一种用于递送纳米抗体的口服硅酸盐载体的制备方法及其应用与流程

1.本发明涉及医药技术领域，特别是涉及一种用于递送纳米抗体的口服硅酸盐载体的制备方法及其应用。


背景技术：

2.肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,tnf-α)是炎症反应的主要介质，与肠道菌群紊乱密切相关，肠道菌群被认为可以调节黏膜稳态和宿主免疫。阻断tnf-α，加强黏膜屏障功能的完整性，重塑肠道微生态，对于治疗肠道疾病及调节远端肠外组织具有重要意义，有利于治疗自身免疫性和过敏性疾病。
3.以tnf-α为靶点的生物制剂(如adalimumab,infliximab,golimumab和certolizumab pegol)可以有效地中和tnf-α，从而阻断tnf-α与其受体结合，大大降低炎症反应的放大，促进粘膜愈合并增加肠道菌群多样性。然而，由于其皮下或系统注射会导致它们分布在全身。免疫原性，抗药物抗体的诱导可能增强药物清除和降低药物中和能力，导致严重的过敏反应和反应丧失。同时，长期全身给药有严重的副作用，包括感染并发症、自身免疫疾病和恶性肿瘤，如黑色素瘤。此外，治疗成本高且病人依从性差等均导致其临床应用仍受到一定的限制。因此，急需将抗tnf-α活性药物口服递送而减少抗体在外周血的暴露和免疫抑制，从而降低副作用。21世纪初，为了解决tnf-α抗体药物治疗肠炎的副作用问题，有2-3种口服tnf-α抗体进入临床前研究，但是鉴于胃部的极酸环境和肠道部位的酶降解作用，至今尚未有可用于口服的tnf-α抗体批准上市。
4.如何构建简单便捷、稳定、高效的口服纳米抗体递送系统，在低成本条件下实现体内治疗性抗体的高效递送，仍有待实现进一步研究突破。


技术实现要素：

5.针对现有技术的问题，本发明的目的是提供一种用于递送纳米抗体的口服硅酸盐载体的制备方法及其应用。
6.为达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：本发明的一种用于递送纳米抗体的口服硅酸盐载体的制备方法，包括如下步骤：
7.(1)将所述的硅酸盐与缓冲液、水或水溶液混合，得到特定浓度的蒙脱土混悬液；
8.(2)硅酸盐混悬液与纳米抗体按体积比为1：1的比例混合；
9.(3)将步骤(2)在一定温度、搅拌时间和搅拌速度下搅拌后，制得用于递送纳米抗体的口服硅酸盐载体。
10.进一步地，所述的纳米抗体通过静电及氢键作用插层或吸附进入硅酸盐的内外表面及边缘；所述的纳米抗体种属来源为骆驼科动物和/或鲨鱼科软骨鱼中的至少一种；所述的纳米抗体为单价纳米抗体、多价/多特异性纳米抗体、融合型纳米抗体中的至少一种；所述的硅酸盐为蒙脱土、萤石、凹凸棒石、高岭土、伊利石、海泡石、绿泥石或沸石中的一种或
几种的混合物。
11.进一步地，所述的骆驼科动物为骆驼、大羊驼或羊驼及其近亲物种中的任意一种；所述的鲨鱼科动物为护士鲨、斑纹须、银鲛或鳐中的任意一种；
12.所述的蒙脱土为ca
2+-蒙脱土、mg
2+-蒙脱土、k
+-蒙脱土、na
+-蒙脱土或cs
+-蒙脱土中的一种或几种的混合物；所述的蒙脱土可与有机化合物、无机化合物、有机-无机化合物形成蒙脱土层间有机化合物和蒙脱土层间无机化合物以及蒙脱土层间有机-无机化合物。
13.更进一步地，所述的有机化合物为醇、醚、酮、醛、羧酸、酸酐、酚、醌、胺、烃、芳香类、酰类或硅烷偶联剂中一种或几种的混合物；所述的有机-无机化合物为聚合羟基阳离子-有机物中的至少一种。
14.进一步地，所述的硅酸盐为蒙脱土，所述的蒙脱土和纳米抗体质量吸附比为10000-0.0001，所述的搅拌速度在100-6000rpm，所述的搅拌温度在0-37℃之间，所述的搅拌时间在0.25-3h，所述的递送纳米抗体的口服蒙脱土载体平均粒径为0.1-8μm。
15.进一步地，所述的硅烷偶联剂包括且不限于小分子硅烷偶联剂，通常以y-r-six3表示其结构，其中，x是卤素或烷氧基，式中y-r为有机硅碳功能性基团，y代表巯基、多硫基团、氨基、改性氨基、乙烯基、环氧基、氰基、异氰酸酯基、甲基丙乙烯酰氧基等功能基团中的一种或多种的组合；所述的蒙脱土和纳米抗体质量吸附比为40000:0.1。
16.所述的蒙脱土和纳米抗体质量吸附比为4000:0.1。
17.本发明所述的硅酸盐载体在制备硅酸盐纳米抗体口服递送系统中的应用。
18.本发明所述的硅酸盐纳米抗体口服递送系统在制备炎症性肠病药物中的应用，其中炎症性肠病为溃疡性结肠炎、克罗恩病或一些不常见表型的结肠炎。
19.本发明所述的硅酸盐纳米抗体口服递送系统在治疗过敏性鼻炎的应用。
