一种制备短串联重复序列分型参照物的方法与流程

1.本发明涉及生物医学技术领域，特别涉及一种制备短串联重复序列分型参照物的方法。


背景技术：

2.短串联重复序列(short tandem repeat，str)是由2～7个碱基作为核心序列的短串联重复结构组成，核心序列重复次数的变化构成了str基因座的个体差异及遗传多态性。str基因座重复序列串联排列，基因扩增片段一般在400bp以下。目前，str是法医dna分析中最常用的一类遗传标记。str在整个人类基因组分布广泛，平均每10kb出现一个。多态str序列绝大多少位于非编码区，极少数在编码区。目前在人类基因组dna中已发现的str序列的数量达8000多个。
3.str分型标准物质是指某一str基因座在人群中常见的str分型参照物的混合物，str分型参照物以dna片段的形式存在，同一str基因座的不同等位基因均含有对应的str分型参照物。str分型标准物质对于str基因座的精确分型十分重要，能够减少不同实验室检测仪器和检测条件的不同所导致的误差，是str基因座分型的标准。
4.按国内外试剂厂家传统的生产方式，都是用扩增试剂盒中相同的引物和模板来制备str分型标准物质(属于扩增后试剂)。但这样生产得到的str分型标准物质将可能对扩增前试剂(包括扩增引物、模板等)的生产造成严重污染。因此国家监管部门(中国安全技术防范认证中心)要求扩增前试剂和扩增后两种试剂的生产必须要在两个严格独立、互不干扰的两个厂区进行生产，两种产品的包装、运输和贮存等也要严格分开。且使用者在使用该试剂盒进行检测时，在进行加样等流程时也存在str分型标准物质对样品造成污染的可能性，从而导致检测失败。


技术实现要素：

5.本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种str分型参照物的制备方法，其制备得到的str分型参照物不会对扩增引物和模板等扩增前试剂造成污染，能够与扩增前试剂在同一个厂区生产、包装、贮存和运输而不造成污染，大大减少了人力浪费和生产成本，且降低了使用者在检测时可能造成的试剂污染所导致的检测失败几率。
6.本发明还提出一种含上述str分型参照物的str分型标准物质。
7.本发明还提供一种含上述str分型参照物的str分型标准物质。
8.本发明还提供一种生物材料在制备str分型标准物质中的应用。
9.本发明还提供一种str分型产品。
10.本发明还提供上述str分型标准物质或上述str分型产品在亲缘鉴定、案件排查、个体识别以及尸源认定中的应用。
11.术语“短串联重复序列”是指以相对恒定的短序列为重复单位，首尾相接，串联连
接形成的重复序列，又称卫星dna(satellite dna)。在本发明实施例中，所述“短串联重复序列”是指以含有2～7个碱基的核心序列作为重复单位，首尾相接，串联连接形成的重复序列。核心序列重复次数的变化构成了str基因座的个体差异及遗传多态性。
12.术语“核苷酸交换”是指a、t、c和g之间的位置交换。由此，得到的碱基序列与变化前的碱基序列不同，且a、t、c和g的数量不发生变化。
13.术语“核苷酸互换”包括a与t互相交换，c与g互相交换。
14.根据本发明的第一方面实施例的一种str分型参照物的制备方法，包括以下步骤：
15.s1：针对目的str基因座的核苷酸序列设计一对引物，包括正向引物f1和反向引物r1；
16.s2：将所述f1的3’端的x个碱基的和所述r1的3’端的y个碱基分别进行核苷酸变化，分别得到f2和r2；
17.所述x和y分别独立选自2～6；
18.s3：在所述f2的3’端和所述r2的3’端分别附加m和n个碱基，分别得到f3和r3；
19.所述f3的3’端所附加的碱基为：所述f1对应的dna序列下游的m个碱基；
20.所述r3的3’端所附加的碱基为：所述r1对应的dna序列下游的n个碱基；
21.s4：利用所述f3和所述r3对含所述目的str基因座的dna进行pcr扩增，得到第一pcr扩增产物；
22.s5：将所述第一pcr扩增产物进一步连接到克隆质粒上，得到重组质粒；
23.s6：利用所述f2和所述r2对所述重组质粒进行扩增，得到第二pcr扩增产物，即为str分型参照物。
24.根据本发明实施例的制备方法，至少具有如下有益效果：
25.实施例的str分型参照物的制备方法工艺简单，成本低，操作难度不高，对技术人员的要求不高，易于实现。其制备得到的str分型参照物，不会对扩增引物和模板造成污染，能够与扩增前试剂(包括引物和模板等)在同一厂区生产、包装、贮存和运输，大大减少了人力浪费和生产成本；还能够降低使用者在检测时可能造成的试剂污染所导致的检测失败几率。
26.以本发明实施例中的d5s818基因座为例。其中，f1的核苷酸序列为5
