一种I型Casposase基因插入工具及应用

一种i型casposase基因插入工具及应用
技术领域
1.本发明涉及一种i型casposase基因插入工具及应用，属于生物医药技术领域。


背景技术：

2.casposon是在某些细菌和古细菌体内新发现的一类可移动基因元件(mges)，它们与一组可变的转座子相关基因相关，如b型dna聚合酶(poly b)。这些簇的两侧是末端倒置重复序列(tirs)，周围是被称为靶位点重复(tsds)的直接重复序列等
1.。但不同于转座子系统，casposon所编码的基因中不存在将mges整合至宿主染色体的转座酶，却存在与crispr-cas1同源的“cas1”基因，这种由cas1所编码的特殊cas1即为casposase
[1,2,3]
。与来自crispr-cas系统的典型cas1基因不同，尽管在一些casposases中已经鉴定出cas4样基因，但casposases与crispr位点或其他cas基因无关。
[0003]
目前，依据比较基因组学、cas1的系统发育和分类学分布分析，casposon可分为四个家族。其中现阶段几乎所有的casposase研究均集中在2型家族的a.boonei casposase和m.mazei casposase，而其它家族的casposase研究还仅限于生物信息
[4,5]
。与ⅱ型casposase相比，i型casposase的c端天然缺失hth结构域，使得其分子量更小，进化学上更接近于crispr-cas1。目前已有文献验证
[6]
，i型家族的ca.n.koreensis casposase也可催化靶序列发生全整合反应。
[0004]
不同于crispr-cas系统需要cas1和cas2两个蛋白完成体外的整合，对于casposase催化的整合反应而言，仅依靠与crispr-cas1同源的casposase即可完成整合反应。在casposase的作用下，dstir序列可以特异性地进攻由leader和tsd序列组成的靶序列，整合通常发生在tsd序列的两侧即tsd的leader端和spacer端两个位置(如图1所示)。
[0005]
从进化学的角度来看，这种类似转座子一样的整合功能源于casposase基因中带有的polb样基因。转座子是一种能够改变其在基因组中位置的dna片段。转座子运动最突出的机制是“剪切-粘贴”转座子，在此过程中，转座子酶介导从其供体位置切除元件并重新整合到新的染色体位点(如图2所示)。在转座过程中，转座子(i)与确定转座子边界的末端倒置重复序列(tirs)中的结合位点相互作用，(ii)促进突触复合体(也称为成对端复合体(pec))的组装，(iii)催化该元素从其供体位点的切除，以及(iv)将切除的转座子整合到目标dna的新位置
[7,8]
，而这些过程都对mg
2+
离子有依赖性
[9,10]
。而casposase催化的整合反应在这些特点上均与转座子系统呈现高度相似。
[0006]
目前，基于polb基因基础上开发的转座子系统，如sleeping beauty，piggybac和tol2等，已经日渐成熟。但这些转座子工具盒长度均在1k-5k之间
[11]
(如图3所示)，使用时过于庞大，且其转座所需的转座子需在tir后添加数个元件，这也使得完成构建后的目的基因两侧携带不可避免的多余元件；且其筛选方式一般均为简单的抗性筛选，在构建时需要目的基因本身携带不同抗性基因，不方便使用。
[0007]
目前以crispr-cas9系统为代表的一系列crispr工具，虽然简单易操作，但在靶向双链断裂处精确敲入外源dna仍然很困难。想要成功精确敲入外源dna 既需要通过靶向内
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技术实现要素：

[0030]
本发明的主要目的是：克服现有技术存在的问题，提出一种i型casposase基因插入工具，能够弥补目前crispr基因插入过程中造成dna双链断裂的不足，降低体内编辑过程中由双链断裂引入的风险，更加高效安全。同时还提出该系统的应用。
[0031]
本发明解决其技术问题的技术方案如下：
[0032]
一种i型casposase基因插入工具，其特征是，由casposase蛋白、含有目的基因片段的mini-casposon、以及target-ccdb载体构成；所述casposase蛋白的氨基酸序列为seq id no.2；所述mini-casposon为dsdna，所述mini-casposon的结构为在目的基因片段的一端连有tirf序列、并在其另一端连有tirr序列，所述tirf序列的核苷酸序列为seq id no.6，所述tirr序列的核苷酸序列为seq id no.7；所述target-ccdb载体含有target基因片段和ccdb蛋白的编码基因片段，所述target基因片段的序列为seq id no.3，所述ccdb蛋白的氨基酸序列为seq id no.5，所述ccdb蛋白的编码基因片段与ccdb蛋白的氨基酸序列相对应。
[0033]
该系统利用casposase蛋白、含有特定末端倒置重复序列(tirf、tirr)的mini-casposon以及target-ccdb载体，对靶位点重复序列(tsds)进行识别与靶向插入，实现目的基因片段固定靶点固定方向插入，更加严谨；既可实现长片段基因的插入，又可确保暴露在外的dna双链在编辑过程中不会发生断裂，以避免由断裂式基因编辑带来的不可预估的脱靶与突变。
[0034]
优选地，所述mini-casposon的结构从上游至下游依次为tirf序列-目的基因片段-tirr序列；所述target-ccdb载体含有lac uv5启动子。如此可进一步优化mini-casposon的具体结构、优化target-ccdb载体的启动子。
[0035]
优选地，所述casposase蛋白的编码基因序列为seq id no.1；所述ccdb蛋白的编码基因片段序列为seq id no.4。如此可进一步优化casposase蛋白、ccdb蛋白的编码基因序列。
[0036]
优选地，所述casposase蛋白、target基因片段分别来源于ca.n.koreensi。如此可进一步优化casposase蛋白、target基因片段的具体来源。
[0037]
采用以上优选方案，可进一步优化具体细节技术特征，从而实现更好地基因插入效果。
[0038]
本发明还提出：
[0039]
一种基因插入方法，其特征是，采用前文所述i型casposase基因插入工具；
[0040]
所述基因插入方法包括以下步骤：
[0041]
第一步、制备casposase蛋白；制备含有目的基因片段的mini-casposon；构建target-ccdb载体；
[0042]
第二步、将casposase蛋白、mini-casposon、target-ccdb载体混匀反应以催化mini-casposon的整合，终止反应后回收整合产物；
[0043]
第三步、将整合产物电转至感受态细胞后，采用含抗生素的抗性培养基进行培养，收集生长出的单克隆即得含有目的基因片段的基因整合产物。
[0044]
该方法利用上述系统的casposase蛋白、含有特定末端倒置重复序列(tirf、tirr)的mini-casposon以及target-ccdb载体，对靶位点重复序列(tsds)进行识别与靶向插入，实现目的基因片段固定靶点固定方向插入；不仅能实现长片段基因的插入，又能确保dna双链在编辑过程中不会发生断裂，以避免由断裂式基因编辑带来的不可预估的脱靶与突变。
[0045]
优选地，第一步中，制备casposase蛋白的过程为：
[0046]
s1、根据casposase蛋白的氨基酸序列，构建含有casposase蛋白的编码基因序列的质粒，用化学转化法将该质粒转入感受态细胞进行培养，再提取质粒并经sanger测序确证获得正确的重组质粒；
[0047]
s2、将含有上述质粒的菌种进行诱导培养后，经破碎菌体、离心、镍柱亲和层析纯化后，获得casposase蛋白。如此可进一步优化casposase蛋白的具体制备过程。
[0048]
优选地，第一步中，制备含有目的基因片段的mini-casposon的过程为：
