一种基于低强度超声刺激的三维脑类器官的培养方法

1.本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种基于低强度超声刺激的三维脑类器官的培养方法。


背景技术：

2.神经系统发育经历神经诱导、图式形成、细胞命运决定及特化、神经细胞极性建立与迁移、神经环路形成等过程。深入开展神经发育的机制研究以指导预防及治疗这类重大神经发育缺陷疾病具有重要意义。小头畸形是胎儿期或婴儿期大脑发育异常导致的患儿头部明显变小的一种神经系统发育障碍性疾病。患者脑部发育不全，终身不能自理生活。目前，治疗手段有限，疗效不理想。
3.脑类器官凭借细胞组成多样性高、结构组织复杂度高、电生理功能相对成熟、基因表达模式与人类相近等优点，是模拟婴儿脑发育过程的良好三维模型。aspm是最常见的常染色体隐性小头畸形突变基因。当aspm基因发生突变时，人脑尺寸将减少50％。而aspm基因灭活仅能使小鼠的大脑萎缩10％，aspm基因敲除小鼠在人类脑皮层发育的研究中只能提供十分有限的参考(nature.2018；556:370-375)。而研究表明，aspm敲除的人源性脑类器官模型可较好地重现小头畸形的表型(protein cell.2017；8(11):823-833)。
4.然而，将低强度超声应用于三维脑类器官发育的相关研究还未见报道。