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agccacagtt tacaacatttgtatcttta-3’(seq id no.2)。r1的核苷酸序列为5
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ggtgattttcct ctttggtatcctt-3’(seq id no.3)所示。f1的3’端变化2个核苷酸后为f2(x取2)，f2的核苷酸序列为5
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agccacagtttacaacatttgtatcttat-3’(seq id no.4)。r1的3’端变化4个核苷酸后为r2(y取4)，r2的核苷酸序列为5
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ggtgattttcctctttggtatttcc-3’(seq id no.8)。f3的3’端所附加的碱基(即f1对应的dna序列下游的m个碱基，m取11)为：5
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tctgtatcctt-3’，f3的核苷酸序列为5
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agccacagtttacaacatttgtatcttattctgtatcctt-3’(seq id no.11)。r3的3’端所附加的碱基(即r1对应的dna序列下游的n个碱基，n取13)为：5
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acgtaatattttg-3’，r3的核苷酸序列为5
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ggtgattttcctctttggtatttccacgtaatattttg-3’(se q id no.12)。
27.根据本发明的一些实施例，所述步骤s2中，所述x和y分别独立选自2～6。核苷酸变化数量不在2～6的范围内，可能会改变引物之间的构型，导致扩增片段长度出现差异，影响后续使用时的检测结果的准确性。
28.根据本发明的一些实施例，所述核苷酸变化包括核苷酸交换或核苷酸互换。
29.根据本发明的一些实施例，所述步骤s3中，所述m和所述n分别独立选自7～15。由此，能够实现对含目的str基因座的dna的特异性扩增。
30.根据本发明的一些实施例，所述目的str基因座为人类str基因座。
31.根据本发明的一些实施例，所述人类str基因座包括常染色体str基因座、y染色体str基因座和x染色体str基因座。
32.根据本发明的一些实施例，所述常染色体str基因座包括d5s818，d21s11，d7s820，d3s1358，vwa，d8s1179，d16s539，d6s1043，d13s317和d12s391中的至少一种。
33.根据本发明的一些实施例，所述x染色体str基因座包括dxs101、hprtb、dxs6789、dxs6800、dxs6801、dxs6809、dxs7132、dxs7424、dxs8377、dxs8378、dxs9898和dxs10011中的至少一种。
34.根据本发明的一些实施例，所述y染色体str基因座包括dys456，dys390，dys458，dys19，dys385a/b，dys393，dys391，dys439，dys635，dys392，ygatah4，dys437，dys438和dys448中的至少一种。
35.当然，本领域技术人员可以根据实际使用需求，合理选择任意本领域中任意的人类str基因座作为目标基因组，包括但不限于上述str基因座。
36.根据本发明的一些实施例，所述步骤s5中，所述克隆质粒选自pmd-t系列或puc系列质粒。
37.根据本发明的一些实施例，所述步骤s5中，所述重组质粒选自但不限于puc18、puc19、pmd19-t、pgm-t质粒、puc57、pmax或pdc315中的任意一种。
38.根据本发明的第二方面实施例的str分型标准物质。由于该str分型标准物质含有上述实施例的制备方法制备得到的str分型参照物，因此至少具有上述实施例的技术方案所带来的所有有益效果。
39.根据本发明的一些实施例，所述str分型标准物质包括所述目的str基因座的不同等位基因对应的所述str分型参照物。在不影响检测准确性的前提下，本领域技术人员可以对所述目的str基因座的不同等位基因的摩尔比进行调整。