[0049]
根据目的基因片段设计上游扩增引物和下游扩增引物，在上游扩增引物的5’端添加tirf序列、并在下游扩增引物的5’端添加tirr序列以得到特异性引物，然后利用特异性引物通过pcr的方式扩增出结构为tirf序列-目的基因片段-tirr序列的mini-casposon，最后以切胶回收的方式获得纯化的mini-casposon。如此可进一步优化mini-casposon的具体制备过程。
[0050]
优选地，第一步中，target-ccdb载体为pet28a-lac uv5 promoter-ca.n.koreensis target-ccdb；s1中，含有casposase蛋白的编码基因序列的质粒为pet-28a-ts-sumo-ca.n.koreensis-casposase。如此可进一步优化target-ccdb载体、以及含有casposase蛋白的编码基因序列的质粒。
[0051]
优选地，第二步中，在反应体系中，casposase蛋白的终浓度为1
±
0.1μm(即μmol/l，下同)，mini-casposon的终浓度为0.2
±
0.05μm，target-ccdb载体的终浓度为65
±
5ng/μl；反应条件为在1
×
integration buffer条件下37℃
±
0.5℃反应至少60min；终止反应时加入edta以终止反应；采用pcr产物回收试剂盒回收整合产物。如此可进一步优化第二步的具体反应过程和反应参数。
[0052]
第三步中，所述感受态细胞为dh10b；电转时采用电转仪，电击参数为：2.5kv/cm，电阻200ω，电容25μf，时间5ms；电转后，先在soc无抗液体培养基中培养，再将菌液涂布在含硫酸卡那霉素的抗性平板中进行培养，正常生长出的单克隆即含有目的基因片段的基因整合产物。如此可进一步优化第三步的具体反应过程和反应参数。
[0053]
采用以上优选方案，可进一步优化具体细节技术特征，从而实现更好地基因插入效果。
[0054]
本发明还提出：
[0055]
前文所述i型casposase基因插入工具用于编辑原核生物基因或真核生物基因的
应用。
[0056]
与现有技术相比，本发明的i型casposase基因插入工具利用casposase蛋白、含有特定末端倒置重复序列(tirf、tirr)的mini-casposon以及target-ccdb载体，对靶位点重复序列(tsds)进行识别与靶向插入，实现目的基因片段固定靶点固定方向插入，可实现长片段基因的插入，并且确保暴露在外的dna双链在编辑过程中不会发生断裂，更加高效安全。
附图说明
[0057]
图1为本发明背景技术中crispr系统整合机制与ⅰ型casposase系统整合机制比较图。
[0058]
图2为本发明背景技术中转座酶介导的剪切粘贴转座概述示意图。
[0059]
图3为本发明背景技术中sleeping beauty(sb)、piggybac(pb)和tol2自主转座元件和转座酶的组织和功能域示意图。
[0060]
图4为本发明实施例1构建得到pet28a-ts-sumo-ca.n.koreensis casposase质粒图谱。
[0061]
图5为本发明实施例2中ca.n.koreensis casposase蛋白的表达与纯化结果示意图。
[0062]
图6为本发明实施例3构建得到puc19-ca.n.koreensis-target质粒图谱。
[0063]
图7为本发明实施例3中mini-casposons全整合示意图。
[0064]
图8为本发明实施例4中pet28a-lac uv5 promoter-ca.n.koreensis target-ccdb质粒图谱。
[0065]
图9为本发明实施例4中ca.n.koreensis koreensis casposase整合中tir关键位点的确定。
[0066]
图10为本发明实施例4改造后的mini-casposon示意图。
[0067]
图11为本发明实施例5构建得到pltduet-p3c-cas2cas3质粒图谱。
[0068]
图12为本发明实施例5中7k-pltduet-mini-casposon全整合后的sanger测序结果图。
具体实施方式
[0069]
下面参照附图并结合实施例对本发明作进一步详细描述。但是本发明不限于所给出的例子。
[0070]
实施例1
[0071]
本实施例为构建pet28a-ts-sumo-ca.n.koreensis-casposase质粒，用于后续基因插入。
[0072]
利用pcr扩增ca.n.koreensis-casposase序列(seq id no.1)，利用载体pet28a，经酶切酶连获得重组质粒，用化学转化法将该重组质粒转入dh5α感受态；再使用plasmid extraction kit提取质粒并经sanger测序后获得正确的重组质粒。
[0073]
通过上述方法构建pet28a-ts-sumo-ca.n.koreensis-casposase质粒结构如图4所示。
[0074]
以上内容涉及的各序列如下：
[0075]
casposase蛋白的编码基因序列：seq id no.1：
[0076]
atgaccctgaagaaccagaagaaccactacaacgtgaagtttctgaaaggttatggccacagcattagcgttaaggacagcaaaatcattctgaaaagca
[0077]
accacgatccgtttagcccgccggagcaggaagagtggttcgtgaagaacatgccgtacgaaaaaattgtgctgagcggcaagggctatgttagcacc
[0078]
gaggcgctgagcctgctgagcgaaaacaaccgtaacgtgatcctgctggacaaccacggtaaaccggttaccttttgcaacggcatgatggacagcct
[0079]
gaccgcgaccaagtaccgtatggcgcaatatgataccttccgtaacccggagaaatgcgaatacctgcgtaagcagatcattagcgcgaagaaagaga
[0080]
gccaactgaaactgctgcgtctgattggtagcgagatcagcgaactgccggatagcgaacacattagcgcgaaggtgtactggaccgagttcgcgaag
[0081]
tttatcccggaaaaatatcagttccacagccgtaaccaaagccacattaccagcagcaaaaacaacgcgaccgacatcattaacgcgctgctgaactacg
[0082]
gttatagcgtgctggcgggcgagatcagcaagttcgtttgcggttttggtctggacccgtacctgggtttcatgcaccgtagccacaccggctttcaaccg
[0083]
ctggtttatgacatcattgaaccgtttcgttggctggttgactacaccgtttatagcatggcgaaccacagcagcacccgtcagcgtattaagctgaaagagt
[0084]
acagcttcaccaaagacggtaccgtggttctggaatatagcctgatcaagcgtttcctggagatgctggaacgtcagtttagccaagagcgtaaatacagc
[0085]
ttccgtcacggtaagaaaaccaaggatggcctgaaaagcgtgcaggaaatcaccgtggttaagatcattatccaaaacctggttgagtatagcaccggca
[0086]
agcagaaaagcctggaaagcaacaacttcgcgttctttgactttta
[0087]
casposase蛋白的氨基酸序列：seq id no.2：
[0088]
mtlknqknhynvkflkgyghsisvkdskiilksnhdpfsppeqeewfvknmpyekivlsgkgyv
[0089]
