一种基于CRISPR/Cas12a的多核苷酸激酶活性检测方法

一种基于crispr/cas12a的多核苷酸激酶活性检测方法
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种基于crispr/cas12a的多核苷酸激酶活性检测方法。


背景技术：

2.规律间隔成簇短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，crispr)和crispr相关蛋白(cas)，即crispr-cas系统，已广泛有效地应用于基因编辑和表达调控。近年来，crispr-cas系统被广泛开发为核酸检测的高灵敏度和选择性工具，包括crispr/cas9、crispr/cas12a、crispr/cas13a和crispr/cas14a系统。crispr/cas12系统由一条crrna和cas12蛋白结合而成，靶标dna与crispr/cas12a中crrna的间隔序列互补配对，就能激发crispr/cas12对单ssdna信号探针进行反式切割，从而释放荧光信号。crispr/cas12可识别的靶标既可以是dsdna，也可以是ssdna，对dsdna的识别需要在靶标序列附件携带pam位点(tttn，n则为任意碱基)，对ssdna识别则不需要pam序列。crispr/cas12最大的优势在于其可编程性，即只需要更换crrna的间隔序列，crispr/cas12可以被改造成为对任意dna序列识别工具，并进行特异性靶标剪切和非特异性的反式切割。与目前已有的探针相比，crispr/cas12通过改变crrna序列可实现多靶标序列的识别。crispr/cas12识别具有序列依赖特性，只有靶标和crrna互补才能激活cas12的活性，相比于传统的酶切法，crispr/cas12表现出了更强的特异性。crispr/cas12本身就是一个信号放大系统，反式切割活性一旦被靶标激活，就对信号探针进行持续性的切割，检测信号会源源不断的被放大，因此能确保检测的灵敏度。crispr/cas12已被应用于核酸或核酸相关样品的检测，具有较高的特异性和敏感性。
3.末端脱氧核苷酸转移酶(terminal deoxyribonucleotidyl transferase,tdt,简称末端转移酶)能够在无模板的情况下，将脱氧核苷酸添加到单链dna(ssdna)的3
’‑
oh端。末端转移酶可给一群dna分子的3
’‑
oh末端接上寡da或dc,而给另一群dna分子的3
’‑
oh末端接上寡dt或dg，两群分子混合即可使同聚物尾部退火形成环状分子。
4.klenow片段是大肠杆菌的dna聚合酶i经过枯草杆菌蛋白酶(或胰蛋白酶)处理后，原来的酶分子切成两个片段，其中大片段分子质量为76kd,小片段分子质量为34kd。该大片段通常称为klenow片段，通过克隆技术也可以获得klenow片段。该片段保留了dna聚合酶i的5
’‑3’
聚合酶和3
’‑5’
外切酶活性，但缺少完整酶的5
’‑3’
外切酶活性，dna聚合酶i(dna-pol i)断开后的存在另一个323个氨基酸残基片段，保留5
’‑3’
外切酶活性。
5.多核苷酸激酶(pnk)是一种双功能dna/rna末端处理酶，催化γ-磷酸基从三磷酸腺苷(atp)转移到寡核苷酸或核酸的5'-羟基上，对修复内源或外源因子诱导的dna链断裂至关重要。pnk可催化dna分子的5'-oh端磷酸化和3'-磷酸基去磷酸化。核酸的磷酸化在正常的细胞活动中起着重要作用，如dna重组、dna复制以及链断裂期间的dna修复。pnk的催化活性可直接影响核酸的磷酸化过程，从而影响一系列的代谢过程。而且，人类的pnk参与维持基因组的完整性，pnk活性的异常表达与多种疾病有关，如神经退行性疾病、脊髓小脑性
共济失调、沃纳综合征等。此外，pnk也被认为是癌症治疗中的潜在靶标，可作为疾病诊断和预后的生物标志物，对其活性的敏感检测在生物化学研究、药物开发、临床诊断和治疗中具有重要意义。
6.pnk的传统检测方法包括聚丙烯酰胺凝胶电泳、放射性同位素
32
p标记、放射自显影，但传统方法的广泛应用受到自身的缺点，包括放射线污染、耗时、操作费力和仪器昂贵等的限制，为了克服上述缺点，近年来发展了很多新的pnk检测方法，包括比色法，荧光分析法、电化学法和电化学发光法等，但是这些方法大多数都依赖于λ核酸外切酶(λ-exo)的辅助切割，但λ-exo也可能切割非磷酸化探针，导致非特异性增强，引起样本假阳性，因此不能用于pnk的准确定量检测。因此，开发一种不依赖λ-exo，灵敏度高特异性好的pnk定量检测方法势在必行。


