血清白蛋白结合多肽的制作方法

aa9(seq id no：181)(iv)，其中aa1是选自y、f、w和n的氨基酸；aa2是选自k、p、h、a和t的氨基酸；aa3是选自v、n、g、q、a和f的氨基酸；aa4是选自h、t、y、w、k、v和r的氨基酸；aa5是选自q、s、g、p和n的氨基酸；aa6是选自s、y、e、l、k和t的氨基酸；aa7是选自s、d、v和k的氨基酸；aa8是选自g、l、s、p、h、d和r的氨基酸；aa9是选自g、q、e和a的氨基酸。
20.在一些实施方案中，(xaa)m是与seq id no：57至108中任一个的氨基酸序列具有至少80％或至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，(xaa)m是seq id no：57至108中任一个的氨基酸序列。在一些实施方案中，(xaa)m是与seq id no：75、77、79、88、93、94和98中任一个的氨基酸序列具有至少80％或至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，(xaa)m是选自seq id no：75、77、79、88、93、94和98中任一个的氨基酸序列的氨基酸序列。
21.在一些实施方案中，所述氨基酸序列与seq id no：110至116和138中任一个的氨基酸序列具有至少70％同一性。在一些实施方案中，氨基酸序列包含seq id no：110至116和138中任一个的氨基酸序列。
22.在一些实施方案中，(xaa)n由式(iv)表示：aa1-aa2-aa3-aa4-aa5-aa6-aa7-aa8-aa9(iv)，其中aa1是具有中性极性亲水侧链的氨基酸；aa2是具有中性非极性疏水侧链的氨基酸；aa3是具有中性非极性疏水侧链的氨基酸；aa4是具有中性极性亲水侧链的氨基酸；aa5是具有带正电荷的极性亲水侧链的氨基酸；aa6是具有带正电荷的极性亲水侧链的氨基酸；aa7是具有中性非极性疏水侧链的氨基酸；aa8是具有中性非极性疏水侧链的氨基酸；并且aa9是具有中性非极性亲水侧链的氨基酸。
23.在一些实施方案中，(xaa)m由式(iv)表示：aa1-aa2-aa3-aa4-aa5-aa6-aa7-aa8-aa9(iv)，其中aa1是具有中性非极性疏水侧链的氨基酸；aa2是具有带正电荷的极性亲水侧链的氨基酸；aa3是具有中性非极性疏水侧链的氨基酸；aa4是具有带正电荷的极性亲水侧链的氨基酸；aa5是具有中性极性亲水侧链的氨基酸；aa6是具有中性极性亲水侧链的氨基酸；aa7是具有带负电荷的极性亲水侧链的氨基酸；aa8是具有带正电荷的极性亲水侧链的氨基酸；并且aa9是具有中性非极性亲水侧链的氨基酸。
24.在一些实施方案中，具有中性非极性亲水侧链的氨基酸选自半胱氨酸(c或cys)和甘氨酸(g或gly)；具有中性非极性疏水侧链的氨基酸选自丙氨酸(a或ala)、异亮氨酸(i或ile)、亮氨酸(l或leu)、甲硫氨酸(m或met)、苯丙氨酸(f或phe)、脯氨酸(p或pro)、色氨酸(w或trp)和缬氨酸(v或val)；具有中性极性亲水侧链的氨基酸选自天冬酰胺(n或asn)、谷氨酰胺(q或gln)、丝氨酸(s或ser)、苏氨酸(t或thr)和酪氨酸(y或tyr)；具有带正电荷的极性亲水侧链的氨基酸选自精氨酸(r或arg)、组氨酸(h或his)和赖氨酸(k或lys)；并且具有带负电荷的极性亲水侧链的氨基酸选自天冬氨酸(d或asp)和谷氨酸(e或glu)。
25.在一些实施方案中，本文提供的多肽的氨基酸序列由通式(iii)表示：
[0026][0027]
其中(xaa)n是选自seq id no：4至55中任一个或seq id no：22、24、26、35、40、41和45中任一个的氨基酸序列的氨基酸序列，和/或者(xaa)m是选自seq id no：57至108中任
一个或seq id no：75、77、79、88、93、94和98中任一个的氨基酸序列的氨基酸序列。
[0028]
在一些实施方案中，多肽的氨基酸序列包含任选地可用于化学缀合的半胱氨酸，并且任选地其中半胱氨酸位于多肽的c端或n端。
[0029]
在一些实施方案中，多肽还包含通过酰胺键共价连接以形成连续融合蛋白的异源多肽。
[0030]
在一些实施方案中，异源多肽包含治疗性多肽。
[0031]
在一些实施方案中，治疗性多肽选自激素、细胞因子、趋化因子、生长因子、止血活性多肽、酶和毒素。在一些实施方案中，治疗性多肽是对激素、细胞因子、趋化因子、生长因子、止血活性多肽、酶或毒素的拮抗剂。
[0032]
在一些实施方案中，治疗性多肽选自受体陷阱(receptor trap)和受体配体。在一些实施方案中，治疗性多肽是对受体陷阱或受体配体的拮抗剂。
[0033]
在一些实施方案中，治疗性多肽序列选自血管生成剂和抗血管生成剂。在一些实施方案中，治疗性多肽是对血管生成剂或抗血管生成剂的拮抗剂。
[0034]
在一些实施方案中，治疗性多肽序列是神经递质，例如，神经肽y。
[0035]
在一些实施方案中，治疗性多肽序列是红细胞生成刺激剂，例如红细胞生成素或红细胞生成素模拟物。
[0036]
在一些实施方案中，治疗性多肽是肠降血糖素。例如，肠降血糖素可以是胰高血糖素、抑胃肽(gastric inhibitory peptide，gip)、胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1，glp-1)、胰高血糖素样肽-2(glucagon-like peptide-1，glp-2)、肽yy(peptide yy，pyy)或胃泌酸调节素(oxyntomodulin，oxm)。
[0037]
为了进一步举例说明，在一些实施方案中，除了至少一个hsa结合性序列之外，本发明的治疗性蛋白质还包含红细胞生成素(erythropoietin，epo)多肽序列，例如seq id no：133中所示。
[0038][0039]
示例性xt/epo融合的多肽序列如seq id no：134所示，其中第一加下划线序列是分泌信号序列，并且第二加下划线序列是(g4s)n连接的epo多肽序列：
[0040][0041]
在一些实施方案中，使用epo的变体序列，其中可以作为糖基化位点的一个或更多个氨基酸残基被不作为糖基化位点的氨基酸残基替代。例如，seq id no：133的氨基酸残基asn24、asn38、asn83和serl26中的一个或更多个可以被改变，例如用asn或ser以外的氨基酸残基，例如用ala替代。示例性xt/变体epo融合的多肽序列如seq id no：135所示，其中第
一加下划线序列是分泌信号序列，并且第二加下划线序列是(g4s)n连接的变体epo多肽序列：
[0042][0043]
作为肠降血糖素-xt融合的实例，用于杜拉鲁肽或激动肽-4(exendin-4)的glp-1类似物可用于产生具有hsa结合性序列的融合蛋白，例如seq id no：136或137中所示，其中第一加下划线序列是分泌信号序列，并且第二加下划线序列是(g4s)n连接的分隔glp-1变体多肽序列与hsa结合性多肽的序列：
[0044][0045]
在一些实施方案中，多肽延长了异源多肽的体内血清半衰期。例如，异源多肽可以具有延长的半衰期，其比不与多肽连接的异源多肽的半衰期长至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍或至少30倍。
[0046]
本公开内容的另一些方面提供了例如用于人患者中之治疗用途的药物制剂，其包含本文中所述的任何多肽，以及可药用赋形剂(例如载体、缓冲剂和/或盐等)。
[0047]
本公开内容的其他方面提供了包含编码本文所述多肽的序列的多核苷酸。
[0048]
在一些实施方案中，编码多肽的序列与转录调节序列可操作地连接。转录调节序列可以是例如启动子或增强子。本文中预期了另一些转录调节序列。
[0049]
在一些实施方案中，多核苷酸还包含复制起点、微型染色体维持元件(minichromosome maintenance element，mme)和/或核定位元件。在一些实施方案中，多核苷酸还包含与编码多肽的序列可操作地连接并一起转录的多腺苷酸化信号序列。在一些实施方案中，多核苷酸还包含至少一个内含子序列。在一些实施方案中，多核苷酸还包含与编码多肽的序列一起转录的至少一个核糖体结合位点。
[0050]
在一些实施方案中，多核苷酸是脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，dna)。在一些实施方案中，多核苷酸是核糖核酸(ribonucleic acid，rna)。
[0051]
本公开内容的其他方面提供了包含本文中所述的多肽的病毒载体、
质粒和/或微环。
[0052]
本公开内容的其他方面提供了方法，所述方法包括向患有自身免疫病的对象施用本文中所述的治疗有效量的多肽。
[0053]
在一些实施方案中，本公开内容提供了包含本文中所述的任何一种多肽的融合蛋白。在一些实施方案中，融合蛋白还包含接头。在一些实施方案中，接头是刚性接头。在一些实施方案中，所述刚性接头包含seq id no：161的序列。在一些实施方案中，接头是柔性接头。在一些实施方案中，柔性接头包含seq id no：165的序列。
[0054]
在一些实施方案中，融合蛋白包含本文中所述的任一多肽中的两种。
[0055]
在一些实施方案中，融合蛋白还包含治疗性分子。在一些实施方案中，治疗性分子是治疗性多肽。在一些实施方案中，治疗性多肽选自激素、细胞因子、趋化因子、生长因子、止血活性多肽、酶和毒素，或者选自对激素、细胞因子、趋化因子、生长因子、止血活性多肽、酶和毒素的拮抗剂。
[0056]
在一些实施方案中，所述多肽包含seq id no：110的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述多肽包含seq id no：113的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述多肽包含seq id no：116的氨基酸序列。
附图说明
[0057]
图1.使用噬菌体展示选择的九个氨基酸结合环(环2和4)序列的比对。从左到右和从上到下的序列对应于seq id no：22、75、45、98、26、79、48、101、23、76、40、93、41、94、24、77、33、86、36、89、35、88、38、91、50、103、56和109。
[0058]
图2.来自血清白蛋白噬菌体选择的相似基序的结合环序列家族。从左到右和从上到下的序列对应于seq id no：169至178。
[0059]
图3a和3b.经纯化的单体血清白蛋白结合性多肽的sec-hplc(图3a)和sds-page(图3b)分析。
[0060]
图4a至4d.在ph 6.0和7.4下经纯化的血清白蛋白结合性多肽针对不同种类的血清白蛋白的octet动力学结合分析。示出了hsa-20(图4a)、hsa-31(图4b)、hsa-36(图4c)和hsa-41(图4d)。
[0061]
图5.在ph 6.0和ph 7.4下经纯化的血清白蛋白结合性蛋白针对不同种类的血清白蛋白的biacore
tm
动力学分析。
[0062]
图6.在ph 7.4下针对来自不同种类的血清白蛋白的多肽结合elisa。
[0063]
图7.在ph 6.0下针对来自不同种类的血清白蛋白的多肽结合elisa。
[0064]
图8.五种铅血清白蛋白结合性多肽在小鼠中的药代动力学谱。
[0065]
图9a和9b.在ph 7.4(图9a)和ph 6.0(图9b)下c端his标签经切割的铅克隆的octet分析。
[0066]
图10.c端his标签经切割的血清白蛋白结合性多肽在小鼠中的药代动力学谱。
[0067]
图11.经biacore
tm
调整的传感图，其表明hsa的fcrn结合不受血清白蛋白结合性
多肽的存在的影响。
[0068]
图12a.pd-l1/血清白蛋白结合性内联融合(in-line fusion，ilf)蛋白的示意图。
[0069]
图12b.在纯化后pd-l1/血清白蛋白结合性ilf蛋白的sec-hplc色谱图。
[0070]
图13.pd-l1/血清白蛋白结合三聚体ilf蛋白的示意图。
[0071]
图14.经纯化的pd-l1/血清白蛋白结合性三聚体ilf蛋白的产生和sds-page分析。
[0072]
图15.示出了ilf三聚体保留与pd-l1靶抗原和血清白蛋白二者的结合的biacore
tm
动力学分析。
[0073]
图16.示出了半衰期延长的三聚体的图，所述三聚体与人pd-l1结合(通过elisa表明)并且表现出与亲本分子ava04-251的类似结合。
[0074]
图17.示出了半衰期延长的ilf多肽的效力类似于pd-1/pd-l1阻断生物测定中的亲本分子的图。
[0075]
图18.示出了在ph 7.4下通过elisa表明的半衰期延长的ilf多肽结合与人血清白蛋白结合等同的图。
[0076]
图19.示出了ilf三聚体半衰期延长的多肽(ava04-251xt14)的混合淋巴细胞反应(mixed lymphocyte reaction，mlr)是功能性的并且在格式化时保留效力(与亲本分子相比)。
[0077]
图20.ilf半衰期延长三聚体在小鼠中的药代动力学谱。
[0078]
图21a至21c.ilf ava04-251 xt14在a375异种移植物模型中的体内效力。图21a中示出了随时间变化的单独迹线。图21b示出了按组合并的图21a中的结果。图21c示出了各组中的肿瘤体积。
[0079]
图22.来自大肠杆菌的ava04-251 xt14-cys的表达和纯化。
[0080]
图23.双人源化新生儿fc受体(neonatal fc receptor，fcrn)/白蛋白小鼠模型中hsa-41的药代动力学谱。
[0081]
图24.hsa-41、hsa-18和hsa-31在食蟹猴体内的药代动力学谱。
[0082]
图25a.抗小鼠pd-l1半衰期延长三聚体的产生和表征。
[0083]
图25b.使用biacore
tm
确定ava04-182 xt20针对小鼠pd-l1 fc的kd。
[0084]
图26a和26b.示出了在ph 7.4(图26a)和6.0(图26b)下ava04-182 xt20与msa结合的elisa。
[0085]
图26c.ava04-182和ava04-182 xt20二者的mpd-l1竞争性elisa。
[0086]
图27.ava04-182 xt20三聚体、ava04-182fc形式多肽在小鼠中的药代动力学谱。
[0087]
图28a至28c.ava04-251 bh cys ilf二聚体蛋白的示意图(图28a)和表征。图28b示出了纯度分析，以及图28c示出了sds-page分析。
[0088]
图29a和29b.使用针对hupd-l1的结合elisa，与亲本分子相比，对经荧光标记的多肽ava04-251 bh cys800(图29a)和ava04-251 xt14 cys800(图29b)的结合能力的评价。
[0089]
图30.治疗之后4小时在两个a375黑素瘤异种移植物模型中的经荧光标记的抗hupd-l1多肽的生物分布的代表性图像。
[0090]
图31a.形成自hsa与抗hsa多肽hsa-41复合物的晶体的图像。
[0091]
图31b.计算出的抗hsa多肽hsa-41与hsa复合的三维结构，其来源于蛋白质复合物的结晶。
[0092]
图31c和31d.在与hsa接触的界面处多肽的环2(图31c)与环4(图31d)残基之间的氨基酸相互作用。
[0093]
图32a.ilf同二聚体hsa-41形式的示意图。
[0094]
图32b.与单体相比，在ph 7.4与hsa结合的kd值的表。
[0095]
图32c.示出了hsa-41单体在经遗传连接以形成二聚体时对hsa的亲合力效应的biacore
tm
传感图。
[0096]
图33a至33c.hsa-41单体与血清白蛋白一起孵育，sec-hplc表征(图33a，1∶1比例；图33b，1∶2比例；图33c，1∶1叠加)。
[0097]
图34.hsa-41内联融合(ilf)二聚体与血清白蛋白一起孵育的sec-hplc表征。
[0098]
图35.hsa-41单体和ilf二聚体在c57bl/6小鼠中的药代动力学分析。
[0099]
图36.hsa-41环4敲除突变体的血清白蛋白biacore动力学分析。
[0100]
图37.使用均相时间分辨荧光(homogeneous time resolved fluorescence，htrf)测定的针对hsa-41的铅血清白蛋白结合性多肽表位分箱。
[0101]
图38a和38b.hsa-41游离c端半胱氨酸形式(gq)的sec-hplc和sds-page表征。
[0102]
图39.在ph 7.4与hsa结合的hsa-41游离c端半胱氨酸形式(cq)的biacore动力学分析。
[0103]
图40.在hsa-18半衰期延长多肽(两种不同形式：xt60和xt61)的情况下的ava04-251 xt ilf的质量控制分析(纯度)。
[0104]
图41a和41b.在ph 7.4(图41a)和ph 6.0(图41b)下xt60和xt61 ilf与hsa结合的biacore动力学分析。
[0105]
图42.在ph 7.4下xt60和xt61 ilf与has和msa的结合elisa。
[0106]
图43.在ph 6.0下针对与msa的结合的xt60和xt61 ilf biacore动力学分析。
[0107]
图44.xt60和xt61 ilf多肽与人pd-l1 fc结合的biacore动力学分析。
具体实施方式
[0108]
本公开内容基于多肽的产生，其与人血清白蛋白(hsa)结合以以受控方式延长与其缀合的任何其他治疗性分子(例如，治疗性多肽、蛋白质、核酸或药物)的血清半衰期。本文中的实验数据表明，多肽的血清半衰期可通过在体内与白蛋白结合而显著提高。
[0109]
基于已被改造以稳定地展示产生结合表面的两个环的天然存在的蛋白质(半胱氨酸蛋白酶抑制剂)，本公开内容的血清白蛋白结合性多肽提供了优于抗体、抗体片段和其他非抗体分子结合蛋白质的许多优点。一个是多肽本身的小尺寸。在其单体形式中，其为约14kda，或抗体大小的1/10。这种小尺寸使组织穿透提高的可能
性更大，特别是在不良地血管化和/或纤维化的靶组织(例如肿瘤)中。多肽具有简单的蛋白质结构(相对于多结构域抗体)，并且由于多肽不需要二硫键或其他翻译后修饰来发挥功能，因此这些多肽可以在原核和真核系统中制备。
[0110]
使用多肽文库(例如在所附实施例中描述的噬菌体展示技术)以及定向诱变，可以产生具有可调节结合动力学的多肽，其具有用于治疗用途的理想范围。例如，多肽可对hsa具有高亲和力，例如单体多肽的单数字纳摩或更低的kd，以及多价形式中的皮摩kd和亲和力。可生成多肽，其具有针对hsa的紧密结合动力学，例如在10-4
至10-5
(s-1)范围内的慢k
off
速率，这有利于靶组织定位。
[0111]
本公开内容的血清白蛋白结合性多肽包括具有极好选择性的多肽。
[0112]
此外，血清白蛋白结合性多肽可以容易地格式化，使得例如fc融合体、完整抗体融合体和内联多聚体的形式能够容易地产生和制造。
[0113]
不需要二硫键和翻译后修饰也使得包括血清白蛋白结合性多肽在内的蛋白质的许多实施方案能够通过引入到患者组织内的基因递送构建体的表达而治疗性地递送，包括其中蛋白质被全身性递送(例如来自肌肉组织的表达)或局部递送(例如通过肿瘤内基因递送)的形式。
[0114]
多肽(也简称为)是小的、高度稳定的多肽(例如蛋白质)，其是stefin多肽的重组改造变体。因此，术语“多肽”在本文中可以与术语“stefin多肽的重组改造变体”互换使用。stefin多肽是半胱氨酸蛋白酶抑制剂超家族中的蛋白质亚组，该家族是涵盖了包含多个半胱氨酸蛋白酶抑制剂样序列的蛋白质的家族。半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族的stefin亚组是相对较小的(约100个氨基酸)单结构域蛋白质。它们未接受任何已知的翻译后修饰，并且缺乏二硫键，这表明它们将能够在广泛范围的胞外和胞内环境中相同地折叠。stefin a是单体、单链、98个氨基酸的单结构域蛋白。stefin a的结构已被解出，有利于stefin a合理突变为多肽。半胱氨酸蛋白酶抑制剂的唯一已知的生物活性是抑制组织蛋白酶活性，这使得能够对经改造蛋白的剩余生物活性进行全面测试。
[0115]
多肽显示两个肽环和一个n端序列，它们都可以被随机分配以以高亲和力和特异性以与单克隆抗体相似的方式与期望的靶蛋白结合。通过stefin a蛋白支架稳定两种肽会限制肽可能采用的构象，从而与游离肽库相比提高结合亲和力和特异性。这些经改造的非抗体结合蛋白被设计成模拟单克隆抗体在不同应用中的分子识别特性。可以对stefin a多肽序列的其他部分进行改变，这种改变可以改善这些亲和试剂的性质，例如提高稳定性，使它们在例如温度和ph的一定范围内都是稳健的。在一些实施方案中，多肽包含来源于stefin a的序列，所述序列与stefin a野生型序列例如人stefin a具有显著同一性。在一些实施方案中，多肽具有与对应于人stefin a的序列共享至少25％、35％、45％、55％或60％同一性的氨基酸序列。例如，
多肽可以具有共享至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少94％、至少95％同一性的氨基酸序列，例如，其中所述序列变异不会不利地影响所述支架与期望靶标结合的能力，并且例如，其不会恢复或产生例如野生型stefin a所具有的那些生物学功能，但会恢复或产生在本文中所述的突变变化中废除的那些生物学功能。
[0116]
人血清白蛋白结合性多肽
[0117]
本公开内容的一个方面提供了结合人血清白蛋白(hsa)的affimer多肽(称为抗hsa多肽)。人血清白蛋白(hsa)是由alb基因编码的蛋白质。hsa是血清半衰期为约20天的585个氨基酸的多肽(约67kda)，并且其主要负责维持胶体渗透血压、血液ph以及许多内源和外源配体的运输和分布。hsa具有三个结构上同源的结构域(结构域i、ii和iii)，几乎完全处于α-螺旋构象，并通过17个二硫桥而高度稳定。代表性的hsa序列由uniprotkb主登录号p02768提供，并且可包括其其他人同种型。
[0118]
抗hsa多肽包含多肽，其中至少一个溶剂可及环来自野生型stefin a蛋白，其具有以使affimer多肽能够选择性地与hsa结合的氨基酸序列，并且在一些实施方案中，以10-6
m或更小的kd进行结合。
[0119]
在一些实施方案中，在ph 7.4至7.6下多肽以1
×
10-9
m至1
×
10-6
m的kd与hsa结合。在一些实施方案中，在ph 7.4至7.6下多肽以1
×
10-6
m或更小的kd与hsa结合。在一些实施方案中，在ph 7.4至7.6下多肽以1
×
10-7
m或更小的kd与hsa结合。在一些实施方案中，在ph 7.4至7.6下多肽以1
×
10-8
m或更小的kd与hsa结合。在一些实施方案中，在ph 7.4至7.6下多肽以1
×
10-9
m或更小的kd与hsa结合。在一些实施方案中，在ph 7.4下多肽以1
×
10-9
m至1
×
10-6
m的kd与hsa结合。在一些实施方案中，在ph 7.4下多肽以1
×
10-6
m或更小的kd与hsa结合。在一些实施方案中，在ph 7.4下多肽以1
×
10-7
m或更小的kd与hsa结合。在一些实施方案中，在ph 7.4下多肽以1
×
10-8
m或更小的kd与hsa结合。在一些实施方案中，在ph 7.4下多肽以1