stealsllsennrnvilldnhgkpvtfcngmmdsltatkyrmaqydtfrnpekceylrkqiisak
[0090]
kesqlkllrligseiselpdsehisakvywtefakfipekyqfhsrnqshitssknnatdiinallny
[0091]
gysvlageiskfvcgfgldpylgfmhrshtgfqplvydiiepfrwlvdytvysmanhsstrqrik
[0092]
lkeysftkdgtvvleyslikrflemlerqfsqerkysfrhgkktkdglksvqeitvvkiiiqnlve
[0093]
ystgkqkslesnnfaffdf
[0094]
实施例2
[0095]
本实施例以实施例1为基础，对ca.n.koreensis-casposase蛋白进行纯化。
[0096]
将含pet-28a-ts-sumo-ca.n.koreensis-casposase质粒的e.coli bl21(de3)菌种，按1％(v/v)接种至含0.1％(v/v)卡那霉素的lb液体培养基中，37℃下220rpm振摇培养至od600值介于0.8-1.0之间，冰浴降温后添加终浓度0.5mm的iptg，25℃180rpm过夜培养。5000rpm离心10min收集过夜培养的细菌，以buffer a(50mm hepes ph 7.5,10％(v/v)甘油，20mm咪唑和1000mm nacl)重悬细菌沉淀。高压破菌仪破碎(800bar,10min)菌体悬液后，4℃下18000rpm离心30min弃沉淀，含有目的蛋白的上清再次离心后所得上清液作为镍柱亲和层析上样。
[0097]
于4℃上样至经buffer a预先平衡好的镍柱后，先用20个柱体积的buffer a洗去不挂柱和亲和力较低的杂蛋白，随后在室温条件下用buffer b(20mm hepes ph 7.5,4.5mnacl)洗脱10个柱体积以除去结合的核酸，最终4℃条件下用5-10个柱体积的buffer c(50mm hepes ph 7.5,1m nacl,10％(v/v)甘油和300mm咪唑)将所有目的蛋白洗脱下来。含目的蛋白的洗脱液内添加1％(w/w)sumo蛋白酶置于4℃下过夜酶切，切去sumo标签蛋白。sumo标签蛋白由于含有6
×
his可与镍柱结合，而目的蛋白由于切去了sumo标签蛋白故无法与镍柱结合而流穿。无标签的ca.n.koreensis-casposase经30k的超滤浓缩管浓缩后即可上样经buffer d(20mm hepes ph 7.5,150mm nacl和10％(v/v)glycerol)预平衡后hiload 16/60superdex 200。依据洗脱各孔的sds-page电泳鉴定结果，收集蛋白纯度较高的峰尖部分，浓缩至15mg/ml左右，置于液氮中快速冷冻后存于-80℃备用。
[0098]
相应结果如图5所示，其中，a图为ca.n.koreensis-casposase不同浓度咪唑镍柱亲和层析洗脱液sds-page分析图；泳道1:20mm咪唑洗脱液；泳道2:50mm咪唑洗脱液；泳道3:300mm咪唑洗脱液。b图为ca.n.koreensis-casposase经hiload 16/600superdex 200prep grade凝胶过滤层析图和sds-page鉴定结果，在凝胶过滤层析图中，横坐标为洗脱体积，纵坐标为相应波长的光吸收值，蛋白峰尖洗脱体积为71.51ml，箭头处的曲线为a280的蛋白吸收值变化曲线，另一曲线为a260的核酸吸收值变化曲线。由此可见，本实施例利用上述方法成功地对ca.n.koreensis-casposase蛋白进行了纯化。
[0099]
实施例3
[0100]
本实施为验证ca.n.koreensis-casposase系统具有全整合能力。
[0101]
(1)构建puc19-ca.n.koreensis-target质粒
[0102]
通过pcr方式将含有特定tsd(靶位点重复序列)的ca.n.koreensis target基因(seq id no.3)整合进标准puc19载体，同源重组后用化学转化法将重组质粒转入dh5α感受态；再使用plasmid extraction kit提取质粒经sanger测序后获得正确的重组质粒。
[0103]
通过上述方法构建puc19-ca.n.koreensis-target质粒结构如图6所示。
[0104]
涉及序列如下：
[0105]
target基因的序列：seq id no.3：
[0106][0107]
注：上述seq id no.3中，加框为tsd序列，其余为target序列。
[0108]
(2)准备mini-casposons
[0109]
以kanr抗性基因为目的整合序列，选取1k-3k不同长度的片段作为待插入的目的基因片段进行扩增，在原有上下游扩增引物末端添加长度为20nt的tir序列，得到包括kanr-tir-f、kanr-tir-1k-r、kanr-tir-2k-r、kanr-tir-3k-r在内的一系列引物，以kanr抗性基因为模板进行pcr扩增，通过对以上pcr产物切胶回收即可得到长度分别为1258bp、2151bp及3292bp含kanr抗性基因且两端带有20bp tir序列的长链dsdna即kanr-mini-casposons。
[0110]
涉及序列如下：
[0111]
tir序列：
[0112]
tagaatctttttattccgtt
[0113]
kanr-tir-f序列：
[0114]
tagaatctttttattccgttcgctgagcaataactagcataacccc
[0115]
kanr-tir-1k-r序列：
[0116]
tagaatctttttattccgttggaagagcgctgcatgcctat
[0117]
kanr-tir-2k-r序列：
[0118]
tagaatctttttattccgttctcgaccgatgcccttgagag
[0119]
kanr-tir-3k-r序列：
[0120]
tagaatctttttattccgtttttcccgcgtggtgaaccagg
[0121]
1258bp kanr-mini-casposon序列：
[0122]
tagaatctttttattccgttcgctgagcaataactagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttgctgaaacctcaggcatttgagaa
[0123]
gcacacggtcacactgcttccggtagtcaataaaccggtaaaccagcaatagacataagcggctatttaacgaccctgccctgaaccgacgacaagctg
[0124]
acgaccgggtctccgcaagtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgaattaatt
[0125]
cttagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaactgcaatttattcatatcaggattatcaataccatatttttgaaaaagccgtttctgtaatgaaggagaaaact
[0126]
caccgaggcagttccataggatggcaagatcctggtatcggtctgcgattccgactcgtccaacatcaatacaacctattaatttcccctcgtcaaaaataa
[0127]
ggttatcaagtgagaaatcaccatgagtgacgactgaatccggtgagaatggcaaaagtttatgcatttctttccagacttgttcaacaggccagccattac
[0128]
gctcgtcatcaaaatcactcgcatcaaccaaaccgttattcattcgtgattgcgcctgagcgagacgaaatacgcggtcgctgttaaaaggacaattacaa
[0129]
