2b、e4中的一者或多者，在一个实施方式中，构成腺病毒载体所必需的核酸序列包含它们。在特定的实施方式中，腺病毒载体质粒不包含e1a及e1b。在一个实施方式中，腺病毒载体质粒可以缺失e1a，而在该缺失部位插入有所期望的基因。已知va rna在人类中与输出蛋白、risk、dicer等进行相互作用，通过使va从腺病毒载体质粒缺失，能降低对腺病毒载体感染细胞的副作用。由于e1a、e1b、e2a、e2b、e4会是腺病毒的复制所必需的基因，因此，使它们缺失而得到的腺病毒载体质粒在感染细胞中的复制能力得以被降低。
[0308]
在一个实施方式中，本公开文本的腺病毒载体可以来源于人的亚群c、例如血清型2或血清型5。在一个实施方式中，本公开文本的腺病毒载体可以来源于血清型12(亚群a)、
血清型7或血清型35(亚群b)、血清型30或血清型36(亚群d)、血清型4(亚群e)、或血清型41(亚群f)。作为用于生产腺病毒载体的生产细胞，可举出hek293、hek293t、hek293f、hela、sf9等细胞。
[0309]
·
腺相关病毒载体
[0310]
腺相关病毒(aav)是细小病毒科依赖病毒属的线状单链dna病毒，病毒粒子的直径为20～26nm。aav的增殖需要腺病毒元件。在aav基因组的两个末端存在被称为itr(inverted terminal repeat，反向末端序列)的t字型发夹结构。该itr的一部分成为复制的起始点，发挥引物的作用。另外，向病毒粒子中的包装、向宿主细胞的染色体dna中的整合也需要该itr。在基因组的左半部分中存在编码非结构蛋白、即控制复制、转录的调控蛋白质(rep78、rep68、rep52、rep40)的rep基因，在基因组的右半部分中存在编码作为结构蛋白(vp1、vp2、vp3)的三种衣壳蛋白的cap基因。
[0311]
aav的生命周期可分为潜伏感染和溶解感染。前者的特征是，在单独感染的情况下，被整合到宿主细胞的19号染色体长臂的aavs1区域(19q13.3-qter)。该整合是通过非同源重组进行的，与rep有关。已报道了rep78/rep68结合于在aavs1区域和itr的rep结合区域中共同存在的碱基序列(gagc重复序列)。因此认为，在野生型aav感染了靶细胞时，rep结合于aav的itr及aavs1，通过介在有rep，从而发生向aav基因组的19号染色体上的部位特异性整合。在同时感染了腺病毒等辅助病毒的情况、向aav潜伏感染的细胞进一步重复感染辅助病毒的情况下，发生aav的复制，由于细胞破坏而释放出大量的病毒(溶解感染)。
[0312]
在一个实施方式中，aav载体质粒包含构成aav载体所必需的核酸序列中的至少一者及所期望的基因。在一个实施方式中，aav载体质粒在5’itr与3’itr之间包含所期望的基因。在一个实施方式中，aav载体质粒在5’itr与3’itr之间包含所期望的基因、启动子及终止子。在一个实施方式中，aav载体质粒在5’itr与3’itr之间不包含构成aav载体所必需的核酸序列中的一者或多者(例如全部)。在一个实施方式中，aav载体质粒以在载体质粒及生产细胞包含构成aav载体所必需的核酸序列的这样的生产细胞中发挥功能的方式构成。在一个实施方式中，构成aav载体所必需的核酸序列中未包含于载体质粒中的基因中的一者或多者(例如，全部)可以由生产细胞的染色体编码。
[0313]
在一个实施方式中，构成aav载体所必需的核酸序列可以为aav的5’itr、rep、cap、aap(组装激活蛋白)、maap(膜相关辅助蛋白)及3’itr、以及腺病毒的e1a、e1b、e2a、va及e4。在一个实施方式中，构成aav载体所必需的核酸序列可包含：编码aav衣壳蛋白的核酸序列(cap)；编码对基因组进行包装、转录及复制的aav蛋白质的核酸序列(rep)；aav的2个末端重复序列(5’itr、3’itr)；和辅助基因的核酸序列(腺病毒的e1a、e1b、e2a、va、e4)。在一个实施方式中，aav载体质粒可以不包含rep、cap、va、e1a、e1b、e2a、e4中的一者或多者，在一个实施方式中，构成腺病毒载体所必需的核酸序列包含它们。
[0314]
关于aav，基于衣壳而报道了1～12型的血清型。另外，还报道了rh10、dj、dj/8、php.eb、php.s、aav2-retro、aav2-quadyf、aav2.7m8、aav6.2、rh.74、aav2.5、aav-tt、anc80的血清型。本公开文本的aav载体可以根据靶组织而基于合适的血清型的aav进行制作。例如，(血清型)：(靶组织)的关系可以如下所述地选择；(aav1)：(肌肉、肝脏、呼吸道、神经细胞)、(aav2)：(肌肉、肝脏、神经细胞)、(aav3)：(肌肉、肝脏、神经细胞)、(aav4)：(肌肉、室管膜细胞)、(aav5)：(肌肉、肝脏、神经细胞、胶质细胞、呼吸道)、(aav6)：(肌肉、肝脏、呼吸道、
神经细胞)、(aav7)：(肌肉、肝脏)、(aav8)：(肌肉、肝脏)、(aav9)：(肌肉、肝脏、呼吸道)。作为用于生产aav载体的生产细胞，可举出hek293、hek293t、hek293f、hela、sf9等细胞。作为aav的衣壳，除了野生型的衣壳之外，还可举出施加了靶向化突变的衣壳(aav2i8、aav2.5、aav-tt、aav9.hr等)、施加了随机突变的衣壳(aav-php.b等)、以生物信息学方式(in silico)设计成的衣壳(anc80等)，在一个实施方式中，本公开文本的aav载体可以包含这些修饰衣壳，本公开文本的aav载体质粒也可以以编码这些修饰衣壳的方式构建。本说明书中，在记载为核酸序列来源于特定的血清型的情况下，可预期核酸序列可以编码野生型的衣壳，也可以编码基于野生型的衣壳实施如上所述的修饰而成的衣壳。
[0315]
·
逆转录病毒载体
[0316]
本说明书中，“逆转录病毒”通常是指逆转录病毒科的病毒。逆转录病毒是双链rna包膜病毒，其主要特征在于将基因组从rna逆转录为dna的能力。病毒体(virion)的长度为直径约100～120nm，并且含有与核衣壳蛋白形成了复合体的相同正链rna的二聚体基因组。基因组被封入含有病毒感染所必需的酶蛋白质、即逆转录酶、整合酶及蛋白酶的衣壳中。基质蛋白形成衣壳核心的外侧的层，其与围绕着病毒核心粒子的、作为来源于宿主细胞膜的脂质双层的包膜进行相互作用。在该双层上固定有识别宿主细胞上的特异性受体并使感染过程开始的病毒包膜糖蛋白。包膜蛋白由将蛋白质固定于脂质膜内的跨膜(tm)和与细胞受体结合的表面(su)这2个亚基形成。
[0317]
作为逆转录病毒，可举出小鼠白血病病毒(mlv)、人类免疫缺陷病毒(hiv)、马感染性贫血病毒(eiav)、小鼠乳房肿瘤病毒(mmtv)、劳氏(rous)肉瘤病毒(rsv)、藤浪(fujinami)肉瘤病毒(fusv)、莫罗尼(moloney)小鼠白血病病毒(mo-mlv)、fbr小鼠骨肉瘤病毒(fbr msv)、莫罗尼小鼠肉瘤病毒(mo-msv)、爱柏森(abelson)小鼠白血病病毒(a-mlv)、禽类骨髓瘤病毒29(mc29)、及禽脑脊髓炎病毒(aev)、以及慢病毒，但并不限定于这些。慢病毒可以分为“灵长类”及“非灵长类”。
[0318]
作为灵长类慢病毒的例子，可举出作为人类获得性免疫缺陷综合症(aids)的诱因物质的人类免疫缺陷病毒(hiv)、及猴免疫缺陷病毒(siv)。在非灵长类慢病毒组中，包括原型“慢发病毒”的维斯纳-梅迪病毒(vmv)、以及相关的山羊关节炎脑炎病毒(caev)、马感染性贫血病毒(eiav)、及最近描述的猫免疫缺陷病毒(fiv)和牛免疫缺陷病毒(biv)。
[0319]
在感染过程期间，逆转录病毒最初附着于特定的细胞表面受体。若侵入敏感性的宿主细胞中，则逆转录病毒rna基因组被逆转录酶拷贝成dna。该dna被输送至宿主细胞核中，接着整合到宿主基因组中，该状态被称为前病毒。前病毒在细胞分裂中的宿主染色体中是稳定的，如其他细胞蛋白质那样被转录。前病毒能够编码为了制作更多病毒所需要的蛋白质及包装机构，并以萌芽的方式离开细胞。若逆转录病毒从宿主细胞萌芽，则它们包含宿主细胞脂质膜。如上所述地，来源于宿主细胞的膜蛋白成为逆转录病毒粒子的一部分。
[0320]
逆转录病毒的基因组包含gag(组特异性抗原)、pro(蛋白酶)、pol(聚合酶)及env(包膜)这4个基因。gag序列编码基质蛋白、核衣壳蛋白、及衣壳蛋白这3种主要的结构蛋白。pro序列编码在粒子的聚集、萌芽及成熟期间担负切割gag及gag-pol的作用的蛋白酶。pol序列编码逆转录酶及整合酶的酶，前者在感染过程期间催化从病毒基因组的rna向dna的逆转录，后者担负对ltr进行加工并将前病毒dna整合到宿主细胞基因组中的作用。env序列编码包膜糖蛋白的su及tm亚基这两者。逆转录病毒利用特异性的细胞表面受体与其靶标宿主
细胞结合的能力可由env蛋白的表面成分(su)提供，逆转录病毒通过膜融合而进入细胞的能力可由膜锚定型跨膜成分(tm)赋予。逆转录病毒基因组含有为了促进基因表达、逆转录及向宿主细胞染色体中的整合所必需的要素，作为该要素，可举出2个ltr(长末端重复)、病毒rna向新形成的病毒体中的特异性包装所必需的包装信号(ψ)序列、及作为在逆转录期间开始正链dna合成的部位而发挥功能的多嘌呤束(polypurine tract；ppt)这样的非编码顺式作用序列。长末端重复(ltr)为约600nt的长度，其中，u3区域为450nt的长度，r序列为100nt的长度，u5区域为约70nt的长度。
[0321]
慢病毒等复合逆转录病毒的基因组除了包含gag、pro、pol及env之外，还可包含调控病毒基因表达、感染性粒子的聚集、调整感染细胞中的病毒复制的附加基因。代表性的慢病毒为hiv-1。慢病毒可包含2个控制基因tat及rev。例如，hiv-1还包含vif、vpr、vpu及nef。除此之外还存在vpx等附加基因。这些附加基因参与病毒rna的合成及加工以及其他复制功能的控制。尤其是，hiv除此之外还包含结构性的界标(landmark)(tar、rre、pe、slip、crs、ins)等。慢病毒粒子可包含p24的衣壳蛋白。
[0322]
在一个实施方式中，逆转录病毒载体质粒包含构成逆转录病毒载体所必需的核酸序列中的至少一者及所期望的基因。在一个实施方式中，逆转录病毒载体质粒在5’ltr与3’ltr之间包含所期望的基因。在一个实施方式中，逆转录病毒载体质粒可以在5’ltr与所期望的基因之间包含引物结合位点(primer binding site，pbs)及/或多嘌呤束(ppt)。在一个实施方式中，逆转录病毒载体质粒可以在所期望的基因与3’ltr之间包含土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(wpre)。在一个实施方式中，逆转录病毒载体质粒以在载体质粒及生产细胞包含构成逆转录病毒载体所必需的核酸序列的这样的生产细胞中发挥功能的方式构成。在一个实施方式中，构成逆转录病毒载体所必需的核酸序列中未包含于载体质粒中的基因中的一者或多者(例如，全部)可以由生产细胞的染色体编码。在一个实施方式中，在构建逆转录病毒载体时，可以将env替换为编码vsv-g(水疱性口炎病毒(vsv)的糖蛋白g)的基因。在一个实施方式中，逆转录病毒载体(包括慢病毒)质粒可以追加包含vsv-g基因。在一个实施方式中，在构建逆转录病毒载体(包括慢病毒)时，可以在env的基础上或者以替代env的方式使用将狂犬病病毒的糖蛋白基因(rv-g)或rv-g的细胞内结构域替换成水疱性口炎病毒糖蛋白(vsv-g)的细胞内结构域而成的融合糖蛋白(fug-b)，逆转录病毒载体(包括慢病毒)质粒也可以包含这些基因。
[0323]
在一个实施方式中，构成逆转录病毒载体所必需的核酸序列可包含：编码衣壳蛋白的核酸序列(gag)；编码对基因组进行包装、转录及复制的蛋白质的核酸序列(pol)；2个末端重复序列(5’ltr、3’ltr)；和辅助基因的核酸序列。在一个实施方式中，辅助基因的核酸序列可以为包装信号(ψ)序列、pro、pol及env。在一个实施方式中，逆转录病毒载体质粒可以不包含gag、pro、pol、env中的一者或多者，在一个实施方式中，构成逆转录病毒载体所必需的核酸序列包含它们。由于pol会是逆转录病毒的复制所必需的基因，因此，使其缺失而得到的逆转录病毒载体质粒在感染细胞中的复制能力得以被降低。在一个实施方式中，逆转录病毒载体质粒在5’ltr与3’ltr之间不包含构成逆转录病毒载体所必需的核酸序列中的一者或多者(例如全部)。在一个实施方式中，逆转录病毒载体质粒在5’ltr与3’ltr之间包含所期望的基因。在一个实施方式中，逆转录病毒载体质粒在5’ltr与3’ltr之间包含所期望的基因、启动子及终止子。在一个实施方式中，逆转录病毒载体质粒可以以ltr的u3
区域缺失的方式进行修饰。作为用于生产逆转录病毒载体的生产细胞，可举出hek293t等细胞。
[0324]