技术实现要素：

7.本发明针对多核苷酸激酶活性检测高灵敏度、高特异性的实际需求，考虑以crispr/cas12a作为检测体系的信号输出平台，并整合tdt引物延伸技术和klenow片段扩增技术的信号放大特点，以此策略实现多聚核苷酸激酶酶活性量化检测。
8.为构建多核苷酸激酶的超敏检测体系，本发明将crispr-cas12a与末端脱氧核苷转移酶(tdt)结合，以特异性和灵敏地检测细胞裂解物中的pnk活性。首先，我们设计了oligo dt primer探针，在其3’端进行了磷酸化修饰，以避免非特异性扩增。在不存在靶标pnk时，oligo dt primer探针不能激活crispr-cas12a单元，从而导致非常低的背景信号。而在靶标多核苷酸激酶存在时，pnk可将oligo dt primer探针3
’‑
磷酸基团(3
’‑
po4)去磷酸为3
’‑
oh。
9.tdt作为一种特殊的dna聚合酶，直接催化脱氧核苷酸三磷酸(dntps)顺序加成到3
’‑
oh的dna分子上，而不需要特定的模板链。因此，在加入tdt和datp的情况下，游离的3
’‑
oh端dna探针可通过tdt扩增产生聚腺嘌呤(poly a)尾单链dna(命名为t-an，n表示a碱基的数量)。
10.加热去除tdt活性后，剩余的primer片段将与t-an单链碱基互补形成双链，加入klenow片段和dttp后，klenow片段将以t-an作为模板，primer作为引物，产生大量的p-tm-at单链dna(m为t碱基的数量，t为primer中t碱基的个数)；at区域会向后折叠并于tm区域杂交，然后klenow片段会以tm区域为模板，at区域为引物扩增，最后形成有t碱基和a碱基完全互补配对的双链产物(t-a dsdna)。
11.t-a dsdna可作为激活子补充到crrna的识别区(poly u),可以激活多个crispr-cas12a单元，反切大量报告探针(两端修饰有荧光基团-淬灭基团对的ssdna)，从而释放荧光信号。dna通过tdt酶、klenow片段的延伸和cas12a的反切活性共同放大了输出的荧光信号，可用于pnk靶标的检测。
12.为达上述技术目的，本发明采用以下技术方案：
13.一种基于crispr/cas12a的多核苷酸激酶活性检测方法，所述检测方法是利用crispr-cas12a、末端脱氧核苷酸转移酶tdt、klenow片段共同对多核苷酸激酶的活性进行检测。
14.优选地，所述检测方法包括以下步骤：
15.(1)tdt引物延伸反应：构建20μl反应体系，体系中包括以下终浓度的组分：400nm oligodt primer探针,3μl 1
×
t4 polynucleotide kinase reactionbuffer,3μl 1
×
tdt reaction buffer,5mm datp,5u tdt,3μl ddh2o,5μl样品提取物，pnk去磷酸和tdt引物延伸反应在35-38℃条件下孵育15-90分钟，然后灭活tdt,得到溶液i；
16.(2)klenow polymerase反应：构建20μl反应体系，体系中包括以下终浓度的组分：5mm dttp,5u klenow fragment,8μl 1
×
nebuffer2，8μl ddh2o,与溶液i混合后在35-38℃条件下孵育15-90分钟，得到溶液ii；
17.(3)crispr/cas 12a反切反应：在溶液ii中加入1-3μl 1μm cas12a,2-4μl400nm crrna,0.5-1.5μl 50μm reporter探针，12-16μl 1
×
reactionbuffer，在35-38℃条件下孵育15-45分钟，加入ddh2o补充至200μl后，测定荧光。
18.更优选地，所述步骤(1)中的oligodtprimer探针为5'-ttt ttt ttt ttt ttt ttt tt-po
4-3'。
19.更优选地，所述步骤(2)中nebuffer2的组成为：50mm nacl,10mm tris-hcl,10mm mgcl2,1mm dtt,ph 7.9@25℃。
20.更优选地，所述步骤(1)、(2)、(3)中的反应温度都为35-38℃。
21.更优选地，所述步骤(3)中reporter探针为5'-fam-ttatt-bhq1-3'。
22.更优选地，所述步骤(3)中reactionbuffer的组成为：50mm nacl,10mm tris-hcl,10mm mgcl2,0.1mg/ml bsa,ph＝7.9。