40.根据本发明的第三方面实施例的含上述实施例的制备方法制备得到的str分型参照物的重组质粒在制备str分型标准物质中的应用。该重组质粒具有良好的遗传稳定性，易于保存，使用方便。由于重组质粒含有上述实施例的制备方法制备得到的str分型参照物，因此至少具有上述实施例的技术方案所带来的所有有益效果。
41.根据本发明的一些实施例，所述重组质粒为重组克隆质粒。
42.根据本发明的一些实施例，所述重组克隆质粒选自pmd-t系列或puc系列质粒。当然，本领域技术人员可以根据实际使用需求，选择本领域中任意的克隆质粒，包括但不限于自pmd-t系列或puc系列质粒。
43.根据本发明的一些实施例，所述重组质粒选自但不限于puc18、puc19、pmd19-t、pgm-t、puc57、pmax或pdc315中的任意一种。所述重组质粒还可以转化入微生物中，得到重组微生物，以进行保存。
44.根据本发明的一些实施例，所述重组微生物为大肠杆菌。
45.根据本发明的一些实施例，所述重组微生物为大肠杆菌dh5α。
46.根据本发明的一些实施例，含本发明第一方面的所述制备方法制备得到的所述str分型参照物的重组质粒在制备str分型标准物质中的应用具体为：通过对重组质粒进行pcr扩增、纯化pcr扩增产物后，获得str分型参照物，将核心序列重复次数不同的str分型参照物进行混合，即得str分型标准物质。
47.根据本发明的一些实施例，含上述重组质粒的重组微生物用于制备str分型标准物质的具体操作为：通过对重组微生物进行扩大培养、提取重组质粒、对重组质粒进行pcr扩增、纯化pcr扩增产物后，获得str分型参照物，将核心序列重复次数不同的str分型参照物进行混合，即得str分型标准物质。本领域公知的能够实现提取微生物细胞中重组质粒的方法均可采用。包括但不限于碱裂法、煮沸法、试剂盒法或其组合。
48.根据本发明的第四方面实施例的str分型产品，包括目的str基因座的引物和根据所述目的str基因座的引物使用上述实施例的制备方法制备得到的str分型参照物。
49.根据本发明实施例的str分型产品，至少具有如下有益效果：
50.利用目的str基因座的引物对待测样品的str基因座进行分型，以根据引物制备得到的str分型参照物作为参照，能够消除str分型参照物对扩增前试剂的污染。
51.根据本发明的第五方面实施例的上述实施例的str分型标准物质或上述实施例的str分型产品在亲缘鉴定、案件排查、个体识别以及尸源认定中的应用。
52.本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。
具体实施方式
53.为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案，现列举以下实施例进行说明。需要指出的是，以下实施例对本发明要求的保护范围不构成限制作用。
54.下列实施例中采用的试剂、方法和设备均为本技术领域常规试剂、方法和设备。下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。
55.一种制备基因短串联重复序列等位基因分型标准物的方法的建立
56.在本发明实施例中，以d5s818基因座作为示例进一步阐述下述基因短串联重复序列等位基因分型标准物的制备方法。本领域技术人员可以理解的是，基于本发明实施例中对于其制备方法与核心机理的公开，下述基因短串联重复序列等位基因分型标准物的制备方法不应被理解为仅限于d5s818基因座的等位基因分型标准物的制备，其适用性应包括但不限于下述的d5s818基因座。
57.d5s818基因座是一个简单的四核苷酸重复str序列，核心序列为atct。d5s818基因座的基因分型标准物的制备方法包括如下步骤：
58.(1)在ncbi中查找d5s818-12(核心序列的重复次数为12的d5s818基因座)的上下游基因序列，并针对d5s818-12设计扩增引物，包括正向引物f1和反向引物r1。
59.其中，d5s818-12及其上下游基因序列(序列id：ac026409.4，区域：98254bp～98493bp)为5
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aagtaattgtctctctcagaggaatgctttagtgctttttagccaagtgattcca atcatagccacagtttacaacatttgtatctttatctgtatccttatttatacctctatctat ctatctatctatctatctatctatctatctatctatctatcttcaaaatattacgtaaggatac caaagaggaaaatcacccttgtcacatact
