一种基于金簇-二氧化锰纳米片的农药荧光免疫分析法

1.本发明属于生物传感器技术和食品及环境样品质量安全监测领域，具体涉及一种荧光免疫分析体系的建立，该技术结合了酶标纳米抗体的高度特异性和金纳米簇-二氧化锰纳米片复合材料的良好荧光性能，为现场高灵敏检测农药以及监测农药在植物组织中的残留和降解动态提供一种新方法。


背景技术：

2.农药是一种化学物质，常用于保护农产品免受部分杂草、害虫与疾病的侵害，有机磷农药就属于其中一种有效杀虫剂。杀螟硫磷(fenitrothion,fnt)是一种比较常用的有机磷农药，因其成本低廉、获取容易及高效等优点，被广泛用于蔬菜、水果等作物的多种害虫防治。这种广泛的使用使其经常在水环境、陆生环境以及农产品中被检测到。杀螟硫磷不仅对植物有一定的毒性，流行病学研究也表明，长期暴露于fnt环境下可能导致dna损伤、延迟肌肉无力和降低人类精子中的浓度，甚至对下一代有影响。除此之外，杀螟硫磷在环境中积累的同时又能进入食物链，从而对生态系统构成一定威胁。因此，监测fnt在作物中的降解和残留水平是十分必要的。同时，由于食物基质中存在大量干扰物质，使得fnt的检测非常复杂。传统的酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,elisa)是一种较为简单、有选择性的农药检测方法，然而其灵敏度相对较低，无法满足越来越高的精密度分析要求。基于上述情况，迫切需要开发一种灵敏度高、抗干扰能力强的检测方法。
3.在免疫分析中，分析性能主要受到两部分的影响：具有亲和力的抗体(识别单元)和显色底物体系(信号单元)。纳米抗体与传统的单克隆和多克隆抗体相比，其溶解性与热稳定性更好、结合特异性和亲和力也更高，可以直接与酶基因片段融合形成免疫试剂，这大幅缩短了检测时间。传统的显色体系虽然易于观察、使用方便，然而其应用于检测复杂食品基质中的目标物时灵敏度较低而且受有毒显色底物的限制，如邻苯二胺(o-phenylenediamine,opd)。因此，基于荧光的免疫分析方法(fluorescence immunoassay,fia)因其优异的检测灵敏度和信号稳定性而逐渐成为传统比色免疫传感的优良替代方案。利用荧光物质取代传统比色底物，可以利用荧光物质的良好荧光特性提高检测灵敏度。金纳米团簇(gold nanoclusters,auncs)因其良好的生物相容性、光稳定性及其特殊的光学和电学特性而受到广泛关注。除上述优势外，auncs在蛋白质稳定的条件下容易合成，适合用于生物检测。目前，荧光探针和有猝灭能力的纳米材料的搭配组合已被广泛用于设计生物传感器。二氧化锰纳米片(manganese dioxide nanoflakes,mno
2 nfs))具有优异的光吸收能力、较大的表面积，并可被抗氧化剂分解，是开发传感平台的一种优秀的荧光猝灭剂。因此，我们相信在荧光免疫体系中，auncs(荧光团)和mno2 nfs(猝灭剂)的组合将具有很好的传感性能。
4.基于上述研究背景，我们提出了将荧光传感平台与免疫体系结合，利用碱性磷酸酶融合杀螟硫磷纳米抗体(the nanobody against fnt linked-alkaline phosphatase，nb-fnt-alp)提高免疫体系的识别单元亲和力从而提高抗体的选择性、检测灵敏度与抗干
扰能力，结合荧光物质的优异荧光传感特性，从而提高荧光免疫传感方法在复杂食品基质中检测痕量农药的能力。


技术实现要素：

5.本发明基于nb-fnt-alp(酶标纳米抗体)和auncs-mno2nfs(荧光底物)，开发了一种高灵敏的竞争型荧光免疫传感器。固定在96孔板上的包被抗原与fnt竞争捕获nb-fnt-alp，形成包被抗原-抗体复合物。auncs-mno2复合材料用于识别alp活性，进而评价fnt残留水平，进一步提高了检测性能。除此之外，该方法成功地用于实际样品(自来水、松花江水、苹果、白菜、生菜、大米和西红柿)中fnt的残留测定。同时，成功地利用该方法对小白菜中fnt的降解动态进行了监测。本发明通过整合nb-fnt-alp的高选择性和荧光基质auncs-mno2复合材料的良好光学特性，构建了可用于广泛目标分析的通用免疫传感器。除可以大幅度提升灵敏度外，该发明检测步骤由“两步法”(抗原-一抗-二抗)变为“一步法”(抗原-酶标纳米抗体)，缩短检测时间，并且有效提升了抗干扰能力，为监测农业和环境样品中的有害物质提供了一个强有力的工具。