acaggaatcgaatgcaaccggcgcaggaacactgccagcgcatcaacaatattttcacctgaatcaggatattcttctaatacctggaatgctgttttcccg
[0130]
gggatcgcagtggtgagtaaccatgcatcatcaggagtacggataaaatgcttgatggtcggaagaggcataaattccgtcagccagtttagtctgaccat
[0131]
ctcatctgtaacatcattggcaacgctacctttgccatgtttcagaaacaactctggcgcatcgggcttcccatacaatcgatagattgtcgcacctgattgcc
[0132]
cgacattatcgcgagcccatttatacccatataaatcagcatccatgttggaatttaatcgcggcctagagcaagacgtttcccgttgaatatggctcatactc
[0133]
ttcctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggcatgcagcgctcttcc
[0134]
aacggaataaaaagattcta
[0135]
2151bp kanr-mini-casposon序列：
[0136]
tagaatctttttattccgttcgctgagcaataactagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttgctgaaacctcaggcatttgagaa
[0137]
gcacacggtcacactgcttccggtagtcaataaaccggtaaaccagcaatagacataagcggctatttaacgaccctgccctgaaccgacgacaagctg
[0138]
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[0139]
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[0140]
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[0141]
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[0142]
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[0143]
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[0144]
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[0145]
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[0146]
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[0147]
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[0148]
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[0149]
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[0150]
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[0151]
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[0152]
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[0153]
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[0154]
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[0155]
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[0156]
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[0157]
3223bp kanr-mini-casposon序列：
[0158]
tagaatctttttattccgttcgctgagcaataactagcataaccccttggggcctctaaacgggtctt
gaggggttttttgctgaaacctcaggcatttgagaa
[0159]
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[0162]
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[0163]
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[0164]
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[0165]
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[0166]
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[0167]
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[0168]
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[0169]
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[0170]
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[0171]
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[0172]
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[0173]
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[0174]
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[0175]
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[0176]
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[0177]
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[0178]
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[0179]
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[0180]
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[0181]
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[0182]
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[0183]
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[0184]