×
10-9
m或更小的kd与hsa结合。
[0120]
在一些实施方案中，在ph 5.8至6.2下，多肽以比在ph 7.4至7.6与hsa结合的kd小半个对数至2.5个对数的kd与hsa结合。在一些实施方案中，在ph 5.8至6.2下，多肽以比在ph 7.4至7.6与hsa结合的kd小至少半个对数的kd与hsa结合。在一些实施方案中，在ph 5.8至6.2下，多肽以比在ph 7.4至7.6与hsa结合的kd小至少1个对数的kd与hsa结合。在一些实施方案中，在ph 5.8至6.2下，多肽以比在ph 7.4至7.6与hsa结合的kd小至少1.5个对数的kd与hsa结合。在一些实施方案中，在ph 5.8至6.2下，多肽以比在ph 7.4至7.6与hsa结合的kd小至少2个对数的kd与hsa结合。在一些实施方案中，在ph 5.8至6.2下，多肽以比在ph 7.4至7.6与hsa结合的kd小至少2.5个对数的kd与hsa结合。在一些实施方案中，在ph 6下，多肽以比在ph 7.4与hsa结合的kd小2.5个对数的kd与hsa结合。在一些实施方案中，在ph 6下，多肽以比在ph 7.4与hsa结合的kd小至少半个对数的kd与hsa结合。在一些实施方案中，在ph 6下，多肽以比在ph 7.4与hsa结合的kd小至少1个对数的kd与hsa结合。在一些实施方案中，在ph6下，多肽以比在ph 7.4与hsa结合的kd小至少1.5个对数的kd与hsa结合。在一些实施方案中，在ph 6下，多肽以比在ph 7.4与hsa结合的kd小至少2个对数的kd与hsa结合。在一些实施方案中，在ph 6下，多肽以比在ph 7.4与hsa结合的kd小至少2.5个对数的kd与hsa结合。
[0121]
在一些实施方案中，所述多肽在人患者中的血清半衰期大于10小时。在一些实施方案中，所述多肽在人患者中的血清半衰期大于24小时。在一些实施方案中，所述多肽在人
患者中的血清半衰期大于48小时。在一些实施方案中，所述多肽在人患者中的血清半衰期大于72小时。在一些实施方案中，所述多肽在人患者中的血清半衰期大于96小时。在一些实施方案中，所述多肽在人患者中的血清半衰期大于120小时。在一些实施方案中，所述多肽在人患者中的血清半衰期大于144小时。在一些实施方案中，所述多肽在人患者中的血清半衰期大于168小时。在一些实施方案中，所述多肽在人患者中的血清半衰期大于192小时。在一些实施方案中，所述多肽在人患者中的血清半衰期大于216小时。在一些实施方案中，所述多肽在人患者中的血清半衰期大于240小时。在一些实施方案中，所述多肽在人患者中的血清半衰期大于264小时。在一些实施方案中，所述多肽在人患者中的血清半衰期大于288小时。在一些实施方案中，所述多肽在人患者中的血清半衰期大于312小时。在一些实施方案中，所述多肽在人患者中的血清半衰期大于336小时。在一些实施方案中，所述多肽在人患者中的血清半衰期大于360小时。在一些实施方案中，所述多肽在人患者中的血清半衰期为24至360小时、48至360小时、72至360小时、96至360小时或120至360小时。
[0122]
在一些实施方案中，所述多肽在人患者中的血清半衰期为hsa的血清半衰期的大于50％、大于60％、大于70％或大于80％。在一些实施方案中，所述多肽在人患者中的血清半衰期为hsa的血清半衰期的50％至80％、50％至90％、或50％至100％。
[0123]
在一些实施方案中，抗hsa多肽来源于野生型人stefina蛋白，其具有骨架序列，并且其中环2(指定为(xaa)n)和环4(指定为(xaa)m)中的一个或两个被替代的环序列(xaa)n和(xaa)m替代，以具有通式(i)：
[0124]
fr1-(xaa)
n-fr2-(xaa)
m-fr3(i)，
[0125]
其中fr1是与mipgglseak
[0126][0127]
具有至少70％同一性的氨基酸序列；fr2是与gtnyyikvragdnkymhlkvfksl(seqidno：2)具有至少70％同一性的氨基酸序列；fr3是与edlvltgyqvdknkddeltgf(seqidno：3)：具有至少70％同一性的氨基酸序列；xaa在每次出现时是独立的氨基酸；并且n是3至20的整数，并且m是3至20的整数。
[0128]
在一些实施方案中，fr1是与seqidno：1具有80％至98％、82％至98％、84％至98％、86％至98％、88％至98％、90％至98％、92％至98％、94％至98％或96％至98％同源性的多肽序列。在一些实施方案中，fr1是与seqidno：1具有80％、82％、84％、86％、88％、90％、92％、94％、96％或95％同源性的多肽序列。在一些实施方案中，fr1是seqidno：1的多肽序列。在一些实施方案中，fr2是与seqidno：2具有至少80％至96％、84％至96％、88％至96％或92％至96％同源性的多肽序列。在一些实施方案中，fr2是与seqidno：2具有至少80％、84％、88％、92％或96％同源性的多肽序列。在一些实施方案中，fr2是与seqidno：2具有至少80％、85％、90％、95％或甚至98％同一性的多肽序列。在一些实施方案中，fr2是seqidno：2的多肽序列。在一些实施方案中，fr3是与seqidno：3具有至少80％至95％、85％至95％或90％至95％同源性的多肽序列。在一些实施方案中，fr3是与seqidno：3具有至少80％、85％、90％或95％同源性的多肽序列。在一些实施方案中，fr3是seqidno：3的多肽序列。
[0129]
在一些实施方案中，抗hsa多肽包含由通式(ii)表示的氨基酸序列：
[0130][0131]
其中xaa在每次出现时是独立的氨基酸；n是3至20的整数，并且m是3至20的整数；xaa1是gly、ala、val、arg、lys、asp或glu；xaa2是gly、ala、val、ser或thr；xaa3是arg、iys、asn、gln、ser、thr；xaa4是gly、ala、val、ser或thr；xaa5是ala、val、ile、leu、gly或pro；xaa6是gly、ala、val、asp或glu；xaa7是ala、val、ile、leu、arg或lys。
[0132]
在一些实施方案中，xaa1是gly、ala、arg或lys。在一些实施方案中，xaa1是gly或arg。在一些实施方案中，xaa2是gly、ala、val、ser或thr。在一些实施方案中，xaa2是gly或ser。在一些实施方案中，xaa3是arg、lys、asn、gln、ser、thr。在一些实施方案中，xaa3是arg、lys、asn或gln。在一些实施方案中，xaa3是lys或asn。在一些实施方案中，xaa4是gly、ala、val、ser或thr。在一些实施方案中，xaa4是gly或ser。在一些实施方案中，xaa5是ala、val、ile、leu、gly或pro。在一些实施方案中，xaa5是ile、leu或pro。在一些实施方案中，xaa5是leu或pro。在一些实施方案中，xaa6是gly、ala、val、asp或glu。在一些实施方案中，xaa6是ala、val、asp或glu。在一些实施方案中，xaa6是ala或glu。在一些实施方案中，xaa7是ala、val、ile、leu、arg或lys。在一些实施方案中，xaa7是ile、leu或arg。在一些实施方案中，xaa7是leu或arg。
[0133]
在一些实施方案中，抗hsa多肽包含由通式(iii)表示的氨基酸序列：
[0134][0135]
其中xaa在每次出现时是独立的氨基酸；n是3至20的整数，并且m是3至20的整数。在一些实施方案中，n是3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。在一些实施方案中，n是8至10、7至11、6至12、5至13、4至14或3至15。在一些实施方案中，m是3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。在一些实施方案中，m是8至10、7至11、6至12、5至13、4至14或3至15。
[0136]
在一些实施方案中，(xaa)n由式(iv)表示：
[0137]
aa1-aa2-aa3-aa4-aa5-aa6-aa7-aa8-aa9(iv)，
[0138]
其中aa1是具有中性极性亲水侧链的氨基酸；aa2是具有中性非极性疏水侧链的氨基酸；aa3是具有中性非极性疏水侧链的氨基酸；aa4是具有中性极性亲水侧链的氨基酸；aa5是具有带正电荷的极性亲水侧链的氨基酸；aa6是具有带正电荷的极性亲水侧链的氨基酸：aa7是具有中性非极性疏水侧链的氨基酸；aa8是具有中性非极性疏水侧链的氨基酸；并且aa9是具有中性非极性亲水侧链的氨基酸。
[0139]
在一些实施方案中，(xaa)m由式(v)表示：
[0140]
aa1-aa2-aa3-aa4-aa5-aa6-aa7-aa8-aa9(v)，
[0141]
其中aa1是具有中性非极性疏水侧链的氨基酸；aa2是具有带正电荷的极性亲水侧链的氨基酸；aa3是具有中性非极性疏水侧链的氨基酸；aa4是具有带正电荷的极性亲水侧链的氨基酸；aa5是具有中性极性亲水侧链的氨基酸；aa6是具有中性极性亲水侧链的氨基
酸；aa7是具有带负电荷的极性亲水侧链的氨基酸；aa8是具有带正电荷的极性亲水侧链的氨基酸；并且aa9是具有中性非极性亲水侧链的氨基酸。
[0142]
具有中性非极性亲水侧链的氨基酸实例包括半胱氨酸(cys)和甘氨酸(gly)。在一些实施方案中，具有中性非极性亲水侧链的氨基酸是cys。在一些实施方案中，具有中性非极性亲水侧链的氨基酸是gly。
[0143]
具有中性非极性疏水侧链的氨基酸实例包括丙氨酸(ala)、异亮氨酸(ile)、亮氨酸(leu)、甲硫氨酸(met)、苯丙氨酸(phe)、脯氨酸(pro)、色氨酸(trp)和缬氨酸(val)。在一些实施方案中，具有中性非极性疏水侧链的氨基酸是ala。在一些实施方案中，具有中性非极性疏水侧链的氨基酸是ile。在一些实施方案中，具有中性非极性疏水侧链的氨基酸是leu。在一些实施方案中，具有中性非极性疏水侧链的氨基酸是met。在一些实施方案中，具有中性非极性疏水侧链的氨基酸是phe。在一些实施方案中，具有中性非极性疏水侧链的氨基酸是pro。在一些实施方案中，具有中性非极性疏水侧链的氨基酸是trp。在一些实施方案中，具有中性非极性疏水侧链的氨基酸是val。
[0144]
具有中性极性亲水侧链的氨基酸实例包括天冬酰胺(asn)、谷氨酰胺(gln)、丝氨酸(ser)、苏氨酸(thr)和酪氨酸(tyr)。在一些实施方案中，具有中性极性亲水侧链的氨基酸是asn。在一些实施方案中，具有中性极性亲水侧链的氨基酸是gln。在一些实施方案中，具有中性极性亲水侧链的氨基酸是ser。在一些实施方案中，具有中性极性亲水侧链的氨基酸是thr。在一些实施方案中，具有中性极性亲水侧链的氨基酸是tyr。
[0145]
具有带正电荷的极性亲水侧链的氨基酸的实例包括精氨酸(arg)、组氨酸(his)和赖氨酸(kys)。在一些实施方案中，具有带正电荷的极性亲水侧链的氨基酸是arg。在一些实施方案中，具有带正电荷的极性亲水侧链的氨基酸是his。在一些实施方案中，具有带正电荷的极性亲水侧链的氨基酸是lys。
[0146]
具有带负电荷的极性亲水侧链的氨基酸的实例包括天冬氨酸(asp)和谷氨酸(glu)。在一些实施方案中，具有带负电荷的极性亲水侧链的氨基酸是asp。在一些实施方案中，具有带负电荷的极性亲水侧链的氨基酸是glu。
[0147]
在一些实施方案中，(xaa)n由式(iv)表示：
[0148]
aa1-aa2-aa3-aa4-aa5-aa6-aa7-aa8-aa9(seqidno：180)(iv)，
[0149]
其中aa1是选自asp、gly、asn和val的氨基酸；aa2是选自trp、tyr、his和phe的氨基酸；aa3是选自trp、tyr、gly、trp和phe的氨基酸；aa4是选自gln、ala和pro的氨基酸；aa5是选自ala、gln、glu、arg和ser的氨基酸；aa6是选自lys、arg和tyr的氨基酸；aa7是选自trp和gln的氨基酸；aa8是选自pro和his的氨基酸；并且/或aa9是选自his、gly和gln的氨基酸。在一些实施方案中，aa1是asp。在一些实施方案中，aa1是gly。在一些实施方案中，aa1是asn。在一些实施方案中，aa2是trp。在一些实施方案中，aa2是tyr。在某些实施方案中，aa2是his。在一些实施方案中，aa2是phe。在一些实施方案中，aa3是trp。在一些实施方案中，aa3是tyr。在一些实施方案中，aa3是gly。在一些实施方案中，aa3是trp。在一些实施方案中，aa3是phe。在一些实施方案中，aa4是gln。在一些实施方案中，aa4是ala。在某些实施方案中，aa4是pro。在一些实施方案中，aa5是ala。在一些实施方案中，aa5是gln。在一些实施方案中，aa5是glu。在一些实施方案中，aa5是arg。在一些实施方案中，aa5是ser。在一些实施方案中，aa6是lys。在一些实施方案中，aa6是arg。在一些实施方案中，aa6是tyr。在一些实
施方案中，aa7是trp。在一些实施方案中，aa7是gln。在某些实施方案中，aa8是pro。在某些实施方案中，aa8是his。在某些实施方案中，aa9是his。在一些实施方案中，aa9是gly。在一些实施方案中，aa9是gln。
[0150]
在一些实施方案中，(xaa)m由式(iv)表示：
[0151]
aa1-aa2-aa3-aa4-aa5-aa6-aa7-aa8-aa9(seqidno：181)(iv)，
[0152]
其中aa1是选自tyr、phe、trp和asn的氨基酸；aa2是选自lys、pro、his、ala和thr的氨基酸；aa3是选自val、asn、gly、gln、ala和phe的氨基酸；aa4是选自his、thr、lys、trp、lys、val和arg的氨基酸；aa5是选自gln、ser、gly、pro和asn的氨基酸；aa6是选自ser、tyr、glu、leu、lys和thr的氨基酸；aa7是选自ser、asp、val和lys的氨基酸；aa8是选自gly、leu、ser、pro、his、asp和arg的氨基酸；并且/或aa9是选自gly、gln、glu和ala的氨基酸。在一些实施方案中，aa1是tyr。在一些实施方案中，aa1是phe。在一些实施方案中，aa1是trp。在一些实施方案中，aa1是asn。在一些实施方案中，aa2是lys。在一些实施例中，aa2是pro。在一些实施方案中，aa2是his。在一些实施方案中，aa2是ala。在一些实施方案中，aa2是thr。在一些实施方案中，aa3是val。在一些实施方案中，aa3是asn。在一些实施方案中，aa3是gly。在一些实施方案中，aa3是gln。在一些实施方案中，aa3是ala。在一些实施方案中，aa3是phe。在一些实施方案中，aa4是his。在一些实施方案中，aa4是thr。在一些实施方案中，aa4是lys。在一些实施方案中，aa4是trp。在一些实施方案中，aa4是lys。在一些实施方案中，aa4是val。在一些实施方案中，aa4是arg。在一些实施方案中，aa5是gln。在一些实施方案中，aa5是ser。在一些实施方案中，aa5是gly。在一些实施方案中，aa5是pro。在一些实施方案中，aa5是asn。在一些实施方案中，aa6是ser。在一些实施方案中，aa6是tyr。在一些实施方案中，aa6是glu。在一些实施方案中，aa6是leu。在一些实施方案中，aa6是lys。在一些实施方案中，aa6是thr。在一些实施方案中，aa7是ser。在一些实施方案中，aa7是asp。在一些实施方案中，aa7是val。在一些实施方案中，aa7是lys。在一些实施方案中，aa8是gly。在一些实施方案中，aa8是leu。在一些实施方案中，aa8是ser。在一些实施方案中，aa8是pro。在一些实施方案中，aa8是his。在一些实施方案中，aa8是asp。在一些实施方案中，aa8是arg。在一些实施方案中，aa9是gly。在一些实施方案中，aa9是gln。在一些实施方案中，aa9是glu。在一些实施方案中，aa9是ala。
[0153]
在一些实施方案中，(xaa)n由式(v)表示：
[0154]
asn-aa1-aa2-gln-gln-arg-arg-trp-pro-gly(seqidno：179)(v)，
[0155]
其中aa1是选自trp和phe的氨基酸；并且aa2是选自tyr和phe的氨基酸。在一些实施方案中，aa1是trp。在一些实施方案中，aa1是phe。在一些实施方案中，aa2是tyr。在一些实施方案中，aa2是phe。
[0156]
在一些实施方案中，(xaa)n由式(vi)表示：
[0157]
aa1-aa2-irp-aa3-aa4-lys-trp-pro-aa5(vi)，
[0158]
其中aa1是选自asp和gly的氨基酸；aa2是选自trp、tyr和phe的氨基酸；aa3是选自gln和ala的氨基酸；aa4是选自ala和ser的氨基酸；并且aa5是选自his和gly的氨基酸。在一些实施方案中，aa1是asp。在一些实施方案中，aa1是gly。在一些实施方案中，aa2是trp。在一些实施方案中，aa2是tyr。在一些实施方案中，aa2是phe。在一些实施方案中，aa3是gln。在一些实施方案中，aa3是ala。在一些实施方案中，aa4是ala。在一些实施方案中，aa4是
ser。在一些实施方案中，aa5是his。在一些实施方案中，aa5是gly。
[0159]
在一些实施方案中，(xaa)n由式(vii)表示：
[0160]
aa1-aa2-aa3-aa4-aa5-aa6-trp-pro-gly(vii)，
[0161]
其中aa1是选自gly和asn的氨基酸；aa2是选自tyr、phe、trp和his的氨基酸；aa3是选自trp、tyr和phe的氨基酸；aa4是选自ala和gln的氨基酸；aa5是选自ala、ser、gln和arg的氨基酸；并且aa6是选自lys、arg和tyr的氨基酸。在一些实施方案中，aa1是gly。在一些实施方案中，aa1是asn。在一些实施方案中，aa2是tyr。在一些实施方案中，aa2是phe。在一些实施方案中，aa2是trp。在一些实施方案中，aa2是his。在一些实施方案中，aa3是trp。在一些实施方案中，aa3是tyr。在一些实施方案中，aa3是phe。在一些实施方案中，aa4是ala。在一些实施方案中，aa4是gln。在一些实施方案中，aa5是ala。在一些实施方案中，aa5是ser。在一些实施方案中，aa5是gln。在一些实施方案中，aa5是arg。在一些实施方案中，aa6是lys。在一些实施方案中，aa6是arg。在一些实施方案中，aa6是tyr。
[0162]
在一些实施方案中，(xaa)n由式(ix)表示：
[0163]
gly-aa1-aa2-ala-aa3-aa4-trp-pro-gly(ix)，
[0164]
其中aa1是选自tyr、phe和his的氨基酸；aa2是选自trp和tyr的氨基酸；aa3是选自ala、ser和arg的氨基酸；并且aa4是选自lys和tyr的氨基酸。在一些实施方案中，aa1是tyr。在一些实施方案中，aa1是phehis。在一些实施方案中，aa1是his。在一些实施方案中，aa2是trp。在一些实施方案中，aa2是tyr。在一些实施方案中，aa3是ala。在一些实施方案中，aa3是ser。在一些实施方案中，aa3是arg。在一些实施方案中，aa4是lys。在一些实施方案中，aa4是tyr。
[0165]
在一些实施方案中，(xaa)n由式(x)表示：
[0166]
aa1-aa2-aa3-gln-aa4-aa5-trp-pro-aa6(x)，
[0167]
其中aa1是选自asp和asn的氨基酸；aa2是选自trp和phe的氨基酸；aa3是选自trp、tyr和phe的氨基酸；aa4是选自ala、gln和arg的氨基酸；aa5是选自lys和arg的氨基酸；并且aa6是选自his和gly的氨基酸。在一些实施方案中，aa1是asp。在一些实施方案中，aa1是asn。在一些实施方案中，aa2是trp。在一些实施方案中，aa2是phe。在一些实施方案中，aa3是trp。在一些实施方案中，aa3是tyr。在一些实施方案中，aa3是phe。在一些实施方案中，aa4是ala。在一些实施方案中，aa4是gln。在一些实施方案中，aa4是arg。在一些实施方案中，aa5是lys。在一些实施方案中，aa5是arg。在一些实施方案中，aa6是his。在一些实施方案中，aa6是gly。
[0168]
在一些实施方案中，抗hsa多肽包含选自seqidno：4至56中任一项的环2氨基酸序列(表1)。在一些实施方案中，抗hsa多肽包含选自seqidno：57至109中任一项的环4氨基酸序列(表1)。
[0169]
表1.hsa环序列的实例
[0170]
名称环2seq id no：环4seq id no：hsa-00wtqpknehh4rfkyfahyq57hsa-01hlkhtdaqp5fhdfwhrrw58hsa-02hdqdvlhaw6dwyhywwev59
hsa-03kfhrqewad7strsihvtt60hsa-04pedfwdpeh8kqhhhyldk61hsa-05vvrttghvv9hsaqdreip62hsa-06ywwfctgqs10wvqsgynsq63hsa-07ihhrqarsl11avfwgkwsd64hsa-08shrrrayiw12qsfdkpwtt65hsa-09wdshhwrap13hyplkysfe66hsa-10dkrvkygq14whhpwhrnr67hsa-11sdwvyalql15dpwwawvvw68hsa-12fwwfwy16fdnqdliqy69hsa-13vrdwpwntf17ekknwykwd70hsa-14qkkrdedyi18drhksrwgi71hsa-15gvheeprkl19lnpftpsvt72hsa-16ewwqkhwps20ykgallnhd73hsa-17nffqrrwpg21wkfrnterg74hsa-18dwwqakwph22ykvhqssgg75hsa-19giwqsrwpg23fhpiagrpw76hsa-20gywaakwpg24fpntsydlq77hsa-21gfyadhwpg25fahynlksg78hsa-22nwyqqrwpg26whnygessg79hsa-23gfyarhwpg27kfyyadhqw80hsa-24dfwkahwpg28ythadphsq81hsa-25dfysvrwpg29fgvpqlgag82hsa-26ywaanhask30ysgfpfagf83hsa-27ikrlehwey31wfswpytpl84hsa-28ewdspwsen32yyhpsiqst85
[0171]
名称环2seq id no：环4seq id n0：hsa-29khknlrwpf33flgwkdtvv86hsa-30rhfpkqtnw34dwwkwwwak87hsa-31vwgpeyqhq35nagwplvpe88hsa-32twknngqdv36yaldpfggk89hsa-33atwlnyylp37gykfwgvsd90hsa-34dqeslflnn38qgkqyillr91hsa-35gfyaqhwpd39ykrhsahdy92hsa-36ghyarywpg40waqkskvhq93hsa-37gfwaskwpg41ftavskkda94hsa-38gfwqrkwpn42wgdkeniwf95hsa-39vwpadndlk43wsghpwvqk96hsa-40hwawtspgy44yadyplspk97