6.本发明的目的可通过如下技术方案实现：
7.一种基于金簇-二氧化锰纳米片的农药荧光免疫分析法的开发，其步骤如下：
8.a.auncs-mno2复合材料的制备：
9.取四氯金酸(haucl4·
4h2o,10mmol l-1
)和牛血清白蛋白(bsa,50mg ml-1
)在37℃静置温育10min，随后将二者按体积比1:1混合。剧烈搅拌5min后，将naoh(1mol l-1
)相比于上述混合溶液体积比1:20加入上述溶液中，在37℃下持续剧烈搅拌12h。将得到的黄色auncs溶液放入透析袋(1kda)中提纯。将提纯的auncs溶液与超纯水按照体积比1:3.9混合，在室温下温和搅拌5min。随后，将氯化锰(mncl2·
4h2o,50mmol l-1
)相比于上述混合溶液1:98加入到上述溶液中，温和搅拌1h。之后，将naoh(1mol l-1
)相比于上述混合溶液体积比1:99加入上述溶液中，温和搅拌4h，得到棕色auncs-mno2溶液。最后，用透析袋(1kda)纯化auncs-mno2溶液。纯化后的auncs溶液与棕色auncs-mno2复合溶液需要在4℃下保存。
10.b.碱性磷酸酶催化活性的研究：
11.通过碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,alp)与l-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐(l-ascorbic acid-2-phosphate,aap)的催化反应生成抗坏血酸(ascorbic acid,aa)，aa可以还原mno2nfs变为mn
2+
，恢复auncs被猝灭的荧光，产生荧光信号变化，对酶催化活性进行研究。将aap(100μmol l-1
)与不同浓度的alp按体积比2:1混合，并在37℃孵育30min。然后将上述溶液、tris-hcl缓冲液(ph＝9.0,10mmol l-1
)和auncs-mno2溶液以3:1:2的比例混合，在37℃孵育10min后，将上述混合物与超纯水按照3:7比例混合。混合后，利用荧光分光光度计进行荧光测量。
12.c.检测杀螟硫磷的荧光免疫分析法：
13.用碳酸盐缓冲液(cbs,50mmol l-1
,ph＝9.6)将包被抗原稀释至1μgml-1
。于96孔板上包被抗原100μl/孔，4℃孵育过夜。用pbst(含0.05％ tween-20的10mmol l-1
pbs)洗涤3次后，每孔加入300μl牛血清白蛋白(bsa,3wt％)，37℃封闭96孔板60min。用pbst洗涤3次后，将nb-fnt-alp(663.5ngml-1
)和不同浓度的fnt按照1:1的比例加入到存在包被抗原的96孔板中。37℃孵育90min后，继续用pbst冲洗3次。然后，在37℃下将超纯水和aap(100μmol l-1
)
按照1:2的比例加入96孔板中，并反应30min。随后，将上述溶液、tris-hcl缓冲液(ph＝9.0,10mmol l-1
)和auncs-mno2溶液以3:1:2的比例混合，在37℃静置10min。然后，将得到的溶液移到1.5ml离心管中，并与超纯水按照3:7的比例混合，测量荧光值。
14.以抑制效率ie％作为反应信号，分析fnt存在水平。ie％的计算公式如下：ie％＝(f
max-f
fnt
)/(f
max-f
min
)
×
100％。式中，f
max
表示体系中不含fnt时的荧光强度，f
fnt
表示体系中存在fnt时的荧光强度，f
min
为体系中不含nb-fnt-alp和fnt的荧光强度。