20.本发明所述的硅酸盐纳米抗体口服递送系统在治疗自身免疫性疾病和过敏性疾病中的应用。
21.有益效果：本发明的硅酸盐载体可稳定负载纳米抗体，在胃肠道中保护纳米抗体，可以在肠道释放该纳米抗体，中和巨噬细胞表面的膜连tnf-α(transmembrane precursor form,mtnf)，缓解炎症症状，同时增加肠道梭状芽胞杆菌丰度，有助于诱导treg的产生，调控宿主免疫，有效缓解过敏性鼻炎小鼠过敏症状。
22.与现有的技术相比，本发明具有以下优点：
23.(1)本发明通过选择蒙脱土作为口服纳米抗体的递送载体，通过将纳米抗体插层或吸附在蒙脱石的内外表面及边缘，具有长时间保护及炎症结肠富集的作用，有效缓解炎症性肠病小鼠疾病活动指数，小鼠结肠长度明显改善，并与模型组具有统计学的差异。
24.(2)从粪便成型度来看，本发明的蒙脱石/纳米抗体口服递送体系治疗相比于模型组、蒙脱土组、纳米抗体组粪便成型度高，同时显著降低促炎细胞因子tnf-α、il-1β、il-6和il-17a的mrna表达水平，显著提高结肠组织紧密连接蛋白occludin-1、zo-1的mrna表达水平，以上共同提示，纳米抗体被蒙脱石包载后，能抵抗胃肠道复杂环境，保护纳米抗体，发挥治疗作用。同时，本发明在ova诱导的过敏性鼻炎小鼠模型中，有效减轻过敏反应。与模型组相比，给药后体重变化均不明显，均低于健康对照组。与其它给药组相比，挠鼻次数和打喷嚏次数显著减少。
25.(3)本发明的将纳米抗体插层到蒙脱石层间空间，在蒙脱石的保护下免受胃肠道
极端ph环境及消化酶的降解，在肠道或结肠炎症部位释放纳米抗体，中和结肠固有层tnf-α，改变肠道菌群组成，选择性的增加梭状芽胞杆菌(clostridia)的丰度，梭状芽胞杆菌是一种产短链脂肪酸的菌株，有助于诱导treg的产生，从而调控宿主免疫。
附图说明
26.下面将结合附图进一步说明，附图中：
27.图1a为本发明的硅酸盐/纳米抗体递送系统的构建；
28.图1b为本发明的蒙脱土/纳米抗体递送系统的构建；
29.鉴于硅酸盐/纳米抗体递送系统的效果与蒙脱土/纳米抗体递送系统效果相似，本发明主要呈现蒙脱土/纳米抗体递送系统的试验数据。
30.图2为本发明的蒙脱土/纳米抗体结合效率的表征；
31.图2a为本发明的蒙脱土/纳米抗体结合效率表征的示意图(荧光法)；图2b为本发明的蒙脱土/纳米抗体结合效率表征的示意图(bca法)
32.图3为本发明的蒙脱土/纳米抗体的粒径电势表征；
33.图3a为本发明的蒙脱土粒径表征示意图；图3b为本发明的纳米抗体粒径表征意图；图3c为本发明的蒙脱土/纳米抗体粒径表征示意图；图3d为本发明的蒙脱土/纳米抗体电势表征示意图；
34.图4为本发明的蒙脱土/纳米抗体的透射电镜表征；
35.图4a为本发明的蒙脱土透射电镜表征示意图；图4b为本发明的蒙脱土/纳米抗体(10:1)透射电镜表征示意图；图4c为本发明的蒙脱土/纳米抗体(1:1)透射电镜表征示意图；图4d为本发明的蒙脱土/纳米抗体(0.25:1)透射电镜表征示意图；
36.图5为本发明的蒙脱土/纳米抗体的扫描电镜表征；
37.图5a/e为本发明的蒙脱土透射电镜表征示意图；图5b/f为本发明的蒙脱土/纳米抗体(10:1)扫描电镜表征示意图；图5c/g为本发明的蒙脱石/纳米抗体(1:1)扫描电镜表征示意图；图5d/h为本发明的蒙脱土/纳米抗体(0.25:1)扫描电镜表征示意图；
38.图6为本发明的蒙脱土/纳米抗体的消化系统分布；
39.图7为本发明的dss诱导的肠炎小鼠模型构建与治疗
40.图7a为本发明的肠炎小鼠体重变化示意图；图7b为本发明的疾病活动指数(dai)评分示意图；图7c为本发明的结肠长度示意图；图7d为本发明的结肠图片示意图；
41.图8为本发明的dss诱导的肠炎小鼠结肠组织病理切片h&e染色；
42.图9为本发明的dss诱导的肠炎小鼠结肠组织细胞因子表达水平；
43.图10为本发明的dss诱导的肠炎小鼠结肠组织紧密连接蛋白的表达水平；
44.图11为本发明的dss诱导的肠炎小鼠肠道菌群梭状芽胞杆菌(clostridia)丰度；
45.图12为本发明的ova诱导的变应性鼻炎小鼠构建与治疗
46.图12a为本发明的变应性鼻炎小鼠体重变化示意图；图12b为本发明的变应性鼻炎小鼠挠鼻次数示意图；图12c为本发明的变应性鼻炎小鼠打喷嚏次数示意图；
47.图13为本发明的蒙脱土的官能团化修饰及粒径电势表征
48.图13a为本发明蒙脱土的官能团化修饰aptes-mmt的粒径示意图；图13b为本发明蒙脱土的官能团化修饰aptes-mmt的电势表征示意图。
具体实施方式