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[0185]
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[0186]
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[0187]
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[0188]
ctggaggtggcaacgccaatcagcaacgactgtttgcccgccagttgttgtgccacgcggttgggaatgtaattcagctccgccatcgccgcttccactttt
[0189]
tcccgcgttttcgcagaaacgtggctggcctggttcaccacgcgggaaaaacggaataaaaagattcta
[0190]
(3)验证ca.n-casposase系统的全整合能力
[0191]
将得到的kanr-mini-casposons与实施例2的ca.n.koreensis casposase以及上述(1)的puc19-ca.n.koreensis-target载体共同孵育，催化kanr-mini-casposons的整合反应。反应后的产物经异丙醇沉淀后，电转至electromax e.coli dh10b感受态中，涂布至含硫酸卡那霉素和氨苄青霉素的双抗平板中。双抗平板上生长的转化子即为全整合反应的产物，随机挑取若干单克隆进行sanger测序。结果如图7所示：整合反应后的质粒中存在预期的kanr-mini-casposons，这一结果表明：与crispr-cas1相似，ca.n.koreensis casposase具备催化全整合反应发生的能力。
[0192]
实施例4
[0193]
本实施例为引入ccdb毒性蛋白并改造原有ca.n.koreensis tir序列以实现mini-casposons的定向整合。
[0194]
ca.n.koreensis casposase全整合反应与crispr-cas1相似，是由mini-casposons两端携带的tir序列的3’端对tsd序列5’端发起进攻而完成的，在ca.n.koreensis casposase原系统内，由于tir序列的3’端的序列均相同，故在全整合过程中会出现不同的方向性，但这样位点特异方向随机的整合方式并不利于后续工具开发。故针对含有ca.n.koreensis target的整合目的载体和ca.n.koreensis tir同时进行改造，
引入毒性蛋白ccdb并将ca.n.koreensis tir改造成ccdb毒性蛋白的表达开关，以求开发出位点特异方向固定的基因编辑工具。
[0195]
(1)构建pet28a-lac uv5 promoter-ca.n.koreensis target-ccdb载体
[0196]
通过pcr方式将ca.n.koreensis target基因(seq id no.3)利用同源重组整合进pet28a载体，并在t7表达框末尾添加ccdb蛋白基因(seq id no.4)，又因ccdb蛋白作为噬菌体毒性蛋白在现有大肠杆菌表达体系常用载体上表达并不高，故在rbs位点后添加lac uv5启动子并保留上下游box元件以提高ccdb表达水平，重组后用化学转化法将重组质粒转入dh5α感受态；再使用plasmid extraction kit提取质粒经sanger测序后获得正确的重组质粒。通过上述方法构建pet28a-lac uv5 promoter-ca.n.koreensis target-ccdb质粒结构如附图8所示。
[0197]
涉及序列如下：
[0198]
ccdb蛋白的编码基因序列：seq id no.4：
[0199]
cagtttaaggtttacacctataaaagagagagccgttatcgtctgtttgtggatgtacagagtgatattattgacacgcccgggcgacggatggtgatcccc
[0200]
ctggccagtgcacgtctgctgtcagataaagtcccccgtgaactttacccggtggtgcatatcggggatgaaagctggcgcatgatgaccaccgatatggccagtgtgccggtctccgttatcggggaagaagtggctgatctcagccaccgcgaaaatgacatcaaaaacgccattaacctgatgttctggggaatataa
[0201]
ccdb蛋白的氨基酸序列：seq id no.5：
[0202]
qfkvytykresryrlfvdvqsdiidtpgrrmviplasarllsdkvprelypvvhigdeswrmmttdmasvpvsvigeevadlshrendiknainlmfwgi
[0203]
lac uv5启动子序列：
[0204]
tttacactttatgcttccggctcgtataatg
[0205]
(2)确认ca.n.koreensis koreensis casposase整合中tir关键位点
[0206]
为了确定参与ca.n.koreensis casposase识别的tir序列，将不同位点突变的tir与3'端6-fam和3'端cy5分别标记的单链dna退火形成的45bp双链target(由9bp leader，13bp tsd和13bp spacer组成)和ca.n.koreensis casposase共同孵育，通过不同突变体的整合活性差异判断参与整合反应的关键tir位点。先以sstir序列作为wt，对其进行逐段突变，sstir(1-25)突变体的整合活性与wt无显著差异；而位于sstir序列3'末端的26-30突变后两端的整合活性均显著降低其中l-int减少更明显；因此sstir序列中3'末端的5'-ttcta-3'motif对整合反应的活性影响最大，这表明该motif是ca.n.koreensis casposase识别sstir序列的关键区域，很可能与ca.n.koreensis casposase存在重要的相互作用。
[0207]
尽管5'-ttcta-3'motif的单碱基突变对tir的整合影响不大，但由于其全部突变后tir整合活性显著降低，因此推测位于该motif内的核苷酸序列可能存在协同或交互作用，共同影响着tir序列的整合效率。以上结果表明：与2型家族的a.boonei和m.mazei casposase对参与整合的tir核苷酸序列具有严格要求不同，ca.n.koreensis casposase对所能整合的tir具有更广的兼容性，这可能更接近于crispr-cas系统的cas1-cas2。除上述sstir外，本研究还对dstir序列进行类似的整合反应确定在tir的整合程中dstir拥有与sstir相同的ca.n.koreensis casposase识别位点。
[0208]
综上所述，如图9所示，sstir和dstir突变体的整合活性结果表明tir序列3'末端
的5'-ttcta-3'motif是其整合反应中最关键的区域。
[0209]
(3)将ca.n.koreensis casposase整合中tir改造为ccdb表达阅读框控制开关
[0210]
通过对ca.n.koreensis casposase原有20nt tir的5'端10nt进行改造，使其可在mini-casposase插入过程中在不同方向的全整合结果内发挥不同作用。改造后的tir以目标插入方向为基准方向，更名为tirf(长25nt，为上游tir)与tirr(长19nt，为下游tir)。与原有tir相比，tirr的第11、12及19位碱基发生突变，这些位点的突变将在不同方向的插入结果中变为ccdb蛋白orf中起到起始密码子或终止密码子的作用。tirf上靠近3'端的19个碱基与tirr完全相同，靠近5'端的6nt则是引入的起始密码子。如图10所示，改造后的tirf与tirr将与目的基因一起组成mini-casposon，该mini-casposon将在完成目的方向的全整合后关闭ccdb蛋白的orf，而在完成非目的方向全整合时保持ccdb的完整表达，从而使得在由不含f+质粒的工具菌种转化所得的筛选平板上，有且仅有目的方向全整合产物对应的单克隆菌落可以正常生长。