在一个实施方式中，构成慢病毒载体所必需的核酸序列可包含：编码衣壳蛋白的核酸序列(gag)；编码对基因组进行包装、转录及复制的蛋白质的核酸序列(pol、rev、包装信号(ψ)序列、app、maap中的至少一者)；2个末端重复序列(5’ltr、3’ltr)；和辅助基因的核酸序列。在一个实施方式中，辅助基因的核酸序列可以为pro、pol及env。在一个实施方式中，慢病毒载体质粒可以不包含rev、gag、pro、pol、env中的一者或多者，在一个实施方式中，构成慢病毒载体所必需的核酸序列包含它们。由于pol及rev会是慢病毒的复制所必需的基因，因此，使它们缺失而得到的慢病毒载体质粒在感染细胞中的复制能力得以被降低。在一个实施方式中，慢病毒载体质粒可以包含tat、vif、vpr、vpu、nef、vpx、tar、rre、pe、slip、crs、ins、app、maap、rpe、ppt、pre、wrpe、opre中的一者或多者。在一个实施方式中，慢病毒载体质粒在5’ltr与3’ltr之间不包含构成慢病毒载体所必需的核酸序列中的一者或多者(例如全部)。在一个实施方式中，慢病毒载体质粒在5’ltr与3’ltr之间包含所期望的基因。在一个实施方式中，慢病毒载体质粒在5’ltr与3’ltr之间包含所期望的基因、启动子、终止子及wpre。在一个实施方式中，慢病毒载体质粒可以以ltr的u3区域、tat缺失的方式进行修饰。在一个实施方式中，逆转录病毒载体质粒可以以ltr的u3区域缺失的方式进行修饰。作为用于生产慢病毒载体的生产细胞，可举出hek293t、hek293、hela等细胞。
[0325]
·
仙台病毒载体
[0326]
仙台病毒(sev)是被分类为副粘病毒科(paramyxoviridae)呼吸道病毒属(respirovirus)的负链rna病毒。仙台病毒还能感染包含神经元的非分裂细胞。在感染仙台病毒后，病毒基因组不会整合到宿主细胞的染色体中，而以rna的状态留在细胞质中。
[0327]
作为编码仙台病毒的蛋白质的基因，可举出n、p、m、f、hn及l基因。n、p、m、f、hn及l基因分别编码核衣壳蛋白、磷蛋白、基质蛋白、融合蛋白、血细胞凝集素
·
神经氨酸酶及大蛋白。通常，在野生型仙台病毒的基因组上，在3’的短前导区(le)之后接着排列有编码n(核衣壳蛋白)、p(磷蛋白)、m(基质蛋白)、f(融合蛋白)、hn(血细胞凝集素
·
神经氨酸酶)及l(大蛋白)的6个基因，在另一端存在较短的5’尾随区(tr)。也可从p基因的区域翻译被称为c及v的附加蛋白。
[0328]
仙台病毒利用宿主细胞的细胞质中的微管蛋白及仙台病毒的rna聚合酶(l蛋白质)这两者来表达基因。仙台病毒不与宿主细胞的基因组进行相互作用，对人不具有病原性。仙台病毒的这些特征暗示仙台病毒载体对于人的安全性。m蛋白质、f蛋白质、及hn蛋白质可负责仙台病毒的病毒粒子形成及病毒感染。n蛋白质、p蛋白质及l蛋白质可负责病毒基因组的表达及复制。
[0329]
在一个实施方式中，在生产细胞中由仙台病毒载体质粒转录成的核酸成为仙台病毒载体的搭载核酸。因此，以下的与仙台病毒载体质粒相关的特征也可以是仙台病毒载体的搭载核酸的特征。
[0330]
在一个实施方式中，仙台病毒载体质粒包含构成仙台病毒载体所必需的核酸序列中的至少一者及所期望的基因。在一个实施方式中，所期望的基因可被定位于仙台病毒基因(n、p、m、f、hn及l基因)中的任一者的上游及/或下游。在一个实施方式中，仙台病毒载体质粒可以在所期望的基因的上游或下游包含eis序列(转录终止(e)序列-介在(i)序列-转
录起始(s)序列)，通过这样的方式，能促进所期望的基因的上游或下游的基因的表达。在一个实施方式中，仙台病毒载体质粒可以以插入具有6的倍数的碱基数的序列(例如，包含所期望的基因的序列)的方式修饰。在一个实施方式中，仙台病毒载体质粒以在载体质粒及生产细胞包含构成仙台病毒载体所必需的核酸序列的这样的生产细胞中发挥功能的方式构成。在一个实施方式中，构成仙台病毒载体所必需的核酸序列中未包含于载体质粒中的基因或其基因产物中的一者或多者(例如，全部)在生产细胞中与载体质粒呈反式地得到供给。
[0331]
在一个实施方式中，构成仙台病毒载体所必需的核酸序列可包含：编码衣壳蛋白的核酸序列(n、hn)；编码对基因组进行包装、转录及复制的蛋白质的核酸序列(p、l)；2个末端序列(le、tr)；和辅助基因的核酸序列。在一个实施方式中，辅助基因的核酸序列可以为f、v、c及m。在一个实施方式中，构成仙台病毒载体所必需的核酸序列可以为仙台病毒的全部基因。在一个实施方式中，仙台病毒载体质粒在le与tr之间包含构成仙台病毒所必需的核酸序列。在一个实施方式中，构成仙台病毒载体所必需的核酸序列可包含n、p、v、c、m、f、hn、l的基因。在一个实施方式中，构成仙台病毒载体所必需的核酸序列可以为除了m、f及hn中的一者或多者以外的仙台病毒的全部基因。在使用缺失m、f及hn基因中的一者或多者的仙台病毒载体质粒的情况下，搭载核酸会丧失宿主中的传播性。在一个实施方式中，仙台病毒载体质粒可以不包含m、f及hn中的一者或多者，在一个实施方式中，构成仙台病毒载体所必需的核酸序列包含它们。在一个实施方式中，仙台病毒载体质粒可以包含编码噬菌体t7的rna聚合酶的基因。在一个实施方式中，仙台病毒载体质粒可以包含自剪切型核酶rbz。
[0332]
在一个实施方式中，为了降低仙台病毒蛋白质的抗原性，或者为了提高rna的转录效率及复制效率，可以对仙台病毒基因进行修饰。在一个实施方式中，为了增强转录或复制的功能，可以对作为复制因子的n基因、p基因及l基因中的一者或多者进行修饰。在一个实施方式中，可以对作为结构蛋白的hn蛋白质进行修饰，通过这样的方式，能使血细胞凝集素活性及/或神经氨酸酶活性变化，可通过减弱血细胞凝集素活性来提高血中的病毒的稳定性，可通过改变神经氨酸酶活性来改变病毒的感染性。在一个实施方式中，可以对与膜融合相关的f蛋白质进行修饰。在一个实施方式中，可以以使作为附加基因的v基因缺失的方式修饰。作为用于生产仙台病毒载体的生产细胞，可举出bhk/t7等细胞。
[0333]
在一个实施方式中，本公开文本提供含有病毒载体的组合物，其包含本公开文本的病毒载体的集群。在一个实施方式中，对于含有病毒载体的组合物而言，全部病毒载体粒子中不包含核酸的病毒载体粒子可以为约90％以下、约80％以下、约75％以下、约70％以下、约65％以下、约60％以下、约55％以下、或约50％以下。在一个实施方式中，对于本公开文本的含有病毒载体的组合物而言，全部病毒载体粒子中，包含含有全部所期望的基因的核酸的病毒载体粒子可以为约75％以上、约80％以上、约85％以上、约90％以上、约92％以上、约95％以上、约97％以上、或约99％以上。在一个实施方式中，对于本公开文本的含有病毒载体的组合物而言，全部病毒载体粒子中，包含除所期望的核酸以外的来源于本公开文本的质粒的核酸的病毒载体粒子可以为约10％以下、约7％以下、约5％以下、约4％以下、约3％以下、约2％以下、约1.5％以下、约1％以下、约0.7％以下、约0.5％以下、约0.4％以下、约0.3％以下、约0.2％以下、或约0.1％以下。
[0334]
(病毒载体质粒的制作)
[0335]
在一个实施方式中，本公开文本提供制作本公开文本的载体质粒的方法，所述方法包括下述步骤：将多个核酸序列以可工作的方式连结。在一个实施方式中，本公开文本提供制作本公开文本的载体质粒的方法，所述方法包括下述步骤：在枯草杆菌中对本公开文本的载体质粒进行复制。在一个实施方式中，本公开文本提供制作本公开文本的载体质粒的方法，所述方法包括下述步骤：将包含具有能在枯草杆菌内被复制的序列的、用于生产病毒载体的核酸序列的核酸导入宿主细胞中，在前述宿主细胞中形成质粒。本说明书中，在一个实施方式中，枯草杆菌可具有由从外部摄入的核酸形成质粒的能力，因此，在该方法中，导入的核酸也可以不是质粒。例如，枯草杆菌若与核酸(例如，具有串联重复的核酸序列的非环状核酸)接触，则可将该核酸摄入，从而在枯草杆菌内形成质粒(例如，参照本说明书中记载的ogab法)。
[0336]
在一个实施方式中，向枯草杆菌中导入核酸的方法可以为任意的方法，例如，可举出感受态枯草杆菌的使用、电穿孔法、使用粒子枪(基因枪)的方法、磷酸钙法等。所谓“感受态”，是指细胞针对外源性的物质(例如，核酸)变得更具透过性的状态。为了使枯草杆菌成为感受态，可以使用任意的已知方法，例如，可以使用anagnostopoulou,c.和spizizen,j.j.bacteriol.,81,741-746(1961)中记载的方法。在一个实施方式中，本公开文本的载体质粒可以在枯草杆菌中制作，并直接在相同的枯草杆菌中扩增。
[0337]
在向枯草杆菌中导入核酸来制作与该核酸不同的结构的病毒载体质粒的情况下，导入的核酸可包含以下详细说明的病毒载体质粒的各要素。
[0338]
(ogab法)
[0339]
在一个实施方式中，本公开文本的载体质粒可利用ogab法来制作。ogab(ordered gene assembly in bacillus subtilis，枯草芽孢杆菌中的有序基因组装)法是通过使集聚核酸被摄入转化生物中从而在该生物中生成环状质粒的方法。ogab法未必需要使用枯草杆菌(bacillus subtilis)，可以使用能够摄入非环状的长链核酸并生成质粒的任意生物，本说明书中将这样的生物称为“转化生物”。通过ogab法，可简便地制备包含大尺寸的核酸的质粒。本说明书中将摄入转化生物中的核酸称为“集聚核酸”，典型而言，集聚核酸具有沿着相同方向重复出现质粒的1个单位、和1组单位核酸这样的串联重复状结构，通过使用这样的结构的集聚核酸，能促进转化生物中的质粒的生成。本说明书中，所谓“单位核酸”，是指具有构成集聚核酸序列的部分序列的核酸分子或核酸分子的一部分，如以下详细说明的那样，将多种单位核酸制备成单位载体，然后构建集聚核酸。
[0340]
以下对用于使转化生物摄入的集聚核酸的制作步骤进行说明。
[0341]
·
单位核酸的制备
[0342]
制备用于整合到集聚核酸中的单位核酸。单位核酸可以通过任意已知的方法来制作，例如，可以通过聚合酶链式反应(pcr)、化学合成来制作。单位核酸可具有编码所期望的蛋白质(治疗用蛋白质、构成病毒载体的蛋白质等)的序列或其一部分、控制基因的序列(启动子、增强子等)、用于对核酸进行操作的序列(限制性内切酶识别序列等)等任意的所期望的序列。在整合到集聚核酸中时，为了使多种单位核酸按特定的顺序及/或特性的方向排列，各个单位核酸的末端可以以产生特定的突出序列的方式构成。
[0343]
最终能在质粒上集聚许多单位核酸，因此，可以以1个或多个单位核酸编码碱基长度较长的1个或多个基因的方式设计。作为碱基长度较长的基因，例如，可举出构成一系列
的代谢途径的基因组等。
[0344]
·
单位载体的制备
[0345]
可以将单位核酸、和与其不同的附加核酸连结，由此制备单位载体。通过使用单位载体，会变得能够更容易地对单位核酸进行处理。
[0346]
附加核酸可以为直链状核酸，也可以为环状质粒。在使用环状质粒作为附加核酸的情况下，单位载体也会具有环状结构，因此，可以用于例如大肠杆菌等的转化。在一个实施方式中，为了使单位载体在所导入的宿主中复制，附加核酸可包含复制起始点。在一个实施方式中，用于构建某种集聚核酸的全部单位核酸可以与相同种类的附加核酸连结，通过这样的方式，能减小单位载体间的尺寸差，多种单位载体的操作变得容易。在一个实施方式中，用于构建某种集聚核酸的单位核酸可以与不同种类的附加核酸连结。在一个实施方式中，对于用于构建某种集聚核酸的1个或多个单位核酸而言，(单位核酸的碱基长度)/(单位载体的碱基长度)的比例或其平均值可以为50％以下、40％以下、30％以下、20％以下、15％以下、10％以下、7％以下、5％以下、2％以下、1.5％以下、1％以下或0.5％以下。附加核酸的尺寸较之单位核酸而言越大，则越能够进行不同种类的单位载体的更均匀的操作。单位核酸与附加核酸的连结可以通过例如使用了dna连接酶的连接、ta克隆法等任意方法来实施。在一个实施方式中，对于用于构建某种集聚核酸的1个或多个单位核酸而言，(单位核酸的碱基长度)/(单位载体的碱基长度)的比例或其平均值可以为1％以上、0.3％以上、0.1％以上、0.03％以上、0.01％以上、0.003％以上或0.001％以上，单位载体的操作会变得容易。
[0347]
在一个实施方式中，单位核酸的长度可以为10bp以上、20bp以上、50bp以上、70bp以上、100bp以上、200bp以上、500bp以上、700bp以上、1000bp以上或1500bp以上、并且5000bp以下、5000bp以下、2000bp以下、1500bp以下、1200bp以下、1000bp以下、700bp以下或500bp以下。
[0348]
在一个实施方式中，集聚核酸可由2种以上、4种以上、6种以上、8种以上、10种以上、15种以上、20种以上、30种以上、40种以上、50种以上、60种以上、70种以上、80种以上、90种以上或100种以上、并且1000种以下、700种以下、500种以下、200种以下、120种以下、100种以下、80种以下、70种以下、60种以下、70种以下或50种以下的单位核酸构建。通过以各个单位核酸(或单位载体)的摩尔数大致相同的方式调整，能高效地制作具有串联重复状结构的所期望的集聚核酸。
[0349]