技术实现要素：

5.鉴于此，本发明的目的是提供一种基于低强度超声刺激的三维脑类器官的培养方法。
6.本发明目的是通过以下方式实现：
7.本发明提供一种基于低强度超声刺激的三维脑类器官的培养方法，包括以下步骤：
8.(1)构建三维脑类器官：将胚胎干细胞或诱导性多能干细胞进行培养，分化为三维脑类器官；
9.(2)低强度超声优化脑类器官发育：利用低强度超声在脑类器官发育过程中进行刺激干预，在不同时间点记录三维脑类器官的结构变化。
10.基于上述技术方案，进一步地，步骤(1)中构建三维脑类器官的具体过程为：将胚胎干细胞或诱导性多能干细胞的单细胞悬液接种在超低黏附u型底孔板中，加入神经诱导培养基培养，形成拟胚体，培养至8-12天，转移到低黏附孔板中，加入神经分化培养基后摇床旋转培养，培养第16-20天，更换为成熟培养基继续旋转培养。
11.基于上述技术方案，进一步地，所述的神经诱导培养基为dmem/f-12培养基，培养基中含有15％ knockout serum replacement，1％ mem-neaa，1％ glutamax supplement，100μmβ-mercaptoethanol，100nm ldn-193189，10μm sb431542，2μmxav939。
12.基于上述技术方案，进一步地，所述的神经分化培养基为50％ dmem/f-12培养基，
培养基中含有50％ neurobasal medium，0.025％ insulin，0.5％ mem-neaa，1％glutamax supplement，1％ penicillin/streptomycin，0.5％ n2 supplement，1％ b27supplement without vitamin a，50μmβ-mercaptoethanol。
13.基于上述技术方案，进一步地，所述的成熟培养基为50％ dmem/f-12培养基，培养基中含有50％ neurobasal medium，0.025％ insulin，0.5％ mem-neaa，1％glutamax supplement，1％ penicillin/streptomycin，0.5％ n2 supplement，1％ b27supplement，50μmβ-mercaptoethanol，200μm ascorbic acid，20ng/ml bdnf。
14.基于上述技术方案，进一步地，步骤(2)中所述的低强度超声的参数为脉冲强度为30-50mw/cm2，额定频率为1-5mhz，5-15％占空比，每天处理1-5min。
15.基于上述技术方案，进一步地，步骤(2)中刺激干预开始时间点为脑类器官发育的第15-20天。
16.本发明还提供所述的低强度超声刺激在构建小头畸形脑类器官疾病模型中的应用。
17.基于上述技术方案，进一步地，所述的小头畸形脑类器官疾病模型中敲除了人类异常纺锤体样小头畸形相关蛋白基因(aspm)。
18.本发明相对于现有技术具有的有益效果如下：
19.本发明首次发现低强度超声刺激优化了脑类器官发育，提供一种基于低强度超声刺激的三维脑类器官的培养方法，可为研究神经系统发育过程提供可靠的、有效的体外研究模型，并为研究小头畸形等神经发育相关疾病的治疗提供了新途径。
附图说明
20.为了更清楚地说明本发明实施例，下面将对实施例涉及的附图进行简单地介绍。
21.图1为低强度超声干预脑类器官发育方案的时间轴；
22.图2为低强度超声刺激处理不同时间的脑类器官光镜对比图；
23.图3为低强度超声刺激处理不同时间的脑类器官免疫荧光对比图，其中，(a)：超声组增殖细胞(ki67)和神经祖细胞(sox2)比例明显上升；(b)：超声组皮质神经元(tbr1)比例明显上升；(c)：超声组凋亡细胞(tunel)比例明显下降。
24.图4为低强度超声刺激处理的脑类器官移植入宿主初级感觉皮层不同时间点的整合图；
25.图5为aspm敲除脑类器官及超声处理后的aspm脑类器官光镜图，其中，(a)：aspm敲除组和对照组的脑类器官光镜对比图；(b)：aspm敲除组、对照组和超声处理后的aspm敲除组的脑类器官光镜对比图。
具体实施方式
26.下面结合实施例对本发明进行详细的说明，但本发明的实施方式不限于此，显而易见地，下面描述中的实施例仅是本发明的部分实施例，对于本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，获得其他的类似的实施例均落入本发明的保护范围。
27.实施例1
28.脑类器官构建：待h9人胚胎干细胞生长融合度高达80％时，使用accutase消化
10min形成单细胞悬液，使用含50μm y27632神经诱导培养基(dmem/f-12，15％knockout serum replacement，1％ mem-neaa，1％ glutamax supplement，100μmβ-mercaptoethanol，100nm ldn-193189，10μm sb431542，2μm xav939)重悬后，以9000个细胞/孔，每孔150μl的比例将细胞接种在超低黏附u型底96孔板中，形成拟胚体。每2天使用不含y27632的神经诱导培养基半量换液一次。培养第10天时，使用5ml巴士吸管将其转移至低黏附6孔板中，每孔6-8个拟胚体，每孔3ml神经分化培养基(50％ dmem/f-12，50％ neurobasal medium，0.025％ insulin，0.5％mem-neaa，1％ glutamax supplement，1％ penicillin/streptomycin，0.5％ n2supplement，1％ b27 supplement without vitamin a，50μmβ-mercaptoethanol)，80rpm摇床旋转培养，每隔2天全量换液一次。培养第18天，更换为成熟培养基(50％dmem/f-12，50％ neurobasal medium，0.025％ insulin，0.5％ mem-neaa，1％ glutamax supplement，1％ penicillin/streptomycin，0.5％ n2 supplement，1％ b27 supplement，50μmβ-mercaptoethanol，200μm ascorbic acid，20ng/ml bdnf)，每隔3-4天全量换液一次。
29.实施例2
30.低强度超声刺激干预脑类器官发育：从脑类器官发育第18天开始处理，约6-8个脑类器官培养在含3ml成熟培养基的低黏附6孔板每孔中，在低黏附6孔板每孔底部涂抹无菌耦合剂(＜1mm厚)，超声探头(me sonicator 740,5平方厘米)放置在孔板下方，紧密接触，无空隙产生。调整超声波治疗仪的参数：脉冲强度为40mw/cm2，额定频率为3mhz，10％占空比，每天处理2min。处理后擦拭底板耦合剂，将孔板放回80rpm摇床持续培养。在脑类器官发育的第35天、第55天、第75天进行神经祖细胞(sox2)、皮质神经元(tbr1)、增殖细胞(ki67)、凋亡细胞(tunel)比例检测。结果如图3所示，可以看出低强度超声刺激处理后的脑类器官表现为尺寸增大，神经祖细胞，皮质神经元比例增加，增殖细胞比例明显增加，凋亡细胞比例显著减少，有效促进脑类器官的结构发育。
31.实施例3
32.低强度超声刺激干预后的脑类器官整合能力检测：将第40天的超声处理的携带gfp的脑类器官移植入nod-scid小鼠初级感觉皮层中，在移植第2个月和移植第5个月检测脑类器官在宿主中的存活能力和与宿主的整合能力。结果见图4，低强度超声刺激处理后的脑类器官移植后在宿主中存活能力明显增高，与宿主整合能力明显提高。
33.实施例4
34.aspm敲除的小头畸形脑类器官模型构建及超声处理：采用crispr-cas9介导的aspm敲除的慢病毒感染胚胎干细胞，药筛两周后挑选单细胞克隆，进行基因片段验证及敲除效果鉴定，构建aspm敲除的胚胎干细胞系。
35.随后，按照实施例1中的人脑类器官构建方法进行培养与鉴定。待第30天后，按照实施例2中的低强度超声干预普通脑类器官的参数方案进行处理与检测，具体结果见图5，可以看出，低强度超声处理后的小头畸形脑类器官表现为尺寸明显增大。
36.最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术
方案的范围。