hsa-41nffqrrwpg45wkfrntdrg98hsa-42hhshrlkgq46qtvathyhy99hsa-43yqntiflsi47whakhllsh100hsa-44fqdqftwsq48sgikkadsv101hsa-45gephwpwqa49kanlinvks102hsa-46adprhpwve50wkshvevrs103hsa-47fhkrfqsqg51wvtqkyiiq104hsa-48ewwqnrwpn52wehakdwpt105hsa-49ewyqtrwpg53fhskvldka106hsa-50efwqrhwpg54ygaqkqavw107hsa-51kfyerhwpg55fsashftsq108共有gwwqrrwpg56x1x2ax3kx4dx5q109
[0172]
在一些实施方案中，(xaa)n包含与seq id no：4至55中任一个的氨基酸序列具有至少80％或至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，(xaa)n包含与seq id no：4至55中任一个的氨基酸序列具有80％至90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，(xaa)n包含seq id no：4至55中任一个的氨基酸序列。
[0173]
在一些实施方案中，(xaa)n包含与seq id no：22、24、26、35、40、41和45中任一个的氨基酸序列具有至少80％或至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，(xaa)n包含与seq id no：22的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，(xaa)n包含与seq id no：24的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，(xaa)n包含与seq id no：26的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，(xaa)n包含与seq id no：35的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，(xaa)n包含与seq id no：40的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，(xaa)n包含与seq id no：41的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，(xaa)n包含与seq id no：45的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，(xaa)n包含与seq id no：22的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，(xaa)n包含与seq id no：24的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，(xaa)n包含与seq id no：26的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，(xaa)n包含与seq id no：35的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，(xaa)n包含与seq id no：40的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，(xaa)n包含与seq id no：41的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，(xaa)n包含与seq id no：45的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。
[0174]
在一些实施方案中，(xaa)n包含与seq id no：22、24、26、35、40、41和45中任一个的氨基酸序列具有80％至90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，(xaa)n包含与seq id no：22的氨基酸序列具有80％至90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，(xaa)n包含与seq id no：24的氨基酸序列具有80％至90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，(xaa)n包含与seq id no：26的氨基酸序列具有80％至90％同一性的氨基酸序列。在一
些实施方案中，(xaa)n包含与seq id no：35的氨基酸序列具有80％至90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，(xaa)n包含与seq id no：40的氨基酸序列具有80％至90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，(xaa)n包含与seq id no：41的氨基酸序列具有80％至90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，(xaa)n包含与seq id no：45的氨基酸序列具有80％至90％同一性的氨基酸序列。
[0175]
在一些实施方案中，(xaa)n包含seq id no：22、24、26、35、40、41和45中任一个的氨基酸序列。在一些实施方案中，(xaa)n包含seq id no：22的氨基酸序列。在一些实施方案中，(xaa)n包含seq id no：24的氨基酸序列。在一些实施方案中，(xaa)n包含seq id no：26的氨基酸序列。在一些实施方案中，(xaa)n包含seq id no：35的氨基酸序列。在一些实施方案中，(xaa)n包含seq id no：40的氨基酸序列。在一些实施方案中，(xaa)n包含seq id no：41的氨基酸序列。在一些实施方案中，(xaa)n包含seq id no：45的氨基酸序列。
[0176]
在一些实施方案中，(xaa)m包含与seq id no：57至108中任一个的氨基酸序列具有至少80％或至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，(xaa)m包含与seq id no：57至108中任一个的氨基酸序列具有80％至90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，(xaa)m包含seq id no：57至108中任一个的氨基酸序列。
[0177]
在一些实施方案中，(xaa)m包含与seq id no：75、77、79、88、93、94和98中任一个的氨基酸序列具有至少80％或至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，(xaa)m包含与seq id no：75的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，(xaa)m包含与seq id no：77的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，(xaa)m包含与seq id no：79的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，(xaa)m包含与seq id no：88的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，(xaa)m包含与seq id no：93的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，(xaa)m包含与seq id no：94的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，(xaa)m包含与seq id no：98的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，(xaa)m包含与seq id no：75的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，(xaa)m包含与seq id no：77的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，(xaa)m包含与seq id no：79的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，(xaa)m包含与seq id no：88的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，(xaa)m包含与seq id no：93的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，(xaa)m包含与seq id no：94的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，(xaa)m包含与seq id no：98的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。
[0178]
在一些实施方案中，(xaa)m包含与seq id no：75、77、79、88、93、94和98中任一个的氨基酸序列具有80％至90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，(xaa)m包含seq id no：75、77、79、88、93、94和98中任一个的氨基酸序列。在一些实施方案中，(xaa)m包含与seq id no：75的氨基酸序列具有80％至90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，(xaa)m包含与seq id no：77的氨基酸序列具有80％至90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，(xaa)m包含与seq id no：79的氨基酸序列具有80％至90％同一性的氨基酸序
列。在一些实施方案中，(xaa)m包含与seq id no：88的氨基酸序列具有80％至90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，(xaa)m包含与seq id no：93的氨基酸序列具有80％至90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，(xaa)m包含与seq id no：94的氨基酸序列具有80％至90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，(xaa)m包含与seq id no：98的氨基酸序列具有80％至90％同一性的氨基酸序列。
[0179]
在一些实施方案中，抗hsa多肽包含选自seq id no：110至116和138中任一个的氨基酸序列(表2)。
[0180]
表2.hsa多肽序列的实例
[0181]
[0182][0183]
在一些实施方案中，抗hsa多肽包含与seq id no：110至116和138中任一个的氨基酸序列具有至少80％或至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗hsa多肽包含与seq id no：110的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗hsa多肽包含与seq id no：111的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗hsa多肽包含与seq id no：112的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗hsa多肽包含与seq id no：113的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗hsa多肽包含与seq id no：114的氨基酸序列具
有至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗hsa多肽包含与seq id no：115的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗hsa多肽包含与seq id no：116的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗hsa多肽包含与seq id no：138的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗hsa多肽包含与seq id no：110的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗hsa多肽包含与seq id no：111的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗hsa多肽包含与seq id no：112的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗hsa多肽包含与seq id no：113的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗hsa多肽包含与seq id no：114的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗hsa多肽包含与seq id no：115的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗hsa多肽包含与seq id no：116的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗hsa多肽包含与seq id no：138的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。
[0184]
在一些实施方案中，抗hsa多肽包含与seq id no：110至116和138中任一个的氨基酸序列具有80％至90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗hsa多肽包含seq id no：110至116和138中任一个的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗hsa多肽包含与seq id no：110的氨基酸序列具有80％至90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗hsa多肽包含与seq id no：111的氨基酸序列具有80％至90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗hsa多肽包含与seq id no：112的氨基酸序列具有80％至90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗hsa多肽包含与seq id no：113的氨基酸序列具有80％至90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗hsa多肽包含与seq id no：114的氨基酸序列具有80％至90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗hsa多肽包含与seq id no：115的氨基酸序列具有80％至90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗hsa多肽包含与seq id no：116的氨基酸序列具有80％至90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗hsa多肽包含与seq id no：138的氨基酸序列具有80％至90％同一性的氨基酸序列。
[0185]
在一些实施方案中，本文提供的抗hsa多肽与另一分子连接，并延长该分子(例如，治疗性多肽)的半衰期。本文中提供了一系列抗hsa多肽，其具有一系列结合亲和力，例如，与其他物种(例如小鼠和食蟹猴(cynomolgus，cyno))交叉反应。在一些实施方案中，这些抗hsa多肽构成了称为affimer xt
tm
平台的东西。这些抗hsa多肽已在体内药代动力学(pharmacokinetic，pk)研究中显示，以
受控的方式延长了任何其他治疗剂的血清半衰期，所述治疗剂在单一基因融合中与之缀合，例如，可在大肠杆菌中制备。affimer xt
tm
还可用于延长其他肽或蛋白质治疗剂的半衰期。
[0186]
术语“半衰期”是指物质(例如治疗性多肽)失去其药理或生理活性或浓度的一半所花费的时间量。生物半衰期可受物质的消除、排泄、降解(例如酶促降解)或在身体某些器官或组织中的吸收和浓缩的影响。例如，可以通过确定物质的血浆浓度达到其稳态水平一半所花费的时间(“血浆半衰期”)来评估生物半衰期。
[0187]
在一些实施方案中，抗hsa多肽延长了分子(例如，治疗性多肽)在体内的血清半衰期。例如，相对于未与抗hsa多肽连接的分子的半衰期，抗hsa多肽可将分子的半衰期延长至少1.2倍。在一些实施方案中，相对于未与抗hsa多肽连接的分子的半衰期，抗hsa多肽将分子的半衰期延长了至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少20倍或至少30倍。在一些实施方案中，相对于未与抗hsa多肽连接的分子，抗hsa多肽将分子的半衰期延长了1.2倍至5倍、1.2倍至10倍、1.5倍至5倍、1.5倍至10倍、2倍至5倍、2倍至10倍、3倍至5倍、3倍至10倍、15倍至5倍、4倍至10倍或5倍至10倍。在一些实施方案中，在体内施用后，相对于未与抗hsa多肽连接的分子的半衰期，抗hsa多肽将分子的半衰期延长至少6小时、至少12小时、至少24小时、至少48小时、至少72小时、至少96小时，例如至少一周。
[0188]
在一些实施方案中，抗hsa多肽具有延长的血清半衰期，并且包含选自seq id no：117至127、139和140中任一个的氨基酸序列(表3)。
[0189]
表3.内联融合多肽序列的半衰期延长的实例
[0190]
[0191]
[0192]
[0193][0194]
在一些实施方案中，抗hsa多肽包含与seq id no：117至127、139和140中任一个的氨基酸序列具有至少80％或至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗hsa多肽包含与seq id no：117的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗hsa多肽包含与seq id no：118的氨基酸
序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗hsa多肽包含与seq id no：119的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗hsa多肽包含与seq id no：120的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗hsa多肽包含与seq id no：121的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗hsa多肽包含与seq id no：122的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗hsa多肽包含与seq id no：123的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗hsa多肽包含与seq id no：124的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗hsa多肽包含与seq id no：125的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗hsa多肽包含与seq id no：126的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗hsa多肽包含与seq id no：127的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗hsa多肽包含与seq id no：139的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗hsa多肽包含与seq id no：140的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。
[0195]
在一些实施方案中，抗hsa多肽包含与seq id no：117的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗hsa多肽包含与seq id no：118的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗hsa多肽包含与seq id no：119的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗hsa多肽包含与seq id no：120的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗hsa多肽包含与seq id no：121的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗hsa多肽包含与seq id no：122的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗hsa多肽包含与seq id no：123的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗hsa多肽包含与seq id no：124的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗hsa多肽包含与seq id no：125的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗hsa多肽包含与seq id no：126的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗hsa多肽包含与seq id no：127的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗hsa多肽包含与seq id no：139的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗hsa多肽包含与seq id no：140的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。