在一个实施方式中，单位核酸可以具有将集聚核酸中的1组重复序列按单位核酸的数量大致等分而得到的碱基长度。通过这样的方式，使各个单位核酸(或单位载体)的摩尔数一致的操作会变得容易。在一个实施方式中，单位核酸可具有从将集聚核酸中的1组重复序列按单位核酸的数量大致等分而得到的碱基长度进行了30％以下、25％以下、20％以下、15％以下、10％以下、7％以下或5％以下的增大或减少的碱基长度。
[0350]
在一个实施方式中，单位核酸可以以在单位核酸的端部具有非回文序列(并非回文序列的序列)的方式设计。对于这样设计而成的单位核酸而言，在使其非回文序列为突出序列的情况下，能够容易地提供集聚核酸中单位核酸以彼此保持顺序的状态连结而成的结构。
[0351]
·
集聚核酸的制作
[0352]
集聚核酸可通过将单位核酸彼此连结而构建。在一个实施方式中，单位核酸可通
过利用限制性内切酶等从单位载体切出而制备。集聚核酸可包含1个以上、2个以上、3个以上、4个以上、5个以上、6个以上、7个以上、8个以上、9个以上或10个以上的重复序列组。集聚核酸中的重复序列可包含单位核酸的序列及根据需要的集聚载体核酸的序列。集聚核酸可具有使转化生物中核酸的复制能够进行的序列。在一个实施方式中，使转化生物中核酸的复制能够进行的序列可包含在转化生物(例如，芽孢杆菌属细菌(枯草杆菌))中有效的复制起始点。在枯草杆菌中有效的复制起始点的序列没有特别限定，例如，作为具有θ型的复制机制的序列，可举出ptb19(imanaka,t.等j.gen.microbioi.130,1399-1408.(1984))、pls32(tanaka,t和ogra,m.febs lett.422,243-246.(1998))、pamβ1(swinfield,t.j.等gene 87,79-90.(1990))等质粒中包含的复制起始点等的序列。
[0353]
集聚核酸可以除了单位核酸之外还根据需要包含追加的碱基序列。在一个实施方式中，集聚核酸可以包含启动子、操纵子、激活子(activator)、终止子等对转录翻译进行控制的碱基序列。作为使枯草杆菌为宿主的情况下的启动子，具体而言，可举出能利用iptg(isopropyl s-d-thiogalactopyranoside)控制表达的pspac(yansura,d.和henner,d.j.pro.natl.acad.sci,usa 81,439-443.(1984.))、或pr启动子(itaya,m.biosci.biotechnol.biochem.63,602-604.(1999))等。
[0354]
单位核酸能在集聚核酸中形成保持了一定的顺序及方向的重复结构。在一个实施方式中，以从单位载体切出的单位核酸的突出末端的碱基序列彼此互补的方式构建单位核酸，由此能够在集聚核酸中形成保持了一定的顺序及方向的重复结构。在一个实施方式中，使每个不同的单位核酸的突出末端的结构唯一，由此能高效地形成保持了一定的顺序及方向的重复结构。在一个实施方式中，突出末端可以具有非回文序列，可以为5’末端突出或3’末端突出中的任一者。
[0355]
在一个实施方式中，可使用限制性内切酶从单位载体切出具有突出末端的单位核酸。在该实施方式中，单位载体可具有1个或多个限制性内切酶识别序列。在单位载体具有多个限制性内切酶识别序列的情况下，各个限制性内切酶识别序列可以利用相同的限制性内切酶来识别，也可以利用不同的限制性内切酶来识别。在一个实施方式中，单位载体可以将由相同的限制性内切酶识别的1对区域以完整的单位核酸区域被包含于这些区域之间的方式包含在内。所使用的限制性内切酶没有特别限定，可以使用ii型限制性内切酶、例如aari、bbsi、bbvi、bcodi、bfuai、bsai、bsaxi、bsmai、bsmbi、bsmfi、bspmi、bspqi、btgzi、foki、sfani等iis型限制性内切酶，这些限制性内切酶能够在识别序列的外侧的与识别序列隔开一定距离的部位制造出突出末端。若使用(例如单独的)iis型限制性内切酶，则所切出的单位核酸的突出末端的序列会根据每个单位核酸而不同，因此，会有利于使多个单位核酸按一定的顺序及方向集聚。在使用iis型限制性内切酶的一个实施方式中，单位载体在单位核酸区域内不包含该iis型限制性内切酶所识别的区域。在使用切割识别区域的限制性内切酶的实施方式中，单位载体可在单位核酸区域的末端包含该限制性内切酶识别的区域。
[0356]
在一个实施方式中，为了从多个单位载体切出单位核酸而使用相同种类的限制性内切酶的情况下，可以在包含该多个单位载体的溶液中进行限制性内切酶处理，从而能提高作业的效率。用于制作某种集聚核酸的限制性内切酶的种类例如可以为5种以下、4种以下、3种以下、2种以下或1种，通过使用较少种类的限制性内切酶，单位核酸间的摩尔数的偏
差得以被降低。在一个实施方式中，从单位载体切出的单位核酸可利用琼脂糖凝胶电泳等任意已知的分级法而容易地纯化。
[0357]
单位核酸及根据需要的集聚载体核酸可以使用dna连接酶等进行彼此连结(连接)。由此，能够制作集聚核酸。例如，单位核酸及根据需要的集聚载体核酸的连结可以在聚乙二醇(例如，peg2000、peg4000、peg6000、peg8000等)及盐(例如，1价的碱金属、氯化钠等)等成分的存在下实施。连接反应液中的各单位核酸的浓度没有特别限定，可以为1fmol/μl以上等。连接的反应温度及时间没有特别限定，为37℃、30分钟以上等。在一个实施方式中，在使单位核酸及根据需要的集聚载体核酸连结之前，可以将包含单位核酸及根据需要的集聚载体核酸的组合物供于使限制性内切酶失活的任意条件下(例如，苯酚
·
氯仿处理)。
[0358]
对于单位核酸而言，可以使用wo2015/111248中记载的方法等，调整为大致相同的摩尔数。通过将单位核酸调整为大致相同的摩尔数，能高效地制作具有串联重复状结构的所期望的集聚核酸。通过对单位载体或单位核酸的浓度进行测定，能够对单位核酸的摩尔数进行调整。
[0359]
·
由集聚核酸制作质粒
[0360]
通过使集聚核酸与转化生物接触，能在转化生物中形成质粒。在一个实施方式中，作为转化生物，可举出芽孢杆菌属细菌、链球菌属细菌、嗜血杆菌属细菌、奈瑟菌属等。作为芽孢杆菌属细菌，可举出枯草杆菌(b.subtilis)、巨大芽孢杆菌(b.megaterium)、嗜热芽胞杆菌(b.stearothermophilus)等。在优选的实施方式中，转化生物为枯草杆菌。在一个实施方式中，摄入集聚核酸的转化生物为感受态的状态，能够主动地摄入核酸。例如，感受态的状态的枯草杆菌将成为底物的双链核酸在细胞上切割，将2条链中的任意1条链从该切割点分解，将另外的1条链摄入菌体内。被摄入的1条链会在菌体内被修复成环状的双链核酸。为了使转化生物成为感受态的状态，可以使用任意已知的方法，例如，枯草杆菌可以使用anagnostopoulou,c.和spizizen,j.j.bacteriol.,81,741-746(1961)中记载的方法制成感受态的状态。转化的方法可以使用适合于各种转化生物的已知方法。
[0361]
在一个实施方式中，由包装细胞生产的载体质粒可以使用任意已知的方法来纯化，本公开文本也提供如上所述地进行了纯化的载体质粒。在一个实施方式中，可以利用调查通过限制性内切酶切割而产生的片段的尺寸模式(size pattern)的方法、pcr法、碱基测序法等，确认经纯化的载体质粒具有所期望的核酸序列。在一个实施方式中，对于利用本公开文本的载体质粒制作方法制备的含有载体质粒的组合物而言，含有的内毒素可以为少量。在一个实施方式中，提供包含本公开文本的载体质粒的枯草杆菌。
[0362]
(组合物)
[0363]
在一个实施方式中，本公开文本提供包含本说明书中记载的载体质粒或病毒载体的组合物。
[0364]
(剂型等)
[0365]
本说明书中记载的组合物可以以各种形态提供。作为组合物的形态，例如，可以为注射剂、胶囊剂、片剂、颗粒剂、吸入剂等。注射用的水溶液例如可以在小瓶或不锈钢容器中保存。另外，注射用的水溶液也可以配合例如生理盐水、糖(例如海藻糖)、nacl、或naoh等。
[0366]
在一个实施方式中，本公开文本的组合物包含药学上可容许的担载体或赋形剂。这样的担载体也可以为无菌液体、例如水及油，包括石油、动物、植物或合成起源的物质，虽
然并不进行限定，但包括花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。在经口施予医药的情况下，水是优选的担载体。在静脉内施予医药组合物的情况下，生理盐水及水性葡萄糖是优选的担载体。优选将生理盐水溶液、以及水性葡萄糖及甘油溶液用作可注射溶液的液体担载体。适当的赋形剂包括轻质硅酸酐、结晶纤维素、甘露糖醇、淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、米、小麦粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇、羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯醇缩乙醛二乙氨基乙酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、明胶、中链脂肪酸甘油三酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油60、泊洛沙姆、白糖、羧甲基纤维素、玉米淀粉、无机盐等。在期望的情况下，组合物也可以还含有少量的润湿剂或乳化剂、或者ph缓冲剂。这些组合物也可以采取溶液、悬浮物、乳液、片剂、丸剂、胶囊、粉末、持续释放配合物等形态。也可以使用传统的粘结剂及担载体、例如甘油三酯，将组合物配合成栓剂。经口配合物也可以包含医药等级的甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等标准担载体。适当的担载体的例子记载于e.w.martin,雷明顿制药科学(remington’s pharmaceutical sciences)(mark publishing company,easton,u.s.a)中。除此之外，也可以包含例如表面活性剂、赋形剂、着色剂、香料、防腐剂、稳定剂、缓冲剂、悬浮剂、等渗剂、粘结剂、崩解剂、润滑剂、流动性促进剂、矫味剂等。在一个实施方式中，本公开文本的任意的液体组合物的ph可以为约3、约3.5、约4、约4.5、约5、约5.5、约6、约6.5、约7、约7.5、约8、约8.5、约9、约9.5、约10、约10.5、约11或它们中的任意2个值之间的范围。
[0367]
本公开文本的组合物的任意成分可以以药学上可容许的盐的形式提供，例如，可以为与来源于盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的游离型羧基一起形成的盐、与来源于异丙基胺、三乙基胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的胺基等游离型胺基一起形成的盐、以及与钠、钾、铵、钙及氢氧化铁一起形成的盐。
[0368]
在优选的实施方式中，可以按照已知的方法，以适合向人施予的医药组合物的形式配合组合物。这样的组合物可以通过注射来施予。代表性地，用于注射施予的组合物是无菌等渗水性缓冲剂中的溶液。在必要的情况下，组合物也可以还包含增溶剂及缓解注射部位的疼痛的利多卡因等局部麻醉剂。通常，可以将成分分别供给，或者在单位投药模型中混合在一起而供给，例如在示出活性剂的量的安瓿或小袋等密封容器中，以冻干粉末或不含水的浓缩物的形式供给。在要通过注入来施予组合物的情况下，也可以使用含有无菌药剂等级的水或生理盐水的注入瓶进行分配。在要通过注射来施予组合物的情况下，也可以以可在施予前将成分混合的方式提供注射用的无菌水或生理盐水的安瓿。
[0369]
(使用
·
用途)
[0370]
本说明书中记载的载体质粒或病毒载体、或者包含它们的组合物可以用于基因治疗、功能基因组学、癌症疫苗接种及/或抗病毒疫苗接种等各种用途中。
[0371]
在将本公开文本的病毒载体或含有病毒载体的组合物应用于受试体的情况下，受试体没有特别限定，可以为哺乳动物(例如，小鼠、大鼠、仓鼠、兔、猫、狗、牛、绵羊、猪、猴、人等)、禽类、爬虫类、两栖类、节肢动物、鱼类等。
[0372]
本公开文本的病毒载体或含有病毒载体的组合物的量可根据要处置或预防的障碍或状态的性质而变动，本领域技术人员可基于本说明书的记载而根据标准的临床技术来决定。根据情况，也可以利用体外分析来辅助确定最适投药量范围。另外，配合物中要使用
的准确用量也可根据施予途径、及疾病或障碍的重大性而变动，因此，应该依据负责医生的判断及各患者的状况来决定。本公开文本的病毒载体或含有病毒载体的组合物的施予量没有特别限定，例如，可以为每1次1
×
105个、1
×
106个、1
×
107个、1
×
108个、1
×
109个、1
×
10
10
个、1
×
10
11
个、1
×
10
12
个、1
×
10
13
个、1
×
10
14
个或1
×
10
15