15.d.食品实际样品中农药水平监测分析：
16.准备了7种样品(自来水、松花江水、苹果、大白菜、生菜、大米和番茄)来评估本发明在实际食品样品中检测农药的能力。除水样外，均质样品(0.5g)加入fnt标准溶液(0.01、1、10、100ngml-1
)，上述样品加入乙腈和水5:1混合的提取缓冲液。振摇60min后，向离心管中加入nacl(1.5g)。涡旋混合上述物质5min，让其沉淀分离。静置30min后，从样品中提取上清液，并采用建立的荧光免疫分析方法进行检测。在这之后，种植两盆小白菜，一盆作为空白对照，另一盆从种植后第8天开始，每天喷洒1次10ml fnt标准物(5.0μgml-1
)，连续喷洒两天。末次喷洒后，待小白菜表面干燥，用前述方法从小白菜的根和叶中提取fnt。然后，用本发明监测小白菜中fnt的降解水平。
17.本发明机理如下：
18.mno
2 nfs可有效猝灭auncs的荧光，因此auncs-mno2复合材料的荧光信号较低。alp可以催化aap生成aa，aa会将mno
2 nfs还原为mn
2+
，导致其失去对auncs的猝灭能力，从而恢复auncs的荧光，导致体系荧光信号提升。利用竞争型elisa，将nb-fnt-alp和fnt同时加入已经包被好抗原的96孔板中，包被抗原与fnt同时竞争nb-fnt-alp，经过洗涤后，96孔板内会留下抗原-抗体复合物，而fnt-抗体结合物会被洗涤，因此fnt存在量越多，体系中存在的nb-fnt-alp就越少，导致aa产生量降低，荧光恢复信号能力减弱。本发明结合了nb-fnt-alp的高选择性和荧光底物auncs-mno2复合材料的良好光学性能，nb-fnt-alp作为直接竞争荧光免疫的识别单元，节省了检测步骤和培养时间。该方法成功地应用于小白菜中fnt降解的精确监测。该方案可通过改变识别单元提供一种多功能的传感工具，并指明了高性能荧光免疫传感器的发展方向。此外，它还为快速和灵敏地监测农业和环境样品中的有害物质提供了一个强大的工具。
19.本发明高灵敏度源于以下特点:
20.(1)酶与纳米抗体融合形成免疫试剂，提高了结合亲和力，无需共价偶联，可提高检测灵敏度。
21.(2)低背景信号的mno2纳米片和auncs的组合有利于提高目标定量检测的灵敏度。
22.(3)auncs-mno2复合材料提供灵敏度较高的可切换荧光信号。
附图说明
23.图1：实施例1所述，auncs-mno2复合材料的制备。其中，(a)为auncs-mno2复合材料的tem图像；(b)为auncs，mno2纳米片和auncs-mno2复合材料的紫外-可见吸收光谱；(c)为mno2纳米片和auncs-mno2复合材料的红外光谱；(d)为auncs-mno2复合材料的光稳定性；(e)为auncs固定在不同浓度mno2纳米片上(0、0.125、0.25、0.375、0.5、0.75、1、1.25、1.5mm)的荧光强度。插图为(f-f1)/f与auncs-mno2nfs浓度对数的线性图。f和f1分别为auncs的荧光
强度和不同浓度auncs-mno2复合材料的荧光强度；(f)为阳光和手持紫外灯照射下auncs-mno2nfs粉末和手持紫外灯照射下auncs-mno2溶液的照片。
24.图2：实施例2所述，碱性磷酸酶催化活性的研究。其中，(a)为抗坏血酸还原auncs-mno2复合材料原理示意图；(b)为不同浓度的aap(5、10、50、100、150μmol l-1
)与alp(0、0.1、1、10、50、100u l-1
)发生交叉反应；(f2和f0分别为交叉反应的荧光强度和无alp存在时体系的荧光强度)；(c)为荧光传感平台构建的可行性。auncs-mno2、auncs-mno2+aa、auncs-mno2+aap+alp、auncs的荧光光谱；(d)为在不同浓度alp(0、0.001、0.004、0.008、0.1、0.4、0.8、1ul-1
)存在下，auncs-mno2+aap+alp体系的荧光光谱。插图为alp存在时系统的荧光强度变化趋势；(e)为(f