49.下面结合试验例和附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。
50.本发明下列试验例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。试验例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
51.除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的试验例的目的，不用于限制本发明。
52.本发明的术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤的过程、方法、装置、产品或设备没有限定于已列出的步骤或模块，而是可选地还包括没有列出的步骤，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤。
53.在本发明中提及的“多个”是指两个或两个以上。“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，a和/或b，可以表示：单独存在a，同时存在a和b，单独存在b这三种情况。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
54.实施例1
55.本发明的一种用于递送纳米抗体的口服硅酸盐载体的制备方法，包括如下步骤：
56.(1)将所述的硅酸盐与缓冲液、水或水溶液混合，得到特定浓度的蒙脱土混悬液；
57.(2)硅酸盐混悬液与纳米抗体按体积比为1：1的比例混合；
58.(3)将步骤(2)在一定温度、搅拌时间和搅拌速度下搅拌后，制得用于递送纳米抗体的口服硅酸盐载体。
59.所述的纳米抗体通过静电及氢键作用插层或吸附进入硅酸盐的内外表面及边缘；所述的纳米抗体种属来源为骆驼科动物和/或鲨鱼科软骨鱼中的至少一种；所述的纳米抗体为单价纳米抗体、多价/多特异性纳米抗体、融合型纳米抗体中的至少一种；所述的硅酸盐为蒙脱土、萤石、凹凸棒石、高岭土、伊利石、海泡石、绿泥石或沸石中的一种或几种的混合物。
60.所述的骆驼科动物为骆驼、大羊驼或羊驼及其近亲物种中的任意一种；所述的鲨鱼科动物为护士鲨、斑纹须、银鲛或鳐中的任意一种；
61.所述的蒙脱土为ca
2+-蒙脱土、mg
2+-蒙脱土、k
+-蒙脱土、na
+-蒙脱土或cs
+-蒙脱土中的一种或几种的混合物；所述的蒙脱土可与有机化合物、无机化合物、有机-无机化合物形成蒙脱土层间有机化合物和蒙脱土层间无机化合物以及蒙脱土层间有机-无机化合物。
62.所述的有机化合物为醇、醚、酮、醛、羧酸、酸酐、酚、醌、胺、烃、芳香类、酰类或硅烷偶联剂中一种或几种的混合物；所述的有机-无机化合物为聚合羟基阳离子-有机物中的至少一种。
63.所述的硅酸盐为蒙脱土，所述的蒙脱土和纳米抗体质量吸附比为10000-0.0001，所述的搅拌速度在100-6000rpm，所述的搅拌温度在0-37℃之间，所述的搅拌时间在0.25-3h，所述的递送纳米抗体的口服蒙脱土载体平均粒径为0.1-8μm。
64.所述的硅烷偶联剂包括且不限于小分子硅烷偶联剂，通常以y-r-six3表示其结构，其中，x是卤素或烷氧基，式中y-r为有机硅碳功能性基团，y代表巯基、多硫基团、氨基、
改性氨基、乙烯基、环氧基、氰基、异氰酸酯基、甲基丙乙烯酰氧基等功能基团中的一种或多种的组合；所述的蒙脱土和纳米抗体质量吸附比为40000:0.1。
65.所述的蒙脱土和纳米抗体质量吸附比为4000:0.1。
66.本发明所述的硅酸盐载体在制备硅酸盐纳米抗体口服递送系统中的应用。
67.本发明所述的硅酸盐纳米抗体口服递送系统在制备炎症性肠病药物中的应用，其中炎症性肠病为溃疡性结肠炎、克罗恩病或一些不常见表型的结肠炎。
68.本发明所述的硅酸盐纳米抗体口服递送系统在治疗过敏性鼻炎的应用。
69.本发明所述的硅酸盐纳米抗体口服递送系统在治疗自身免疫性疾病和过敏性疾病中的应用。
70.实施例2
71.实施例2与实施例1的区别在于：本发明的一种用于递送纳米抗体的口服蒙脱石载体的制备方法，纳米抗体通过静电及氢键作用插层或吸附进入硅酸盐的内外表面及边缘。
72.在其中一些试验例中，所述的蒙脱土为ca
2+-蒙脱土、mg
2+-蒙脱土、k
+-蒙脱土、na
+-蒙脱土和cs
+-蒙脱土中的一种或几种的混合物。
73.在其中一些试验例中，所述的纳米抗体种属来源包括骆驼科动物(骆驼，大羊驼，羊驼及其近亲物种)和/或鲨鱼科(护士鲨、斑纹须、银鲛、鳐等软骨鱼中的至少一种。
74.在其中一些试验例中，所述的纳米抗体为单价纳米抗体、多价/多特异性纳米抗体、融合型纳米抗体中的至少一种。