个的个数的病毒载体，也可以在上述任意2个值的范围内。施予间隔没有特别限定，例如，可以每1、7、14、21或28天施予1或2次，也可以在上述任意2个值的范围内各施予1或2次。施予量、施予间隔、施予方法可以根据患者的年龄、体重、症状、对象器官等而适宜地选择。
[0373]
本说明书中记载的病毒载体或含有病毒载体的组合物的施予途径例如可以为静脉内、皮内、皮下、肌肉内、腹腔内、髓腔内、脑室内、脑实质内、经肺、鼻内、硬膜外、或经口施予等。在一个实施方式中，可以将本公开文本的组合物、各种输送(递送)系统一起使用。在这样的系统中，有例如脂质体、微小粒子、及微小胶囊中的封装、受体介导的内吞作用的应用等。可以通过合适的途径、例如通过注入、通过弹丸式(bolus)注射、通过经由上皮或皮肤粘膜衬(例如口腔、直肠及肠粘膜等)的吸收而施予医药，可根据需要利用气溶胶化剂并使用吸入器或喷雾器，而且也可以与其他药剂一同施予。施予也可以是全身性或局部的。
[0374]
本公开文本的组合物可以以试剂盒的形式提供。在一个实施方式中，本公开文本提供试剂盒，其为用于制作载体质粒的试剂盒，所述试剂盒包含至少一种核酸，所述至少一种核酸包含：在枯草杆菌中促进质粒复制的核酸序列；和构成病毒所必需的核酸序列。在一个实施方式中，本公开文本提供药剂包(pack)或试剂盒，其包含填充有可添加至本公开文本的组合物中的1种以上的成分的、1个以上的容器。根据情况，也可以随着这样的容器，以由对医药或生物学制品的制造、使用或销售进行管制的政府机关规定的形式，示出表明用于向人施予的制造、使用或销售受到政府机关认可的信息。
[0375]
本公开文本的组合物的作为医药等的制剂化步骤在本领域中是已知的，例如，记载于日本药典、美国药典、其他国家的药典等中。因此，对于本领域技术人员而言，只要有本说明书的记载，则能够在不进行过度实验的情况下决定应使用的量等实施方式。
[0376]
本说明书中，“或者”是在可以采用文章中所列举的事项的“至少1个(一者)以上”时使用的。“或”也是同样的。本说明书中，在明确记载为“2个值”的“范围内”的情况下，在该范围内也包含2个值本身。
[0377]
本说明书中引用的科学文献、专利、专利申请等参考文献整体以与分别具体记载的情况相同的程度作为参考而并入本说明书中。
[0378]
以上，为了易于理解而示出优选的实施方式来说明本公开文本。以下，基于实施例来说明本公开文本，但上述的说明及以下的实施例只是以示例为目的而提供的，而非出于限定本公开文本的目的提供的。因此，本公开文本的范围既不限定于本说明书中具体记载的实施方式，也不限定于实施例，而仅由权利要求书限定。
[0379]
实施例
[0380]
试剂类具体使用了实施例中记载的制品，但也可以代用其他制造商(sigma-aldrich、和光纯药、nacalai、r&d systems、uscn life science inc等)的等同品。
[0381]
(实施例1：aav载体质粒的扩增)
[0382]
按照以下的步骤制作aav载体质粒，在大肠杆菌及枯草杆菌中进行扩增。
[0383]
材料
[0384]
paav-cmv载体、prc2-mi342载体、phelper载体的质粒(aavpro(注册商标)无辅助系统(helper free system))从takarabio(滋贺县)购入。作为枯草杆菌-大肠杆菌间穿梭质粒载体的pg ets103δaari是通过向质粒pgets103(tsuge,k.,itaya,m.(2001)100kb的基因组dna向枯草芽孢杆菌168的质粒中的重组转移(recombinational transfer of 100-kilobase genomic dna to plasmid in bacillus subtilis 168),细菌学杂志(journal of bacteriology),183,5453-5458.)中的唯一的限制性内切酶aari识别位点(5
’‑
cacctgc-3’)导入点突变(5
’‑
caccagc-3’)而使aari识别位点消失了的质粒，是由神户大学转让的。大肠杆菌jm109株的化学感受态细胞从takara bio购入。枯草杆菌busy9797株(tsuge,k.,sato,y.,kobayashi,y.,gondo,m.,hasebe,m.,togashi,t.,tomita,m.,itaya,m.(2015)用于超过50个片段的dna一步组装的等摩尔dna混合物的制备方法(method of preparing an equimolar dna mixture for one-step dna assembly of over 50fragments),科学报告(scientific reports),5,10655.)是由神户大学转让的。ta克隆用载体的pmd19-tv-vector、dna ligation kit《mighty mix》从takara bio购入。限制性内切酶aari从thermo fisher scientific(美国)购入。其他限制性内切酶均从new england biolab(美国)购入。te缓冲液(10mm tris-hcl，1mm edta，ph8.0)从nacalai tesque(京都)购入。羧苄青霉素及四环素从sigma-aldrich(美国)购入。作为低熔点琼脂糖，使用2-羟乙基琼脂糖(sigma-aldrich)。其他的通常的电泳用琼脂糖凝胶使用invitrogen(美国)的ultrapure agarose。苯酚饱和te从nacalai tesque购入。作为质粒的柱纯化试剂盒，使用qiagen(德国)的qia quick miniprep试剂盒、及pcr purification kit。bactotryptone(细菌用胰蛋白胨)、酵母抽提物(yeast extract)、bacto agar(细菌琼脂粉)从bectondickinson(美国)购入。其他的培养基用试剂从nacalai tesque购入。蛋清溶菌酶、溴化乙锭从sigma-aldrich购入。核糖核酸酶a从nacalai tesque购入。质粒纯化中使用的p1、p2、p3从qiagen购入。氯化铯从nacalai tesque购入。
[0385]
培养基
[0386]
lb培养基使用了将bactotryptone 10g、酵母抽提物5g、氯化钠5g溶解于1l的水中、在形成琼脂板的情况下进一步添加bactoagar 15g并进行高压釜处理(121℃，20分钟)而得到的培养基。根据需要加入羧苄青霉素(最终浓度为100μg/ml)、或四环素(最终浓度为10μg/ml)。枯草杆菌转化用的tf-1培养基及tf-ii培养基如下所述地制备。首先，对10
×
spizizen(按每1l计，140g k2hpo4(无水)，60g kh2po4(无水)，20g(nh4)2so4，10g柠檬酸三钠二水合物)、50％葡萄糖、2％ mgso4·
7h2o、2％酪蛋白氨基酸及水分别进行高压釜处理从而分开准备。色氨酸、精氨酸、亮氨酸、苏氨酸中的各氨基酸的水溶液(5mg/ml)是通过过滤器灭菌而准备的。为了制备tf-i培养基500ml，使用10
×
spizizen 50ml，使用50％葡萄糖、2％ mgso4·
7h2o、2％酪蛋白氨基酸、5mg/ml的色氨酸、精氨酸、亮氨酸、苏氨酸中的各氨基酸各5ml，最后混合灭菌水415ml，利用过滤器进行过滤，于4℃保存至使用。关于tf-ii培养基500ml的制备，除了使2％酪蛋白氨基酸为2.5ml、使各氨基酸溶液(5mg/ml)为0.5ml、使灭菌水为435.5ml以外，加入与tf-i培养基同样的量，利用过滤器进行过滤，于4℃保存至使用。
[0387]
试管内基因操作
[0388]
关于其他的通常的dna的操作，按照标准操作规程(sambrook,j.等,分子克隆：实验室指南.冷泉港实验室出版社,冷泉港,纽约(1989))进行。
[0389]
dna片段从电泳凝胶的切出及纯化
[0390]
对于经扩增的dna片段，利用0.7％的低熔点琼脂糖凝胶(2-hydroxyethyl agarose typevii，sigma-aldrich)，在1
×
tae缓冲液(tris-acetate-edta buffer，nacalai tesque)的存在下，在通用琼脂糖凝胶电泳装置(i-myrun.n核酸用电泳系统，cosmobio(东京))中，施加100v(约8v/cm)的电压，进行1小时泳动，由此分离载体质粒及单位dna。将该泳动凝胶在包含1μg/ml的溴化乙锭的1
×
tae缓冲液100ml中染色30分钟，照射长波长的紫外线(366mn)而将其可视化，由此，利用剃刀将目标大小的pcr产物切出，回收至1.5ml管中。向所回收的低熔点琼脂糖凝胶(约300mg左右)中添加1
×
tae缓冲液，使总体积为约700μl，于65℃将其孵育10分钟，由此将凝胶溶解。然后，添加等量的te饱和苯酚，充分混合，由此使限制性内切酶失活。通过离心分离(20,000
×
g，10分钟)而分离成苯酚相和水相，将水相(约900μl)回收至新的1.5ml管中。向其中添加1-丁醇500μl，充分混合后，通过离心分离(20,000
×
g，1分钟)来进行分离，除去水分已饱和的1-丁醇相，重复如上操作直至水相的体积成为450μl以下，由此使水相的体积减少。向其中添加3m乙酸钾-乙酸缓冲液(ph5.2)50μl及乙醇900μl，进行离心分离(20,000
×
g，10分钟)，由此使dna沉淀，将其用70％乙醇冲洗，溶解于20μl的te缓冲液中。将该回收dna于-20℃保存至使用。
[0391]
重组质粒构建
[0392]
将通过基于限制性内切酶的切出等从paav-cmv质粒(图1)、prc2-mi342质粒(图2)、phelper质粒(图3)获得的必需片段(从paav-cmv获得1.8kb的sbfi片段，从prc2-mi342获得5.2kb的eagi-xmai片段，从phelper获得9.3kb的bamhi-bamhi-ndei片段)与集聚用的质粒连结，由此构建重组质粒。在phelper内的va区域内存在bamhi位点，因此，该bamhi位点与附近的ndei位点之间的0.3kb的片段是通过pcr进行扩增而获得的。针对该片段，以能导入上述的3个片段的方式使用导入有sbfi位点、aari位点、eagi-xmai位点的引物进行扩增，由此得到具有序列号1所示的序列的pcr产物。
[0393]
将该pcr产物克隆至质粒pmd19中，确认碱基序列正确后，利用在上述dna的末端附近设计的bsai切割，由此得到片段。将该片段与进行基于hindiii的pgets103δaari的切割及脱磷酸化处理而获得的片段连结。所得到的质粒命名为pgets103-va(图4)。将pgets103-va用eagi及xmai切割后，通过电泳除去短片段，将质粒prc2-mi342用eagi及xmai切割后，将5.2kb的大片段从凝胶切出并纯化，将它们连结并将所得到的质粒命名为pgets103-rc2(图5)。将pgets103-rc2用sbfi切割后，为了使限制性内切酶失活而进行苯酚处理及乙醇沉淀，进行纯化，针对所得到的片段上连结将质粒paav-cmv用sbfi切割而得到的1.8kb的片段，将所得到的质粒命名为pgets103-aav-rc2(图6)。进一步将其用aari切割，将较短的dna片段除去，将其与质粒phelper的9.0kb的bamhi片段连结，选择通过与已预先导入的bamhi-ndei区域的连结而在va区域再生的方向上导入了bamhi片段的产物，由此构建将3个质粒整合为1个质粒而成的一体化结构的pgets103-aav-helper-rc2(图7，序列号2)。进一步构建单独具有片段的质粒。具体而言，在将pgets103-va用sbfi切割而得到的片段上连结将质粒paav-cmv用sbfi切割而得到的1.8kb的片段，并将所得到的质粒命名为pgets103-aav(图8)。另外，将pgets103-va用aari切割，将较短的dna片段除去，在其上连结质粒phelper的9.0kb的bamhi片段，选择通过与已预先导入的bamhi-ndei区域的连结而在va区域再生的方向上导入了bamhi片段的产物，由此构建pgets103-helper(图9)。
[0394]
大肠杆菌转化法
[0395]
将已溶解的大肠杆菌jm109感受态细胞50μl转移到在冰上准备的1.5ml的离心管中，将重组质粒以最多5μl的方式添加至其中，在冰上静置15分钟后，在42℃的温浴中孵育45秒后，放回冰上，经过2分钟后，添加附属于感受态细胞的soc培养基200μl，设置于旋转培养装置(在rt-50上搭载试管用培养支架sa-1811，taitec(大阪))，以30rpm的旋转速度于37℃培养1小时。然后，将其涂抹至加有羧苄青霉素的lb培养基琼脂板，于37℃培养一夜。
[0396]
枯草杆菌转化法
[0397]