23.更优选地，所述步骤(3)crrna为5'-uaauuu cuacuaagu gug uguauu uuu uuu uuu uuu uuu uuu u-3。
24.一种多核苷酸激酶活性检测产品，所述产品包括crispr-cas12a、末端脱氧核苷酸转移酶tdt和klenow片段。
25.优选地，所述产品为试剂盒。
26.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
27.(1)本发明基于末端转移酶tdt和klenow片段的双酶联合扩增技术作为信号放大方式，最大化放大微量靶标信号；
28.(2)本发明以crispr/cas12a作为检测体系的信号输出平台，并以双链dna作为激活链。
附图说明
29.图1为本发明多核苷酸激酶活性检测的原理图。
30.图2为实施例1中不同在波长505nm-650nm发射范围内测定的反应体系的荧光光谱图，加入pnk反应组的浓度均为1.0u/ml；为其中曲线1：不存在任何酶；曲线2：单独存在pnk；曲线3：单独存在tdt；曲线4：单独存在klenow片段；曲线5：存在tdt和klenow片段；曲线6：存在pnk和klenow片段；曲线7：存在pnk和tdt；曲线8：存在pnk，tdt，klenow片段，图2中从上至下依次为曲线8-7-3-5-2-4-6-1。
31.图3为实施例1中荧光发射强度在520nm处的荧光光谱图，其中曲线1：不存在任何酶曲线2：单独存在pnk；曲线3：单独存在tdt；曲线4：单独存在klenow片段；曲线5：存在tdt和klenow片段；曲线6：存在pnk和klenow片段；曲线7：存在pnk和tdt；曲线8：存在pnk，tdt，
klenow片段。
32.图4为实施例2中体系特异性荧光实验验证图，其中dna腺嘌呤甲基化甲基转移酶(dam)，80u/ml；phi29 dna聚合酶，100u/ml；t4 ligase,200u/ml；dpni限制性内切酶，200u/ml；牛血清白蛋白(bsa)，5mg/ml；多核苷酸激酶(pnk)，1u/ml。
33.图5为实施例1中加入不同细胞提取物后的荧光检测结果。
34.图6为实施例3中不同浓度pnk的检测结果。
35.图7为实施例3中荧光强度与pnk浓度的线性关系图。
具体实施方式
36.实施例1
37.本实施例提供了一种基于crispr/cas12a的多核苷酸激酶活性检测方法，具体步骤如下：
38.(1)设计探针序列
39.oligo dt primer(seq id no.1)：5'-ttt ttt ttt ttt ttt ttt tt-po
4-3'；
40.reporterprobe:5'-fam-ttatt-bhq1-3'；
41.crrna(seq id no.2):5'-uaa uuu cua cua agu gug ugu auu uuu uuu uuu uuu uuu uuu u-3'(下划线部分是t-a dsdna的识别序列)。
42.(2)实验方案
43.2.1pnk去磷酸化反应
44.(1)tdt引物延伸反应：构建20μl反应体系，其中含400nm oligodtprimer探针(3
’‑
po4),3μl 1
×
t4 polynucleotide kinase reactionbuffer,3μl 1
×
tdt reactionbuffer,5mm datp,5u tdt,3μl ddh2o,不同浓度的pnk，pnk去磷酸和tdt引物延伸反应在35-38℃条件下孵育15-90分钟，然后通过80℃加热混合物5-10分钟灭活tdt,得到溶液i；
45.(2)klenow polymerase反应：构建20μl反应体系，其中含5mm dttp,5u klenow fragment,8μl 1
×
nebuffer2(50mm nacl,10mm tris-hcl,10mm mgcl2,1mm dtt,ph 7.9@25℃)，8μl ddh2o,与溶液i混合后在35-38℃条件下孵育15-90分钟，得到溶液ii；
46.(3)crispr/cas 12a反切反应：在溶液ii中加入2μl 1μm cas12a,3μl 400nm crrna,1μl 50μm reporter探针，14μl 1
×
reaction buffer(50mm nacl,10mm tris-hcl,10mm mgcl2,0.1mg/ml bsa,ph＝7.9,25℃)，在35-38℃条件下孵育15-45分钟，加入ddh2o补充至200μl后，测定荧光。