[0196]
在一些实施方案中，抗hsa多肽包含与seq id no：117至127、139和140中任一个的氨基酸序列具有80％至90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗
hsa多肽包含seq id no：117至127、139和140中任一个的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗hsa多肽包含与seq id no：117的氨基酸序列具有80％至90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗hsa多肽包含与seq id no：118的氨基酸序列具有80％至90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗hsa多肽包含与seq id no：119的氨基酸序列具有80％至90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗hsa多肽包含与seq id no：120的氨基酸序列具有80％至90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗hsa多肽包含与seq id no：121的氨基酸序列具有80％至90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗hsa多肽包含与seq id no：122的氨基酸序列具有80％至90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗hsa多肽包含与seq id no：123的氨基酸序列具有80％至90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗hsa多肽包含与seq id no：124的氨基酸序列具有80％至90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗hsa多肽包含与seq id no：125的氨基酸序列具有80％至90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗hsa多肽包含与seq id no：126的氨基酸序列具有80％至90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗hsa多肽包含与seq id no：127的氨基酸序列具有80％至90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗hsa多肽包含与seq id no：139的氨基酸序列具有80％至90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗hsa多肽包含与seq id no：140的氨基酸序列具有80％至90％同一性的氨基酸序列。
[0197]
多肽
[0198]
多肽是任意长度的氨基酸(天然存在或非天然存在的，例如氨基酸类似物)的聚合物。除非另有说明，否则术语“多肽”和“肽”在本文中可互换使用。蛋白质是多肽的一个实例。应当理解，多肽可以是线性的或支化的，它可包含天然存在的和/或非天然存在的(例如经修饰的)氨基酸，和/或它可包含非氨基酸(例如散布在整个聚合物中)。如本文中所提供的多肽可以被修饰(例如，天然或非天然地修饰)，例如，通过二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或与标记组分缀合进行修饰。在一些情况下，多肽可包含至少一种氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸)和/或其他修饰。
[0199]
氨基酸(也称为氨基酸残基)参与多肽的肽键。通常来说，本文中用于指定氨基酸的缩写是基于iupac-iub生物化学命名委员会的建议(参见biochemistry(1972)11：1726-1732)。例如，met、ile、leu、ala和gly分别代表甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、丙氨酸和甘氨酸的“残基”。残基是通过消除羧基的oh部分和α-氨基的h部分而来源于相应的α-氨基酸的基团。如由k.d.kopple，“peptides and amino acids”，w.a.benjamin inc.，new york and amsterdam，1966，pages 2and 33所定义，氨基酸侧链是不包括-ch(nh2)cooh部分的氨基酸的一部分。
[0200]
在一些实施方案中，本文中所使用的氨基酸是例如在蛋白质中发现的天然存在的氨基酸，或者包含氨基和羧基的这样的氨基酸的天然存在的合成代谢或分解代谢产物。氨基酸侧链的实例包括选自下列氨基酸的侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、
异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、赖氨酸、精氨酸、脯氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸，以及已被鉴定为肽多糖细菌细胞壁成分的那些氨基酸和氨基酸类似物。
[0201]
具有碱性侧链的氨基酸包括arg、lys和his。具有酸性侧链的氨基酸包括glu和asp。具有中性极性侧链的氨基酸包括ser、thr、asn、gln、cys和tyr。具有中性非极性侧链的氨基酸包括gly、ala、val、ile、leu、met、pro、trp和phe。具有非极性脂肪族侧链的氨基酸包括gly、ala、val、ile和leu。具有疏水侧链的氨基酸包括ala、val、ile、leu、met、phe、tyr和trp。具有小的疏水侧链的氨基酸包括ala和val。具有芳香族侧链的氨基酸包括tyr、trp和phe。
[0202]
术语氨基酸包括本文所指的任何特定氨基酸的类似物、衍生物和同类物；例如，多肽(尤其是如果通过化学合成产生的话)可包含氨基酸类似物，例如氰基丙氨酸、刀豆氨酸、黎豆氨酸(djenkolic acid)、正亮氨酸、3-磷酸丝氨酸、高丝氨酸、二羟基苯丙氨酸、5-羟基色氨酸、1-甲基组氨酸、3-甲基组氨酸、二氨基庚二酸、鸟氨酸或二氨基丁酸。适用于本文中的其他天然存在的具有侧链的氨基酸代谢物或前体是本领域技术人员所认识的并包括在本公开内容的范围内。
[0203]
当氨基酸的结构允许立体异构形式时，本文中还包括这样的氨基酸的(d)和(l)立体异构体。本文中氨基酸和氨基酸的构型用适当的符号(d)、(l)或(dl)表示；此外，当未指定构型时，氨基酸或残基可以具有构型(d)、(l)或(dl)。应当注意，本公开内容的一些化合物的结构包括不对称碳原子。因此，应当理解，由这样的不对称性引起的异构体包括在本公开内容的范围内。这样的异构体可以通过经典的分离技术和空间控制合成以基本上纯的形式获得。为了本公开内容的目的，除非明确相反地指出，否则命名的氨基酸应被解释为包括(d)或(l)立体异构体二者。
[0204]
在两个或更多个核酸或多肽的情况下，百分比同一性是指当进行比较和比对(必要时引入缺口)以获得最大对应性并且不考虑任何保守氨基酸替换作为序列同一性的一部分的情况下，两个或更多个相同(相同/100％同一性)或具有特定百分比(例如，至少70％同一性)的相同的核苷酸或氨基酸残基的序列或子序列。百分比同一性可以使用序列比较软件或算法或者通过目视检查来测量。可用于获得氨基酸或核苷酸序列的比对的多种算法和软件是本领域中公知的。这些算法和软件包括但不限于blast、align、megalign、bestfit、gcg wisconsin package及其变化形式。在一些实施方案中，本公开内容的两个核酸或多肽基本上相同，这意味着当使用序列比较算法或通过目视检查进行比较和比对以获得最大对应性时，它们具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％，并且在一些实施方案中具有至少95％、96％、97％、98％、99％的核苷酸或氨基酸残基同一性。在一些实施方案中，同一性存在于氨基酸序列的长度为至少约10个残基、至少约20个残基、至少约40至60个残基、至少约60至80个残基或其间任何整数值的区域上。在一些实施方案中，同一性存在于比60至80个残基更长(例如至少约80至100个残基)的区域上，并且在一些实施方案中，所述序列在被比较的序列(例如靶蛋白或抗体的编码区)的全长上基本相同。在一些实施方案中，同一性存在于核苷酸序列长度为至少约10个碱基、至少约20个碱基、至少约40至60个碱基、至少约60至80个碱基或其间任何整数值的区域上。在一些实施方案中，同一性存在于比60至80个碱基更长(例如至少约80至1000个碱基或更多)的区域上，并且在一些实施方案
中，所述序列在被比较的序列(例如编码目的蛋白质的核苷酸序列)的全长上基本相同。
[0205]
保守氨基酸替换是其中一个氨基酸残基被另一个具有相似侧链的氨基酸残基替代的替换。具有相似侧链的氨基酸残基家族在本领域中已被普遍定义，包括碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-支链侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链例如(酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。例如，用苯丙氨酸替换酪氨酸是保守替换。通常来说，本公开内容的多肽、可溶性蛋白质和/或抗体的序列中的保守替换不会消除含有氨基酸序列的多肽、可溶性蛋白质或抗体与靶结合位点的结合。鉴定不消除结合的氨基酸保守替换的方法是本领域中公知的。
[0206]
在本文中，应该理解的是，分离的分子(例如，多肽(例如，可溶性蛋白质、抗体等)多核苷酸(例如，载体)、细胞或其他组合物)处于在自然界中未出现的形式。例如，分离的分子已经被纯化到自然界不可能的程度。
[0207]
在一些实施方案中，分离的分子(例如，多肽(例如，可溶性蛋白质、抗体等)、多核苷酸(例如，载体)、细胞或其他组合物))是基本上纯的，这指的是分离的分子为至少50％纯(例如，不含与分子的未纯化形式相关的50％污染物)、至少90％纯、至少95％纯、至少98％纯或至少99％纯。
[0208]
包含多肽融合物的缀合物
[0209]
在本文中的动词“缀合”(与动词“连接”可互换使用)是指两个或更多个分子(例如，多肽和/或化学部分)连接在一起以形成另一个分子。因此，一个分子(例如，抗hsa多肽)与另一个分子(例如，另一个多肽、药物分子或者其他治疗性蛋白质或核酸)缀合形成了缀合物。两个或更多个分子的连接可以是，例如，通过非共价键或共价键。例如，与化学部分或另一多肽(例如，异源多肽)直接或间接连接的抗hsa多肽形成本文中所提供的缀合物。缀合物的非限制性实例包括化学缀合物(例如，通过“点击”化学或另一化学反应连接)和融合物(通过连续肽键连接的两个分子)。在一些实施方案中，缀合物是融合多肽，例如融合蛋白。在一些实施方案中，抗hsa多肽与两个或更多个其他分子缀合。例如，双(或多)作用模式药物缀合物可以与本公开内容的抗hsa多肽缀合。这样的双作用模式药物缀合物包括tmac(肿瘤微环境激活缀合物，tumor microenvironment-activated conjugate)平台的那些(参见，例如，avacta.com/therapeutics/tmac-affimer-drug-conjugates)。
[0210]
融合多肽(例如，融合蛋白)是这样的多肽，所述多肽包含至少两个结构域(例如，蛋白质结构域)，其由包含至少两个独立分子(例如，两个基因)的核苷酸序列的多核苷酸编码。在一些实施方案中，多肽包含通过酰胺键共价连接(至多肽的氨基酸)以形成连续融合多肽(例如，融合蛋白)的异源多肽。在一些实施方案中，异源多肽包含治疗性多肽。在一些实施方案中，抗hsa多肽通过抗hsa多肽的c端或n端的连续肽键与异源多肽缀合。
[0211]
接头是插入第一多肽(例如作为多肽)和第二多肽(例如另一多肽、fc结构域、配体结合结构域等)之间的分子。接头可以是任何分子，例如
一个或更多个核苷酸、氨基酸、化学官能团。在一些实施方案中，接头是肽接头(例如，两个或更多个氨基酸)。接头不应不利地影响多肽的表达、分泌或生物活性。在一些实施方案中，接头不是抗原性的，并且不会引发免疫应答。免疫应答包括来自先天免疫系统和/或适应性免疫系统的应答。因此，免疫应答可以是细胞介导的应答和/或体液免疫应答。免疫应答可以是例如t细胞应答、b细胞应答、自然杀伤(natural killer，nk)细胞应答、单核细胞应答和/或巨噬细胞应答。本文中考虑了其他细胞应答。
[0212]
在一些实施方案中，接头是非蛋白质编码的。
[0213]
在一些实施方案中，缀合物包含与治疗或诊断分子连接的多肽。在一些实施方案中，缀合物包含与另一种蛋白质、核酸、药物或者其他小分子或大分子连接的多肽。
[0214]
任何缀合方法都可以用于或容易地适于将分子连接到本公开内容的多肽上，包括例如hunter，et al.，(1962)nature 144：945；david，et al.，(1974)biochemistry 13：1014；pain，et al.，(1981)j.immunol.meth.40：219和nygren，j.，(1982)histochem.and cytochem.30：407中所述的方法。
[0215]
治疗
[0216]
在一些实施方案中，治疗性分子用于治疗自身免疫病(对象的免疫系统错误攻击他/她的身体的病症)。自身免疫病的非限制性实例包括重症肌无力、寻常性天疱疮、视神经脊髓炎、吉兰-巴雷综合征、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮(狼疮)、特发性血小板减少性紫癜、血栓性血小板减少性紫癜、抗磷脂综合征(antiphospholipid syndrome，aps)、自身免疫性荨麻疹、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病(chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy，cidp)、银屑病、古德帕斯丘综合征、格雷夫斯病、炎性肠病、克罗恩病、舍格伦综合征(sjogren
′
s syndrome)、溶血性贫血、中性粒细胞减少症、副肿瘤性小脑变性、副蛋白血症性多发性神经病、原发性胆汁性肝硬化、僵人综合征、白癜风、温热特发性溶血性贫血(warm idiopathic haemolytic anaemia)、多发性硬化(multiple sclerosis)、1型糖尿病、桥本甲状腺炎、重症肌无力、自身免疫性血管炎、pernicus贫血和乳糜泻。本文中考虑了其他自身免疫病。
[0217]
在一些实施方案中，治疗性分子用于治疗癌症。癌症的非限制性实例包括皮肤癌(例如，黑色素瘤或非黑色素瘤(例如基底细胞或鳞状细胞))、肺癌、前列腺癌、乳腺癌、结肠直肠癌、肾(肾)癌、膀胱癌、非霍奇金淋巴瘤、甲状腺癌、子宫内膜癌、外分泌癌和胰腺癌。本文中考虑了其他癌症。
[0218]
在一些实施方案中，多肽与治疗性分子连接。本文中，治疗性分子可用于例如在对象(例如人对象或其他动物对象)中预防和/或治疗疾病。本领域已知的术语“治疗”是指减轻至少一种与疾病相关的症状的过程。症状可以是疾病的身体、精神或病理表现。与多种疾病相关的症状是已知的。为了治疗或预防特定病症，本文中提供的缀合物(例如，与治疗性分子连接的抗多肽)应以有效量施用，该有效量可以是用于治疗或预防该疾病的任何量。因此，在一些实施方案中，有效量是用于减轻与被治疗的特定疾病相关的症状的量。例如，确定多种治疗性分子的有效量的方法是已知的。
[0219]
对象可以是任何动物(例如哺乳动物)，包括但不限于人、非人灵长类、犬科、猫科
protein，ingap)、bmp(骨形态发生蛋白)(bone morphogenetic protein，bmp)和骨钙素(osteocalcin，ocn)。
[0224]
抗体
[0225]
在一些实施方案中，与抗hsa多肽连接的异源多肽是抗体(例如，抗体的可变区)。因此，在一些实施方案中，本公开内容提供了多肽-抗体融合蛋白。在一些实施方案中，多肽-抗体融合蛋白包含全长抗体，所述全长抗体包含例如至少一个附加到其vh和/或vl链的至少一条的c端或n端的多肽序列(装配抗体的至少一条链与多肽形成融合蛋白)。在一些实施方案中，多肽-抗体融合蛋白包含至少一种多肽和抗体片段的抗原结合位点或可变区。
[0226]
抗体是免疫球蛋白分子，其通过至少一个抗原结合位点识别并特异性结合靶标，例如多肽(例如，肽或蛋白质)、多核苷酸、碳水化合物、脂质或任何前述物质的组合。在一些实施方案中，抗原结合位点位于免疫球蛋白分子的可变区内。抗体包括多克隆抗体、单克隆抗体、抗体片段(例如fab、fab’、f(ab’)2和fv片段)、单链fv(single chain fv，scfv)抗体，前提是这些片段已经被格式化以包含fc或其他fcγriii结合结构域、多特异性抗体、双特异性抗体、单特异性抗体、单价抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、包含抗体的抗原结合位点的融合蛋白(被格式化以包含fc或其他fcγriii结合结构域)、以及任何其他包含抗原结合位点的经修饰的免疫球蛋白分子，只要抗体表现出期望的生物活性即可。
[0227]
抗体可以是免疫球蛋白的五种主要类别(iga、igd、ige、igg和igm)或其亚类(同种型)(例如，igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2)中的任何一种，基于其重链恒定结构域的同一性，称为α、δ、ε、γ和μ。
[0228]
抗体的可变区可以是抗体轻链的可变区或抗体重链的可变区，可以是单独的或组合的。通常来说，重链和轻链的可变区各自由四个框架区(framework region，fr)和三个互补决定区(complementarity determining region，cdr，也称为高变区)组成。每条链中的cdr通过框架区紧密结合在一起，并与另一条链中的cdr一起形成抗体的抗原结合位点。至少有两种确定cdr的技术：(1)基于跨物种序列变异的方法(kabat et al.，1991，sequences of proteins of immunological interest，5th edition，national institutes of health，bethesda md)，以及(2)基于对抗原-抗体复合物的晶体学研究的方法(al lazikani et al.，1997，j.mol.biol.，273：927-948)。另外，这两种方法的组合有时在本领域中用于确定cdr。
[0229]
人源化抗体是非人(例如，鼠)抗体的形式，其是包含最少非人序列的特异性免疫球蛋白链、嵌合免疫球蛋白或其片段。通常来说，人源化抗体是其中cdr的残基被来自具有期望特异性、亲和力和/或结合能力的非人物种(例如小鼠、大鼠、兔或仓鼠)的cdr的残基替代的人免疫球蛋白。在一些情况下，人免疫球蛋白的fv框架区残基被来自非人物种的抗体中的相应残基所替代。可以通过替换fv构架区内和/或经替代的非人残基内的其他残基进一步修饰人源化抗体，以完善和优化抗体特异性、亲和力和/或结合能力。人源化抗体可包含可变结构域，该可变结构域包含对应于非人免疫球蛋白的所有或基本上所有cdr，而所有或基本上所有框架区是人免疫球蛋白序列的那些。在一些实施方案中，可变结构域包含人
免疫球蛋白序列的框架区。在一些实施方案中，可变结构域包含人免疫球蛋白共有序列的框架区。人源化抗体还可包含免疫球蛋白恒定区或结构域(fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的恒定区或结构域。通常认为人源化抗体不同于嵌合抗体。
[0230]
表位(也称为抗原决定簇)是能够被特定抗体、特定多肽或其他特定结合结构域识别并特异性结合的抗原部分。当抗原是多肽时，表位可以由连续氨基酸和通过蛋白质的三级折叠并列的非连续氨基酸二者形成。由连续氨基酸形成的表位(也称为线性表位)通常在蛋白质变性时保留，而通过三级折叠形成的表位(也称为构象表位)通常在蛋白质变性时丢失。在独特的空间构象中，表位通常包含至少3个，更通常至少5、6、7或8至10个氨基酸。
[0231]
如本文所用，术语“与......特异性结合”或“对......具有特异性”是指可测量和可再现的相互作用，例如靶标与多肽、抗体或其他结合伴侣之间的结合，其确定在分子(包括生物分子)的异质群体的存在下靶标的存在。例如，与靶标特异性结合的多肽是以比其与其他靶标结合更大的亲和力、亲合力(如果多聚体被格式化的话)、更容易和/或以更长的持续时间结合该靶标的多肽。
[0232]
可与本公开内容的抗hsa和多肽偶联的抗体的非限制性实例是：3f8、8h9、阿巴伏单抗、阿昔单抗、阿比妥珠单抗(abituzumab)、阿泽奇单抗(abrezekimab)、阿利鲁单抗(abrilumab)、阿克托舒单抗(actoxumab)、阿达木单抗(adalimumab)、阿达木单抗、阿杜卡努单抗(aducanumab)、阿非莫单抗(afelimomab)、培化阿珠单抗(alacizumab pegol)、阿仑单抗(alemtuzumab)、阿利西尤单抗(alirocumab)、喷替酸阿妥莫单抗(altumomab pentetate)、阿麦妥昔单抗(amatuximab)、马安那莫单抗、安德利昔单抗(andecaliximab)、anetumab ravtansine、阿尼鲁单抗(anifrolumab)、安卢珠单抗(ima-638)、阿泊珠单抗(apolizumab)、伊汀-阿普卢妥单抗(aprutumab ixadotin)、阿昔莫单抗(arcitumomab)、阿伐苏单抗(ascrinvacumab)、阿塞珠单抗(aselizumab)、阿特珠单抗(atezolizumab)、阿度尤单抗(atidortoxumab)、阿替奴单抗(atinumab)、阿托木单抗(atorolimumab)、阿维单抗(avelumab)、azintuxizumab vedotin、巴匹珠单抗(bapineuzumab)、巴利昔单抗(basiliximab)、巴维昔单抗(bavituximab)、bcd-100、贝妥莫单抗(bectumomab)、贝戈洛单抗(begelomab)、玛贝妥单抗(belantamab mafodotin)、贝利木单抗(belimumab)、bemarituzumab、贝那利珠单抗(benralizumab)、berlimatoxumab、bermekimab、bersanlimab、柏替木单抗(bertilimumab)、besilesomab、贝伐单抗(bevacizumab)、bezlotoxumab、biciromab、bimagrumab、bimekizumab、birtamimab、莫比伐单抗(bivatuzumab mertansine)、bleselumab、博纳吐单抗(blinatumomab)、blontuvetmab、blosozumab、博科昔单抗(bococizumab)、brazikumab、维汀-布仑妥昔单抗(brentuximab vedotin)、briakinumab、布罗达单抗(brodalumab)、布洛赛珠单抗(brolucizumab)、brontictuzumab、burosumab、卡比利珠单抗(cabiralizumab)、camidanlumab tesirine、卡瑞利珠单抗、康纳单抗(canakinumab)、莫坎妥珠单抗、雷坎妥珠单抗、caplacizumab、卡罗单抗喷地肽、卡鲁单抗、卡罗妥昔单抗(carotuximab)、卡妥索单抗、cbr96-倍癌霉素、免疫缀合物、西利珠单抗、西米普利单抗、cergutuzumab amunaleukin、赛妥珠单抗、西利单抗、西妥昔单抗、cibisatamab、西妥珠单抗