向falcon(注册商标)的14ml试管(2051)中装入lb培养基2ml，向其中接种作为于-70℃进行了保存的甘油冻存物的枯草杆菌，一边在旋转培养装置中旋转，一边于37℃培养17小时。向新的14ml试管(falcon 2051)中分注tf-i培养基900μl，添加25μl的2％酪蛋白氨基酸，添加50μl的上述培养液，一边在旋转培养装置中旋转，一边于37℃培养4小时。然后，向新的14ml试管中分注tf-ii培养基900μl，添加100μl的tf-i培养液，一边在旋转培养装置中旋转，一边于37℃培养1.5小时。向1.5ml的离心管中装入tf-ii培养液100μl，添加8μl的重组质粒。一边在旋转培养装置中旋转，一边于37℃培养30分钟，然后，添加lb培养基300μl，进一步地，一边在旋转培养装置中旋转，一边于37℃培养1小时。然后，将培养物铺展于包含四环素10μg/ml的lb培养基琼脂板上，于37℃孵育一夜，由此得到转化体。
[0398]
少量制备大肠杆菌的质粒
[0399]
使用qiagen的qiaprep spin miniprep kit、及自动化装置qia cube，按照指南进行用于确认在大肠杆菌内构建的重组质粒的结构的少量纯化。
[0400]
由枯草杆菌及大肠杆菌大量制备质粒的方法
[0401]
利用氯化铯-溴化乙锭密度梯度超速离心法，制成高纯度的质粒dna。以下示出lb培养基200ml的情况下的纯化方法，在大于200ml的情况下，对每200ml重复进行以下的操作。准备在lb培养基中加入抗生素(四环素)而得到的产物200ml，向500ml的锥形瓶中各装入100ml，接种大肠杆菌或枯草杆菌质粒保持株，于37℃培养一整夜。
[0402]
培养结束后，以各50ml的量分注至4个50ml管(falcon 2070)中，以5,000
×
g离心10分钟。舍弃上清液，通过涡漩使菌颗粒完全散开。准备添加有10mg/ml的溶菌酶及10mg/ml的核糖核酸酶a的p1溶液，向4个装有菌的管中分别各添加5ml，充分混合。将其于室温孵育5分钟。向4个管中分别各添加5ml p2，缓缓地混合，于室温孵育5分钟。进一步地，各添加5ml p3，以白浊物质能够均等地分散的方式利用一定程度上较强的力混合。以5,000
×
g离心10分钟，利用移液管吸取上清液，转移到新的4个螺旋盖的50ml管(falcon 2070)中。向各个管中添加5ml的苯酚饱和te，剧烈地混合。以5,000
×
g离心10分钟，利用移液管吸取上清液，转移到新的4个螺旋盖的50ml管(falcon 2070)中。分别添加20ml的100％乙醇并混合，以5,000
×
g离心10分钟，将上清液除去。向沉淀中添加5.4ml的te，使其完全溶解。接下来，投入6.40g的氯化铯，使其完全溶解。进一步添加1.1g/ml的氯化铯溶液(将1.1g的氯化铯与1ml的水混合而制作的溶液，未调整体积)2.6ml。最后添加10mg/ml的溴化乙锭溶液600μl，充分混合。将内容物转移到1个超速离心管(b eckman 362181)中。以与平衡物(balance)的重量差异在20mg以内的方式，添加水或1.1g/ml氯化铯溶液(比重为约1.5g/ml左右)从而对重量进行微调。利用超速离心装置(beckman-coulter)，在以下的条件下进行离心。温度：18℃，速度：50,000rpm，加速度：max，减速度：max。离心15小时以上。
[0403]
离心结束后，在紫外线(365nm)观察下，利用设置有针(21g
×
5/8”)的1ml的注射器插入ccc型的质粒的条带中，回收质粒溶液，转移到15ml管中。向其中添加500μl p3，接下来，以整体成为3ml的方式添加水。进一步添加9ml的100％乙醇。以5,000
×
g离心10分钟，除去上清液。向所得到的沉淀中添加700μl的te从而在15ml管中将dna溶解。将其转移到1.5ml的管中，添加600μl的1-丁醇并混合，以20,000
×
g离心10秒左右，分离成2个层，舍弃上层的丁醇层。重新添加600μl的1-丁醇并混合，以20,000
×
g离心10秒左右，分离成2个层，舍弃上层的丁醇层。持续进行该操作直至水层成为200μl以下。水层成为200μl以下后，添加1ml的pb(qiagen)，充分混合，将600μl的pb混合物上样至qiaprep spin miniprep kit的离心柱，以20,000
×
g离心1分钟。舍弃滤过液(flow-through)，将剩余的600μl的pb混合物再次上样至上述柱，以20,000
×
g离心1分钟。舍弃滤过液，将柱再次设置于收集管，将700μl pe上样，以20,000
×
g离心1分钟(第1次)。再次舍弃滤过液，将柱再次设置于收集管，将700μl pe上样，以20,000
×
g离心1分钟(第2次)。舍弃滤过液，将柱再次设置于收集管，将700μl pe(qiagen)上样，以20,000
×
g离心1分钟(第3次)。舍弃滤过液，将柱再次设置于收集管，在空的状态下，以20,000
×
g离心1分钟，将残渣完全掸落。将50μl te上样，于室温孵育1分钟后，以20,000
×
g离心1分钟，使质粒溶出。
[0404]
将溶出物1μl上样至nanodrop，对浓度、纯度进行测定。确认到：浓度为数十ng/μl，纯度260/280＝1.8～2.0，260/230＝2.0～3.0。将26.2μl的样品溶解于158μl的样品中，以各8μl的量利用以下的限制性内切酶进行消化并确认结构；不切割，bamhi-hf，bglii(neb3.1)，ecori-hf，ecorv-hf，hindiii-hf，kpni-hf，noti-hf，psti-hf，pvuii-hf，saci-hf，sali-hf，sfii，smai，xbai(除了bglii以外，为cutsmart缓冲液)。
[0405]
(实施例2：由经扩增的载体质粒生产aav载体)
[0406]
将在大肠杆菌及枯草杆菌中扩增而得到的载体质粒导入生产细胞中，使其生产aav载体。该实施例的实验是委托signagen laboratories(美国)实施的。
[0407]
将在大肠杆菌或枯草杆菌中扩增而得到的pgets103-aav-helper-rc2(1.19
×
10
13
个拷贝)、在大肠杆菌或枯草杆菌中扩增而得到的pgets103-aav：pgets103-helper：pgets103-rc2＝1：1：1(合计1.19
×
10
13
个拷贝)、或在大肠杆菌中扩增而得到的paav-cmv：phelper：prc2-mi342＝1：1：1(合计1.19
×
10
13
个拷贝)用于转染。相对于这些质粒dna，混合2.7倍(重量比)量的polyjet(商标)试剂。将所制备的dna复合体转染至经培养的2
×
108个细胞的hek293细胞(传代数为12)，进一步继续培养5小时。回收经转染的细胞，进行3次冻融后，于37℃利用benzonaze(注册商标)处理1小时。以12500rpm进行30分钟离心分离，回收上清液。接下来，以28000rpm进行18小时氯化铯密度梯度超速离心后，回收raav(重组腺相关病毒载体粒子)，利用包含0.001％ pluronic(注册商标)f-68的pbs使其分散。
[0408]
使用定量pcr，对所制作的raav的基因组拷贝滴度进行定量。利用dnasei对各raav进行处理后，使用蛋白酶k使dnasei失活。于98℃进行15分钟加热处理，使衣壳变性，以落入标准曲线的范围内的方式进行稀释后，利用定量pcr进行测定。靶标设定为itr，使用5
’‑
ggaacccctagtgatggagtt-3’(序列号67)及5
’‑
cggcctcagtgagcga-3’(序列号68)的序列的引物。另外，使用pierce lal内毒素定量试剂盒(thermo fisher scientific，美国)对raav分散液中包含的内毒素量进行定量。
[0409]
[表1]
[0410]
用于产生raav的质粒
[0411][0412]
对在各质粒条件下生产的raav病毒基因组量[vg/ml]及内毒素量[unit/ml]进行测定。在全部条件下同样地确认到raav病毒的生产。在任意条件下均未检测到内毒素。
[0413]
(实施例3：所构建的质粒dna的ccc纯度)
[0414]
使用p/ace mdq plus(sciex)及dsdna 1000试剂盒(absciex，东京)，对用于制作raav的质粒dna的ccc(共价闭合环状)纯度进行定量。向试剂盒中包含的凝胶粉末中加入20ml超纯水，搅拌一整夜。确认凝胶已完全溶解，利用1
×
tbe电泳缓冲液(thermofisher)稀释10倍。在经稀释的凝胶中，以成为0.01vol％的方式加入sybr gold核酸凝胶染料(nucleicacid gel stain)(thermofisher)后，向毛细管中填充凝胶。对于各质粒dna而言，利用超纯水调整为10ng/μl，使用p/ace mdq plus进行测定。
[0415]
对于测定样品而言，以0.2psi、2秒的条件注入毛细管中，以9.0kv进行20分钟电泳。为了进行检测，使用荧光(激发波长：488nm，荧光波长：520nm，动态范围：1000rfu)。质粒dna的ccc纯度是通过将ccc质粒dna的峰面积值除以也包含其他杂质的峰面积值的合计而算出的。
[0416]
将结果示于以下的表中。
[0417]
[表2]
[0418][0419]
关于pgets103-aav-helper-rc2及pgets103-rc2这两种质粒，较之大肠杆菌而言，枯草杆菌中ccc纯度高。本公开文本的质粒能具有高的ccc纯度。根据fda的指南，规定了ccc纯度高于80％，观察到使用枯草杆菌生产的质粒具有高的ccc纯度，因此，能够减少用于提
高ccc纯度的纯化操作的负担及制造成本。认为ccc纯度还关系到质粒dna的稳定性、功能性、转染效率，高的ccc纯度的质粒dna的有用性高。
[0420]
(实施例4：包含全基因组的raav的比例)
[0421]
将由signagen冷冻保存的各raav解冻，使用step one plus(thermofisher)，对raav基因组实施定量pcr。将已制备成250u/ml的dnasei(takara bio)与所制作的raav等量混合后，使用pcr用热循环仪(thermofisher)，于37℃加热30分钟。接着，添加0.04m的edta缓冲液(ph8.0，takara bio)而稀释2倍，于55℃加热30分钟。进一步地，利用无核酸酶的水(promega)稀释2.5倍，于95℃加热10分钟。最后，加入te缓冲液(promega)而进行10倍稀释，使用提取出的raav基因组作为定量pcr用的模板。
[0422]
对于定量pcr的反应液而言，在板的每1个孔中，包含quantitect sybr green pcr master mix(qiagen)10μl、0.01mm引物(正向)1μl、0.01mm引物(反向)1μl、水6μl、模板2μl，通过封板膜而将板密闭后，实施定量pcr。反应液制备了以下的两种：包含以itr为靶标的引物(正向：5
’‑
ggaacccctagtgatggagtt-3’(序列号67)，反向：5
’‑
cggcctcagtgagcga-3’(序列号68))的反应液；和包含以cmv为靶标的引物(正向：5
’‑
catcaatgggcgtggatagc-3’(序列号69)，反向：5
’‑
ggagttgttacgacattttggaaa-3’(序列号70))的反应液。
[0423]
pcr条件为：于95℃加热15分钟后，将(1)94℃下15秒、(2)60℃下30秒、(3)72℃下30秒的循环重复40次。标准曲线使用利用限制性内切酶使paav-cmv成为直线状而得到的dna来制作，由各个ct值算出raav基因组拷贝浓度。包含全基因组的raav的比例是通过将以cmv为靶标算出的基因组拷贝浓度除以以itr为靶标算出的基因组拷贝数而算出的。
[0424]
将结果示于以下的表中。
[0425]
[表3]
[0426][0427]
在raav#1(一体化，枯草杆菌)及raav#3(一体化，大肠杆菌)中，全基因组的比例特别高。对于基因组而言，由于在病毒粒子内包含核酸，因此，在制作病毒载体后难以将含有全基因组的病毒粒子与含有非全基因组的病毒粒子分离，能够在病毒载体制作阶段中以高比例制备包含全基因组的病毒粒子这一点是非常理想的。本公开文本的质粒能提供高效地含有全基因组的病毒载体。
[0428]
(实施例5：包含标记基因的raav的比例)
[0429]
将由signagen冷冻保存的各raav解冻，使用step one plus，对质粒骨架(backbone)中包含的ampr基因实施定量pcr。向所制作的raav中加入te缓冲液而稀释3倍后，使用pcr用热循环仪，于95℃加热10分钟，使用从所得液体提取出的raav基因组作为定量pcr用的模板。
[0430]
对于定量pcr的反应液而言，在板的每1个孔中，包含quantitect sybr green pcr master mix 10μl、0.01mm引物(正向：5
’‑
ttgatcgttgggaaccggag-3’(序列号71))1μl、0.01mm引物(反向：5
’‑
ttgttgccgggaagctagag-3’(序列号72))1μl、水6μl、模板2μl，通过封板膜而将板密闭后，实施pcr。
[0431]