tgctattaaaatatacttttattagtac-3’(seq id no.1)，下划线标记部分为短串联重复序列；
60.f1的核苷酸序列为5
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agccacagtttacaacatttgtatcttta-3’(seq id no.2)；
61.r1的核苷酸序列为5
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ggtgattttcctctttggtatcctt-3’(seq id no.3)；
62.f1和r1以人类基因组为模板扩增得到的对应序列为seq id no.1所示序列的第61-199位碱基。
63.(2)针对步骤(1)的f1和r1的3’端进行2～6个碱基的核苷酸变化，分别得到f2-xs、f2-1xs、f2-2xs、r2-xs、r2-1xs、r2-2xs和r2-3xs。
64.其中，将f1的3’端的2个碱基进行了核苷酸交换，具体为ta取代为at，得到f2-xs，其核苷酸序列为5
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agccacagtttacaacatttgtatcttat-3’(seq id no.4)；
65.将f1的3’端的4个碱基进行了核苷酸互换，具体为ttta取代为aaat，得到f2-1xs，其核苷酸序列为5
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agccacagtttacaacatttgtatcaaat-3’(seq id no.5)；
66.将f1的3’端的6个碱基进行了核苷酸互换，具体为tcttta取代为agaaat，得到f2-2xs，其核苷酸序列为5
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agccacagtttacaacatttgtaagaaat-3’(seq id no.6)；
67.将r1的3’端的2个碱基进行了核苷酸互换，具体为tt取代为aa，得到r2-xs，其核苷酸序列为5
’‑
ggtgattttcctctttggtatccaa-3’(seq id no.7)；
68.将r1的3’端的4个碱基进行了核苷酸交换，具体为cctt取代为ttcc，得到r2-1xs，其核苷酸序列为5
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ggtgattttcctctttggtatttcc-3’(seq id no.8)；
69.将r1的3’端的4个碱基进行了核苷酸互换，具体为cctt取代为ggaa，r2-2xs的核苷酸序列为5
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ggtgattttcctctttggtatggaa-3’(seq id no.9)；
70.将r1的3’端的6个碱基进行了核苷酸互换，具体为atcctt取代为taggaa，r2-3xs的核苷酸序列为5
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ggtgattttcctctttggttaggaa-3’(seq id no.10)。
71.(3)将seq id no.1所示序列中，f1对应dna序列下游的11个碱基(5
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tctgtatcctt-3’)附加在f2-xs的3’端，得f3；将seq id no.1所示序列的反向互补序列中，与r1对应的dna片段下游的13个碱基(5
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acgtaatattttg-3’)附加在r2-1xs的3’端，得r3。
72.其中，f3的核苷酸序列为5
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agccacagtttacaacatttgtatcttattctgtatcctt-3’(seq id no.11)；
73.r3的核苷酸序列为5
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ggtgattttcctctttggtatttccacgtaatattttg-3’(seq id no.12)。