mertansine)、losatuxizumab vedotin、鲁卡木单抗(lucatumumab)、lulizumab pegol、鲁昔单抗(lumiliximab)、卢姆珠单抗(lumretuzumab)、lupartumab amadotin、lutikizumab、马帕木单抗(mapatumumab)、马格妥昔单抗(margetuximab)、marstacimab、马司莫单抗(maslimomab)、马妥珠单抗(matuzumab)、mavrilimumab、美泊利单抗(mepolizumab)、soravtansine、米妥莫单抗(mitumomab)、modotuximab、莫加珠单抗(mogamulizumab)、莫那利珠单抗(monalizumab)、morolimumab、mosunetuzumab、莫维珠单抗(motavizumab)、莫妥莫单抗(moxetumomab pasudotox)、muromonab-cd3、他那可单抗(nacolomab tafenatox)、namilumab、他那莫单抗(naptumomab estafenatox)、那妥昔单抗美坦新(naratuximab emtansine)、narnatumab、natalizumab、navicixizumab、navivumab、naxitamab、奈巴库单抗(nebacumab)、耐昔妥珠单抗(necitumumab)、nemolizumab、neod001、奈瑞莫单抗(nerelimomab)、奈伐苏单抗(nesvacumab)、netakimab、尼妥珠单抗(nimotuzumab)、nirsevimab、纳武单抗(nivolumab)、巯诺莫单抗-美培坦(nofetumomab merpentan)、obiltoxaximab、奥比妥珠单抗(obinutuzumab)、ocaratuzumab、奥美珠单抗(ocrelizumab)、odulimomab、奥法木单抗(ofatumumab)、奥拉单抗(olaratumab)、oleclumab、奥仑达利珠单抗(olendalizumab)、奥洛珠单抗(olokizumab)、奥马珠单抗(omalizumab)、omburtamab、oms721、、奥纳珠单抗(onartuzumab)、ontuxizumab、onvatilimab、奥匹努单抗(opicinumab)、莫奥珠单抗(oportuzumab monatox)、奥戈伏单抗(oregovomab)、orticumab、奥昔珠单抗(otelixizumab)、otilimab、otlertuzumab、欧西鲁单抗(oxelumab)、ozanezumab、ozoralizumab、pagibaximab、帕利珠单抗(palivizumab)、pamrevlumab、帕尼单抗(panitumumab)、潘科曼单抗(pankomab)、panobacumab、parsatuzumab、帕考珠单抗(pascolizumab)、pasotuxizumab、pateclizumab、帕曲妥单抗(patritumab)、pdr001、派姆单抗(pembrolizumab)、培妥单抗(pemtumomab)、perakizumab、帕妥珠单抗(pertuzumab)、培克珠单抗(pexelizumab)、皮地利珠单抗(pidilizumab)、pinatuzumab vedotin、平妥单抗(pintumomab)、placulumab、plozalizumab、pogalizumab、polatuzumab vedotin、ponezumab、porgaviximab、prasinezumab、prezalizumab、priliximab、pritoxaximab、普托木单抗(pritumumab)、pro 140、quilizumab、雷妥莫单抗(racotumomab)、雷德图单抗(radretumab)、、雷韦单抗(rafivirumab)、ralpancizumab、雷莫芦单抗(ramucirumab)、ranevetmab、雷珠单抗(ranibizumab)、ravagalimab、雷夫利珠单抗(ravulizumab)、瑞西巴库单抗(raxibacumab)、refanezumab、瑞加韦单抗(regavirumab)、relatlimab、remtolumab、瑞利珠单抗(reslizumab)、利妥木单抗(rilotumumab)、rinucumab、risankizumab、利妥昔单抗(rituximab)、rivabazumab pegol、rmab、罗妥木单抗(robatumumab)、roledumab、若奇单抗(romilkimab)、romosozumab、隆利组单抗(rontalizumab)、rosmantuzumab、rovalpituzumab tesirine、罗维珠单抗(rovelizumab)、洛利昔珠单抗(rozanolixizumab)、鲁利单抗(ruplizumab)、sa237、sacituzumab govitecan、沙玛立珠单抗(samalizumab)、samrotamab vedotin、沙利鲁单抗(sarilumab)、satralizumab、satumomab pendetide、苏金单抗(secukinumab)、塞鲁单抗(selicrelumab)、seribantumab、setoxaximab、setrusumab、sevirumab、sgn-cd19a、shp647、西罗珠单抗(sibrotuzumab)、sifalimumab、司妥昔单抗(siltuximab)、simtuzumab、西普利珠单抗(siplizumab)、sirtratumab vedotin、西鲁库单抗
(sirukumab)、sofituzumab vedotin、solanezumab、solitomab、sonepcizumab、松妥珠单抗(sontuzumab)、斯巴达珠单抗(spartalizumab)、stamulumab、sulesomab、suptavumab、苏替莫单抗(sutimlimab)、suvizumab、suvratoxumab、他贝鲁单抗(tabalumab)、它卡斯珠单抗替赛坦(tacatuzumab tetraxetan)、他度珠单抗(tadocizumab)、talacotuzumab、他利珠单抗(talizumab)、tamtuvetmab、他那珠单抗(tanezumab)、帕他普莫单抗(taplitumomab paptox)、tarextumab、tavolimab、替非珠单抗(tefibazumab)、telimomab aritox、telisotuzumab vedotin、帕他普莫单抗(tenatumomab)、teneliximab、替利组单抗(teplizumab)、tepoditamab、替妥木单抗(teprotumumab)、特度鲁单抗(tesidolumab)、tetulomab、tezepelumab、tgnl412、tibulizumab、替加珠单抗(tigatuzumab)、tildrakizumab、timigutuzumab、timolumab、tiragotumab、替雷利珠单抗(tislelizumab)、tisotumab vedotin、tnx-650、托珠单抗(tocilizumab)、tomuzotuximab、托拉珠单抗(toralizumab)、tosatoxumab、托西莫单抗(tositumomab)、tovetumab、曲罗芦单抗、曲妥珠单抗(trastuzumab)、曲妥珠单抗美坦新(trastuzumab emtansine)、trbs07、tregalizumab、曲美木单抗(tremelimumab)、trevogrumab、西莫白介素图考珠单抗(tucotuzumab celmoleukin)、tuvirumab、优利妥昔单抗(ublituximab)、ulocuplumab、乌瑞鲁单抗(urelumab)、乌头克珠单抗(urtoxazumab)、乌斯他珠单抗(ustekinumab)、乌托米单抗(utomilumab)、vadastuximab talirine、vanalimab、vandortuzumab vedotin、vantictumab、伐努赛珠单抗(vanucizumab)、vapaliximab、varisacumab、伐立鲁单抗(varlilumab)、vatelizumab、维多珠单抗(vedolizumab)、维妥珠单抗(veltuzumab)、vepalimomab、vesencumab、维西珠单抗(visilizumab)、伏巴利珠单抗(vobarilizumab)、伏洛昔单抗(volociximab)、vonlerolizumab、vopratelimab、vorsetuzumab mafodotin、伏妥莫单抗(votumumab)、vunakizumab、xentuzumab、xmab-5574、扎鲁木单抗(zalutumumab)、扎诺木单抗(zanolimumab)、zatuximab、zenocutuzumab、ziralimumab、佐贝妥昔单抗(zolbetuximab)(imab362、克劳西单抗(claudiximab))、和阿佐莫单抗(zolimomab aritox)。
[0233]
其他治疗性分子
[0234]
细胞因子的非限制性实例包括il-2、il-12、tnf-α、ifn-α、ifn-β、ifn-γ、il-10、il-15、il-24、gm-csf、il-3、il-4、il-5、il-6、il-7、il-9、il-11、il-13、lif、cd80、b70、tnf
‑‑
β、lt-β、cd-40配体、fas-配体、tgf-β、il-1α和il-1β。
[0235]
趋化因子的非限制性实例包括il-8、groα、groβ、groγ、ena-78、ldgf-pbp、gcp-2、pf4、mig、ip-10、sdf-1α/β、bunzo/strc33、i-tac、blc/bca-1、mip-1α、mip-1β、mdc、teck、tarc、rantes、hcc-1、hcc-4、dc-ck1、mip-3α、mip-3β、mcp-1-5、嗜酸性粒细胞趋化因子、嗜酸性粒细胞趋化因子-2、i-309、mpif-1、6ckine、ctack、mec、淋巴趋化因子和分形趋化因子。
[0236]
dna烷化剂的非限制性实例包括氮芥类，例如二氯甲基二乙胺、环磷酰胺(异环磷酰胺、曲磷胺)、苯丁酸氮芥(美法仑、泼尼莫司汀(prednimustine))、苯达莫司汀(bendamustine)、尿嘧啶氮芥和雌氮芥(estramustine)；亚硝基脲，例如卡莫司汀(carmustine)(bcnu)、洛莫司汀(lomustine)(司莫司汀(semustine))、福莫司汀(fotemustine)、尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀(ranimustine)和链脲菌素
(streptozocin)；烷基磺酸盐，例如白消安(甘露舒凡(mannosulfan)、曲奥舒凡(treosulfan))；氮丙啶，例如卡波醌(carboquone)、噻替哌(thiotepa)、三亚胺醌(triaziquone)、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)；肼类(甲基苄肼(procarbazine))；三氮烯类，例如达卡巴嗪(dacarbazine)和替莫唑胺(temozolomide)；六甲蜜胺(altretamine)和二溴甘露醇(mitobronitol)。
[0237]
拓扑异构酶i抑制剂的非限制性实例包括喜树碱衍生物，包括cpt-11(伊立替康)、sn-38、apc、npc、喜树碱、托扑替康、甲磺酸依喜替康(exatecan mesylate)、9-硝基喜树碱、9-氨基喜树碱、勒托替康(lurtotecan)、鲁比替康(rubitecan)、silatecan、吉马替康(gimatecan)、二氟替康(diflomotecan)、依喜替康(extatecan)、bn-80927、dx-8951f和mag-cpt，如在pommier y.(2006)nat.rev.cancer 6(10)：789-802和美国专利公开no.200510250854中描述的；原小檗碱(protoberberine)生物碱及其衍生物，包括小檗红碱(berberrubine)和甲氧檗因(coralyne)，如在li et al.(2000)biochemistry 39(24)：7107-7116和gatto et al.(1996)cancer res.15(12)：2795-2800中描述的；菲咯啉衍生物，包括苯并[i]菲啶、两面针碱(nitidine)和花椒宁碱(fagaronine)，如在makhey et al.(2003)bioorg.med.chem.11(8)：1809-1820中描述的；terbenzimidazole及其衍生物，如在xu(1998)biochemistry 37(10)：3558-3566中描述的；以及蒽环类衍生物，包括多柔比星、柔红霉素和米托蒽醌，如在foglesong et al.(1992)cancer chemother.pharmacol.30(2)：123-]25，crow et al.(1994)j.med.chem.37(19)：31913194，和crespi et al.(1986)biochem.biophys.res.commun.136(2)：521-8中描述的。拓扑异构酶ii抑制剂包括但不限于依托泊苷和替尼泊苷。双重拓扑异构酶i和ii抑制剂包括但不限于沙托品(saintopin)和其他萘并萘二酮(naphthecenedione)、daca和其他吖啶-4-羧酰胺、茚托利辛(intoplicine)和其他苯并吡啶并吲哚、tas-i03和其他7h-茚并[2，1-c]喹啉-7-酮、吡唑啉吖啶、xr 11576和其他苯并吩嗪、xr 5944和其他二聚化合物、7-氧代-7h-二苯并[f，ij]异喹啉和7-氧代-7h-苯并[e]啶和蒽基-氨基酸缀合物，如在denny and baguley(2003)curr.top.med.chem.3(3)：339-353中描述的。一些药剂抑制拓扑异构酶ii并且具有dna插入活性，例如但不限于蒽环类(阿柔比星(aclarubicin)、柔红霉素、多柔比星、表柔比星(epirubicin)、伊达比星(idarubicin)、氨柔比星(amrubicin)、吡柔比星(pirarubicin)、戊柔比星(valrubicin)、佐柔比星(zorubicin))和蒽二酮类(米托蒽醌和匹杉琼(pixantrone))。
[0238]
内质网应激诱导剂的非限制性实例包括二甲基塞来昔布(dimethyl-celecoxib，dmc)、奈非那韦、塞来昔布和硼放射增敏剂(即velcade(硼替佐米))。
[0239]
基于铂的化合物的非限制性实例包括卡铂、顺铂、奈达铂(nedaplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin)、四硝酸三铂(triplatin tetranitrate)、赛特铂(satraplatin)、阿罗铂(aroplatin)、洛铂(lobaplatin)和jm-216。(参见mckeage et al.(1997)j.clin.oncol.201：1232-1237和一般而言chemotherapy for gynecological neoplasm，current therapy and novel approaches，in the series basic and clinical oncology，angioli et al.eds.，2004)。
[0240]
抗代谢物药剂的非限制性实例包括基于叶酸的，例如二氢叶酸还原酶抑制剂，例如氨基蝶呤、甲氨蝶呤和培美曲塞；胸苷酸合酶抑制剂，例如雷替曲塞(raltitrexed)、培美
曲塞(pemetrexed)；基于嘌呤的，例如腺苷脱氨酶抑制剂，例如喷司他丁(pentostatin)，硫代嘌呤，例如硫鸟嘌呤和巯基嘌呤，卤代/核糖核苷酸还原酶抑制剂，例如克拉屈滨、氯法拉滨、氟达拉滨，或鸟嘌呤/鸟苷：硫代嘌呤，例如硫鸟嘌呤；或基于嘧啶的，例如胞嘧啶/胞苷：低甲基化剂(hypomethylating agent)，例如阿扎胞苷和地西他滨，dna聚合酶抑制剂，例如阿糖胞苷，核糖核苷酸还原酶抑制剂，例如吉西他滨，或胸腺嘧啶/胸腺嘧啶核苷：胸苷酸合酶抑制剂，例如氟尿嘧啶(5-fu)。5-fu的等同物包括其前药、类似物和衍生物，例如5
′‑
脱氧-5-氟尿苷(doxifluoroidine)、1-四氢呋喃基-5-氟尿嘧啶卡培他滨(xeloda)、si(mbms-247616，由替加氟和两种调节剂5-氯-2，4-二羟基吡啶和草酸钾(potassium oxonate)组成)、雷替曲塞诺拉曲特(no latrexed)(thymitaq，ag337)、ly231514和zd9331，如在papamicheal(1999)the oncologist 4：478-487中描述的。
[0241]
长春碱、长春新碱、长春氟宁、长春地辛和长春瑞滨的非限制性实例。
[0242]
紫杉烷类的非限制性实例包括多西他赛(docetaxel)、拉洛他赛(larotaxel)、奥他赛(ortataxel)、紫杉醇和tesetaxel。埃博霉素的实例是iabepilone。
[0243]
酶抑制剂的非限制性实例包括法尼基转移酶抑制剂(tipifamib)；cdk抑制剂(alvocidib，seliciclib)；蛋白酶体抑制剂(硼替佐米(bortezomib))；磷酸二酯酶抑制剂(阿那格雷(anagrelide)；咯利普兰(rolipram))；imp脱氢酶抑制剂(噻唑呋林(tiazofurine))；以及脂氧合酶抑制剂(马索罗酚(masoprocol))。受体拮抗剂的实例包括但不限于era(阿曲生坦(atrasentan))；类视黄醇x受体(贝沙罗汀(bexarotene))；以及性类固醇(睾丸内酯)。
[0244]
酪氨酸激酶抑制剂的非限制性实例包括erbb的抑制剂：her1/egfr(厄洛替尼(erlotinib)、吉非替尼、拉帕替尼、凡德他尼、舒尼替尼、来那替尼(neratinib))；her2/neu(拉帕替尼、来那替尼)；rtk iii类：c-kit(阿昔替尼、舒尼替尼、索拉非尼)、flt3(来他替尼(lestaurtinib))、pdgfr(阿昔替尼、舒尼替尼、索拉非尼)；以及vegfr(凡德他尼、司马沙尼(semaxanib)、西地尼布(cediranib)、阿昔替尼、索拉非尼)；bcr-abl(伊马替尼、尼洛替尼(nilotinib)、达沙替尼)；src(博舒替尼(bosutinib))和janus激酶2(来他替尼)。
[0245]
化学治疗剂的非限制性实例包括安吖啶(amsacrine)、曲贝替定(trabectedin)、类视黄醇(阿利维a酸(alitretinoin)、维a酸(tretinoin))、三氧化二砷、天冬酰胺耗竭剂天冬酰胺酶/培门冬酶(pegaspargase)、塞来昔布、秋水仙胺(demecolcine)、伊利司莫(elesclomol)、依沙芦星(elsamitrucin)、依托格鲁(etoglucid)、氯尼达明(lonidamine)、硫蒽酮(lucanthone)、米托胍腙(mitoguazone)、米托坦(mitotane)、奥利默森(oblimersen)、替西罗莫司(temsirolimus)和伏立诺他(vorinostat)。
[0246]
可与本公开内容的多肽连接的其他治疗性分子的非限制性实例包括氟氧头孢(flomoxef)；福提米星(fortimicin(s))；庆大霉素；葡氨苯砜苯丙砜(glucosulfone solasulfone)；短杆菌肽s；短杆菌肽；格帕沙星(grepafloxacin)；胍甲四环素(guamecycline)；海他西林(hetacillin)；异帕米星(isepamicin)；交沙霉素(josamycin)；卡那霉素；氟氧头孢；福提米星；庆大霉素；葡氨苯砜苯丙砜；短杆菌肽s；短杆菌肽；格帕沙星；胍甲四环素；海他西林；异帕米星；交沙霉素；卡那霉素；杆菌肽；班贝霉素；比阿培南(biapenem)；溴莫普林(brodimoprim)；丁苷菌素(butirosin)；卷曲霉素
(capreomycin)；羧苄青霉素(carbenicillin)；卡波霉素(carbomycin)；卡芦莫南(carumonam)；头孢羟氨苄(cefadroxil)；头孢孟多(cefamandole)；头孢曲嗪(cefatrizine)；头孢拉宗(cefbuperazone)；头孢克定(cefclidin)；头孢地尼(cefdinir)；头孢托仑(cefditoren)；头孢吡肟(cefepime)；头孢他美(cefetamet)；头孢克肟(cefixime)；头孢甲肟(cefinenoxime)；cefininox；克拉屈滨(cladribine)；阿帕西林(apalcillin)；阿哌环素(apicycline)；安普霉素(apramycin)；阿贝卡星(arbekacin)；阿扑西林(aspoxicillin)；叠氮氯霉素(azidamfenicol)；氨曲南(aztreonam)；头孢地嗪(cefodizime)；头孢尼西(cefonicid)；头孢哌酮(cefoperazone)；头孢雷特(ceforamide)；头孢噻肟(cefotaxime)；头孢替坦(cefotetan)；头孢替安(cefotiam)；头孢唑兰(cefozopran)；头孢咪唑(cefpimizole)；头孢匹胺(cefpiramide)；头孢匹罗(cefpirome)；头孢丙烯(cefprozil)；头孢沙定(cefroxadine)；头孢特仑(cefteram)；头孢布烯(ceftibuten)；头孢唑南(cefuzonam)；头孢氨苄(cephalexin)；头孢甘氨(cephaloglycin)；头孢菌素c(cephalosporin c)；头孢拉定(cephradine)；氯霉素(chloramphenicol)；金霉素(chlortetracycline)；克林沙星(clinafloxacin)；克林霉素(clindamycin)；氯莫环素(clomocycline)；黏菌素(colistin)；环己西林(cyclacillin)；氨苯砜(dapsone)；地美环素(demeclocycline)；地百里砜(diathymosulfone)；地贝卡星(dibekacin)；二氢链霉素(dihydrostreptomycin)；6-巯基嘌呤(6-mercaptopurine)；硫鸟嘌呤(thioguanine)；卡培他滨(capecitabine)；多西他赛(docetaxel)；依托泊苷(etoposide)；吉西他滨(gemcitabine)；拓扑替康(topotecan)；长春瑞滨(vinorelbine)；长春新碱(vincristine)；长春碱(vinblastine)；替尼泊苷(teniposide)；美法仑(melphalan)；甲氨蝶呤(methotrexate)；2-对-磺胺酰基苯胺基乙醇(2-p-sulfanilyanilinoethanol)；4，4