pcr条件为：于95℃加热15分钟后，将(1)94℃下15秒、(2)60℃下30秒、(3)72℃下30秒的循环重复40次。标准曲线使用利用限制性内切酶使paav-cmv成为直线状而得到的dna来制作，由各个ct值算出基因组拷贝浓度。包含标记基因的raav的比例是通过将以ampr为靶标算出的基因组拷贝浓度除以以cmv为靶标算出的raav基因组拷贝数而算出的。
[0432]
将结果示于以下的表中。
[0433]
[表4]
[0434][0435]
在raav#1(一体化，枯草杆菌)及raav#4(3种混合质粒，大肠杆菌)中，杂质的比例特别低。暗示了一体化结构的质粒及枯草杆菌的组合优异。
[0436]
(实施例6：空衣壳的比例)
[0437]
将由signagen冷冻保存的各raav解冻，使用arvo x5(per kin elmer)，利用elisa法进行衣壳粒子浓度的定量。在定量试剂盒中，利用aav2 titration elisa 2.0r(progen)，基于操作规程实施试验。在固定有试剂盒中包含的抗aav2抗体的96孔板中，以各100μl的量添加raav及标准品(试剂盒中包含的空衣壳试剂)。于37℃静置1小时后，将液体废弃，利用200μl的检测缓冲液清洗3次。添加100μl的生物素结合抗aav2抗体，于37℃静置1小时后，将液体废弃，利用200μl的检测缓冲液清洗3次。进一步添加100μl的hrp标记完毕的链霉亲和素，于37℃静置1小时后，将液体废弃，利用200μl的检测缓冲液清洗3次。最后，添加100μl的tmb，于室温静置15分钟后，加入反应终止试剂，利用arvo x5对吸光度(450nm、650nm)进行测定。
[0438]
将以cmv为靶标算出的raav基因组拷贝浓度(基因组拷贝滴度)除以利用eliza法定量得到的衣壳粒子浓度(病毒粒子滴度)，并从1减去所得到的值，由此算出空衣壳的比例。
[0439]
将结果示于以下的表中。
[0440]
[表5]
[0441][0442]
在raav#1(一体化，枯草杆菌)中，空衣壳的比例特别低。空衣壳会是免疫原性的，因此优选将其减少。如实施例2中记载的那样，在获得raav时进行氯化铯密度梯度超速离心，通过该操作，有可能部分地除去空衣壳，但认为空衣壳并未被根本除去。即使进行柱层析，通常也难以将空衣壳高效地除去，因此，特别优选在上游工序中减少空衣壳的生成。然而，利用本公开文本的方法制作的病毒载体中，空衣壳的比例特别低，能够实现高效率的病毒载体的生产。因此，能减轻基于微小的密度之差的分离法等可能需要劳力的空衣壳的除去操作的负担。
[0443]
(实施例7：基于ogab法的质粒构建)
[0444]
利用ogab法构建pgets103-aav-helper-rc2(图10)。
[0445]
ogab集聚用载体dna的构建
[0446]
利用限制性内切酶hindiii将质粒pgets103δaari切割，通过te饱和苯酚处理、丁醇提取、乙醇沉淀来进行纯化，向其中插入将序列号3及4所示的单链dna退火而制成的接头dna，从而制成作为ogab集聚用载体的pgets103-δaari-linker。利用限制性内切酶aari将该质粒切割，通过低熔点琼脂糖凝胶电泳来进行尺寸分离，将15kb的大片段从凝胶切出并纯化，获得ogab集聚用的载体片段。
[0447]
ogab用集聚片段的准备
[0448]
对于pgets103-aav-helper-rc2的碱基序列中的、除载体部分的pgets103的碱基序列之外的aav-helper-rc2的区域(图10)，研究是否能利用ogab法进行重建。首先，以分割成图10所示的22个片段的方式设计上述dna区域。第3片段包含aav片段与helper片段的边界的区域，第16片段包含helper片段与rc2片段的边界的区域，因此，第1、第3及第16片段是如下所述地化学合成材料dna后、通过map法(日本特愿2018-93024)准备的。具体而言，关于第1片段，使用了利用序列号5～10的单链dna、通过map法装配而得到的双链dna，关于第3片段，使用了利用序列号11～16的单链dna、通过map法装配而得到的双链dna，关于第16片段，使用了利用序列号17～22的单链dna、通过map法装配而得到的双链dna。关于剩余的区域，使用序列号23～66所示的带有各片段编号的f与r的引物的组合，针对第2片段而将paav-cmv载体作为模板，针对第4～第15片段而将phelper载体作为模板，针对第17～第22片段而将prc2-mi342载体作为模板，采用以下的条件通过pcr进行扩增。在每一次反应中，加入10μl的2
×
prime star mix(takara bio)、1μl的模板dna、包含两种引物各3.2pmol的1μl溶液、8μl的灭菌水，于96℃经过2分钟后，将98℃下10秒、55℃下15秒、72℃下5秒的循环实施30次循环。
[0449]
ogab用集聚片段向载体中的克隆
[0450]
通过map法或pcr法得到dna片段后，使用minelute pcr纯化试剂盒(purification kit)(qiagen)对这些dna进行纯化，最终利用15μl的te缓冲液(nacalai tesque)使其从柱溶出。向1.4μl所得到的dna溶液中加入0.2μl的10
×
ex-taq缓冲液(takara bio)、0.2μl的2mm dntp(takara bio)、0.2μl的10xa-attachme nt mix(toyobo)，于60℃反应1小时。然后，将1μl的pmd19simple(takara bio)用te缓冲液稀释至20倍，加入3μl的dna ligation kit《mighty mix》，于16℃进行3小时连接反应，使用大肠杆菌jm109感受态细胞(takara bio)进行转化。培养一整夜后，针对在加有羧苄青霉素的lb板上出现的菌落来确认碱基序列，由此，针对各片段而获得正确序列的克隆。
[0451]
ogab用片段的等摩尔混合物的调整
[0452]
使具有这些克隆的大肠杆菌在2ml的lb培养基中增殖后，使用其中的900μl，利用qiaprep spin miniprep kit(qiagen)，通过自动化系统qiacube对质粒进行纯化，最终溶出至30μl的te缓冲液中。针对其中的包含相当于2.5μg的质粒dna的溶液，以成为50μl的方式添加te缓冲液。进一步向其中加入6μl的10xplasmid safe缓冲液(epicentre)、2.4μl的25mm atp、2μl的plasmid-safe atp-dependent dnase(epicentre)，于37℃反应1小时后，于70℃经30分钟使其失活，由此将环状结构以外的dna分解。然后，使用minelute pcr纯化试剂盒(qiagen公司)对反应液进行纯化，最终利用15μl的te缓冲液(nacalai tesque)使其从柱溶出。使用微量分光光度计(nano drop one，thermofisher)对所得到的dna溶液进行测定，以成为100ng/μl的方式加入te缓冲液而进行稀释。然后，再次测定浓度，准确地将分取500ng的dna时所需的dna体积计算至小数点后第2位(μl)，利用微量移液管进行分取，由此进行各质粒的等摩尔分取。对于所分取的dna溶液，根据其后使用的限制性内切酶的种类而分成2个1.5ml的离心管来进行合并(pool)。分别地，将第1、3、5、7、9、11、13、14、17、19、21片段克隆化的质粒合并到利用限制性内切酶aari进行切割的管中，将第2、4、6、8、10、12、15、16、18、20、22片段克隆化的质粒合并成利用限制性内切酶bsai进行切割的组。然后，在利用aari进行切割的管中，将各质粒的容积的合计设为1体积时，加入1.94体积的灭菌水、0.33体积的10
×
buffer aari(thermofisher)、0.06体积的50
×
寡核苷酸(0.025mm)、0.17体积的aari(thermofisher)，于37℃反应2小时。另外，在利用bsai进行切割的管中，将各质粒的容积的合计设为1体积时，加入2体积的灭菌水、0.33体积的10
×
cutsmart缓冲液(neb)、0.17体积的bsai-hf v2，于37℃反应2小时。向各个管中添加与限制性内切酶反应液等量的te饱和苯酚，充分混合，由此使限制性内切酶失活，然后，将已乳化的状态的苯酚与dna溶液的混合物整合到一个2ml离心管中，以20,000
×
g离心10分钟，分离成苯酚相和水相。将上层转移到新管中，向其中加入等量的1-丁醇，充分搅拌，以20,000
×
g离心1分钟。然后，将上层用移液管吸取除去，再次重复实施加入等量的1-丁醇、离心、舍弃上层的操作，直至下层的体积成为450μl以下为止。然后，加入50μl的p3缓冲液，加入900μl的乙醇，以20,000
×
g离心10分钟。以不失去沉淀的方式舍弃上清液后，利用900μl的70％乙醇冲洗，然后，将上清液用移液管吸取并舍弃。然后，再次离心，将残留的上清液集中到底部，利用移液管将液体完全除去。立即加入te50μl，将沉淀轻弹5分钟，由此使其完全溶解。然后，通过基于低熔点琼脂糖凝胶的电泳，对从pmd19切出的约750bp的22种片段的等摩尔混合物进行尺寸分级，按照实施例1中记载的dna片段从电泳凝胶的切出和纯化的方法，对22种片段的混合物进行纯化。
[0453]
基于ogab法的pgets103-aav-helper-rc2重建
[0454]
然后，向所得到的dna溶液1fmol、和利用aari切割并纯化而得到的pgets103δaari-linker 1fmol中，以合计成为4μl的方式追加te缓冲液，向其中添加5μl的2
×
连接缓冲液(15％聚乙二醇6000，500mm nacl，132mm tris
·
hcl(ph7.6)，13.2mm mgcl2，20mm dtt，0.2mm atp)，充分混合后，加入1μl的t4 dna连接酶(takara bio)，于37℃孵育5小时。向其中添加枯草杆菌感受态细胞100μl，于37℃利用鸭式转子(duck rotor)旋转培养30分钟。然后，添加300μl的lb培养基，于37℃利用鸭式转子旋转培养1小时，然后，将培养液铺展于加有10μg/ml的四环素(sigma-aldrich)的lb板上，于37℃培养一夜。得到94个菌落。
[0455]
转化体的质粒结构确认
[0456]
随机选择12株的菌落，在2ml的加有10μg/ml的四环素的lb培养基中培养一夜，为了使内部的质粒的拷贝数扩增，以最终浓度成为1mm的方式添加iptg，进一步于37℃培养3小时。如下所述地从所得到的菌体进行少量的质粒提取。取900μl的菌液至1.5ml离心管中，以6800
×
g离心3分钟，利用微量移液管将上清液除去。使所得到的菌体颗粒良好地悬浮后，添加包含10mg/ml的蛋清溶菌酶(wako)的p1缓冲液100μl，然后于37℃孵育5分钟。向其中加入200μl的p2缓冲液，进行4次颠倒混合。然后，添加150μl p3，进行4次颠倒混合。以20,000
×
g对其进行10分钟离心，由此分离成白色沉淀和上清液。将上清液转移到新的1.5ml离心管中，向其中添加450μl的te饱和苯酚(nacalai tesque)，充分混合后，以20,000
×
g离心10分钟，由此分离成苯酚相和水相，将水相320μl转移到新管中，向其中加入900μl的乙醇，以20,000
×
g离心10分钟。利用微量移液管将上清液除去，加入900μl的70％乙醇，对管整体进行冲洗。然后，利用微量移液管将70％乙醇除去，将所得到的沉淀用27μl的te缓冲液溶解。取8μl所得到的质粒溶液，向其中添加1μl的10
×
3.1neb缓冲液(neb)、和1μl的smai，于37℃反应1小时后，通过琼脂糖凝胶电泳对切割模式进行确认。如图11所示，在12个中有1个(克隆编号3)显示出所期待的切割模式。针对该克隆，对全碱基序列进行确定，结果确认到，重建了pgets103-aav-helper-rc2。
[0457]
(实施例8：各种aav一体化载体质粒的构建)
[0458]
同样地，使用从其他血清型的aav基因组及腺病毒基因组获得的构成要素，构建了用于生产aav病毒载体的一体化结构的7种载体质粒。基于pgets118-aari(tsuge,k.,sato,y.,kobayashi,y.,gondo,m.,hasebe,m.,togashi,t.,tomita,m.,和itaya,m.用于超过50个片段的dna一步组装的等摩尔dna混合物的制备方法(method of preparing an equimolar dna mixture for one-step dna assembly of over 50fragments).sci rep 5,10655(2015).)而构建了各质粒(在图16中示出示意图)。将成为在各个载体质粒中使用的itr、rep、cap及helper(va、e2a及e4)的来源的病毒基因组的血清型示于以下的表中(也参见图17)。
[0459]
[表6]
[0460][0461]
＊1的载体质粒为上述实施例的载体质粒(pgets103-aav-helper-rc2).