alp-f0)/(f-f0)与alp浓度对数的线性图(f
alp
表示不同浓度alp存在时的荧光强度)；(f)为auncs-mno2+aap体系和auncs-mno2+aap+alp体系有干扰物质(0.1μg/ml)存在下的荧光强度。
25.图3：实施例3所述，检测杀螟硫磷的荧光免疫分析法。其中，(a)为竞争免疫原理示意图；(b)为fia与elisa检测fnt的灵敏度比较；(c)为本方法检测杀螟硫磷的特异性(杀螟硫磷与其他农药的浓度皆为1.0ngml-1
)；(d)为本方法检测杀螟硫磷的抗干扰能力(杀螟硫磷与其他物质的浓度皆为1.0ngml-1
)。
26.图4：实施例4所述，食品实际样品中农药水平监测分析。其中，(a)为小白菜、叶和根的图像；(b)为fnt在叶和根中的降解情况。
具体实施方式
27.下面结合附图对本发明做进一步地说明。
28.实施例1：auncs-mno2的合成和表征
29.取四氯金酸(haucl4·
4h2o,10mmol l-1
)和牛血清白蛋白(bsa,50mg ml-1
)在37℃静置温育10min，随后将二者按体积比1:1混合。剧烈搅拌5min后，将naoh(1mol l-1
)相比于上述混合溶液体积比1:20加入上述溶液中，在37℃下持续剧烈搅拌12h。将得到的黄色auncs溶液放入透析袋(1kda)中提纯。将提纯的auncs溶液与超纯水按照体积比1:3.9混合，在室温下温和搅拌5min。随后，将氯化锰(mncl2·
4h2o,50mmol l-1
)相比于上述混合溶液1:98加入到上述溶液中，温和搅拌1h。之后，将naoh(1mol l-1
)相比于上述混合溶液体积比1:99加入上述溶液中，温和搅拌4h，得到棕色auncs-mno2溶液。最后，用透析袋(1kda)纯化auncs-mno2溶液。纯化后的auncs溶液与棕色auncs-mno2复合溶液需要在4℃下保存。auncs和auncs-mno2nfs通过日本日立透射电镜(tem)记录了形貌图像；通过岛津uv-2550紫外可见分光光度计记录紫外可见吸收光谱；在irprestige-21光谱仪上收集傅立叶变换红外(ftir)光谱；采用岛津rf-5301荧光光谱仪采集了auncs-mno2复合材料的荧光光谱，激发波长为585nm，发射波长为615～800nm，发射和激发狭缝分别固定为15nm和10nm。
30.结果如图1所示，通过透射电镜(tem)对auncs-mno2复合材料进行表征，显示出典型的带褶皱片状结构(图1a)。表面有0.21nm的明显晶格条纹，证实了auncs成功地锚定在mno2纳米片表面(图1a内插图)。紫外-可见吸收光谱显示在300～500nm处有较宽的吸收带，最大吸收峰在375nm处(图1b)，这使得mno2纳米片成为多种能量供体的有效猝灭剂。随后，傅里叶变换红外光谱(ftir)在3300cm-1
、1656cm-1
和514cm-1
处分别显示了o-h键拉伸振动、mn-o-h弯曲振动和mn-o拉伸振动的特征峰(图1c)。在150w氙灯照射下，auncs-mno2复合材
料的荧光发射强度表现出高稳定性(图1d)。在auncs-mno2复合材料中，随着mno2纳米片浓度从0增加到1.5mm，auncs的荧光强度逐渐降低(图1e)，荧光颜色由亮红色向暗红色变化明显(图1f)。以上结论充分证明auncs-mno2复合材料的成功合成。
31.实施例2：碱性磷酸酶催化活性的研究
32.取tris-hcl缓冲液(ph＝9.0,10mmol l-1
)25μl，实施例1中合成的auncs-mno2溶液50μl，抗坏血酸(50μmol l-1
)50μl，分别加入同一支离心管中，在37℃下反应10min。确定抗坏血酸的还原能力。随后，通过棋盘格法筛选aap的最佳工作浓度，不同浓度的aap与不同浓度的alp按比例2:1混合，在37℃下反应30min，将上述溶液、tris-hcl缓冲液(ph＝9.0,10mmol l-1