′‑
亚磺酰基二苯胺(4，4
′‑
sulfinyldianiline)；4-磺酰胺基水杨酸(4-sulfanilamidosalicylic acid)；布托啡诺(butorphanol)；纳布啡(nalbuphine).链脲霉素(streptozocin)；多柔比星(doxorubicin)；柔红霉素(daunorubicin)；普卡霉素(plicamycin)；伊达比星(idarubicin)；丝裂霉素c(mitomycin c)；喷司他丁(pentostatin)；米托蒽醌(mitoxantrone)；阿糖胞苷(cytarabine)；磷酸氟达拉滨(fludarabine phosphate)；布托啡诺(butorphanol)；纳布啡.链脲霉素；多柔比星；柔红霉素；普卡霉素；伊达比星；丝裂霉素c；喷司他丁；米托蒽醌；阿糖胞苷；磷酸氟达拉滨；醋地砜(acediasulfone)；乙酰砜(acetosulfone)；阿米卡星(amikacin)；两性霉素b(amphotericin b)；氨苄青霉素(ampicillin)；阿托伐他汀(atorvastatin)；依那普利(enalapril)；雷尼替丁(ranitidine)；环丙沙星(ciprofloxacin)；普伐他汀(pravastatin)；克拉霉素(clarithromycin)；环孢菌素(cyclosporin)；法莫替丁(famotidine)；亮丙瑞林(leuprolide)；阿昔洛韦(acyclovir)；紫杉醇(paclitaxel)；阿奇霉素(azithromycin)；拉米夫定(lamivudine)；布地奈德(budesonide)；沙丁胺醇(albuterol)；茚地那韦(indinavir)；二甲双胍(metformin)；阿仑膦酸钠(alendronate)；尼扎替丁(nizatidine)；齐多夫定(zidovudine)；卡铂；美托洛尔(metoprolol)；阿莫西林(amoxicillin)；双氯芬酸(diclofenac)；赖诺普利(lisinopril)；头孢曲松(ceftriaxone)；卡托普利(captopril)；沙美特罗(salmeterol)；昔萘酸盐(xinafoate)；亚胺培南(imipenem)；西司他丁(cilastatin)；贝那普利(benazepril)；头孢克洛
(cefaclor)；头孢他啶(ceftazidime)；吗啡；多巴胺；比拉米可(bialamicol)；氟伐他汀(fluvastatin)；非那米丁(phenamidine)；鬼臼酸2-乙基肼(podophyllinic acid 2-ethylhydrazine)；吖啶黄(acriflavine)；氯脒佐定(chloroazodin)；胂凡纳明(arsphenamine)；双脒苯脲(amicarbilide)；氨喹脲(aminoquinuride)；奎那普利(quinapril)；羟吗啡酮(oxymorphone)；丁丙诺啡(buprenorphine)；氟尿苷(floxuridine)；地红霉素(dirithromycin)；强力霉素(doxycycline)；依诺沙星(enoxacin)；恩维霉素(enviomycin)；依匹西林(epicillin)；红霉素(erythromycin)；柱晶白霉素(leucomycin(s))；林可霉素(lincomycin)；洛美沙星(lomefloxacin)；光明霉素(lucensomycin)；赖甲环素(lymecycline)；甲氯环素(meclocycline)；美罗培南(meropenem)；甲烯土霉素(methacycline)；小诺霉素(micronomicin)；麦迪霉素(midecamycin(s))；米诺环素(minocycline)；拉氧头孢(moxalactam)；莫匹罗星(mupirocin)；那氟沙星(nadifloxacin)；纳他霉素(natamycin)；新霉素(neomycin)；奈替米星(netilmicin)；诺氟沙星(norfloxacin)；夹竹桃霉素(oleandomycin)；土霉素(oxytetracycline)；对-磺胺酰基苄胺(p-sulfanilylbenzylamine)；帕尼培南(panipenem)；巴龙霉素(paromomycin)；帕珠沙星(pazufloxacin)；青霉素n(penicillin n)；匹哌环素(pipacycline)；吡哌酸(pipemidic acid)；多黏菌素(polymyxin)；普利霉素(primycin)；奎那西林(quinacillin)；核糖霉素(ribostamycin)；利福酰胺(rifamide)；利福平(rifampin)；利福霉素sv(rifamycin sv)；利福喷丁(rifapentine)；利福昔明(rifaximin)；瑞斯托霉素(ristocetin)；利替培南(ritipenem)；罗他霉素(rokitamycin)；氢吡四环素(rolitetracycline)；罗沙米星(rosaramycin)；罗红霉素(roxithromycin)；柳氮磺嘧啶(salazosulfadimidine)；山环素(sancycline)；西索米星(sisomicin)；司帕沙星(sparfloxacin)；壮观霉素(spectinomycin)；螺旋霉素(spiramycin)；链霉素(streptomycin)；琥珀氨苯砜(succisulfone)；磺胺柯定(sulfachrysoidine)；磺胺洛西酸(sulfaloxic acid)；磺胺米柯定(sulfamidochrysoidine)；对氨基苯磺酸(sulfanilic acid)；阿地砜(sulfoxone)；替考拉宁(teicoplanin)；替马沙星(temafloxacin)；替莫西林(temocillin)；四氧普林(tetroxoprim)；甲砜霉素(thiamphenicol)；噻唑砜(thiazolsulfone)；硫链丝菌素(thiostrepton)；替卡西林(ticarcillin)；替吉莫南(tigemonam)；妥布霉素(tobramycin)；托氟沙星(tosufloxacin)；甲氧苄啶(trimethoprim)；丙大观霉素(trospectomycin)；曲伐沙星(trovafloxacin)；结核放线菌素(tuberactinomycin)；万古霉素(vancomycin)；重氮丝氨酸(azaserine)；杀念珠菌素(candicidin(s))；氯苯甘油醚(chlorphenesin)；制皮菌素(dermostatin(s))；菲律宾菌素(filipin)；制霉色基素(fungichromin)；美帕曲星(mepartricin)；制霉菌素(nystatin)；寡霉素(oligomycin(s))；培里霉素a(perimycin a)；杀结核菌素(tubercidin)；6-氮杂尿苷(6-azauridine)；6-重氮-5-氧代-l-正亮氨酸；阿克拉霉素(aclacinomycin(s))；安西他滨(ancitabine)；氨茴霉素(anthramycin)；阿扎胞苷(azacitadine)；重氮丝氨酸；博来霉素(bleomycin(s))；双香豆乙酸乙酯(ethyl biscoumacetate)；乙叉双香豆素(ethylidene dicoumarol)；伊洛前列素(iloprost)；拉米非班(lamifiban)；他前列烯(taprostene)；噻氯香豆素(tioclomarol)；替罗非班(tirofiban)；氨普立糖(amiprilose)；布西拉明(bucillamine)；胍立莫司(gusperimus)；龙胆酸(gentisic acid)；葡美辛
(glucamethacin)；水杨酸乙二醇酯(glycol salicylate)；甲氯芬那酸(meclofenamic acid)；甲芬那酸(mefenamic acid)；美沙拉嗪(mesalamine)；尼氟灭酸(niflumic acid)；奥沙拉嗪(olsalazine)；奥沙西罗(oxaceprol)；s-腺苷甲硫氨酸(s-enosylmethionine)；水杨酸；双水杨酸酯(salsalate)；柳氮磺吡啶(sulfasalazine)；托芬那酸(tolfenamic acid)；卡柔比星(carubicin)；嗜癌霉素a(carzinophillin a)；氯脲菌素(chlorozotocin)；色霉素(chromomycin(s))；二甲叶酸(denopterin)；去氧氟尿苷(doxifluridine)；依达曲沙(edatrexate)；依氟鸟氨酸(eflornithine)；甲基羟基玫瑰树碱(elliptinium)；依诺他滨(enocitabine)；表柔比星(epirubicin)；甘露醇氮芥(mannomustine)；美诺立尔(menogaril)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；莫哌达醇(mopidamol)；霉酚酸(mycophenolic acid)；诺加霉素(nogalamycin)；橄榄霉素(olivomycin(s))；培洛霉素(peplomycin)；吡柔比星(pirarubicin)；吡曲克辛(piritrexim)；泼尼莫司汀(prednimustine)；甲基苄肼；蝶罗呤(pteropterin)；嘌呤霉素(puromycin)；雷莫司汀(ranimustine)；链黑霉素(streptonigrin)；硫咪嘌呤(thiamiprine)；霉酚酸(mycophenolic acid)；丙考达唑(procodazole)；罗莫肽(romurtide)；雷帕霉素(sirolimus(rapamycin))；他克莫司(tacrolimus)；丁胺卡因(butethamine)；非那可明(fenalcomine)；羟丁卡因(hydroxytetracaine)；纳依卡因(naepaine)；俄妥卡因(orthocaine)；哌啶卡因(piridocaine)；水杨醇(salicyl alcohol)；3-氨基-4-羟基丁酸；醋氯芬酸(aceclofenac)；阿米洛芬(alminoprofen)；氨芬酸(amfenac)；溴芬酸(bromfenac)；溴水杨醇(bromosaligenin)；丁丙二苯肼(bumadizon)；卡洛芬(carprofen)；双氯芬酸(diclofenac)；二氟尼柳(diflunisal)；地他唑(ditazol)；因法来酸(enfenamic acid)；依托度酸(etodolac)；依托芬那酯(etofenamate)；芬度柳(fendosal)；非普地醇(fepradinol)；氟芬那酸(flufenamic acid)；雷替曲塞(tomudex)(n-[[5-[[(1，4-二氢-2-甲基-4-氧代-6-喹唑啉基)甲基]甲基氨基]-2-噻吩基]羰基]-l-谷氨酸)、三甲曲沙(trimetrexate)、杀结核菌素、乌苯美司、长春地辛、佐柔比星)；阿加曲班(argatroban)；库美香豆素(coumetarol)和双香豆素(dicoumarol)。
[0247]
细胞毒性因子的非限制性实例包括白喉毒素、铜绿假单胞菌外毒素a链、蓖麻毒蛋白a链、相思豆毒蛋白a链、蒴莲根毒蛋白a链、α-sarcin、油桐(aleurites fordii)蛋白质和化合物(例如脂肪酸)、香石竹毒蛋白、美洲商陆(phytoiacca americana)蛋白质papi、papii和pap-s、苦瓜抑制因子、麻疯树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草抑制因子、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素和伊诺霉素。
[0248]
神经递质的非限制性实例包括精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、γ-氨基丁酸、甘氨酸、d-丝氨酸、乙酰胆碱、多巴胺、去甲肾上腺素(去甲肾上腺素)、肾上腺素(肾上腺素)、血清素(5-羟色胺)、组胺、苯乙胺、n-甲基苯乙胺、酪胺、章鱼胺、synephrine、色胺、n-甲基色胺、花生四烯酰乙醇胺、2-花生四烯酰甘油、2-花生四烯酰甘油醚、n-花生四烯酰多巴胺、virodhamine、腺苷、三磷酸腺苷、缓激肽、促肾上腺皮质激素释放激素、urocortin、甘丙肽、galanin-like peptide、、胃泌素、胆囊收缩素、促肾上腺皮质激素、阿黑皮素原肽、黑素细胞刺激激素、加压素、催产素、neurophysin i、neurophysin ii、神经调节肽u、神经肽b、神经肽s、神经肽y、胰多肽、肽yy、脑啡肽、强啡肽、内啡肽、内吗啡肽、孤啡肽/孤啡肽fq、食欲
肽a、食欲肽b、kisspeptin、神经肽ff、催乳素释放肽、焦谷氨酰化rf酰胺肽、促胰液素、胃动素、胰高血糖素、胰高血糖素样肽-1、胰高血糖素样肽-2、血管活性肠肽、生长激素释放激素、垂体腺苷酸环化酶激活肽、生长抑素、神经激肽a、神经激肽b、物质p、神经肽k、刺鼠相关肽、n-乙酰天冬氨酸、可卡因和安非他明调节转录物、铃蟾肽、胃泌素释放肽、促性腺激素释放激素、黑色素浓缩激素、一氧化氮、一氧化碳和硫化氢。
[0249]
代谢激素的非限制性实例，例如肠降血糖素(其刺激血糖水平的降低)，包括胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1，glp-1)和抑胃肽(gastric inhibitory peptide，gip)及其类似物，例如度拉糖肽艾塞那肽利拉鲁肽和艾塞那肽缓释剂
[0250]
多核苷酸
[0251]
多核苷酸(也称为核酸)是任意长度的核苷酸的聚合物，并且可包括脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经修饰的核苷酸或碱基、和/或者它们的类似物，或者可以通过dna或rna聚合酶并入聚合物的任何底物。在一些实施方案中，本文中的多核苷酸编码多肽，例如抗hsa多肽。如在本领域已知的，多核苷酸中脱氧核糖核苷酸的顺序决定了氨基酸沿着编码的多肽(例如，蛋白质)的顺序。
[0252]
多核苷酸序列可以是脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸的任何序列，可以是单链、双链或部分双链的。多核苷酸的长度可以变化，并且没有限制。因此，多核苷酸可包含例如2至1,000,000个核苷酸。在一些实施方案中，多核苷酸的长度为100至100,000、100至10,000、100至1,000、100至500、200至100,000、200至10,000、200至1,000或200至500个核苷酸。
[0253]
本文中的载体是指用于将分子递送至细胞的载剂。在一些实施方案中，载体是包含与编码多肽的多核苷酸序列可操作连接的启动子(例如，诱导型或组成型)的表达载体。载体的非限制性实例包括病毒载体(例如腺病毒载体、腺相关病毒载体和逆转录病毒载体)、裸dna或rna表达载体、质粒、黏粒、噬菌体载体、与阳离子缩合剂相关的dna和/或rna表达载体，以及包封在脂质体中的dna和/或rna表达载体。载体可以例如，使用任何转染方法(包括，例如，磷酸钙-dna共沉淀、deae-右旋糖酐介导的转染、凝聚胺介导的转染、电穿孔、显微注射、脂质体融合、脂质转染、原生质体融合、逆转录病毒感染或基因枪技术(基因枪法(biolistics)))转染到细胞中。
实施例
[0254]
实施例1.人血清白蛋白(hsa)和小鼠血清白蛋白(msa)结合物的选择
[0255]
使用从约6
×
10
10
多样性大小的文库中添加的约1
×
10
12
个噬菌体，从文库中进行hsa或msa结合性噬菌体的选择。
[0256]
通过从噬菌体展示文库进行选择来鉴定本公开内容的hsa结合性肽，所述文库包含展示在基于sqt序列的恒定构架主链中长度为9个氨基酸的随机环序列。将噬菌体的混悬液与靶抗原(在链霉亲和素珠上捕获的生物素化抗原或在板上捕获的未生物素化抗原)一起孵育。然后洗去未结合的噬菌体，并随后，通过在低ph下孵育抗原，然后在高ph下孵育来洗掉未结合的噬菌体。然后，用释放的、ph中和的噬菌体感染大肠杆菌，并获
得第一轮噬菌体的制备物。重复该循环两到三次。为了富集靶向噬菌体，在后面几轮选择中增加严格条件。增加的严格条件包括增加洗涤步骤的数目、降低抗原浓度和/或用封闭的链霉亲和素珠或包被有封闭试剂的孔进行预选。
[0257]
本文中用于噬菌体选择的抗原是hsa(sigma；a3782)和msa(alpha diagnostics；alb13-n-25)。使用ez link sulfo-nhs-lc生物素试剂盒(pierce)在内部进行抗原生物素化。
[0258]
通过连续几轮噬菌体扩增进行选择后，通过如下所述的噬菌体elisa鉴定hsa和msa结合性克隆。噬菌体选择后，将包含噬菌粒载体的单个细菌克隆从滴定板移至96孔细胞培养形式中。在辅助噬菌体拯救和过夜生长后，将展示与基因-iii次要外壳蛋白融合的hsa多肽的重组噬菌体颗粒释放到培养物上清液中。随后通过elisa筛选上清液中包含的噬菌体与抗原的结合。用hrp缀合的抗m13单克隆抗体(ge healthcare)检测与固定在板上的抗原结合的噬菌体展示并使用一步超tmb-elisa底物(thermo scientific)对elisa进行显影。
[0259]
对从噬菌体选择中鉴定的多肽环2和环4进行比对(图1)。通过比对，鉴定了来自hsa和msa噬菌体选择的序列基序家族(图2)。
[0260]
实施例2.多肽大肠杆菌蛋白产生
[0261]
所有在大肠杆菌中表达的多肽都已克隆有c端六组氨酸标签(hhhhhh；seq id no：168)以简化用固定化金属亲和色谱树脂(imac树脂)的蛋白质纯化。当需要时，可以在多肽和his标签之间添加另外的肽序列，例如myc(eqkliseedl；seq id no：162)以用于检测，或者tev蛋白酶切割位点(enlyfq(g/s)；seq id no：163)以允许去除标签。蛋白从大肠杆菌中表达，并使用imac、iex和sec纯化。使用制造商的方案，通过将表达质粒pd861(atum)转化到bl21大肠杆菌细胞(millipore)中来进行从大肠杆菌中纯化单体。将全部转化的细胞混合物铺板在包含50μg/ml卡那霉素(applichem)的lb琼脂平板上，并在37℃下孵育过夜。第二天，将转化的大肠杆菌菌苔(lawn)转移到含有1
×
terrific肉汤培养基(melford)和50μg/ml卡那霉素的无菌烧瓶中，并在30℃以250rpm振荡进行培养。一旦细胞达到约0.8至1.0的光密度od
600
，就用10mm鼠李糖(alfa aesar)诱导表达。然后将培养物在37℃下再培养5小时。通过离心和溶解所得细胞沉淀来收获细胞。使用his标记的蛋白质的分批结合亲和纯化来进行多肽纯化。具体地，使用镍琼脂糖亲和树脂(super-ninta500；generon)。用npi20缓冲液(50mm磷酸钠，0.5m nacl，20mm咪唑)洗涤树脂，并用5倍柱体积(column volume，cv)的npi400缓冲液洗脱结合的蛋白质。然后使用cm ff离子交换柱(exchange column，ge)在运行缓冲液中通过阳离子交换纯化洗脱的蛋白质，对于克隆hsa-31(seq id no：113)，运行缓冲液为ph 5.2的20mm乙酸钠，以及对于克隆hsa-41(seq id no：116)，运行缓冲液为ph 6.0的25mm mes。两种蛋白质纯化都还包括0.1％triton 114x(sigma)洗涤步骤，并用1m nacl线性梯度洗脱蛋白质。在使用在pbs 1
×
缓冲液中运行的hiload 26/600 superdex 75pg(ge healthcare)进行的制备型sec上进行第三阶段纯化。使用pbs 1
×
的流动相，使用具有acclaim sec-300柱(thermo)的sec-hplc(图3a)分析克隆hsa-41(seq id no：116)和hsa-31(seq id no：113)的表达和纯度。使用nanodrop(thermo)a280读数估计蛋白质产量，并且最终产物在200伏下在novex
tm 20
×
bolt
tm mes sds运行缓冲液(thermo)中
的sds-page bolt bis tris plus 4至12％凝胶(thermo)上运行，样品在还原缓冲液中加热。凝胶上的蛋白质条带用quick commassie(generon)染色。将经pageruler预染色蛋白质分子量标志物(thermo)在凝胶上运行，以估计三阶段纯化后融合蛋白的分子量(图3b)。
[0262]
实施例3.血清白蛋白结合性多肽的表征
[0263]
在ph 6.0和ph 7.4二者下，通过生物层干涉测量术(octet)评估经纯化的hsa-20(seq id no：111)、hsa-31(seq id no：113)、hsa-36(seq id no：114)、hsa-41(seq id no：116)蛋白与人、小鼠和食蟹猴血清的结合亲和力。在ph 6.0下，hsa结合亲和力为7.1nm至135.5nm，在ph 6.0下，msa亲和力为3.7nm至833.7nm，以及在ph 6.0下，csa亲和力为18.5nm至1.15um(数据显示在图4a至4d、表4中)。在ph 6.0或7.4下，经生物素化的抗原以1μg/ml被捕获到sa传感器上在包含pbs-t(0.01％吐温20)+1％酪蛋白的缓冲液中，持续600秒。进行300秒的缔合和600秒的解离，并使用ph 1.5的10mm甘氨酸(ge healthcare)进行再生持续3
×
5秒。所有步骤都在1000rpm和25℃下进行。在约10
×
kd值的起始浓度下分析两倍连续稀释的经纯化多肽。使用octet数据分析软件进行动力学分析，减去参考传感器(负载有抗原)，将y轴与基线对齐，并使用步间校正以将缔合与解离对齐。应用savitzky-golay滤波并处理数据。进行数据分析，其采用1∶1模型，全局拟合，r
最大
不与传感器相关联。
[0264]
表4.在ph 6.0和7.4下蛋白与人、小鼠和食蟹猴血清白蛋白结合的kd值。
[0265][0266]