75.在其中一些试验例中，所述的蒙脱石和纳米抗体吸附比为10000-0.0001，其中优选为40000:0.1，较优选为4000:0.1，更优选为4000:1，还可以为2000.1,1000:10,500:1,200:1,120:1,100:1,80:1,50:1,25:1,20:1,12.5:1,10:1,8:1,5:1,4:1,2:1,1:1,0.75:1,0.5:1,0.25:1,0.125:1或上述任意两个具体质量比之间的范围，优选的质量比在4000:1制备的蒙脱石负载纳米抗体具有良好的稳定性。
76.在其中一些试验例中，所述的递送纳米抗体的口服蒙脱土载体平均粒径为100-8000nm，优选地，粒径范围在2000-3500nm，蒙脱土负载的纳米抗体具有良好的胃肠道稳定性。
77.本发明的一种递送纳米抗体的口服蒙脱石载体的制备方法，包括如下步骤：
78.(1)将所述的蒙脱土与缓冲液、水或水溶液混合，得到特定浓度的蒙脱土混悬液。
79.(2)蒙脱土混悬液与纳米抗体按体积比为1：1的比例混合；
80.(3)将步骤(2)在一定温度、搅拌时间和搅拌速度下搅拌后，制得蒙脱土负载的纳米抗体复合物。
81.在其中一些试验例中，搅拌速度在100-6000rpm。
82.在其中一些试验例中，搅拌温度在0-37℃之间。
83.在其中一些试验例中，搅拌时间在0.25-3h之间。
84.以下结合具体试验例对本发明进一步详细的说明：
85.试验例1
86.蒙脱土/纳米抗体递送系统的构建
87.实验材料
88.1.1.1试剂
89.蒙脱土(montmorillonite k-10)购自麦克林，磷酸盐缓冲液(phosphate-buffered saline)购自赛维尔生物(servicebio)。
90.1.1.2主要仪器
91.搅拌仪(dwb,ms-h-s10)
92.1.2实验方法
93.称取200mg的蒙脱石溶于5ml 1
×
pbs，得到40mg/ml的蒙脱石混悬液，纳米抗体(5mg/ml)的储备液稀释至(1mg/ml)，将蒙脱石混悬液(40mg/ml)与纳米抗体(1mg/ml)按体积比为1：1的比例混合，在冰水浴条件下，缓慢搅拌1h，得到蒙脱土负载的纳米抗体。
94.试验例2
95.蒙脱土/纳米抗体结合效率的表征
96.2.1实验材料
97.2.1.1试剂
98.bca试剂盒购自上海碧云天生物，纳米抗体(含荧光蛋白tagrfp)来自实验室
99.2.1.2主要仪器
100.全波长多功能酶标仪，型号safire购自瑞士tecan
101.2.2实验方法
102.荧光定量法
103.称取200mg的蒙脱土(mmt k-10)溶于1ml 1
×
pbs，得到200mg/ml的蒙脱土混悬液，并将其稀释至120mg/ml,100mg/ml，并以100mg/ml为初始母液，使用1
×
pbs往后依次对半稀释11个浓度梯度50、25、12.5、6.25、3.125、1.5625、0.78125、0.390625、0.1953125、0.09765625mg/ml，且以纳米抗体(1mg/ml)和等体积的ddh2o稀释后作为阴性对照，将此一系列浓度的mmt k-10与纳米抗体(1mg/ml)按体积比为1：1的比例混合，在冰水浴条件下，缓慢搅拌1h，得到蒙脱土负载的纳米抗体，4℃条件下12000rpm离心1min。
104.荧光定量
105.取100μl上清于corning 96well flat bottom并以mmt k-10(0mg/ml)设置为空白对照组1，以ddh2o组设为空白对照组2，设置激发波长为555nm，发射波长为583nm，通过酶标仪得到吸光度od值，通过计算得到吸附效率，计算公式为：【1-(实验组od值-空白对照组1od值)/(阴性对照组od值-空白对照组1od值)】*100％
106.bca检测法
107.称取10mg的蒙脱土(mmt k-10)溶于1ml 1
×
pbs，得到10mg/ml的蒙脱土混悬液，并将其稀释至1mg/ml。以纳米抗体(1mg/ml)为初始母液，使用1
×
pbs往后依次对半稀释8个浓度梯度1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125、0.015625、0.0078125mg/ml，且以mmt k-10(1mg/ml)和等体积的ddh2o稀释后作为空白对照，将此一系列浓度的mmt k-10与纳米抗体(1mg/ml)按体积比为1：1的比例混合，在冰水浴条件下，缓慢搅拌1h，得到蒙脱土负载的纳米抗体，4℃条件下12000rpm离心1min。
108.bca反应