74.(4)以含d5s818-8、d5s818-9、d5s818-10、d5s818-11、d5s818-12、d5s818-13、d5s818-14、d5s818-15、d5s818-16、d5s818-17、d5s818-18的str分型标准物质为模板，用f3和r3对其进行pcr扩增，扩增体系如表1所示。
75.表1
76.[0077][0078]
反应程序为：95℃2min；94℃10s，63℃1min 30s，70℃
[0079]
(5)采用ta cloning
tm
试剂盒(购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司)将步骤(4)得到的pcr产物连接到t载体上，操作过程严格按照说明书进行。
[0080]
随后将连接产物转化到大肠杆菌dh5α感受态细胞(购自天根生化科技(北京)有限公司)中，转化过程严格按说明书进行。将转化后的大肠杆菌dh5α适当稀释后涂布到麦康凯琼脂平板(购自生工生物工程(上海)股份有限公司)上，于37℃培养18h后，挑取单菌落至含有10μl如表1所示扩增体系(以纯水替代模板)的扩增管中，按步骤(4)中的反应程序进行pcr扩增，得待验证pcr产物。
[0081]
以f1和r1重复步骤(4)得到的pcr产物为阳性对照，与上述待验证pcr产物，分别跑毛细电泳，筛选出分别含有t vector/d5s818-8、t vector/d5s818-9、t vector/d5s818-10、tvector/d5s818-11、t vector/d5s818-12、t vector/d5s818-13、t vector/d5s818-14、tvector/d5s818-15、t vector/d5s818-16、t vector/d5s818-17、t vector/d5s818-18的阳性重组大肠杆菌。
[0082]
各核心序列重复数量不同的pcr产物与阳性对照相比，仅存在其在不同毛细管中进行电泳所产生的微小差异。
[0083]
通过测序，上述鉴定为阳性的重组大肠杆菌中的重组质粒中所含的str基因参照物的核苷酸序列均正确。其中，t vector/d5s818-12的str基因参照物的核苷酸序列为5
’‑
agccacagtttacaacatttgtatcttattctgtatccttatttatacctctatctatctatctatctatctatctatctatctatctatctatctatcttcaaaatattacgtggaaataccaaagaggaaaatcacc-3’(seq id no.13)。
[0084]
(6)将步骤(5)中筛选得到的重组大肠杆菌分别进行扩大培养后，用genejet质粒小提试剂盒(购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司)分别提取重组质粒t vector/d5s818-8、t vector/d5s818-9、t vector/d5s818-10、t vector/d5s818-11、t vector/d5s818-12、t vector/d5s818-13、t vector/d5s818-14、t vector/d5s818-15、t vector/d5s818-16、t vector/d5s818-17、t vector/d5s818-18。
[0085]
以上述提取得到的重组质粒分别作为模板，以f2-xs和r2-1xs对其进行pcr扩增，扩增体系如表2所示。
[0086]
表2
[0087]
组份体积10
×
pcr buffer5μldntp(各25mm)0.7μltaq酶(2.5u/μl)0.5μl
模板约10ng引物混合物(f2-xs和r2-1xs，各50μm)0.5μl纯水补足至50μl
[0088]
反应程序为95℃2min；94℃10s，63℃1min 30s，70℃30s，33个循环；63℃20min。
[0089]
将得到的扩增产物进行混合，得到str分型标准物质。其中，dna片段d5s818-8、d5s818-9、d5s818-10、d5s818-11、d5s818-12、d5s818-13、d5s818-14、d5s818-15、d5s818-16、d5s818-17、d5s818-18的以适当比例进行混合。
[0090]
(7)将步骤(6)得到的基因分型标准物进行10倍稀释，分别得到稀释100倍、1000倍、10000倍和100000倍的基因分型标准物，以稀释后的基因分型标准物和步骤(5)中的阳性对照作为模板，分别用f1和r1对其进行扩增。扩增体系如表3所示。
[0091]