还使用表面等离子体共振(surface plasmon resonance，spr)在ph 7.4下测量了四(4)种结合物对小鼠、人和食蟹猴血清的亲和力(图5、表5)。使用运行缓冲液hbs-ep+(ge healthcare)和系列s传感器cm5芯片(ge healthcare)进行biacore t200动力学分析，所述芯片固定在表面fc2、fc3和fc4上，其分别具有在ph 5.0的10mm乙酸钠(ge healthcare)中的hsa(sigma；a37812)、msa(sigma；a3559)或cyno血清白蛋白(cyno serum albumin，csa)(abcam；ab184894)(使用胺偶联试剂(ge healthcare)进行)。将单体的浓度滴定作为分析物以30μl/分钟或60μl/分钟的流量运行。减去fc2-1、fc3-1和fc4-1动力学数据空白，并将其拟合至1∶1朗缪尔结合模型(biacore评价软件；ge)以计算kd值。
[0267]
表5.使用在ph 7.4下测量的biacore spr测量的四种结合物与
人、小鼠和食蟹猴血清白蛋白的结合动力学
[0268][0269]
实施例4.血清白蛋白物种交叉反应性
[0270]
通过在ph 6.0和ph 7.4二者下的结合elisa，分析对hsa具有最高亲和力的五(5)种蛋白与人、食蟹猴、马、犬、小鼠、兔、猪和大鼠血清白蛋白的交叉反应性(图7a至7b、表6)。简言之，elisa如下进行：
[0271]
将人(sigma-aldrich)、食蟹猴和小鼠(abcam)、马(abcam)、犬(abcam)、小鼠(sigma-aldrich)、兔(sigma-aldrich)、猪(sigma-aldrich)和大鼠(sigma-aldrich)的血清白蛋白在适当ph(ph 6.0或7.4)以1μg/ml在pbs中在96孔板(corning costar)上包被过夜。使用pbs中的5％酪蛋白(sigma-aldrich)缓冲液使板饱和。封闭后，将稀释的五(5)种铅结合物(hsa-18(seq id no：110)、hsa-20(seq id no：111)、hsa-36(seq id no：114)、hsa-31(seq id no：113)和hsa-41(seq id no：116))添加至板，并孵育90分钟。然后洗涤板，并使用经生物素化的多克隆抗体抗半胱氨酸蛋白酶抑制剂(r&d system)检测蛋白持续90分钟。洗涤后，添加链霉亲和素-hrp(thermo fisher scientific)并孵育30分钟。最后洗涤之后，使用tmb(thermo fisher scientific)使反应显影，并在450nm下使用读板仪读取板(图6)。
[0272]
表6.在ph 7.4下的血清白蛋白物种交叉反应性结合-ec
50
(nm)
[0273]
物种hsa-18hsa-20hsa-31hsa-36hsa-41人1.4118.900.47687.30.05食蟹猴7.149.550.43447.112.85小鼠nana0.03na42.5兔847.1na210.9863.0380.9马nana0.25661.8150.1
犬96.47na3.17383.421.49猪615.0893.82.60267.551.71大鼠89.4316.100.399.734.18
[0274]
实施例5.五种铅血清白蛋白结合物在小鼠体内的药代动力学谱
[0275]
选择五(5)种蛋白以进行体内测试，即hsa-18(seq id no：110)、hsa-20(seq id no：111)、hsa-31(seq id no：113)、hsa-36(seq id no：114)、hsa-41(seq id no：116)，其对于msa具有一系列不同的亲和力和缔合及解离常数。使用i-125对蛋白进行放射性标记，并在每个时间点以10mg/kg作为推注iv注射剂向三(3)只小鼠给药。通过测量放射性，在七(7)天内的八(8)个时间点(0.25至168小时)确定蛋白的血清浓度(图8、表7)。与sqt gly his对照单体蛋白相比，所有蛋白的半衰期都增加，并且所有克隆在体内都具有良好的耐受性。
[0276]
表7.非房室分析中蛋白在小鼠体内的药代动力学参数：(半衰期，t
1/2
)和暴露(auc 0-t)：
[0277]
克隆t1/2(小时)auc 0-t(h*mg/ml)hsa-4138.25670hsa-3637.73435hsa-2030.61401
[0278]
克隆t1/2(小时)auc 0-t(h*mg/ml)hsa-1824.31059hsa-3129.0112sqt-gly his(对照)1.618.1
[0279]
实施例6.c端his标签经切割的半衰期延长的多肽在小鼠体内的药代动力学谱
[0280]
为了确保c端6
×
his标签的存在不影响多肽在体内的药代动力学谱，在蛋白质和纯化标签之间引入了tev可切割接头。由于在多肽-myc c端基因插入物之后包含了tev切割位点氨基酸序列enlyfqg(seq id no：164)，因此前导克隆hsa-41(seq id no：116)的c端6
×
his标签的切割是可能的。如制造商(invitrogen)所建议的，将多肽与actev在30℃下孵育1小时，并通过结合ninta树脂(generon)去除切割的his标签，并收集经切割的蛋白流过物。进行抗his(r&d system)western印迹以确认不再能检测到his标签。使用octet如实施例3中所述来测量多肽结合动力学，并显示在切割c端6
×
his标签后，多肽在ph 7.4下保留了与hsa和msa的结合特性(图9)。评价了iv注射his标签经切割的蛋白相较于c端带his标签的蛋白的药代动力学谱。使用抗半胱氨酸蛋白酶抑制剂夹心elisa对每个时间点来自三(3)只小鼠的合并血清分析了八(8)个时间点，结果显示在存在和不存在c端his标签的情况下，蛋白质具有相似的延长pk(图10)。
[0281]
实施例7.在血清白蛋白结合性多肽的存在下hsa的fcrn结合
[0282]
当500nm多肽与hsa在ph 6.0下预孵育时，hsa与重组fcrn的结合的实例不受影响(图11)。根据制造商的方案(ge healthcare)，使用生物素capture芯片进行
fcrn biacore结合分析。简言之，生物素capture试剂以2μl/分钟的流量在表面fc1和fc2上运行300秒，然后以10μg/ml捕获经生物素化的fcrn(amsbio)，其中接触时间为50秒，以10μk/分钟运行，仅递送至fc2。2.5μm的恒定hsa浓度流过表面fc1和fc2，与500nm的在pbs-t ph 6.0中的hsa-20(seq id no：111)预混合或不预混合。与单独的白蛋白相比，当多肽与hsa结合时，hsa与fcrn的结合没有差异。根据制造商的方案进行表面fc1和fc2再生。
[0283]
实施例8.pd-l1结合性半衰期延长的内联融合(ilf)二聚体
[0284]
三(3)种pd-l1结合性多肽即ava04-236(seq id no：117和118)、ava04-261(seq id no：119和120)和ava04-269(seq id no：121和122)的半衰期通过在n或c端与hsa-41(seq id no：116)进行遗传融合而延长。使用刚性a(eaaak)6(seq id no：161)或柔性(g4s)6(seq id no：165)重复遗传接头形成为二聚体遗传融合体的半衰期延长的pd-l1多肽的示意图在图12a中给出，并且ilf取向和命名表在表8中示出。如实施例3所述从大肠杆菌中产生ilf二聚体。简言之，使用三个阶段纯化蛋白质：亲和捕获、iex和制备型sec。使用sec-hplc评估最终的ilf蛋白纯度，并显示为＞95％纯(图12b)。biacore动力学分析显示遗传融合的两种多肽都能够与靶抗原即人pd-l1-fc(r&d system)和hsa(sigma)接合(表9)。如实施例3所述进行biacore以分析hsa结合。为了分析pd-l1-fc结合动力学，使用运行缓冲液hbs-ep+和系列s传感器cm5(ge healthcare)芯片fc2进行biacore t200动力学分析，所述芯片使用胺偶联剂(ge healthcare)固定有在ph 4.0的10mm乙酸钠中的pd-l1-fc(r&d system)。将ilf多肽的浓度滴定作为分析物在30μl/分钟的流量下运行。再生的pd-l1-fc以20μl/分钟的流量用3mm naoh(ge healthcare)固定在表面上20秒。减去fc2-1数据空白并将其拟合至1∶1朗缪尔结合模型(biacore评价软件；ge)以计算表观kd值。
[0285]
表8.半衰期延长的pd-l1(ava04)结合性ilf蛋白与hsa结合性蛋白的命名
[0286][0287]
表9.蛋白的biacoretm动力学分析
[0288][0289]
实施例9.pd-l1结合性二聚体半衰期延长的内联融合三聚体
[0290]
图13示出了pd-l1结合性二聚体(seq id no：129的两个单体)的示意图，所述二聚体用刚性接头(eaaak)6(seq id no：161)与hsa-41(seq id no：116)遗传融合。如实施例3所述，使用通过亲和捕获、iex和制备型sec纯化的蛋白质，在大肠杆菌中进行ilf产生。使用sds-page和sec-hplc评估蛋白质纯度。发现多肽的为99.8％至100％纯(图14)。biacore动力学分析显示，经遗传融合的二聚体能够与它们的两种靶蛋白接合(图15a)。发现ava04多肽与pd-l1和hsa-41(seq id no：116)结合并与hsa接合。如实施例3所述进行biacore分析以分析hsa结合，以及如实施例8所述分析pd-l1-fc结合(表10)。
[0291]
为了评价在affimer内联融合形式的不同位置添加hsa-41是否影响ava04-251与人pd-l1的结合，用三(3)种ilf形式的多肽进行pd-l1结合elisa(图16)。简言之，人pd-l1-fc(r&d system)嵌合蛋白在碳酸盐缓冲液中以0.5mg/ml包被在96孔板中。用5％酪蛋白/pbs缓冲液进行饱和之后，洗涤板，并将对照或多肽的稀释物孵育90分钟。然后洗涤板，并添加经生物素化的多克隆抗体抗半胱氨酸蛋白酶抑制剂a(r&d system)持续1小时。洗涤板，并使用链霉亲和素-hrp检测多肽。在最后的洗涤步骤后，添加tmb进行实验的显影，并在450nm处读取板。测试的三(3)个构建体表现出相似的ec
50
(范围从0.03至0.1nm)，并且与抗pd-l1亲本ilf二聚体分子(ava04-251 bh(seq id no：129))相同。当进行半衰期延长的多肽与亲本分子相比较的pd-1/pd-l1阻断生物测定(promega)时，证实了这一点(图17)。根据制造商说明书一式两份运行pd-1/pd-l1阻断生物测定(promega)，并显示测试的三(3)个构建体具有相似的ec
50
值(在2倍差异内)，并且与亲本二聚体分子(ava04-251bh；seq id no：129)相同。
[0292]
类似地，在ph 7.4下，使用elisa评估三(3)种半衰期延长的多肽与人血清白蛋白的结合。简言之，在ph 7.5下，以1mg/ml的浓度将hsa包被在96孔板中。在用ph 7.5的5％pbs酪蛋白饱和后，洗涤板，并将对照或多肽的稀释物孵育90分钟。然后洗涤板，并添加经生物素化的多克隆抗体抗半胱氨酸蛋白酶抑制剂a(r&d system)1小
时。洗涤板，并使用链霉亲和素-hrp检测多肽。在最后的洗涤步骤后，添加tmb进行实验的显影，并在450nm处读取板。所测试的三(3)个构建体表现出相似的ec
50
(范围为0.03至0.06nm)并且与亲本分子(hsa-41；seq id no：116)相同(图18)。
[0293]
表10.多肽(pd-l1-fc，hsa)的biacore
tm
动力学分析
[0294][0295]
实施例10.半衰期延长的ilf三聚体的混合淋巴细胞反应
[0296]
在混合淋巴细胞反应(mixed lymphocyte reaction，mlr)测定中测试了ava04-251 xt内联融合形式的多肽(图19)。简言之，从培养七(7)天的cd14
+
单核细胞制备衍生自单核细胞的树突细胞(dendritic cell，dc)。在第7天使用未成熟的dc，并将其与同种异体t细胞(负分离(negative isolation))和参考物质或载剂对照(rpmi-10培养基)一起培养。将细胞培养4天，并在培养期结束时通过elisa测量上清液中的ifnγ。数据以平均值+/-标准差pg/ml表示，或归一化为载剂对照(n＝6)。虚线表示平均载剂(rpmi-10)值。发现半衰期形式的多肽ava04-251 xt14(seq id no：123)提高了ifnγ的水平，类似于其对照(非半衰期延长的)(图21)。
[0297]
实施例11.pd-l1结合性半衰期延长的内联融合多肽在小鼠体内的药代动力学谱
[0298]
在c57/bl6小鼠的药代动力学研究中测试了半衰期延长的ilf ava04-251三聚体。如图20所述，以10mg/kg的剂量静脉内注射(intravenously，iv)小鼠。使用六只小鼠，并在九个时间点(0、0.25、6、24、72、120、168和336小时)收集血清。合并每个时间点的血清样品，并使用注射的经纯化分子作为参考标准品，通过夹心elisa进行分析。结果以15分钟时初始剂量的百分比表示。没有半衰期延长的ilf蛋白(ava04-251 bh seq id no：129)具有快速清除(t
1/2
3.2小时)，而ilf ava04-251 xt形式均显示半衰期延长，估计在β相(23.8至24.2小时)。
[0299]
实施例12.ilf三聚体的小鼠异种移植物模型测试
[0300]
从一名健康供体中分离出pbmc。分离总t细胞，并将其在补充有il-2的完全培养基中针对a375细胞扩增两轮，持续7至10天。在小鼠(n＝10)的右胁腹区域皮下接种a375肿瘤细胞和经活化的t细胞(在pbs中0.2ml)用于肿瘤发展。细胞接种之后一小时开始处理。每周两(2)次，持续三(3)周施用ava04-251 xt14(seq id no：123)纯化蛋白。总的来说，在随机
化之后第13天，与对照组相比，两种治疗均显示出肿瘤生长抑制。与被给予非结合性多肽ilf sqt gly xt28(seq id no：128)的对照组相比，用ava04-251 xt14(seq id no：123)处理的小鼠中超过70％的小鼠具有减小的肿瘤尺寸(图21a至21c)。
[0301]
实施例13.ava04半衰期延长的ilf三聚体c端cys多肽表达
[0302]
通过快速变化诱变(agilent)合成半衰期延长三聚体，以在c端6
×
his标签后进一步包含c端半胱氨酸，从而产生ava04-251 xt14 cys(seq id no：126)。如实施例3所述，从大肠杆菌中产生蛋白，并用亲和、iex和制备型尺寸排阻纯化。用2mm tcep在还原条件下表征经纯化的蛋白质，其显示最终蛋白质的纯度＞97％(图22)。因此，可以利用游离半胱氨酸产生ilf蛋白，随后使用马来酰亚胺化学反应进行缀合，以使得能够产生蛋白-药物缀合物。
[0303]
实施例14：hsa-41在针对fcrn和血清白蛋白人源化的双转基因小鼠中的药代动力学谱
[0304]
如前表明的，hsa蛋白的半衰期与其对血清白蛋白的结合亲和力相关。hsa-41(seq id no：116)对人血清白蛋白的亲和力明显高于小鼠。因此，在双转基因人源化新生fc受体(fcrn)/人血清白蛋白小鼠模型中评价前导分子hsa-41(seq id no：116)的pk谱，以更接近地模拟在人中发现的生理相互作用。如图23所述，以10mg/kg的剂量静脉内注射(iv)小鼠。注射9只小鼠，并在10(十)个时间点收集血清(直到336小时)。合并每个时间点的血清样品，并使用注射的分子作为参考标准品，通过夹心elisa对其进行分析。结果以浓度最大值的百分比表示。在该转基因小鼠模型中，hsa-41多肽(seq id no：116)蛋白在β期的半衰期估计为约145小时。
[0305]
实施例15：3种前导多肽在食蟹猴中的药代动力学谱
[0306]
三(3)种蛋白，即hsa-18(seq id no：110)、hsa-31(seq id no：113)和hsa-41(seq id no：116)，在小鼠中显示出不同的pk谱。在每组的两(2)只动物(一只雄性和一只雌性)中，多肽以5mg/kg的剂量以推注静脉内(iv)注射进行施用。通过elisa在28(二十八)天内的14(十四)个时间点(0.25至672小时)测定蛋白的血清浓度。所有测试的蛋白在体内均耐受性良好(图24和表11)。
[0307]
表11.蛋白在小鼠体内的药代动力学参数(半衰期，t
1/2
)
[0308][0309]
实施例16.抗小鼠pd-l1结合物半衰期延长的内联融合三聚体
[0310]
ava04-182 xt20(seq id no：127)半衰期延长的ilf三聚体由大肠杆菌产生。sds-page和sec-hplc分析如实施例2中所述运行，并显示出最终蛋白质纯度＞98％(图25a)。经纯化的蛋白在biacore上运行，以评估其与小鼠pd-l1-fc标记的重组抗原(r&d system)的亲和力。使用蛋白a芯片(ge healthcare)捕获抗原，并使用从1nm的最大浓度开始滴定的单
循环动力学将ilf形式作为分析物运行，并使用ph 1.5的10mm甘氨酸(ge healthcare)再生。减去fc2-1动力学数据空白，并将其拟合至1∶1朗缪尔结合模型(biacore评价软件；ge healthcare)以计算出90.6pm的kd值，证实以这种形式添加半衰期延长的多肽不影响ava04-182与小鼠pd-l1靶抗原的结合(图25b)。
[0311]
在elisa中评价ava04-182 xt20(seq id no：127)ilf在ph 7.4和ph 6.0与hsa结合的能力(如实施例4中所述)。图26a和26b显示出ava04-182 xt20保留了hsa-41与msa结合的能力。另外，为了评价半衰期延长的多肽是否是功能性的，进行了竞争性elisa(mpd-1/mpd-l1)。简言之，将pd-1在碳酸盐缓冲液中以1μg/ml的浓度在板上包被过夜。然后使用5％酪蛋白/pbs缓冲液使板饱和。同时，mpd-l1与半衰期延长的多肽的稀释物及其对照一起预孵育。饱和之后，将混合物添加到板，并孵育90分钟。然后洗涤板，并添加检测用多克隆抗体，经生物素化的抗pd-l1。洗涤板之后，添加链霉亲和素-hrp持续30分钟。在最后的洗涤之后，使用tmb(pierce)进行反应的显影，并使用读板仪在450nm下读取板(图26c)。该图显示出半衰期延长的多肽与其亲本分子具有相似的中和能力。
[0312]
作为概念的证明，在小鼠中进行了药代动力学研究。每组12只动物腹膜内(intraperiotneally，ip)注射有25mg/kg的多肽。每个时间点使用三只动物。在八(8)个时间点，抽取血清，直到注射之后336小时。使用elisa分析合并的血清，以量化血清中多肽的水平。在这项研究中，半衰期延长的多肽的药代动力学谱显示半衰期为约17小时(图27)。
[0313]
实施例17：ava 04-251 bh-800 cw在a375小鼠异种移植物模型中的生物分布
[0314]
在小鼠异种移植物模型中评估了抗pd-l1多肽是否靶向表达人pd-l1的肿瘤，其中使用荧光成像来检查ir染料缀合的多肽随时间的生物分布。ava04-251 bh cys(seq id no：130)和ava04-251 xt14 cys(seq id no：126)与irdye 800cw(li-cor)利用马来酰亚胺化学反应进行缀合，以修饰蛋白质上可接近的氨基。将多肽在50mm mes ph 6、150mm nacl、1mm tcep中稀释至1mg/ml，并与irdye 800cw(4mg/ml在水中)在室温(约23℃)下在黑暗条件中以染料：蛋白质9∶1的化学计量比孵育2小时。根据制造商的说明使用5ml zeba spin脱盐柱(mwco 7000；pierce)相对于染料缀合的多肽而分离出游离染料。基于280和780nm处的吸光度，按照下式计算染料：蛋白质的比例：
[0315]
染料：蛋白质比例＝(a780/ε染料/(a280-(0.03
×
a780))/ε蛋白质，
[0316]
其中0.03是irdye 800cw在280nm处吸光度的校正因子，以及ε染料和ε蛋白质分别是染料和蛋白质的摩尔消光系数，即染料270,000m-1
cm-1
和蛋白质39871m-1
cm-1
(对于ava04-251 bh cys(seq id no：130))和37626m-1
cm-1
(对于ava04-251 xt14 cys(seq id no：126))。图28a至28c示出了使用sec-hplc和sds-page分析方法(如实施例2中详述的)的缀合材料的形式示意图和纯度。
[0317]
使用pd-l1结合elisa将染料缀合的ava04-251 bh-800或ava04-251 xt14-800与重组人pd-l1的结合与未缀合的多肽进行比较。
[0318]
简言之，将人pd-l1 fc(r&d system)嵌合蛋白以0.5μg/ml包被在96孔板中的碳酸盐缓冲液中。用5％酪蛋白/pbs缓冲液饱和之后，洗涤板，并将未缀合对照或缀合
多肽的稀释物孵育90分钟。然后洗涤板，添加经生物素化的多克隆抗体抗半胱氨酸蛋白酶抑制剂a(r&d system)，并将板孵育1小时。洗涤板，并使用链霉亲和素-hrp检测结合的多肽。在最后的洗涤步骤之后，添加tmb，并在450nm处读取板。缀合的多肽表现出与亲本分子相似的ec
50
。因此，基于可比较的结合曲线，数据表明染料缀合不影响两种缀合形式分子对pd-l1靶标的亲和力(图29)。
[0319]
在将a375细胞(100μl无菌pbs中的5
×
106个细胞[atcc])皮下注射到雌性无胸腺裸鼠(charles river laboratories)的胁部后，在动物中建立a375小鼠异种移植物模型。每周监测肿瘤三(3)次，用卡尺测量发展中的肿瘤。在将ava04-251 bq-800和bh-800(1纳摩)静脉内注射到三(3)只小鼠的尾静脉中之前，允许肿瘤生长到500至1000mm3。紧接在注射之后(时间0)和给药之后1、2、4、8、24和48小时时用xenogen ivis 200生物光子成像仪记录荧光图像。在四(4)小时时间点，检测到针对肿瘤的半衰期延长的抗pd-l1多肽的靶向性。数据在图30中显示，以及箭头表示肿瘤的大致位置。
[0320]
实施例18：hsa-41l多肽与hsa复合的结晶
[0321]
如实施例2所述，使用ninta和制备型尺寸排阻色谱从bl21大肠杆菌细胞中表达和纯化hsa-41(seq id no：116)。hsa是从sigma cat.no.a3782购买的并重构成50mg/ml。将经纯化的多肽与hsa以1∶1.5的摩尔比混合1小时，并轻轻搅拌。使用10mm tris ph 7.4和150mm nacl缓冲液作为流动相，使用制备型尺寸排阻色谱来纯化所形成的蛋白质复合物。将正确分子量的洗脱复合物级分浓缩至105.3mg/ml，在液氮上快速冷冻，并储存在-80℃下。为了进行晶体学分析，将数个商业筛选设置在+4℃和+18℃两种温度下。使用100∶100nl蛋白质比储液进行坐滴蒸汽扩散法。结晶筛选设置为：md jcsg+、md pact、md proplex、md structure和hampton salt rx。在从10mm氯化镍(ii)六水合物、0.1m tris-hcl ph 8.5和20％w/v peg 2000 mme产生的晶体中获得的晶体上收集衍射数据集(图31a)。用diamond light source，uk收集数据。衍射数据集近完全(蛋白质复合物的3d晶体结构，图31b)。hsa-41(seq id no：116)显示主要通过多肽环2相互作用而结合hsa的结构域ii，这是因为电子密度表明蛋白质表面上ni