[0211]
涉及序列如下表所示：
[0212]
名称序列(5'-3')备注sstir30(1-5)tacgaatgataacggaataaaaagattcta——sstir30(6-10)atgcttactaaacggaataaaaagattcta——sstir30(11-15)atgctatgatttgccaataaaaagattcta——sstir30(16-20)atgctatgataacggttattaaagattcta——sstir30(21-25)atgctatgataacggaataatttctttcta——sstir30(1-25)tacgatactattgccttatttttctttcta——sstir30(26-30)atgctatgataacggaataaaaagaaagat——sstir30-t26aatgctatgataacggaataaaaagaatcta——sstir30-t27aatgctatgataacggaataaaaagatacta——sstir30-c28gatgctatgataacggaataaaaagattgta——sstir30-t29aatgctatgataacggaataaaaagattcaa——sstir30-a30tatgctatgataacggaataaaaagattctt——sstir30-a30catgctatgataacggaataaaaagattctc——sstir30-a30gatgctatgataacggaataaaaagattctg——tirftagaatctttacattcgtaatgcatseq id no.6tirrtacgaatgtaaagattctaseq id no.7
[0213]
实施例5
[0214]
本实施例为检测改造后的i型casposase系统在大肠杆菌表达体系内的基因全整合能力。
[0215]
(1)构建pltduet-p3c-cas2cas3载体
[0216]
随机选取两个载体(本实施例选取了prsf-duet-cas2和plenti-cas3)通过pcr方式扩增cas3蛋白orf并将其同源重组至prsf-duet-cas2载体上重组后用化学转化法将重组质粒转入dh5α感受态；再使用plasmid extraction kit提取质粒经sanger测序后获得正确的重组质粒。通过上述方法构建pltduet-p3c-cas2cas3质粒结构如图11所示。该载体为制备mini-casposon的模板载体。
[0217]
(2)制备mini-casposons
[0218]
以pltduet-p3c-cas2cas3载体为模板，选取1k-7k不同长度片段设计上下扩增引物，在原有上游扩增引物5'端添加长度为25nt的tirf序列，在原有下游扩增引物5'端添加长度为19nt的tirr序列，得到包括pltduet-tirf-f、pltduet-tirr-1k-r、pltduet-tirr-2k-r、pltduet-tirr-3k-r、pltduet-tirr-4k-r、pltduet-tirr-5k-r、pltduet-tirr-6k-r、pltduet-tirr-7k-r在内的一系列引物，随后进行pcr扩增并对pcr产物切胶回收即可得到1k/2k/3k/4k/5k/6k/7k的pltduet-mini-casposon。
[0219]
涉及序列如下：
[0220]
pltduet-tirf-f序列：
[0221]
tagaatctttacattcgtaatgcatcgctgagcaataactagcataacccc
[0222]
pltduet-tirr-1k-r序列：
[0223]
tagaatctttacattcgtaggaagagcgctgcatgcctat
[0224]
pltduet-tirr-2k-r序列：
[0225]
tagaatctttacattcgtactcgaccgatgcccttgagag
[0226]
pltduet-tirr-3k-r序列：
[0227]
tagaatctttacattcgtattaggtgaatgtgaaaccagtaacgttatacg
[0228]
pltduet-tirr-4k-r序列：
[0229]
tagaatctttacattcgtattacggaactcccaagcttatcgataaaattttg
[0230]
pltduet-tirr-5k-r序列：
[0231]
tagaatctttacattcgtattagtctgaggcacgaatcccttgg
[0232]
pltduet-tirr-6k-r序列：
[0233]
tagaatctttacattcgtattatggtccacggtagcgctgaagaa
[0234]
pltduet-tirr-7k-r序列：
[0235]
tagaatctttacattcgtattatccaggtacttaggcagctgagg
[0236]
1k-pltduet-mini-casposon序列：
[0237]
tagaatctttacattcgtacgctgagcaataactagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttgctgaaacctcaggcatttgagaa
[0238]
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[0239]
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[0240]
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[0241]
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[0242]
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[0244]
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[0249]
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[0250]
2k-pltduet-mini-casposon序列：
[0251]
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[0252]
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[0260]
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[0266]
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[0267]
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[0268]
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[0269]
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[0270]
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[0271]
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[0272]
3k-pltduet-mini-casposon序列：
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[0275]