)和auncs-mno2溶液以3:1:2的比例混合，在37℃反应10min。在这之后，通过alp与l-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐(aap)的荧光反应对酶催化活性进行研究。将aap(100μmol l-1
)与不同浓度的alp按体积比2:1混合，并在37℃孵育30min。然后将上述溶液、tris-hcl缓冲液(ph＝9.0,10mmol l-1
)和auncs-mno2以3:1:2的比例混合，在37℃孵育10min后，将上述混合物与超纯水按照3:7比例混合。混匀后，利用荧光分光光度计进行荧光测量。
33.结果如图2所示，图2a是aa还原auncs-mno2复合材料原理示意图；图2b筛选出aap的最佳工作浓度为100μmol l-1
；图2c说明该原理可行；图2d表明，随着alp浓度的增加，体系荧光恢复的越好，并从图2e看出荧光恢复率(f
alp-f0)/(f-f0)在0.001～1.0ul-1
范围内与alp对数浓度呈良好的线性关系(r2＝0.9942)。其中，f
alp
和f0分别为体系存在和不存在alp时的荧光强度。图2f表明alp活性作用不会受到生物样品中蛋白质(牛血清白蛋白和)、氨基酸(组氨酸、谷氨酸、色氨酸和酪氨酸)、乳糖和离子(na
+
和mg
2+
)等常见物质的干扰。
34.实施例3：检测杀螟硫磷的荧光免疫分析法
35.用碳酸盐缓冲液(cbs,50mmol l-1
,ph＝9.6)将包被抗原稀释至1μgml-1
。于96孔板上包被抗原100μl/孔，4℃孵育过夜。用pbst(含0.05％ tween-20的10mmol l-1
pbs)洗涤3次后，每孔加入300μl牛血清白蛋白(bsa,3wt％)，37℃封闭96孔板60min。用pbst洗涤3次后，将nb-fnt-alp(663.5ngml-1
)和不同浓度的fnt按照1:1的比例加入到存在包被抗原的96孔板中。37℃孵育90min后，继续用pbst冲洗3次。然后，在37℃下将超纯水和l-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐(aap,100μmol l-1
)按照1:2的比例加入96孔板中，并反应30min。随后，将上述溶液、tris-hcl缓冲液(ph＝9.0,10mmol l-1
)和auncs-mno2溶液以3:1:2的比例混合，在37℃静置10min。然后，将得到的溶液移到1.5ml离心管中，并与超纯水按照3:7的比例混合，测量荧光值。传统elisa分析法与荧光免疫分析法区别在于，传统elisa方案在37℃孵育90min，洗涤三次后直接加入200μl显色底物4-硝基苯磷酸二钠盐六水合物(4-npp)于37℃反应30min。最后测量od值并按照分析公式进行计算。
36.以抑制效率ie％作为反应信号，分析fnt存在水平。ie％的计算公式如下：ie％＝(f
max-f
fnt
)/(f
max-f
min
)
×
100％。式中，f
max
表示体系中不含fnt时的荧光强度，f
fnt
表示体系中存在fnt时的荧光强度，f
min
为体系中不含nb-fnt-alp和fnt的荧光强度。上述公示，将荧光强度换成od值同样适用。
37.结果如图3所示，图3a展示了荧光免疫分析方法检测fnt的原理。图3b表明在0.00001～100ngml-1
浓度范围内，抑制率(ie％)随fnt浓度(r2＝0.9940)的升高而增强，fnt检测限(lod,ic10)计算为5.78pgml-1
，对比传统elisa灵敏度提升了近56倍。以速灭磷、水胺硫磷、高效氯氟氰菊酯、马拉硫磷、西维因、毒死蜱、啶虫脒、对氧磷、甲基对氧磷、吡虫啉为
对照，考察本发明构建方法的选择性。图3c中的结果清楚地表明，只有fnt(1ngml-1
)导致了显著的变化，显示出本发明对fnt的高选择性。除此之外，如图3d所示，样品中常见物质，卵清蛋白、组氨酸、谷氨酸、牛血清白蛋白、乳糖、钠离子、镁离子、色氨酸、酪氨酸不会显著影响本方法构建体系的荧光变化，表明本发明方法有良好的抗干扰能力。