109.取20μl上清于96孔板中，加入200μl bca工作液，轻轻摇匀，37℃孵育30min。
110.检测
111.反应结束后使用酶标仪在562nm处测定吸光值，绘制标准曲线，计算样品浓度。
112.2.3实验结果和分析
113.如图2结果显示，荧光定量法及bca法均表明，随着蒙脱土比例的增大，特别是比例为1:1时，蒙脱土对纳米抗体的包载达到100％。
114.试验例3
115.蒙脱石/纳米抗体的粒径电势表征
116.3.1实验材料
117.3.1.1主要仪器
118.马尔文粒径分析仪(malvern)
119.3.2实验方法
120.蒙脱土混悬液(10mg/ml)与纳米抗体(5mg/ml)按体积比为1：1的比例混合，按试验例1方法制备蒙脱石负载的纳米抗体。
121.粒径测量
122.取20μl的蒙脱土/纳米抗体，加入180μl的去离子水稀释，转移至样品池(zen0040)中，使用马尔文粒径仪测量复合物粒径大小；
123.电势测量
124.取10μl的蒙脱土/纳米抗体，加入1ml的ddh2o稀释，加入样品池(dts1070)中，使用马尔文粒径仪测量复合物粒径大小。
125.3.3实验结果和分析
126.如图3结果显示，蒙脱土粒径大小为3104.7nm，纳米抗体粒径大小为368.8nm，蒙脱土/纳米抗体粒径大小为1482.7nm；蒙脱土电势大小为-10.6mv，纳米抗体电势大小为+0.887mv，蒙脱土/纳米抗体电势大小为-28.4mv。蒙脱土包载纳米抗体后粒径变小，推测蒙脱土结合纳米抗体后，增加了分散程度，其次，从电势可以看出，纳米抗体的微正电有利于与负电的蒙脱土结合。
127.试验例4
128.蒙脱土/纳米抗体的透射电镜表征
129.4.1实验材料
130.4.1.1试剂
131.磷钨酸负染色液购自索莱宝
132.4.1.2主要仪器
133.透射电子显微镜(tem,fei philips tecnai 20)
134.4.2实验方法
135.称取200mg的蒙脱土(mmt k-10)溶于去离子水中，得到40mg/ml的蒙脱土混悬液，将40mg/ml的蒙脱土混悬液依次稀释至10mg/ml、1mg/ml、0.25mg/ml与纳米抗体(1mg/ml)按体积比为1：1的比例混合，在冰水浴条件下，缓慢搅拌1h，得到蒙脱土负载的纳米抗体。4℃条件下12000rpm离心1min，用200μl的ddh2o重悬，4℃条件下12000rpm离心1min，重复洗涤三次，最后用200μl的去离子水重悬。分别取10μl样品滴到300目铜网上，使其在铜网上浸润3-5min，用滤纸吸去剩余样品，用10μl移液枪滴入一滴磷钨酸负染色液，同样使其在铜网上浸润3-5min，用滤纸吸去剩余磷钼酸，将铜网至于烤灯下，烤干后于透射电子显微镜下成像。
136.4.3实验结果和分析
137.如图4结果显示，随着蒙脱土/纳米抗体比例的减小，即纳米抗体含量相对增多，透射电镜观察到随着纳米抗体含量的增加，纳米抗体从少量插层到蒙脱土到插层至蒙脱土的内外表面及边缘。
138.试验例5
139.蒙脱土/纳米抗体的扫描电镜表征
140.5.1.1主要仪器
141.扫描电子显微镜(sem,ssx-550,30kv)。
142.5.2实验方法
143.蒙脱土负载的纳米抗体样品制备方法参见试验例4，分别取10μl样品滴到锡箔纸上，将其置于通风橱处晾干，将含样品的锡箔纸剪成小方块并粘贴到黏结于样品座上的导电胶带上，用喷枪吹去锡箔纸上未黏牢的样品粉末，随后将样品进行喷金处理，于扫描电子显微镜下成像，并进行x射线能谱分析仪(eds)扫描表面元素。
144.5.3实验结果和分析
145.如图5结果显示，随着蒙脱土/纳米抗体比例的减小，即纳米抗体含量相对增多时，扫面电镜可以观察到蒙脱土吸附纳米抗体后产生聚集。
146.试验例6
147.蒙脱土/纳米抗体的消化系统分布
148.6.1实验材料
149.6.1.1试剂
150.cy5.5-nhs购自aladdin，4％多聚甲醛固定液、甘油明胶封片剂购自赛维尔生物(servicebio)，oct包埋剂购自leica，纳米抗体由实验室纯化制备。
151.6.1.2主要仪器
152.小动物活体成像仪(ivis lumina xr)
153.6.1.3动物来源
154.c57bl/6j小鼠购自江苏华创信诺医药科技有限公司，生产许可证scxk(苏)2020-0009。
155.6.2实验方法
156.6.2.1小动物活体成像观察(ivis)
157.6.2.1.1纳米抗体与cy5.5-nhs反应
158.称取5mg cy5.5-nhs溶解于1ml 1
×