表3
[0092]
组份体积10
×
pcr buffer5μldntp(各25mm)0.7μltaq酶(2.5u/μl)0.5μl模板1μl引物混合物(f1和r1，各50μm)0.5μl纯水补足至50μl
[0093]
反应程序为95℃2min；94℃10s，63℃1min 30s，70℃30s，33个循环；63℃20min。
[0094]
将得到的扩增产物分别进行毛细电泳，不同稀释倍数下的步骤(6)制备得到的str分型标准物质均未见扩增峰，而步骤(5)中的阳性对照重复步骤(6)后得到str分型标准物质，进行倍比稀释后，重复上述试验，出现了高低不等的扩增峰。这表明f1和r1不能对本实施例制备得到的str分型标准物质进行特异性扩增。
[0095]
本实施例制备得到的str分型标准物质还可以通过生物公司进行合成，其效果与上述制备方法的效果相同。
[0096]
对f2-1xs、f2-2xs、r2-xs、r2-2xs和r2-3xs做类似上述步骤(3)的改造后，选择改造后的任一正向引物和任一反向引物进行组合，重复上述步骤(4)～(7)，能够获得与f2-xs和r2-1xs相同的效果。
[0097]
上面对本发明实施例作了详细说明，但本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

技术特征：
1.一种str分型参照物的制备方法，包括以下步骤：s1：针对目的str基因座的核苷酸序列设计一对引物，包括正向引物f1和反向引物r1；s2：将所述f1的3’端的x个碱基的和所述r1的3’端的y个碱基分别进行核苷酸变化，分别得到f2和r2；所述x和y分别独立选自2～6；s3：在所述f2的3’端和所述r2的3’端分别附加m和n个碱基，分别得到f3和r3；所述f3的3’端所附加的碱基为：所述f1对应的dna序列下游的m个碱基；所述r3的3’端所附加的碱基为：所述r1对应的dna序列下游的n个碱基；s4：利用所述f3和所述r3对含所述目的str基因座的dna进行pcr扩增，得到第一pcr扩增产物；s5：将所述第一pcr扩增产物进一步连接到质粒上，得到重组质粒；s6：利用所述f2和所述r2对所述重组质粒进行扩增，得到第二pcr扩增产物，即为str分型参照物。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤s2中，所述核苷酸变化包括核苷酸交换或核苷酸互换。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤s3中，所述m选自7～15。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤s3中，所述n选自7～15。5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述目的str基因座为人类str基因座。6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述人类str基因座包括常染色体str基因座、y染色体str基因座和x染色体基因座。7.一种str分型标准物质，其特征在于，所述str分型标准物质包括权利要求1～6任一项所述的制备方法制备得到str分型参照物。8.含权利要求1～6任一项所述的制备方法制备得到的所述str分型参照物的重组质粒在制备str分型标准物质中的应用。9.一种str分型产品，其特征在于，所述str分型产品包括目的str基因座的引物和根据所述目的str基因座的引物使用权利要求1-6任一项所述的制备方法制备得到的str分型参照物。10.权利要求7所述的str分型标准物质或权利要求9所述的str分型产品在亲缘鉴定、案件排查、个体识别以及尸源认定中的应用。

技术总结
本发明公开了一种制备短串联重复序列分型参照物的方法，涉及生物医学技术领域。该方法包括以下步骤：针对目的STR基因座的核苷酸序列设计引物F1和R1；将所述F1和所述R1的3’端的碱基分别进行多个核苷酸变化后，在3’端分别附加多个碱基，分别得到F3和R3；利用所述F3和所述R3对含所述目的STR基因座的DNA进行PCR扩增后，将PCR扩增产物连接到克隆质粒上，得到重组质粒；利用所述F2和所述R2对所述重组质粒进行扩增，得到STR分型参照物。该方法工艺简单，成本低，操作难度不高，对技术人员的要求不高，易于实现，其制备得到的STR分型参照物，不会对扩增引物和模板造成污染。扩增引物和模板造成污染。


技术研发人员：何仕雯 王琪 何汝雯 程洁萍 温小莲 张兹钧
受保护的技术使用者：广东科登法医物证司法鉴定所
技术研发日：2023.04.03
技术公布日：2023/7/7