38.实施例4：食品实际样品中农药水平监测分析
39.准备了7种样品(自来水、松花江水、苹果、大白菜、生菜、大米和番茄)来评估本发明在实际食品样品中检测农药的能力。除水样外，均质样品(0.5g)加入fnt标准溶液(0.01、1、10、100ngml-1
)，上述样品加入乙腈和水5:1混合的提取缓冲液。振摇60min后，向离心管中加入nacl(1.5g)。涡旋混合上述物质5min，让其沉淀分离。静置30min后，从样品中提取上清液，并采用建立的荧光免疫分析方法进行检测。这之后，种植两盆小白菜，一盆作为空白对照，另一盆从种植后第8天开始，每天喷洒1次10ml fnt标准物(5.0μgml-1
)，连续喷洒两天。末次喷洒后，待小白菜表面干燥，用前述方法从小白菜的根和叶中提取fnt。然后，用本发明监测小白菜中fnt的降解水平。
40.结果分别如表1和图4所示。表1所示，实际样品中fnt的回收率在90.49～107.21％范围内，相对标准偏差(rsd)小于7.45％，表明本发明在复杂食品和环境样品中fnt的检测具有潜在的适用性。如图4b所示，自最后一次喷洒fnt后放置3天，残留量减少了一半，说明随着生长时间的延长，叶片和根系中fnt的残留量逐渐降低。生长10天后，fnt残留量低于0.5μgg-1
，证明了fnt在小白菜中的有效代谢。图4d所示fnt降解过程遵循准一级动力学规律，叶片y＝4.3826e
(-0.2332x)
(r2＝0.9895)，根系y＝3.672e
(-0.3061x)
(r2＝0.9861)。
41.表1
42.
技术特征：
1.一种基于金簇-二氧化锰纳米片的农药荧光免疫分析法，其特征在于，其步骤如下：a.auncs-mno2复合材料的制备：取haucl4·
4h2o和bsa在37℃静置温育10min，随后将二者按体积比1:1混合，剧烈搅拌5min后，将naoh相比于上述混合溶液体积比1:20加入上述溶液中，在37℃下持续剧烈搅拌12h，将得到的黄色auncs溶液放入1kda透析袋中提纯，将提纯的auncs溶液与超纯水按照体积比1:3.9混合，在室温下温和搅拌5min，随后，将mncl2·
4h2o相比于上述混合溶液1:98加入到上述溶液中，温和搅拌1h，之后，将naoh相比于上述混合溶液体积比1:99加入上述溶液中，温和搅拌4h，得到棕色auncs-mno2溶液，最后，用1kda透析袋纯化auncs-mno2溶液，纯化后的auncs溶液与棕色auncs-mno2复合溶液需要在4℃下保存，b.碱性磷酸酶催化活性的研究：通过碱性磷酸酶与l-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐的催化反应生成抗坏血酸，抗坏血酸可以还原mno2纳米片变为mn
2+
，恢复auncs荧光，产生荧光信号变化，对酶催化活性进行研究，将l-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐与不同浓度的alp按体积比2:1混合，并在37℃孵育30min，然后将上述溶液、tris-hcl缓冲液和auncs-mno2溶液以3:1:2的比例混合，在37℃孵育10min后，将上述混合物与超纯水按照3:7比例混合，混合后，利用荧光分光光度计进行荧光测量，c.检测杀螟硫磷的荧光免疫分析法：用碳酸盐缓冲液将包被抗原稀释至1μgml-1
，于96孔板上包被抗原100μl/孔，4℃孵育过夜，用pbst洗涤3次后，每孔加入300μl牛血清白蛋白，37℃封闭96孔板60min，用pbst洗涤3次后，将nb-fnt-alp和不同浓度的fnt按照1:1的比例加入到存在包被抗原的96孔板中，37℃孵育90min后，继续用pbst冲洗3次，然后，在37℃下将超纯水和l-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐按照1:2的比例加入96孔板中，并反应30min，随后，将上述溶液、tris-hcl缓冲液和auncs-mno2溶液以3:1:2的比例混合，在37℃静置10min，然后，将得到的溶液移到1.5ml离心管中，并与超纯水按照3:7的比例混合，测量荧光值，d.