47.2.2可行性验证
48.通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和荧光光谱实验验证体系的可行性：
49.(1)聚丙烯酰胺凝胶电泳：用5
×
tbe buffer制备12％天然聚丙烯酰胺凝胶(native-page)，用含有3μl 6
×
loading buffer的15μl反应溶液混合制备电泳样本。凝胶在1
×
tbebuffer(9mm tris-hcl,ph 7.9,9mm boric acid,0.2mm edta)中以100v恒压电泳60-90分钟后，用1
×
gel red核酸染料染色后，进行成像。
50.(2)荧光光谱实验：预制好的样本的荧光光谱在荧光分光光度计(f4500,日立)测定，激发波长492nm，在波长505nm-650nm发射范围内测定反应体系的荧光光谱，结果参见图
2，(图片从上至下依次为曲线8-7-3-5-2-4-6-1)；只有存在pnk且体系成分完整的情况下才能观察到较强的荧光响应，曲线1-曲线6峰值荧光值无明显差异。
51.在荧光测试中，激发和发射狭缝均设置为5nm，pmt电压设置为700v，荧光发射强度在520nm处测定，结果如图3所示(图3与图2中的检测样品完全相同，图3中的柱状图是荧光峰值的统计)。
52.2.3细胞样本中pnk活性的测定
53.选择hepg2细胞(肝癌细胞)和hl-7702(正常肝细胞)作为模型细胞进行细胞内pnk活性检测。hepg2和hl-7702细胞均在dmem(10％胎牛血清，100u/ml青霉素，100u/ml链霉素)培养基中培养。培养的细胞用冰pbs洗涤后，用胰蛋白酶消化分离。冰pbs再次洗涤后，使用血细胞计数器计数细胞密度。使用核蛋白提取试剂盒获取细胞提取物，可存储于-80℃备用。
54.如图5所示，加入hepg2细胞提取物后荧光明显增强，与纯pnk荧光结果相似。而加入hl-7702细胞提取物的荧光强度显著低于hepg2细胞提取物，这一结果也说明pnk在癌细胞系中的表达高于正常细胞。
55.实施例2
56.本实施例验证了实施例1中多核苷酸激酶活性检测方法的特异性，具体步骤如下：
57.在测定检测方法的特异性时，选择不同的酶或者蛋白替代实施例1中的pnk，按实施例1中pnk活性检测的方法进行。
58.其中pnk浓度：1u/ml；dam浓度：80u/ml；phi29浓度：100u/ml；t4 ligase浓度：200u/ml；dpni限制性内切酶浓度：200u/ml；bsa浓度：5mg/ml，结果参见图4。
59.实施例3
60.本实施例验证了实施例1中多核苷酸激酶活性检测方法的灵敏度，具体步骤如下：
61.在检测体系中加入不同浓度的pnk(0、0.0001、0.001、0.01、0.1、0.25、0.5、0.75、1.0u/ml,测定520nm处对应的荧光响应。实验步骤参见pnk活性检测方法步骤，实验结果参见图6。随着pnk浓度(0-1u/ml)的增加，传感系统的荧光信号逐渐增强，520nm处的荧光强度与pnk浓度(0-1u/ml)之间存在良好的线性相关关系，对应方程为y＝836.9*x+115.9，r2＝0.9962，其中f为520nm处传感系统的荧光强度，x为pnk的浓度(u/ml)，直接检出限为1
×
10-4
u/ml。图6中曲线至下而上依次为0、0.0001、0.001、0.01、0.1、0.25、0.5、0.75、1.0u/ml，图7为线性关系图。
62.高灵敏度和特异性是生物传感器构建过程中最关键的两个因素，crispr/cas具有序列依赖性识别特点，确保靶标检测的特异性。此外，crispr/cas12a在识别靶标核酸之后，引发的反式切割对外源信号进行探针源源不断的剪切，是crispr/cas成为一种信号放大和读出系统，从而确保了检测灵敏度。crispr/cas和生物放大技术结合将进一步提高检测灵敏度，实现高度灵敏、特异、快速、经济高效地对靶标核酸进行多重检测，无需专业操作人员和复杂设备，适用于现场部署和即时检测。
63.末端脱氧核苷转移酶tdt是一种独特的无模板dna聚合酶，可将脱氧核苷三磷酸(dntps)随机添加到单链dna(ssdna)的3
’‑
oh端从而延长ssdna链。因此，在只添加datp时，tdt可在无模板的情况下扩增出polya尾的长单链，
64.可为后续扩增步骤提供长模板链，进一步放大靶标信号。
65.klnew片段的引入将长单链扩增为双链，激活crispr/cas12a。同时本发明中的检测体系不依赖λ-exo的辅助切割，可降低背景信号，减少假阳性，提高检测特异性；同时序列设计简单，扩增方式单一但扩增循环多样，可实现微量靶标信号放大。