pbs(含1％dmso),取1ml纳米抗体(5mg/ml)，加入40μlcy5.5 nhs(5mg/ml)，在nahco3(ph 8.3-9.0)水溶液中室温，过夜反应，生成稳定的酰胺键。反应结束后，于1
×
pbs中透析18h，并用3kda的超滤管进行浓缩。
159.6.2.1.2dss诱导的肠炎小鼠模型的建立与给药
160.选取c57bl/6j小鼠(雌性，6-7周，20g左右)适应喂养一周后，随机分成3组：dss模型组，纳米抗体-cy5.5+蒙脱土混合给药组(纳米抗体-cy5.5给药4h后给蒙脱土)，蒙脱土/纳米抗体-cy5.5包载组，于造模第6天给药，其中蒙脱土给药剂量为200mg/kg，纳米抗体-cy5.5给药剂量为25mg/kg。
161.灌胃给药后，于2h、6h、18h通过小动物活体成像仪(ivis)观察，并在最后一个时间
点将小鼠解剖，对小鼠不同组织器官及结肠组织成像，比较不同组织的分布及结肠富集情况。
162.6.3实验结果与分析
163.pbs无背景干扰；2h时，纳米抗体-cy5.5+蒙脱土混合给药组腹部荧光强度强于蒙脱土/纳米抗体-cy5.5包载组；6h和18h时，蒙脱土/纳米抗体-cy5.5包载组腹部荧光强度显著强于纳米抗体-cy5.5+蒙脱土混合给药组，提示，mmt包载纳米抗体-cy5.5对胃肠道蛋白酶及极端ph环境有一定的保护作用，蒙脱土/纳米抗体-cy5.5包载组在消化道及炎症结肠部位荧光强度均明显强于纳米抗体-cy5.5+蒙脱土混合给药组且主要分布在胃肠道，提示，口服给药后，抗体主要在胃肠道分布。
164.试验例7
165.dss诱导的肠炎小鼠模型的建立与治疗
166.7.1实验材料
167.7.1.1试剂
168.硫酸葡聚糖钠盐(dextran sulfate sodium salt,dss,mw:36000～50000)购自翌圣生物。
169.7.1.2动物来源
170.c57bl/6j小鼠购自江苏华创信诺医药科技有限公司，生产许可证scxk(苏)2020-0009。
171.7.2实验方法
172.7.2.1dss诱导的肠炎小鼠造模与给药
173.选取c57bl/6j小鼠(雌性，6-7周，20g左右)适应喂养一周后，随机分成5组(n＝5)：healthy control组，dss模型组，mmt组(200mg/kg)，nanobody(50μg/kg)，mmt/nanobody(200mg/kg mmt+50μg/kgnanobody)，于造模第1、7天给药，每只口服灌胃0.2ml，healthy control组小鼠给予健康饮水，其余小鼠给予3％ dss自由饮用7天，直至便血，肠炎小鼠造模成功。
174.7.2.2小鼠体重变化及dai(disease activity index)评分
175.实验期间每天观察小鼠状态，包括背毛、采食、饮水等，以及每天记录小鼠体重，观察小鼠粪样的松软度及粪样的潜血情况。根据以上指标，得出小鼠的dai评分。
176.7.2.2.1小鼠体重变化
177.小鼠体重变化用百分比表示：体重(％)＝【(实验后某天体重-实验前起始体重)/实验前起始体重+1】*100％
178.7.2.2.2dai评分
179.疾病活动指数评分细则如表1所示：
180.表1
[0181][0182]
7.2.3小鼠结肠组织病理形态改变观察
[0183]
结肠组织取出后，用预冷的pbs将肠道内容物冲洗干净，剪取1cm结肠，置于4％多聚甲醛溶液中过夜固定，30％蔗糖脱水8h，修剪组织后oct包埋，使用冰冻切片机((leica cm 1950)对以包埋的组织进行切片，切成8um厚的组织片，组织切片经过苏木素和伊红染色液染色(hematoxglin-eosin staining,he)后，于光学显微镜下观察肠道组织的结构形态。he染色具体操作如下：
[0184]
1)将制作好的冰冻切片从-80℃取出，室温平衡10min；
[0185]
2)浸入苏木素中染色1min；
[0186]
3)自来水缓慢冲洗1min洗去浮色
[0187]
4)1％的盐酸酒精分化5-10s；
[0188]
5)自来水缓慢冲洗1min，温水返蓝1min；
[0189]
6)浸入1％的伊红酒精中10s；
[0190]
7)脱水(80％、95％、100％乙醇各30s，二甲苯i、ii各1min)；
[0191]
8)中性树胶封片、晾干。
[0192]
7.2.4实时荧光定量pcr(qpcr)检测结肠组织细胞因子表达量
[0193]
一、提取结肠组织rna
[0194]
1.将1ml trizol加到30mg组织中，打磨3～4次至全溶，8000g离心5min，吸取800μl上清液；
[0195]