2+
离子的共价修饰，并且可能促进结晶。的总相互作用面积主要通过结合环2，发现其在环内形成α螺旋结构，并且该界面的特征是亲水和疏水相互作用的混合。环4存在很少的相互作用。图31c、31d和表12示出了多肽与hsa之间的特定氨基酸相互作用。
[0322]
表12.hsa-41多肽与hsa的晶体结构预测氨基酸相互作用
[0323]
[0324][0325]
实施例19：环2和4的hsa-41丙氨酸扫描突变体概述
[0326]
使用定点突变对多肽hsa-41(seq id no.116)针对在环2和环4的每个氨基酸中的丙氨酸残基进行突变，以鉴定哪些氨基酸与靶抗原接合。如实施例3所述，对从大肠杆菌中产生的最终克隆进行序列验证，并进行亲和纯化。在sec-hplc上进行一阶段纯化后，比较了总共十八(18)个丙氨酸突变体的蛋白质纯度和在50nm(标准蛋白质浓度)下在biacore上在ph 7.4下针对hsa的结合响应。数据显示环2大量参与与靶标的结合，其中当突变为丙氨酸时，残基51、52、55、56和58失去结合信号。在环4中，当突变为丙氨酸时，第一位置84失去其结合能力，并且环的剩余部分较少参与结合(表13)。因为当任一个替换丙氨酸时，蛋白质纯度降低，所以sec-hplc数据显示环2位置50和55可能涉及自身缔合。
[0327]
表13.丙氨酸突变体筛选的结果
[0328][0329]
实施例20：hsa-41环4敲除突变体
[0330]
从hsa-41(seq id no：116)(实施例18)的解析晶体结构和丙氨酸扫描(实施例19)
实验中，hsa-41显示出主要通过环2结合hsa。多肽被设计为利用缺失(seq id no：141)或通过用9个甘氨酸残基替代该环(seq id no：142)来敲除环4。这些突变体失去了与靶抗原结合的能力，这表明环4是hsa-41与靶接合和半衰期延长所需的(图36)。
[0331]
实施例21：hsa-41的ilf同二聚体的亲合力
[0332]
多肽被遗传融合以形成具有刚性(hsa-41 bk；seq id no：131)或柔性(hsa-41 di；seq id no：132)重复接头的ilf同二聚体(示意图图32a)。如实施例3所述，从大肠杆菌中产生和纯化多肽。在ph 7.4下进行biacore动力学分析，以结合固定的hsa(如实施例3所述)。当多肽以pm kd值融合(相较于nm单体与hsa结合)时，该分析示出了亲合力(图32b和32c)。
[0333]
实施例22：hsa-41与血清白蛋白的孵育，sec-hplc表征
[0334]
多肽hsa-41(seq id no：116)与hsa(sigma)以1∶1或1∶2的比例孵育1至4小时的时间进程。将hsa-41hsa复合物的总质量与在sec-hplc acclaim-300柱(thermo)上运行的融合蛋白(80.5kda)的质量对照进行比较。结果显示，在1小时后具有1∶1结合化学计量的复合物的预期分子量(molecular weight，mw)为83kda(图33a至33c)。在二聚体内联融合(ilf)蛋白形式：hsa-41di(seq id no：132)或hsa-41bk(seq id no：131)的孵育下进行相同的实验。ilf蛋白与hsa一起孵育超过4小时(图34)。在yarra-3000(phenomenex)柱上对这些样品进行sec-hplc分析，并且数据显示hsa：ilf二聚体的结合化学计量比为2∶1，以及两种多肽以ilf形式同时与hsa接合。ilf二聚体：hsa复合物以约160kda的质量在柱上运行，其mw比150kda的单克隆抗体质量对照更高(图34)。
[0335]
实施例23：hsa-41单体和ilf二聚体在c57bl/6小鼠中的药代动力学分析
[0336]
向九(9)只野生型c57bl/6小鼠静脉内注射10mg/kg多肽，并在10个时间点(0.25分钟和2、6、12、24、72、120、168、336和504小时)收集血液样品。制备血清并将其冷冻直至分析。对于每个时间点，合并血清，并使用抗半胱氨酸蛋白酶抑制剂夹心elisa检测和定量多肽。分析数据显示，在野生型小鼠中，从单体的β相计算出的半衰期延长(72小时)随着ilf二聚体hsa-41 di(103小时)而进一步提高(图35)。
[0337]
实施例24：抗血清白蛋白结合物的表位分箱
[0338]
将均相时间分辨荧光测定用于表位分箱。该测定用于筛选与经生物素化的人血清白蛋白(其与hsa-41 myc his结合)结合的血清白蛋白结合性多肽。使用铽穴合物(terbium cryptate)供体标记的链霉亲和素和d2接受体标记的抗myc来进行hsa-41 myc his与经生物素化的hsa之间的相互作用。在竞争性测定中测试的所有蛋白均是在没有myc标签的情况下产生的(hsa-18、hsa-20和hsa-36)，并且显示出对hsa-41 myc his与生物素化的hsa之间的相互作用的抑制，除hsa-31之外，这表明其结合不同的表位(图37)。
[0339]
实施例25：hsa-41游离c端半胱氨酸形式(cq)表征
[0340]
多肽hsa-41(seq id no：116)被遗传改造成在hsa-41的c端标签区插入游离半胱氨酸残基，从而产生hsa-41 cq(seq id no：138)，其与c端标签myc cys tev his一起表达。hsa-41 cq可用于通过马来酰亚胺化学反应进行缀合，例如，以提高多肽的半
衰期。在还原剂5mm tcep的存在下纯化cys变体多肽(has-41 cq)，并在还原条件下在sds-page和sec-hplc上表征(图38a至38b)。如实施例3所述，在ph 7.4下进行与hsa结合的biacore动力学分析。发现hsa-41 cq与没有游离c端cys的单体相当，kd为约3nm(图39)。
[0341]
实施例26：用hsa-18半衰期延长多肽格式化的ava04-251 xt ilf
[0342]
设计了两种三聚体内联融合(ilf)形式。每个均包含两个融合的ava04-251人pd-l1结合性多肽，其还与hsa-18(seq id no：110)融合以延长半衰期。ava04-251 xt60(seq id no：139)包含定位于c端的半衰期延长多肽，而ava04-251 xt61(seq id no.140)包含位于该形式的中部的半衰期延长多肽，从而将两种抗pd-l1多肽分开(示意图，图40)。用多肽之间的重复刚性遗传接头a(eaaak)6(seq id no：161)设计形式。如实施例2中所述，从大肠杆菌产生三聚体，并将其用亲和ninta树脂随后进行制备型尺寸排阻来纯化。还原型sds-page和sec-hplc分析显示该蛋白质形式的最终纯度＞98％(图40)。
[0343]
实施例27：半衰期延长的ava04-251 xt60和ava04-251 xt61 ilf形式与血清白蛋白的结合
[0344]
使用前述实施例3中的方法，用ph 6.0和ph 7.4的运行缓冲液来进行人血清白蛋白(hsa)biacore动力学分析。数据显示包含半衰期延长的多肽hsa-18(seq id no：110)的ilf形式结合hsa，在ph 7.4下kd具有三位数nm亲和力，以及在ph 6.0下具有两位数nm亲和力，在109至152nm的hsa-18单体亲和力的2至4倍之间(图41a至41b)。对于ph 6.0条件下的小鼠血清白蛋白(mouse serum albumin，msa)，ilf形式的结合亲和力在结合性多肽的单体血清白蛋白的大约2倍之内(图43)。
[0345]
实施例28：与血清白蛋白结合的半衰期延长的ava04-251 xt60和ava04-251 xt61 ilf形式
[0346]
用elisa评估了两种半衰期延长的ilf形式(ava04-251 xt60，seq id no：139；ava04-251 xt61，seq id no：140)在ph 7.4与人血清白蛋白和小鼠血清白蛋白的结合。简言之，在ph 7.5下，将hsa或msa以1mg/ml的浓度包被在96孔板中。用ph 7.5的5％pbs酪蛋白饱和之后，洗涤板，并将对照或三聚体的稀释物在板上孵育90分钟。然后洗涤板，并添加经生物素化的多克隆抗体抗半胱氨酸蛋白酶抑制剂a(r&d system)持续1小时。洗涤板，并使用链霉亲和素-hrp检测affimer ilf。在最后的洗涤步骤之后，添加tmb进行实验的显影，并在450nm处读取板。所测试的两种ilf，即ava04-251 xt60和ava04-251 xt61，对has(范围从5.7至8.8)和msa(范围从133.6至60.8)二者表现出相似的ec
50
值(图42)。
[0347]
实施例29：与人pd-l1-fc结合的ava04-251 xt60和ava04-251 xt61 ilf形式
[0348]
如实施例3中所述，用单循环动力学进行biacore动力学分析，以评估ava04-251 xt60和ava04-251 xt61(分别为seq id no：139和140)的结合。进行实验以比较三聚体和hsa-41。结合亲和力kd值在三位数nm范围内，观察到相似的开和关速率，不管半衰期延长多肽是在形式的中部还是c端(图44)。
[0349]
本文中公开的所有参考文献、专利和专利申请均关于其各自被引用的主题通过引
用并入，在一些情况下，其可涵盖文件的全部内容。
[0350]
除非明确指出相反，否则如本文中在说明书和权利要求书中使用的没有数量词修饰的名词应理解为意指“至少一个/种”。
[0351]
还应该理解，除非明确地指出相反，否则在本文中所保护的包括多于一个步骤或动作的任何方法中，该方法的步骤或动作的顺序不必需限于其中记载该方法的步骤或动作的顺序。
[0352]
在权利要求中以及在以上说明书中，所有过渡性短语例如“包括”、“包含”、“带有”、“具有”、“含有”、“涉及”、“持有”、“由......构成”等都应理解为开放式的，即意指包括但不限于。仅过渡短语“由......组成”和“基本上由......组成”应分别为封闭或半封闭的过渡短语，如美国专利局专利审查程序手册的第2111.03节中所述。
[0353]
数值前面的术语“约/大约”和“基本上”意指所列举数值的
±
10％。
[0354]
在提供值范围的情况下，该范围的上限与下限之间的每个值在本文中均被具体地考虑和描述。

技术特征：
1.多肽，其在ph7.4以1
×
10-6
m或更小的k
d
与人血清白蛋白(hsa)结合，并且在ph6以比在ph7.4与hsa结合的k
d
小至少半个对数的k
d
与hsa结合。2.权利要求1所述的多肽，其中所述多肽在ph7.4以1
×
10-7
m或更小的k
d
与hsa结合、在ph7.4以1
×
10-8
m或更小的k
d
与hsa结合或者在ph7.4以1
×
10-9
m或更小的k
d
与hsa结合。3.权利要求1或2所述的多肽，其中所述多肽在ph6以这样的k
d
与hsa结合：所述k
d
比在ph7.4与hsa结合的k
d
小至少1个对数、比在ph7.4与hsa结合的k
d
小至少1.5个对数、比在ph7.4与hsa结合的k
d
小至少2个对数，或比在ph7.4与hsa结合的k
d
小至少2.5个对数。4.权利要求1至3中任一项所述的多肽，其中所述多肽在人患者中的血清半衰期大于10小时、大于24小时、大于48小时、大于72小时、大于96小时、大于120小时、大于144小时、大于168小时、大于192小时、大于216小时、大于240小时、大于264小时、大于288小时、大于312小时、大于336小时或大于360小时。5.权利要求1至4中任一项所述的多肽，其中所述多肽在人患者中的血清半衰期为hsa的血清半衰期的大于50％、大于60％、大于70％或大于80％。6.权利要求1至5中任一项所述的多肽，所述多肽包含由通式(i)表示的氨基酸序列fr1-(xaa)
n-fr2-(xaa)
m-fr3(i)，其中fr1是与mipgglseakpatpeiqeivdkvkpqleektnetygkleavqyktqvla(seqidno：1)具有至少70％同一性的氨基酸序列；fr2是与gtnyyikvragdnkymhlkvfksl(seqidno：2)具有至少70％同一性的氨基酸序列；fr3是与edlvltgyqvdknkddeltgf(seqidno：3)具有至少70％同一性的氨基酸序列；并且xaa在每次出现时是独立的氨基酸，n是3至20的整数，并且m是3至20的整数。7.权利要求6所述的多肽，其中：fr1与seqidno：1具有至少80％、至少82％、至少84％、至少86％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％或至少98％同一性；fr2与seqidno：2具有至少80％、至少84％、至少88％、至少92％或至少96％同一性；和/或fr3与seqidno：3具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性。8.权利要求7所述的多肽，其中：fr1包含seqidno：1的氨基酸序列；fr2包含seqidno：2的氨基酸序列；和/或fr3包含seqidno：3的氨基酸序列。9.权利要求6所述的多肽，其中所述氨基酸序列由通式(ii)表示
其中xaa在每次出现时是独立的氨基酸；n是3至20的整数，并且m是3至20的整数；xaa1是gly、ala、val、arg、lys、asp或glu；xaa2是gly、ala、val、ser或thr；xaa3是arg、lys、asn、gln、ser、thr；xaa4是gly、ala、val、ser或thr；xaa5是ala、val、ile、leu、gly或pro；xaa6是gly、ala、val、asp或glu；并且xaa7是ala、val、ile、leu、arg或lys。10.权利要求9所述的多肽，其中所述氨基酸序列由通式(iii)表示其中xaa在每次出现时是独立的氨基酸；n是3至20的整数；并且m是3至20的整数。11.权利要求6至10中任一项所述的多肽，其中(xaa)
n
由式(iv)表示aa1-aa2-aa3-aa4-aa5-aa6-aa7-aa8-aa9(seq id no：180)(iv)，其中aa1是选自d、g、n和v的氨基酸；aa2是选自w、y、h和f的氨基酸；aa3是选自w、y、g、w和f的氨基酸；aa4是选自q、a和p的氨基酸；aa5是选自a、q、e、r和s的氨基酸；aa6是选自k、r和y的氨基酸；aa7是选自w和q的氨基酸；aa8是选自p和h的氨基酸；并且aa9是选自h、g和q的氨基酸。12.权利要求6至11中任一项所述的多肽，其中(xaa)
n
是与seq id no：4至55中任一个的氨基酸序列具有至少80％或至少90％同一性的氨基酸序列。13.权利要求12所述的多肽，其中(xaa)
n
是seq id no：4至55中任一个的氨基酸序列。14.权利要求6至13中任一项所述的多肽，其中(xaa)
n
是与seq id no：22、24、26、35、40、41和45中任一个的氨基酸序列具有至少80％或至少90％同一性的氨基酸序列。15.权利要求14所述的多肽，其中(xaa)
n
是seq id no：22、24、26、35、40、41和45中任一个的氨基酸序列。16.权利要求6至15中任一项所述的多肽，其中(xaa)
m
由式(iv)表示：aa1-aa2-aa3-aa4-aa5-aa6-aa7-aa8-aa9(seq id no：181)(iv)，其中
aa1是选自y、f、w和n的氨基酸；aa2是选自k、p、h、a和t的氨基酸；aa3是选自v、n、g、q、a和f的氨基酸；aa4是选自h、t、y、w、k、v和r的氨基酸；aa5是选自q、s、g、p和n的氨基酸；aa6是选自s、y、e、l、k和t的氨基酸；aa7是选自s、d、v和k的氨基酸；aa8是选自g、l、s、p、h、d和r的氨基酸；并且aa9是选自g、q、e和a的氨基酸。17.权利要求6至16中任一项所述的多肽，其中(xaa)
m
是与seq id no：57至108中任一个的氨基酸序列具有至少80％或至少90％同一性的氨基酸序列。18.权利要求17所述的多肽，其中(xaa)
m
是seq id no：57至108中任一个的氨基酸序列。19.权利要求6至16中任一项所述的多肽，其中(xaa)
m
是与seq id no：75、77、79、88、93、94和98中任一个的氨基酸序列具有至少80％或至少90％同一性的氨基酸序列。20.权利要求19所述的多肽，其中(xaa)
m
是seq id no：75、77、79、88、93、94和98中任一个的氨基酸序列。21.权利要求1至20中任一项所述的多肽，其中所述多肽包含与seq id no：110至116和138中任一个的氨基酸序列具有至少70％、至少80％或至少90％同一性的氨基酸序列。22.权利要求21所述的多肽，其中所述多肽包含seq id no：110至116和138中任一个的氨基酸序列。23.权利要求6至10中任一项所述的多肽，其中(xaa)
n
由式(iv)表示aa1-aa2-aa3-aa4-aa5-aa6-aa7-aa8-aa9(iv)，其中aa1是具有中性极性亲水侧链的氨基酸；aa2是具有中性非极性疏水侧链的氨基酸；aa3是具有中性非极性疏水侧链的氨基酸；aa4是具有中性极性亲水侧链的氨基酸；aa5是具有带正电荷的极性亲水侧链的氨基酸；aa6是具有带正电荷的极性亲水侧链的氨基酸；aa7是具有中性非极性疏水侧链的氨基酸；aa8是具有中性非极性疏水侧链的氨基酸；并且aa9是具有中性非极性亲水侧链的氨基酸。24.权利要求6至10中任一项所述的多肽，其中(xaa)
m
由式(iv)表示aa1-aa2-aa3-aa4-aa5-aa6-aa7-aa8-aa9(iv)其中aa1是具有中性非极性疏水侧链的氨基酸；aa2是具有带正电荷的极性亲水侧链的氨基酸；aa3是具有中性非极性疏水侧链的氨基酸；aa4是具有带正电荷的极性亲水侧链的氨基酸；
aa5是具有中性极性亲水侧链的氨基酸；aa6是具有中性极性亲水侧链的氨基酸；aa7是具有带负电荷的极性亲水侧链的氨基酸；aa8是具有带正电荷的极性亲水侧链的氨基酸；并且aa9是具有中性非极性亲水侧链的氨基酸。25.权利要求23或24所述的多肽，其中所述具有中性非极性亲水侧链的氨基酸选自半胱氨酸(c)和甘氨酸(g)；所述具有中性非极性疏水侧链的氨基酸选自丙氨酸(a)、异亮氨酸(i)、亮氨酸(l)、甲硫氨酸(m)、苯丙氨酸(f)、脯氨酸(p)、色氨酸(w)和缬氨酸(v)；所述具有中性极性亲水侧链的氨基酸选自天冬酰胺(n)、谷氨酰胺(q)、丝氨酸(s)、苏氨酸(t)和酪氨酸(y)；所述具有带正电荷的极性亲水侧链的氨基酸选自精氨酸(r)、组氨酸(h)和赖氨酸(k)；并且所述具有带负电荷的极性亲水侧链的氨基酸选自天冬氨酸(d)和谷氨酸(e)。26.权利要求1至25中任一项所述的多肽，其中所述多肽包含含有半胱氨酸的氨基酸序列。27.权利要求26所述的多肽，其中所述半胱氨酸可用于化学偶联，并且任选地其中所述半胱氨酸位于所述多肽的c端或n端，并且任选地其中所述多肽包含seq id no：138的氨基酸序列。28.权利要求1至27中任一项所述的多肽，其还包含通过酰胺键共价连接以形成连续融合蛋白的异源多肽。29.权利要求28所述的多肽，其中所述异源多肽包含治疗性多肽。30.权利要求29所述的多肽，其中所述治疗性多肽选自多肽激素、多肽细胞因子、多肽趋化因子、生长因子、止血活性多肽、酶和毒素。31.权利要求29所述的多肽，其中所述治疗性多肽选自受体陷阱和受体配体。32.权利要求29所述的多肽，其中所述治疗性多肽序列选自血管生成剂和抗血管生成剂。33.权利要求29所述的多肽，其中所述治疗性多肽序列是神经递质，并且任选地其中所述神经递质是神经肽y。34.权利要求29所述的多肽，其中所述治疗性多肽序列是红细胞生成刺激剂，并且任选地其中所述红细胞生成刺激剂是红细胞生成素或红细胞生成素模拟物。35.权利要求29所述的多肽，其中所述治疗性多肽是肠降血糖素，并且任选地其中所述肠降血糖素选自胰高血糖素、抑胃肽(gip)、胰高血糖素样肽-1(glp-1)、胰高血糖素样肽-2(glp-2)、肽yy(pyy)和胃泌酸调节素(oxm)。36.适用于人患者中之治疗用途的药物组合物，其包含权利要求1至35中任一项所述的多肽以及可药用赋形剂。37.多核苷酸，其包含编码权利要求1至36中任一项所述的多肽的序列。38.权利要求37所述的多核苷酸，其中编码所述多肽的序列与转录调节序列可操作地连接。
39.权利要求38所述的多核苷酸，其中所述转录调节序列选自启动子和增强子。40.权利要求38或39所述的多核苷酸，其还包含复制起点、微型染色体维持元件(mme)和/或核定位元件。41.权利要求38至40中任一项所述的多核苷酸，其还包含与所述编码所述多肽的序列可操作地连接并一起转录的多腺苷酸化信号序列。42.权利要求38至41中任一项所述的多核苷酸，其中所述编码所述多肽的序列包含至少一个内含子序列。43.权利要求38至42中任一项所述的多核苷酸，其还包含与所述编码所述多肽的序列一起转录的至少一个核糖体结合位点。44.权利要求38至43中任一项所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸是脱氧核糖核酸(dna)。45.权利要求38至43中任一项所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸是核糖核酸(rna)。46.病毒载体，其包含权利要求38至45中任一项所述的多核苷酸。47.质粒或微环，其包含权利要求38至46中任一项所述的多核苷酸。48.融合蛋白，其包含前述权利要求中任一项所述的多肽。49.权利要求48所述的融合蛋白，其还包含接头。50.权利要求49所述的融合蛋白，其中所述接头是刚性接头。51.权利要求50所述的融合蛋白，其中所述刚性接头包含seq id no：161的序列。52.权利要求49所述的融合蛋白，其中所述接头是柔性接头。53.权利要求50所述的融合蛋白，其中所述柔性接头包含seq id no：165的序列。54.权利要求48至53中任一项所述的融合蛋白，其包含两种前述权利要求中任一项所述的多肽。55.权利要求48至54中任一项所述的融合蛋白，其还包含治疗性分子。56.权利要求55所述的融合蛋白，其中所述治疗性分子是治疗性多肽。57.权利要求56所述的融合蛋白，其中所述治疗性多肽选自激素、细胞因子、趋化因子、生长因子、止血活性多肽、酶和毒素，或者选自对激素、细胞因子、趋化因子、生长因子、止血活性多肽、酶和毒素的拮抗剂。58.权利要求48至57中任一项所述的融合蛋白，其中所述多肽包含seq id no：110的氨基酸序列。59.权利要求48至57中任一项所述的融合蛋白，其中所述多肽包含seq id no：113的氨基酸序列。60.权利要求48至57中任一项所述的融合蛋白，其中所述多肽包含seq id no：116的氨基酸序列。

技术总结
本文在一些实施方案中提供了stefin多肽(多肽)的重组改造变体，所述变体与人血清白蛋白结合并延长所述多肽的半衰期。本文在一些实施方案中还提供了包含所述多肽的组合物、使用所述多肽的方法和产生所述多肽的方法。的方法。的方法。


技术研发人员：艾玛
受保护的技术使用者：阿瓦克塔生命科学有限公司
技术研发日：2021.07.30
技术公布日：2023/7/13