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[0277]
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[0278]
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[0436]
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[0439]
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[0458]
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[0459]
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[0460]
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[0461]
7k-pltduet-mini-casposon序列：
[0462]
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[0463]
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[0464]
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[0488]
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[0489]
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[0490]
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[0491]
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[0492]
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[0493]
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[0494]
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[0495]
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[0496]
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[0497]
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[0498]
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[0499]
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[0500]
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[0501]
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[0502]
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[0503]
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[0504]
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[0505]
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[0506]
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[0507]
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[0508]
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[0509]
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[0510]
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[0511]
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[0512]
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[0513]
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[0514]
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[0515]
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[0516]
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[0517]
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[0518]
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[0519]
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[0520]
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[0521]
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[0522]
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[0523]
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[0524]
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[0525]
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[0526]
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[0527]
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[0528]
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[0529]
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[0530]
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[0531]
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[0532]
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[0533]
(3)验证改造后ca.n.koreensis菌株的ⅰ型casposase基因插入工具的全整合能力
[0534]
将得到的pltduet-mini-casposons与ca.n.koreensis casposase和pet28a-lac uv5promoter-ca.n.koreensis target-ccdb载体共同孵育，催化pltduet-mini-casposons的整合反应。反应后的产物经异丙醇沉淀后，电转至electromax e.coli dh10b感受态中，涂布至含硫酸卡那霉素抗性平板中。抗性平板上生长的转化子即为全整合反应的产物，随机挑取若干单克隆进行sanger测序。
[0535]
具体过程为：将各pltduet-mini-casposons(终浓度0.2μm)，ca.n.koreensis casposase(终浓度1μm)，pet28a-lac uv5 promoter-ca.n.koreensis target-ccdb(终浓度65ng/μl)分别在1
×
integration buffer(20mm hepes ph 7.5，150mm nacl，5mm mncl2和50μg/ml bsa)条件下37℃反应60min即可催化pltduet-mini-casposons的整合，随后加入50mm edta终止反应。整合产物经pcr产物回收试剂盒回收后，溶于约8μl的无菌水中。取5μl回收产物加至50μl thermo dh10b商业电转感受态中，冰浴2min，后转至到孔宽1mm提前冰浴的电转杯中，bio-rad电转仪(genepulser)按2.5kv/cm，电阻200ω，电容25μf，时间5ms电击后，冰浴30s，而后加入800μl预热soc无抗培养基，37℃下200rpm培养1h后，将菌液涂布在含硫酸卡那霉素的抗性平板中，37℃培养20h，可正常生长出的单克隆即为全整合反应的产物，随机挑取若干单克隆进行sanger测序。(注：实施例3、实施例4的相应步骤采用与本实施例相同的全整合过程参数或条件。)
[0536]
结果如图12所示：整合反应后的质粒中存在预期的pltduet-mini-casposons，最长可实现7k-pltduet-mini-casposon的整合且均为目的方向插入，结果证明了改造后的ca.n.koreensis菌株的ⅰ型casposase基因插入工具能够实现固定靶点固定方向插入，还具有可携带长片段整合的优越性。
[0537]
综合以上各实施例，本发明主要提供一种源于ca.n.koreensis菌株的ⅰ型casposase基因插入工具及其应用，不仅可以实现目的基因固定靶点固定方向插入，还可确保双链dna在编辑过程中不发生断裂降低脱靶与其他单链基因编辑技术中存在的隐患，且具有～7k大小的整合能力，这些均表明该系统的优越性，具有很大的研究与开发潜力。
[0538]
除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。

技术特征：
1.一种i型casposase基因插入工具，其特征是，由casposase蛋白、含有目的基因片段的mini-casposon、以及target-ccdb载体构成；所述casposase蛋白的氨基酸序列为seq id no.2；所述mini-casposon为dsdna，所述mini-casposon的结构为在目的基因片段的一端连有tirf序列、并在其另一端连有tirr序列，所述tirf序列的核苷酸序列为seq id no.6，所述tirr序列的核苷酸序列为seq id no.7；所述target-ccdb载体含有target基因片段和ccdb蛋白的编码基因片段，所述target基因片段的序列为seq id no.3，所述ccdb蛋白的氨基酸序列为seq id no.5，所述ccdb蛋白的编码基因片段与ccdb蛋白的氨基酸序列相对应。2.根据权利要求1所述的一种i型casposase基因插入工具，其特征是，所述mini-casposon的结构从上游至下游依次为tirf序列-目的基因片段-tirr序列；所述target-ccdb载体含有lac uv5启动子。3.根据权利要求1所述的一种i型casposase基因插入工具，其特征是，所述casposase蛋白的编码基因序列为seq id no.1；所述ccdb蛋白的编码基因片段序列为seq id no.4。4.根据权利要求1所述的一种i型casposase基因插入工具，其特征是，所述casposase蛋白、target基因片段分别来源于ca.n.koreensi。5.一种基因插入方法，其特征是，采用权利要求1至4任一项所述的一种i型casposase基因插入工具；所述基因插入方法包括以下步骤：第一步、制备casposase蛋白；制备含有目的基因片段的mini-casposon；构建target-ccdb载体；第二步、将casposase蛋白、mini-casposon、target-ccdb载体混匀反应以催化mini-casposon的整合，终止反应后回收整合产物；第三步、将整合产物电转至感受态细胞后，采用含抗生素的抗性培养基进行培养，收集生长出的单克隆即得含有目的基因片段的基因整合产物。6.根据权利要求5所述的一种基因插入方法，其特征是，第一步中，制备casposase蛋白的过程为：s1、根据casposase蛋白的氨基酸序列，构建含有casposase蛋白的编码基因序列的质粒，用化学转化法将该质粒转入感受态细胞进行培养，再提取质粒并经sanger测序确证获得正确的重组质粒；s2、将含有上述质粒的菌种进行诱导培养后，经破碎菌体、离心、镍柱亲和层析纯化后，获得casposase蛋白。7.根据权利要求5所述的一种基因插入方法，其特征是，第一步中，制备含有目的基因片段的mini-casposon的过程为：根据目的基因片段设计上游扩增引物和下游扩增引物，在上游扩增引物的5’端添加tirf序列、并在下游扩增引物的5’端添加tirr序列以得到特异性引物，然后利用特异性引物通过pcr的方式扩增出结构为tirf序列-目的基因片段-tirr序列的mini-casposon，最后以切胶回收的方式获得纯化的mini-casposon。8.根据权利要求6所述的一种基因插入方法，其特征是，第一步中，target-ccdb载体为pet28a-lac uv5 promoter-ca.n.koreensis target-ccdb；s1中，含有casposase蛋白的编码基因序列的质粒为pet-28a-ts-sumo-ca.n.koreensis-casposase。
9.根据权利要求5所述的一种基因插入方法，其特征是，第二步中，在反应体系中，casposase蛋白的终浓度为1
±
0.1μm，mini-casposon的终浓度为0.2
±
0.05μm，target-ccdb载体的终浓度为65
±
5ng/μl；反应条件为在1
×
integration buffer条件下37℃
±
0.5℃反应至少60min；终止反应时加入edta以终止反应；采用pcr产物回收试剂盒回收整合产物；第三步中，所述感受态细胞为dh10b；电转时采用电转仪，电击参数为：2.5kv/cm，电阻200ω，电容25μf，时间5ms；电转后，先在soc无抗液体培养基中培养，再将菌液涂布在含硫酸卡那霉素的抗性平板中进行培养，正常生长出的单克隆即含有目的基因片段的基因整合产物。10.权利要求1至4任一项所述的一种i型casposase基因插入工具用于编辑原核生物基因或真核生物基因的应用。

技术总结
本发明涉及一种I型Casposase基因插入工具及应用。该I型Casposase基因插入工具由Casposase蛋白、含有目的基因片段的Mini-Casposon、以及target-ccdB载体构成。其应用为编辑原核生物基因或真核生物基因。本发明利用Casposase蛋白、含有特定末端倒置重复序列(TIRF、TIRR)的Mini-Casposon以及target-ccdB载体，对靶位点重复序列(TSDs)进行识别与靶向插入，实现目的基因片段固定靶点固定方向插入，可实现长片段基因的插入，并且确保暴露在外的DNA双链在编辑过程中不会发生断裂，更加高效安全。高效安全。高效安全。


技术研发人员：肖易倍 陆美玲 尹捷 任科静
受保护的技术使用者：中国药科大学
技术研发日：2023.03.28
技术公布日：2023/7/7