2.加入160μl氯仿(trizol体积的1/5)，上下颠倒混匀30下，静置5min；
[0196]
3. 12000g离心15min离心，4℃预冷；
[0197]
4.吸上清500μl并加入等体积异丙醇，上下颠倒混匀30下，静置10min；
[0198]
5. 4℃条件下12000g离心10min；
[0199]
6.弃上清，加1ml 75％乙醇(提前预冷，depc水稀释)(此步骤可冻-20℃保存)；
[0200]
7. 4℃条件下12000g离心5min，ep管底部可见白色rna沉淀；
[0201]
8.弃上清，吹干，冰上晾干5min
[0202]
9.加50μl depc水溶解rna沉淀
[0203]
10.取2μl定量
[0204]
二、rna定量
[0205]
1.取rna定量板，用2μl depc水清洗2遍
[0206]
2.用核酸检测仪检测提取完成的rna样品的浓度，并根据a260/280的数值判断rna
的纯度,a260/280的数值在1.8～2左右是最好的。
[0207]
三、逆转录成cdna
[0208]
1)rna样品于65℃水浴5min，使用toyobo revertraqpcr rt kit获取单链互补脱氧核糖核酸(cdna),逆转录反应体系如表2所示。
[0209]
表2
[0210][0211]
2)根据反应体系，配制样品于无核酶的pcr小管中。反应条件如表3所示。
[0212]
表3
[0213][0214]
3)反应结束后，将逆转录好的cdna置于-20℃保存。
[0215]
四、实时荧光定量pcr
[0216]
将逆转录完成后的cdna稀释200倍，用于配制qpcr反应体系，qpcr反应体系所需的引物序列如表4所示，所有引物序列均针对鼠源基因。
[0217]
表4
[0218][0219]
相关引物序列如表5所示：
[0220]
表5
[0221][0222][0223]
配制完成后避光条件下加入qpcr专用的96孔板，离心后，上机检测，qpcr的反应条件如表6所示：
[0224]
表6
[0225][0226]
使用applied biosystems qpcr仪相应的stepone software v2.1软件分析qpcr的扩增结果，使用2－δδct法进行样品数据的相对定量分析。
[0227]
7.2.516s核糖体rna(rrna)基因测序分析
[0228]
给药三天后，收集小鼠粪便(大于三颗)用于16s核糖体rna(rrna)基因测序分析(16s ribosomal rna(rrna)gene sequencing analysis)。
[0229]
7.3实验结果与分析
[0230]
7.3.1治疗组小鼠dai指数降低
[0231]
dss诱导的肠炎小鼠通常以体重减少为显著特征，dss造模后，模型组肠炎发生后体重下将明显，mmt治疗组、nanobody治疗组小鼠体重均下降，mmt/nanobody治疗组小鼠体重稍缓解，如图7a所示。且mmt/nanobody治疗组dai评分缓解明显(如图7b)，说明其疾病活
0009。
[0249]
8.1.3实验方法
[0250]
选取c57bl/6j小鼠(雌性，6-7周，20g左右)适应喂养一周后，随机分成6组(n＝8)：healthy control，ar模型组，nanobody组，mmt+nanobody(200mg/kg mmt+12.5mg/kg nanobody)组，mmt/nanobody(200mg/kg mmt,12.5mg/kg nanobody)。小鼠皮下注射ova/al(oh)3混悬佐剂，0.2ml/只，2天一次，连续七次。之后鼻内滴入ova溶液(10％)，10μl/侧，连续十天。在第一天和第八天鼻内滴入ova溶液前1h，每只口服灌胃0.2ml，其中英夫利西阳性对照组腹腔注射100μl。观察小鼠滴鼻10min内的抓鼻和打喷嚏次数。
[0251]
8.1.4治疗后变应性鼻炎症状缓解结果
[0252]
与其它给药组相比，mmt/nanobody组挠鼻次数和打喷嚏次数显著减少，有效缓解变应性鼻炎小鼠过敏症状。图11为本发明的变应性鼻炎小鼠体重变化，挠鼻次数，打喷嚏次数示意图。
[0253]
试验例9
[0254]
蒙脱土的官能团化修饰及粒径电势表征
[0255]
9.1实验材料
[0256]
9.1.1试剂
[0257]
3-氨基丙基三乙氧基硅烷(aptes)购自麦克林。
[0258]
9.2实验方法
[0259]
称取1g的蒙脱土溶解于100ml ddh2o中，常温搅拌30min，加入1ml aptes，在60℃下回流搅拌24h，用乙醇和ddh2o分别依次洗涤三次，收集aptes-mmt。