技术特征：
1.一种基于低强度超声刺激的三维脑类器官的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)构建三维脑类器官：将胚胎干细胞或诱导性多能干细胞进行培养，分化为三维脑类器官；(2)低强度超声优化脑类器官发育：利用低强度超声在脑类器官发育过程中进行刺激干预，在不同时间点记录三维脑类器官的结构变化。2.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤(1)中构建三维脑类器官的具体过程为：将胚胎干细胞或诱导性多能干细胞的单细胞悬液接种在超低黏附u型底孔板中，加入神经诱导培养基培养，形成拟胚体，培养至8-12天，转移到低黏附孔板中，加入神经分化培养基后摇床旋转培养，培养第16-20天，更换为成熟培养基继续旋转培养。3.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述的神经诱导培养基为dmem/f-12培养基，培养基中含有15％knockout serum replacement，1％mem-neaa，1％glutamax supplement，100μmβ-mercaptoethanol，100nm ldn-193189，10μmsb431542，2μm xav939。4.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述的神经分化培养基为50％dmem/f-12培养基，培养基中含有50％neurobasal medium，0.025％insulin，0.5％mem-neaa，1％glutamax supplement，1％penicillin/streptomycin，0.5％n2supplement，1％b27 supplement without vitamin a，50μmβ-mercaptoethanol。5.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述的成熟培养基为50％dmem/f-12培养基，培养基中含有50％neurobasal medium，0.025％insulin，0.5％mem-neaa，1％glutamax supplement，1％penicillin/streptomycin，0.5％n2supplement，1％b27 supplement，50μmβ-mercaptoethanol，200μm ascorbic acid，20ng/ml bdnf。6.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤(2)中所述的低强度超声的参数为脉冲强度为30-50mw/cm2，额定频率为1-5mhz，5-15％占空比，每天处理1-5min。7.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤(2)中刺激干预开始时间点为脑类器官发育的第15-20天。8.权利要求1所述的低强度超声刺激在构建小头畸形脑类器官疾病模型中的应用。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的小头畸形脑类器官疾病模型中敲除了人类异常纺锤体样小头畸形相关蛋白基因(aspm)。

技术总结
本发明公开了一种基于低强度超声刺激的三维脑类器官的培养方法，属于生物医学技术领域。本发明的培养方法首先培养脑类器官，然后通过低强度超声干预脑类器官的发育，通过分析全发育周期低强度超声对脑类器官结构的优化作用，并且研究了低强度超声刺激对人类异常纺锤体样小头畸形相关蛋白基因(ASPM)敲除的小头畸形脑类器官培养中的作用。本发明首次发现低强度超声刺激优化了脑类器官发育，可为研究神经系统发育过程提供可靠的、有效的体外研究模型，并为研究小头畸形等神经发育相关疾病的治疗提供新途径。治疗提供新途径。治疗提供新途径。


技术研发人员：李晓红 陈力群 郭迪 樊秀 常哲瀚 史建新 胡楠
受保护的技术使用者：天津大学
技术研发日：2023.04.03
技术公布日：2023/7/7