[0462]
aav：腺相关病毒血清型
[0463]
ad:腺病毒血清型及组
[0464]
设计上述的各一体化核酸(全长15～16kb)，根据其长度而化学合成包含18～19个单位dna片段(700～900bp)的dna片段。利用aari、bbsi、bsai、bsmbi中的任一种限制性内切酶将这些dna片段切出，从而制备单位dna片段。将这些单位dna片段与用aari切割而得的pgets118以串联重复的方式连结，然后，与上述的实施例同样地，利用ogab法在枯草杆菌中形成环状质粒。其结果，确认了上述追加的7种aav的一体化结构的载体质粒的构建。
[0465]
确认了通过将这些质粒导入培养细胞(生产细胞)中，可生产各病毒载体(图18)。
[0466]
(实施例9：腺病毒一体化载体质粒的构建)
[0467]
关于腺病毒载体ad5，设计了向takara bio公司的paxcawtit2中导入gio基因而得到的全长约36kb的用于生产腺病毒载体的一体化结构(图19)。将其分割成40个约800bp的部分，通过pcr或化学合成来制备包含单位dna片段的dna片段。利用aari、bbsi、bsai、bsmbi中的任一种限制性内切酶将这些dna片段切出，从而制备单位dna片段。然后，向用aari切割而得的pgets118-aari或pbet131(tanaka,t.,和m.ogura.1998.一种能够在枯草芽孢杆菌中复制的新型纳豆芽孢杆菌质粒pls32(a novel bacillusnatto plasmid pls32 capable of replication in bacillus subtilis).febs lett.422：243-246)的bamhi位点导入接头dna，将导入了2处新的aari位点的pbet131-aari(图20)与用aari切割而得的2个大片段以串联重复的方式连结，然后，与上述的实施例同样地，利用ogab法在枯草杆菌中形成环状质粒。其结果，确认了具有用于生产腺病毒载体的一体化结构的克隆的构建。
[0468]
(实施例10：进一步的aav病毒一体化载体质粒的结构例)
[0469]
还可预期图21～26所示的aav病毒一体化载体质粒。
[0470]
·
图21为基于pgets103-δaari的使用aav1的rep及aav6的cap的构建例。
[0471]
·
图22为基于pgets103-δaari的使用cag启动子、aav5的rep及aav1的cap的构建例。
[0472]
·
图23为基于pgets103-δaari的使用ef1α启动子、aav8的rep及aav9的cap的构建例。
[0473]
·
图24为基于pgets103-δaari的使用sv40启动子、以不同顺序配置rep、cap及helper的构建例。
[0474]
·
图25为基于pgets131-aari的以不同顺序配置rep、cap及helper的构建例。
[0475]
·
图26为基于pbets103-δaari的变更helper基因的要素(与其他要素分离地追加了腺病毒e1a及e1b)的构建例。
[0476]
(实施例11：基于各种病毒的病毒载体质粒的构建)
[0477]
对于aav病毒载体质粒而言，在使用除hek293以外的生产细胞(nih3t3、ht1080、a549、hela、hek 293t等)的情况下，可以以除了上述的实施例的结构之外还进一步包含e1a及e1b基因的方式构建。
[0478]
例如，作为逆转录病毒载体质粒、慢病毒载体质粒、仙台病毒载体质粒、腺病毒病毒载体质粒的具体构成，以上述实施例的pge ts103δaari为基础而设想到图12～15。
[0479]
慢病毒载体质粒(图12)
[0480]
以pgets103δaari为基础追加以下的核酸序列从而构建载体质粒。
[0481]
·
cmv启动子、vsv-g(水疱性口炎病毒的糖蛋白g)、多聚a(polya)
·
cmv启动子、rev、多聚a
[0482]
·5’
ltr、ψ(包装信号序列)、rpe、ppt、cmv启动子、wpre、3’ltr
[0483]
·
cmv启动子、gag、pol、rpe、多聚a
[0484]
(所期望的基因可在ltr间定位于启动子的下游)
[0485]
逆转录病毒载体质粒(图13)
[0486]
以pgets103δaari为基础追加以下的核酸序列从而构建载体质粒。
[0487]
·
cmv启动子、env、多聚a
[0488]
·5’
ltr、ψ(包装信号序列)、rpe、ppt、cmv启动子、wpre、3’ltr
[0489]
·
cmv启动子、gag、pol、rpe、多聚a
[0490]
(所期望的基因可在ltr间定位于启动子的下游)
[0491]
仙台病毒载体质粒(图14)
[0492]
以pgets103δaari为基础追加以下的核酸序列从而构建载体质粒。
[0493]
·
cag启动子、t7 rna聚合酶
[0494]
·
cag启动子、n
[0495]
·
cag启动子、p、l、f
[0496]
·
t7启动子、缺失了f的仙台病毒基因组、rbz
[0497]
(所期望的基因可被定位于仙台病毒基因组的任意基因之间)
[0498]
腺病毒载体质粒(图15)
[0499]
以pgets103δaari为基础追加以下的核酸序列从而构建载体质粒。
[0500]
·5’
itr、腺病毒血清型5的基因组(将e1基因的部位用启动子及e1a基因替换)、3’itr
[0501]
(除了e1a基因之外，所期望的基因也可被定位于上述或其他启动子的下游)
[0502]
冠状病毒载体质粒(图27)
[0503]
以pgets103δaari为基础追加以下的核酸序列从而构建冠状病毒载体质粒。
[0504]
·
包含非结构蛋白区域的orf1a、非结构蛋白区域的orf1b及结构蛋白区域，在结构蛋白区域中包含所期望的基因。结构蛋白区域的刺突基因s、包膜基因e、基质基因m、核衣壳基因n等也可以根据需要缺失。
[0505]
(附注)
[0506]
如上所述地，使用本公开文本的优选的实施方式对本公开文本进行了示例，但应理解，本公开文本应当仅根据权利要求书来解释其范围。应理解，本说明书中引用的专利、专利申请及文献的内容与其内容本身被具体记载在本说明书中的情况同样地作为参考而并入本说明书中。
[0507]
本技术针对于2020年11月4日向日本专利局提出申请的日本特愿2020-184491号主张优先权权益，其全部内容作为参考而并入本说明书中。
[0508]
产业上的可利用性
[0509]
本公开文本提供新型结构的载体质粒，能够使基于载体质粒的病毒载体的供给成为可能。
[0510]
序列表自由文本
[0511]
序列号1：pcr产物
[0512]
tagggtctcaagcttgcctgcaggcagatcatgcgcaggtgcacctgcatgcgatccggggttcgaaccccggtcgtccgccatgatacccttgcgaatttatccaccagaccacggaagagtgcccgcttacaggctctccttttgcacggtctagagcgtcaacgactgcgcacgcctcaccggccagagcgtcccgaccatggagcactttttgccgctgcgcaacatctggaaccgcgtccgcgactttccgcgcgcctccaccaccgccgccggcatcacctggatgtccaggtacatctacggattacgtcgacgtttaaaccatatgagcggccgcatatatcccgggagctagagacctca
[0513]
序列号2：pgets103-aav-helper-rc2
[0514]
(同序列表中记载)
[0515]
序列号3：接头f
[0516]
agcttgcgcaggtgcacctgcatgcgg
[0517]
序列号4：接头r
[0518]
agctccgcatgcaggtgcacctgcgca
[0519]
序列号5：第1-1
[0520]
tagaggcaagggttgtttttattgactacacctgcgatcaagcttgcctgcaggcagctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaaagcccgggcgtcgggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcactagg
[0521]
序列号6：第1-2
[0522]
ggtcgttgggcggtcagccaggcgggccatttaccgtaagttatgtaacgcggaactccatatatgggctatgaactaatgaccccgtaattgattactattaaagcttgatatcgataggaacccctagtgatggagttggccactccctctct
[0523]
序列号7：第1-3
[0524]
atggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcat
[0525]
序列号8：第1-4
[0526]
gtaatagcgatgactaatacgtagatgtactgccaagtaggaaagtcccataaggtcatgtactgggcataatgccaggcgggccatttaccgtcattgacgtcaatagggggcgtacttggcatatgatacacttgatgtactgccaagtgggc
[0527]
序列号9：第1-5
[0528]
gtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggact
[0529]
序列号10：第1-6
[0530]
tactggttggaagaaagacctctatcacctgcgatcctgggcccttaaggatatccactaaaccagctctgcttatatagacctcccaccgtacacgcctaccgcccatttgcgtcaatggggcggagttgttacgacattttggaaagtcccgttgattttggtgccaaaacaaac
[0531]
序列号11：第3-1
[0532]
tagaggcaagggttgtttttattgactacacctgcgatcggaaccaagctggagtgcagtggcacaatcttggctcactgcaatctccgcctcctgggttcaagcgattctcctgcctcagcctcccgagttgttgggattccaggcatgcatgaccaggctcagctaatttttgtt
[0533]
序列号12：第3-2
[0534]
agggagcagtggttcacgcctgtaatcccagcaatttgggaggccaaggtgggtagatcacctgagattaggagttggagaccagcctggccaatatggtgaaaccccgtctctaccaaaaaaacaaaaattagctgagcctggtcatgc
[0535]
序列号13：第3-3
[0536]
ggattacaggcgtgaaccactgctcccttccctgtccttatcgatagatctaggaacccctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgg
[0537]
序列号14：第3-4
[0538]
ggaagctgtagagctgttcctggttgcgacgcagggtgggctgtacctggggactgttaagcatggagttgggtaccggatctgcctgcaggcagctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaaagcccgggcgtcgggcgacc
[0539]
序列号15：第3-5
[0540]
cgcaaccaggaacagctctacagcttcctggagcgccactcgccctacttccgcagccacagtgcgcagattaggagcgccacttctttttgtcacttgaaaaacatgtaaaaataatgtactaggagacactttcaataaaggcaaatgt
[0541]
序列号16：第3-6
[0542]
tactggttggaagaaagacctctatcacctgcgatctgtccctgccagtggcgcatagcgatgcgcggcagaacccctttgatttttaaacggcgcagacggcaagggtggggggtaaataatcacccgagagtgtacaaataaaaacatttgcctttattgaaagtgtctcct
[0543]
序列号17：第16-1
[0544]
tagaggcaagggttgtttttattgactaggtctcgcaggtacatctacggattacgtcgacgtttaaaccatatgagcggccgctctagaactagtggatcccccggaagatcagaagttcctattccgaagttcctattctctagaaagtataggaacttctgatctgcgcagccgcc
[0545]
序列号18：第16-2
[0546]
cagaatctggcggcaactcccattccttctcggccacccagttcacaaagctgtcagaaatgccgggcagatgctcgtcaaggtcgctggggaccttaatcacaatctcgtaaaaccccggcatggcggctgcgcagatcagaagttcctatac
[0547]
序列号19：第16-3
[0548]
agaaggaatgggagttgccgccagattctgacatggatctgaatctgattgagcaggcacccctgaccgtggccgagaagctgcagcgcgactttctgacggaatggcgccgtgtgagtaaggccccggaggcccttttctttgtgcaat
[0549]
序列号20：第16-4
[0550]
ccgcggtaaattctctgaatcagtttttcgcgaatctgactcaggaaacgtcccaaaaccatggatttcaccccggtggtttccacgagcacgtgcatgtggaagtagctctctcccttctcaaattgcacaaagaaaagggcctccggggcct
[0551]
序列号21：第16-5
[0552]
cgaaaaactgattcagagaatttaccgcgggatcgagccgactttgccaaactggttcgcggtcacaaagaccagaaatggcgccggaggcgggaacaaggtggtggatgagtgctacatccccaattacttgctccccaaaacccagcctgag
[0553]
序列号22：第16-6
[0554]