[0260]
9.3实验结果和分析
[0261]
利用动态光散射表征修饰后的mmt结果显示，经aptes修饰后，mmt电势从-10.6mv变为+43.3mv，粒径大小为1842.3nm。图12为本发明蒙脱土的官能团化修饰aptes-mmt的粒径及电势表征示意图。
[0262]
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述试验例的限制，上述试验例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。

技术特征：
1.一种用于递送纳米抗体的口服硅酸盐载体的制备方法，其特征在于包括如下步骤：(1)将所述的硅酸盐与缓冲液、水或水溶液混合，得到特定浓度的蒙脱土混悬液；(2)硅酸盐混悬液与纳米抗体按体积比为1：1的比例混合；(3)将步骤(2)在一定温度、搅拌时间和搅拌速度下搅拌后，制得用于递送纳米抗体的口服硅酸盐载体。2.根据权利要求1所述的用于递送纳米抗体的口服硅酸盐载体的制备方法，其特征在于：所述的纳米抗体通过静电及氢键作用插层或吸附进入硅酸盐的内外表面及边缘；所述的纳米抗体种属来源为骆驼科动物和/或鲨鱼科软骨鱼中的至少一种；所述的纳米抗体为单价纳米抗体、多价/多特异性纳米抗体、融合型纳米抗体中的至少一种；所述的硅酸盐为蒙脱土、萤石、凹凸棒石、高岭土、伊利石、海泡石、绿泥石或沸石中的一种或几种的混合物。3.根据权利要求2所述的用于递送纳米抗体的口服硅酸盐载体的制备方法，其特征在于：所述的骆驼科动物为骆驼、大羊驼或羊驼及其近亲物种中的任意一种；所述的鲨鱼科动物为护士鲨、斑纹须、银鲛或鳐中的任意一种；所述的蒙脱土为ca
2+-蒙脱土、mg
2+-蒙脱土、k
+-蒙脱土、na
+-蒙脱土或cs
+-蒙脱土中的一种或几种的混合物；所述的蒙脱土可与有机化合物、无机化合物、有机-无机化合物形成蒙脱土层间有机化合物和蒙脱土层间无机化合物以及蒙脱土层间有机-无机化合物。4.根据权利要求3所述的用于递送纳米抗体的口服硅酸盐载体的制备方法，其特征在于：所述的有机化合物为醇、醚、酮、醛、羧酸、酸酐、酚、醌、胺、烃、芳香类、酰类或硅烷偶联剂中一种或几种的混合物；所述的有机-无机化合物为聚合羟基阳离子-有机物中的至少一种。5.根据权利要求4所述的用于递送纳米抗体的口服硅酸盐载体的制备方法，其特征在于：所述的硅酸盐为蒙脱土，所述的蒙脱土和纳米抗体质量吸附比为10000-0.0001，所述的搅拌速度在100-6000rpm，所述的搅拌温度在0-37℃之间，所述的搅拌时间在0.25-3h，所述的递送纳米抗体的口服蒙脱土载体平均粒径为0.1-8μm。6.根据权利要求5所述的用于递送纳米抗体的口服硅酸盐载体的制备方法，其特征在于：所述的硅烷偶联剂包括且不限于小分子硅烷偶联剂，通常以y-r-six3表示其结构，其中，x是卤素或烷氧基，式中y-r为有机硅碳功能性基团，y代表巯基、多硫基团、氨基、改性氨基、乙烯基、环氧基、氰基、异氰酸酯基、甲基丙乙烯酰氧基等功能基团中的一种或多种的组合；所述的蒙脱土和纳米抗体质量吸附比为40000:0.1。7.权利要求1-6任一项所述的硅酸盐载体在制备硅酸盐纳米抗体口服递送系统中的应用。8.权利要求1～6任一项所述的硅酸盐纳米抗体口服递送系统在制备炎症性肠病药物中的应用，其中炎症性肠病为溃疡性结肠炎、克罗恩病或一些不常见表型的结肠炎。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：在治疗过敏性鼻炎的应用。10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：在治疗自身免疫性疾病和过敏性疾病中的应用。

技术总结
本发明公开了一种用于递送纳米抗体的口服硅酸盐载体的制备方法及其应用，包括如下步骤：(1)将所述的硅酸盐与缓冲液、水或水溶液混合，得到特定浓度的蒙脱土混悬液；(2)硅酸盐混悬液与纳米抗体按体积比为1：1的比例混合；(3)将步骤(2)在一定温度、搅拌时间和搅拌速度下搅拌后，制得用于递送纳米抗体的口服硅酸盐载体。本发明的硅酸盐载体可稳定负载纳米抗体，在胃肠道中保护纳米抗体，可以在肠道释放该纳米抗体，中和巨噬细胞表面的膜连TNF-α，缓解炎症症状，同时增加肠道梭状芽胞杆菌丰度，有助于诱导Treg的产生，调控宿主免疫，有效缓解过敏性鼻炎小鼠过敏症状。过敏性鼻炎小鼠过敏症状。过敏性鼻炎小鼠过敏症状。


技术研发人员：华子春 曹志婷 黄宝莲
受保护的技术使用者：江苏靶标生物医药研究所有限公司
技术研发日：2023.03.28
技术公布日：2023/7/7