食品实际样品中农药水平监测分析：准备了7种样品：自来水、松花江水、苹果、大白菜、生菜、大米和番茄，来评估本发明在实际食品样品中检测农药的能力，除水样外，均质样品加入fnt标准溶液，上述样品加入乙腈和水5:1混合的提取缓冲液，振摇60min后，向离心管中加入nacl，涡旋混合上述物质5min，让其沉淀分离，静置30min后，从样品中提取上清液，并采用建立的荧光免疫分析方法进行检测，这之后，种植两盆小白菜，一盆作为空白对照，另一盆从种植后第8天开始，连续2天，每天喷洒1次10ml fnt标准物，末次喷洒后，待小白菜表面干燥，用前述方法从小白菜的根和叶中提取fnt，然后，用本发明监测小白菜中fnt的降解水平。2.如权利要求1所述的一种基于金簇-二氧化锰纳米片的农药荧光免疫分析法，其特征在于，步骤a所述的auncs的整个合成过程在37℃下进行，auncs-mno2的整个合成过程在室温下进行。3.如权利要求1所述的一种基于金簇-二氧化锰纳米片的农药荧光免疫分析法其特征在于，步骤a所述的haucl4.4h2o浓度为10mmol l-1
，bsa浓度为50mg ml-1
，naoh浓度为1mol l-1
，mncl2.4h2o浓度为50mmol l-1
。4.如权利要求1所述的一种基于金簇-二氧化锰纳米片的农药荧光免疫分析法，其特征在于，步骤b所述的l-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐浓度为100μmol l-1
，tris-hcl缓冲液ph＝
9.0，浓度为10mmol l-1
，反应过程皆在37℃下进行。5.如权利要求1所述的一种基于金簇-二氧化锰纳米片的农药荧光免疫分析法，其特征在于，步骤b荧光测定时激发波长为585nm，发射波长为615～800nm，发射和激发狭缝分别固定为15nm和10nm。6.如权利要求1所述的一种基于金簇-二氧化锰纳米片的农药荧光免疫分析法，其特征在于，步骤b测定auncs最佳发射波长位于655nm处，mno
2 nfs最大吸收峰位于375nm处。7.如权利要求1所述的一种基于金簇-二氧化锰纳米片的农药荧光免疫分析法，其特征在于，步骤c所述的碳酸盐缓冲液浓度为50mmol l-1
,ph＝9.6；包被抗原浓度为1μgml-1
，pbst为含0.05％tween-20的10mmol l-1
pbs，nb-fnt-alp浓度为663.5ngml-1
，l-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐浓度为100μmol l-1
，tris-hcl缓冲液ph＝9.0,浓度为10mmol l-1
，反应过程皆在37℃进行。8.如权利要求1所述的一种基于金簇-二氧化锰纳米片的农药荧光免疫分析法，其特征在于，步骤d所述的乙腈和水皆为分析纯溶液。9.如权利要求1所述的一种基于金簇-二氧化锰纳米片的农药荧光免疫分析法，其特征在于，步骤d描述的喷洒10ml fnt标准物，其浓度为5.0μgml-1
。10.如权利要求1所述的一种基于金簇-二氧化锰纳米片的农药荧光免疫分析法，其特征在于，该方法可以通过改变识别单元构建检测多种农药通用方法。

技术总结
本发明公开了一种基于金簇-二氧化锰纳米片的农药荧光免疫分析法。目前，开发一项灵敏度高、抗干扰能力强的分析法检测复杂食品基质中的农药仍有挑战性。在本发明中，利用包被抗原与农药竞争识别酶标抗体。经过竞争性免疫反应后，ALP催化底物产生抗坏血酸，可触发AuNCs-MnO2NFs的分解，调节荧光反应。选择杀螟硫磷作为分析物用本方法检测。结果表明，荧光免疫分析法具有较高的检测灵敏度(IC


技术研发人员：李红霞 吕婷 王博旭 苏长顺 胡亚楠 王荷蕊 孙春燕
受保护的技术使用者：吉林大学重庆研究院
技术研发日：2023.02.07
技术公布日：2023/7/12