tactggttggaagaaagacctctatggtctccctgctcctgcgtctgcgacacgtgcgtcagatgctgcgccaccaaccgtttacgctccgtgagattcaaacaggcgcttaaatactgttccatattagtccacgcccactggagctcaggctgggttttggggagcaagtaatt
[0555]
序列号23：第1-f
[0556]
tagcacctgcatgcaagcttgcctgcaggca
[0557]
序列号24：第1-r
[0558]
tagcacctgcgcatctgggcccttaaggatatc序列号25：第2-f
[0559]
tagggtctcgccagccggcc
[0560]
序列号26：第2-r
[0561]
tagggtctccttcccaatagaccccgca
[0562]
序列号27：第3-f
[0563]
tagcacctgcatgcggaaccaagctggagtg
[0564]
序列号28：第3-r
[0565]
tagcacctgcgcattgtccctgccagtgg
[0566]
序列号29：第4-f
[0567]
tagggtctcggacacgttgcgatactggt
[0568]
序列号30：第4-r
[0569]
tagggtctcccacgagcccacgg
[0570]
序列号31：第5-f
[0571]
tagcacctgcatgccgtggtgcttgtaggttac序列号32：第5-r
[0572]
tagcacctgcgcatgagcgcggacgc
[0573]
序列号33：第6-f
[0574]
tagggtctcggctcgggggtggt
[0575]
序列号34：第6-r
[0576]
tagggtctccttgccgcgcgtttctc
[0577]
序列号35：第7-f
[0578]
tagcacctgcatgcgcaaacgctctgcaacaaga序列号36：第7-r
[0579]
tagcacctgcgcatgtccgccaggtgc
[0580]
序列号37：第8-f
[0581]
tagggtctcgggacattatcttccccgaac
[0582]
序列号38：第8-r
[0583]
tagggtctccgtggcggcggc
[0584]
序列号39：第9-f
[0585]
tagcacctgcatgcccacccacggacga
[0586]
序列号40：第9-r
[0587]
tagcacctgcgcatgagggagcgcagaga
[0588]
序列号41：第10-f
[0589]
tagggtctcgcctcacccgcagctg
[0590]
序列号42：第10-r
[0591]
tagggtctccgactaaaaaatgacgtaacggttaaagtc
[0592]
序列号43：第11-f
[0593]
tagcacctgcatgcagtcctatatatactcgctctgtact
[0594]
序列号44：第11-r
[0595]
tagcacctgcgcatggagctatgctaaccagc
[0596]
序列号45：第12-f
[0597]
tagggtctcgctccgagtatgcgtgtca
[0598]
序列号46：第12-r
[0599]
tagggtctccgtagttgtagtatatccactctctca
[0600]
序列号47：第13-f
[0601]
tagcacctgcatgcctactacacagagcgagct
[0602]
序列号48：第13-r
[0603]
tagcacctgcgcatgcacagcaccacaatattgttca
[0604]
序列号49：第14-f
[0605]
tagcacctgcatgcgtgctgcagttactgtgct
[0606]
序列号50：第14-r
[0607]
tagcacctgcgcattagcgaggtaagcacttactct
[0608]
序列号51：第15-f
[0609]
tagggtctcggctagtttctgtggattcactaga
[0610]
序列号52：第15-r
[0611]
tagggtctcccctggacatccaggtga
[0612]
序列号53：第16-f
[0613]
tagggtctcgcaggtacatctacggattacgt
[0614]
序列号54：第16-r
[0615]
tagggtctccctgctcctgcgtctg
[0616]
序列号55：第17-f
[0617]
tagcacctgcatgcgcagaacaaagagaatcagaatcc
[0618]
序列号56：第17-r
[0619]
tagcacctgcgcatggtgagttcaaatttgaacatccg
[0620]
序列号57：第18-f
[0621]
tagggtctcgcacccgccgtctg
[0622]
序列号58：第18-r
[0623]
tagggtctcccgagggccgcg
[0624]
序列号59：第19-f
[0625]
tagcacctgcatgcctcgagcacgacaaagc
[0626]
序列号60：第19-r
[0627]
tagcacctgcgcattgacttgaatgttaaagagcttgaagttga
[0628]
序列号61：第20-f
[0629]
tagggtctcggtcaaagaggtcacgcaga
[0630]
序列号62：第20-r
[0631]
tagggtctccttggttgtcctgatttcctcttc
[0632]
序列号63：第21-f
[0633]
tagcacctgcatgcccaatcccgtggctac
[0634]
序列号64：第21-r
[0635]
tagcacctgcgcatgcatatgatacacttgatgtactgc
[0636]
序列号65：第22-f
[0637]
tagggtctcgatgccaagtacgccccct
[0638]
序列号66：第22-r
[0639]
tagggtctccctcccgggctgtagt
[0640]
序列号67：itr靶标引物(正向)
[0641]
ggaacccctagtgatggagtt
[0642]
序列号68：itr靶标引物(反向)
[0643]
cggcctcagtgagcga
[0644]
序列号69：cmv靶标引物(正向)
[0645]
catcaatgggcgtggatagc
[0646]
序列号70：cmv靶标引物(反向)
[0647]
ggagttgttacgacattttggaaa
[0648]
序列号71：ampr基因区域靶标引物(正向)
[0649]
ttgatcgttgggaaccggag
[0650]
序列号72：ampr基因区域靶标引物(反向)
[0651]
ttgttgccgggaagctagag

技术特征：
1.质粒，其包含：在枯草杆菌中促进质粒复制的核酸序列；和构成病毒载体所必需的核酸序列中的至少一者。2.如权利要求1所述的质粒，其中，所述构成病毒载体所必需的核酸序列包含：编码所述病毒的衣壳蛋白的核酸序列；编码对所述病毒的基因组进行包装、转录及复制的蛋白质的核酸序列；所述病毒的2个末端重复序列；和编码辅助基因的核酸序列。3.如权利要求1所述的质粒，其包含下述核酸序列中的至少二者：编码所述病毒的衣壳蛋白的核酸序列；编码对所述病毒的基因组进行包装、转录及复制的蛋白质的核酸序列；所述病毒的2个末端重复序列；以及编码辅助基因的核酸序列。4.如权利要求1所述的质粒，其包含下述核酸序列中的至少三者：编码所述病毒的衣壳蛋白的核酸序列；编码对所述病毒的基因组进行包装、转录及复制的蛋白质的核酸序列；所述病毒的2个末端重复序列；以及编码辅助基因的核酸序列。5.如权利要求1所述的质粒，其包含：编码所述病毒的衣壳蛋白的核酸序列；编码对所述病毒的基因组进行包装、转录及复制的蛋白质的核酸序列；所述病毒的2个末端重复序列；和编码辅助基因的核酸序列。6.如权利要求1～5中任一项所述的质粒，其中，所述构成病毒载体所必需的核酸序列为约10kb以上。7.如权利要求2～6中任一项所述的质粒，其中，所述编码衣壳蛋白的核酸序列、所述编码对基因组进行包装、转录及复制的蛋白质的核酸序列及所述辅助基因中的至少一者位于被所述2个末端重复序列夹持的区域之外。8.如权利要求1～7中任一项所述的质粒，其中，在枯草杆菌中促进质粒复制的所述核酸序列包含在枯草杆菌中工作的复制起点。9.如权利要求1～8中任一项所述的质粒，其还包含在大肠杆菌中使质粒进行扩增的核酸序列。10.如权利要求2～9中任一项所述的质粒，其中，编码所述病毒的衣壳蛋白的核酸序列包含l1、l2、l3、l4、l5、cap及gag中的至少一者。11.如权利要求2～10中任一项所述的质粒，其中，编码对所述病毒的基因组进行包装、转录及复制的蛋白质的核酸序列包含e1a、e1b、e2a、e2b、e4、rep、ψ、app、maap、pol及rev中的至少一者。12.如权利要求2～11中任一项所述的质粒，其中，所述末端重复序列为末端反向重复序列(itr)或长末端重复序列(ltr)。
13.如权利要求2～12中任一项所述的质粒，其中，所述辅助基因包含e1a、e1b、e2a、e4、va、env、tat、rpe、ppt、pre及pro中的至少一者。14.如权利要求2～13中任一项所述的质粒，其中，编码所述病毒的衣壳蛋白的核酸序列及编码对所述病毒的基因组进行转录及复制的蛋白质的核酸序列中的至少一者来源于腺病毒的血清型1～52或腺相关病毒的血清型1～12及它们的修饰体中的任一者。15.如权利要求1～14中任一项所述的质粒，其中，所述质粒不包含所述病毒的全基因组中的至少一部分基因的序列。16.如权利要求1～15中任一项所述的质粒，其中，所述病毒为腺病毒、腺相关病毒、慢病毒、逆转录病毒或仙台病毒。17.如权利要求1～15中任一项所述的质粒，其中，所述病毒为腺相关病毒或慢病毒。18.如权利要求1～15中任一项所述的质粒，其中，所述病毒为腺相关病毒。19.如权利要求2～18中任一项所述的质粒，其中，所述末端重复序列为来源于腺相关病毒的血清型1～12及其修饰体中的任一者的末端反向重复序列(itr)。20.如权利要求19所述的质粒，其中，在5’itr与3’itr之间从上游起包含启动子、所期望的基因及终止子。21.如权利要求2～20中任一项所述的质粒，其中，所述辅助基因包含e1a、e1b、e2a、e4及va中的至少一者。22.如权利要求2～20中任一项所述的质粒，其中，所述辅助基因包含e2a、e4及va。23.如权利要求2～22中任一项所述的质粒，其中，所述辅助基因各自来源于腺病毒的血清型1～52及其修饰体中的任一者。24.如权利要求2～23中任一项所述的质粒，其中，编码对所述病毒的基因组进行包装、转录及复制的蛋白质的核酸序列包含rep。25.如权利要求24所述的质粒，其中，所述rep来源于腺相关病毒的血清型1～12及其修饰体中的任一者。26.如权利要求2～25中任一项所述的质粒，其中，编码所述病毒的衣壳蛋白的核酸序列包含cap。27.如权利要求26所述的质粒，其中，所述cap来源于腺相关病毒的血清型1～12及其修饰体中的任一者。28.如权利要求2～27中任一项所述的质粒，其中，在所述病毒的2个末端重复序列之间包含所期望的基因。29.如权利要求28所述的质粒，其中，所述所期望的基因为2～100个基因。30.如权利要求28所述的质粒，其中，所述所期望的基因为10～100个基因。31.如权利要求28～30中任一项所述的质粒，其中，所述所期望的基因包含启动子序列。32.如权利要求1～31中任一项所述的质粒，其中，所述质粒及生产细胞一同包含所述构成病毒载体所必需的核酸序列。33.如权利要求1～32中任一项所述的质粒，其中，由导入有所述质粒的生产细胞所生产的全部病毒载体粒子中，不包含核酸的病毒载体粒子为65％以下。34.如权利要求1～33中任一项所述的质粒，其中，在导入至生产细胞中的情况下，所生
产的全部病毒载体粒子中，包含含有全部所期望的基因的核酸的病毒载体粒子为90％以上。35.如权利要求1～34中任一项所述的质粒，其中，在导入至生产细胞中的情况下，所生产的全部病毒载体粒子中，包含除所期望的核酸以外的来源于所述质粒的核酸的病毒载体粒子为2％以下。36.如权利要求1～35中任一项所述的质粒，其ccc(共价闭合环状)纯度为80％以上。37.用于表达所期望的基因的、包含权利要求1～36中任一项所述的质粒的组合物，所述所期望的基因在所述质粒上配置于所述病毒的2个末端重复序列之间。38.生产权利要求1～36中任一项所述的质粒的方法，其包括将权利要求1～32中任一项所述的核酸序列以可工作的方式连结的步骤。39.含有质粒的组合物，所述质粒是利用权利要求38所述的方法生产的。40.如权利要求39所述的含有质粒的组合物，其中，质粒的ccc(共价闭合环状)纯度为80％以上。41.试剂盒，其用于制作权利要求1～36中任一项所述的质粒，所述试剂盒包含至少一种核酸，所述至少一种核酸包含：在枯草杆菌中促进质粒复制的核酸序列；和构成病毒所必需的核酸序列。42.用于制备病毒载体的组合物，其包含权利要求1～36中任一项所述的质粒。43.用于制备病毒载体的方法，其包括使用权利要求1～36中任一项所述的质粒生产病毒载体的步骤。44.如权利要求43所述的方法，其中，所述质粒中包含的核酸的至少一部分被整合到导入有所述质粒的生产细胞的染色体中。45.病毒载体，其是使用权利要求1～36中任一项所述的质粒生产的，或者是使用权利要求43或44所述的方法生产的。46.含有病毒载体的组合物，所述病毒载体是使用权利要求1～36中任一项所述的质粒生产的，或者是使用权利要求43或44所述的方法生产的。47.如权利要求46所述的组合物，其中，全部病毒载体粒子中不包含核酸的病毒载体粒子为65％以下。48.如权利要求46或47所述的组合物，其中，全部病毒载体粒子中，包含含有全部所期望的基因的核酸的病毒载体粒子为90％以上。49.如权利要求46～48中任一项所述的组合物，其中，全部病毒载体粒子中，包含除所期望的核酸以外的来源于所述质粒的核酸的病毒载体粒子为2％以下。50.包含权利要求1～36中任一项所述的质粒的枯草杆菌或大肠杆菌。51.生产细胞，其为导入有权利要求1～36中任一项所述的质粒的生产细胞，其中，所述质粒中包含的核酸的至少一部分被整合到所述生产细胞的染色体中。

技术总结
本公开文本生产病毒载体质粒。在一个方面，本公开文本提供制作具有在枯草杆菌内进行复制的序列的病毒载体质粒的方法，该方法包括下述步骤：将具有在枯草杆菌内进行复制的序列的、包含用于生产病毒载体的核酸序列的核酸导入宿主细胞中，在前述宿主细胞中形成质粒。在一个实施方式中，枯草杆菌可具有由从外部摄入的核酸形成质粒的能力，因此，在该方法中，导入的核酸也可以不是质粒。的核酸也可以不是质粒。的核酸也可以不是质粒。


技术研发人员：斋藤俊介 柘植谦尔
受保护的技术使用者：株式会社辛普罗根
技术研发日：2021.11.02
技术公布日：2023/7/7