66.以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

技术特征：
1.一种基于crispr/cas12a的多核苷酸激酶活性检测方法，其特征在于，所述检测方法是利用crispr-cas12a、末端脱氧核苷酸转移酶tdt、klenow片段共同对多核苷酸激酶的活性进行检测。2.根据权利要求1所述的基于crispr/cas12a的多核苷酸激酶活性检测方法，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：(1)tdt引物延伸反应：构建20μl反应体系，体系中包括以下终浓度的组分：400nm oligodt primer探针,3μl 1
×
t4 polynucleotide kinase reactionbuffer,3μl 1
×
tdt reaction buffer,5mm datp,5u tdt,3μl ddh2o,5μl样品提取物，pnk去磷酸和tdt引物延伸反应在35-38℃条件下孵育15-90分钟，然后灭活tdt,得到溶液i；(2)klenow polymerase反应：构建20μl反应体系，体系中包括以下终浓度的组分：5mm dttp,5u klenow fragment,8μl 1
×
nebuffer2，8μl ddh2o,与溶液i混合后在35-38℃条件下孵育15-90分钟，得到溶液ii；(3)crispr/cas 12a反切反应：在溶液ii中加入1-3μl 1μm cas12a,2-4μl400nm crrna,0.5-1.5μl 50μm reporter探针，12-16μl 1
×
reactionbuffer，在35-38℃条件下孵育15-45分钟，加入ddh2o补充至200μl后，测定荧光。3.根据权利要求2所述的基于crispr/cas12a的多核苷酸激酶活性检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中的oligodtprimer探针为5'-ttt ttt ttt ttt ttt ttt tt-po
4-3'。4.根据权利要求3所述的基于crispr/cas12a的多核苷酸激酶活性检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中nebuffer2的组成为：50mm nacl,10mm tris-hcl,10mm mgcl2,1mm dtt,ph 7.9。5.根据权利要求4所述的基于crispr/cas12a的多核苷酸激酶活性检测方法，其特征在于，所述步骤(1)、(2)、(3)中的反应温度都为35-38℃。6.根据权利要求5所述的基于crispr/cas12a的多核苷酸激酶活性检测方法，其特征在于，所述步骤(3)中reporter探针为5'-fam-ttatt-bhq1-3'。7.根据权利要求6所述的基于crispr/cas12a的多核苷酸激酶活性检测方法，其特征在于，所述步骤(3)中reaction buffer的组成为：50mm nacl,10mm tris-hcl,10mm mgcl2,0.1mg/mlbsa,ph＝7.9。8.根据权利要求7所述的基于crispr/cas12a的多核苷酸激酶活性检测方法，其特征在于，所述步骤(3)crrna为5'-uaauuu cuacuaagu gug uguauu uuu uuu uuu uuu uuu uuu u-3'。9.一种多核苷酸激酶活性检测产品，其特征在于，所述产品中包括crispr-cas12a、末端脱氧核苷酸转移酶tdt和klenow片段。10.根据权利要求9所述的多核苷酸激酶活性检测产品，其特征在于，所述产品为试剂盒。

技术总结
本发明公开了一种基于CRISPR/Cas12a的多核苷酸激酶活性检测方法，属于生物技术领域。该检测方法以CRISPR/Cas12a作为检测体系的信号输出平台，并整合TdT引物延伸技术和Klenow片段扩增技术的信号放大特点，以此策略实现了多聚核苷酸激酶酶活性量化检测。本发明进一步提高了检测灵敏度，实现了高度灵敏、特异、快速、经济高效地对靶标核酸进行多重检测，无需专业操作人员和复杂设备，适用于现场部署和即时检测。时检测。时检测。


技术研发人员：罗阳 陈艺 陈恒屹 陈晓辉 莫家希
受保护的技术使用者：重庆大学
技术研发日：2023.02.14
技术公布日：2023/7/13