一种莱茵衣藻通用表达质粒pHyg-P2A-3HA载体及其构建方法和应用

一种莱茵衣藻通用表达质粒phyg-p2a-3ha载体及其构建方法和应用
技术领域
1.本发明属于生物工程领域，具体涉及一种莱茵衣藻通用表达质粒phyg-p2a-3ha载体及其构建方法和应用。


背景技术：

2.莱茵衣藻(chlamydomonas reinhardtii)是单细胞真核生物，具有光合酵母的称号，同时也是典型的模式生物之一。其生长条件简单、易于培养、培养成本低；细胞周期短、繁殖力强；衣藻的全基因组测序已完成，cdna文库已建立，各种分子生物学技术手段齐全，技术成熟，是良好的基因表达研究的细胞工厂之一。衣藻作为绿色细胞工厂，在食品、养殖、医药等领域的重组蛋白表达具有广泛应用。
3.自剪切多肽2a于1991年在口蹄疫病毒(fmdv)中被发现，平均长度为18-22个氨基酸，位于小核糖核酸病毒家族成员的两种蛋白质之间。2a肽的切割位点一般位于其c末端的甘氨酸(g)和脯氨酸(p)之间。自切割后，2a肽n末端的氨基酸残基连接到上游蛋白，脯氨酸残基则依然连接在下游蛋白，通常2a肽残基可以通过弗林蛋白酶和信号肽去除。在四种常用的2a肽(p2a、t2a、e2a和f2a)中，p2a通常具有最高的切割效率。因此，寻求一种带p2a片段的质粒载体及构建方法显得尤为重要。


技术实现要素：

4.本发明提供一种莱茵衣藻通用表达质粒phyg-p2a-3ha载体及其构建方法和应用，不仅可实现抗性蛋白与目的蛋白相偶联，提高阳性转化子的获得率，还能排除同一阅读框内抗性蛋白的干扰，从而方便研究目的蛋白结构、定位与功能。
5.为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：一种莱茵衣藻通用表达质粒phyg-p2a-3ha载体，包括tub2启动子、潮霉素b(hyg
+
)筛选基因、自剪切多肽p2a、目的基因插入位点ecorv、3’末端的3
×
ha标签和rbcs2终止子；其中，tub2启动子的核苷酸序列如seq id no.2所示，潮霉素b(hyg
+
)筛选基因的核苷酸序列如seq id no.3所示，自剪切多肽p2a的核苷酸序列如seq id no.4所示，目的基因插入位点ecorv的核苷酸序列如seq id no.5所示，3’末端的3
×
ha标签的核苷酸序列如seq id no.6所示，rbcs2终止子的核苷酸序列如seq id no.7所示，所述莱茵衣藻通用表达质粒phyg-p2a-3ha载体的核苷酸序列如seq id no.1所示。
6.本发明还提供了一种莱茵衣藻通用表达质粒phyg-p2a-3ha载体的构建方法，包括以下步骤：
7.(1)构建该表达质粒的载体骨架：以质粒phyg-3ha为模板，质粒phyg-3ha的核苷酸序列如seq id no.8所示，用bamh i和ecor i进行双酶切，可获得四段不同大小的核苷酸序列，分别为2899bp、1072bp、642bp、164bp；对酶切产物进行电泳分析，将2899bp片段进行回收，检测dna浓度后待用；
8.(2)构建含自剪切多肽p2a的序列片段：以质粒phyg-3ha为模板，分别扩增649-2101bp片段和236-361bp片段即为片段一和片段二；合成该片段一时，上游引物(phyg-3ha-f1，seq id no.9)加ecor i酶切位点序列(gaattc)，下游引物(phyg-3ha-r1，seq id no.10)带p2a序列，进行后续搭桥；合成片段二时上游引物(phyg-3ha-f2，seq id no.11)带p2a序列进行搭桥，下游引物(phyg-3ha-r2，seq id no.12)带终止密码子(tga)和bamh i酶切位点序列(ggatcc)；将片段一和片段二使用两端的引物phyg-3ha-f1和phyg-3ha-r2进行搭桥pcr连接得到自剪切多肽p2a的序列片段；
9.(3)将所得自剪切多肽p2a的序列片段进行胶回收，测定片段的浓度，并通过同源重组法将片段整合进入步骤(1)得到的质粒骨架结构片段2899bp，即成表达质粒phyg-p2a-3ha载体，全长为4556bp。
10.优选的，所述步骤(2)中pcr的体系为：
[0011][0012][0013]
；pcr的程序为：
[0014][0015]
优选的，所述步骤(1)中电泳分析是利用1％琼脂糖凝胶电泳分离目的片段，纯化回收是使用胶回收试剂盒纯化。
[0016]
优选的，步骤(3)中，所述同源重组法就是将自剪切多肽p2a的序列片段通过同源重组酶与质粒骨架结构片段2899bp于50℃反应1h进行重组。
[0017]
本发明还提供一种莱茵衣藻通用表达质粒phyg-p2a-3ha载体在筛选阳性转化藻
株中的应用，具体应用过程为：将所需表达的目标基因片段通过同源重组或者酶切连接插入至表达质粒phyg-p2a-3ha载体的ecorv位点，构建成最终的目标基因表达质粒；将最终的目标基因表达质粒线性化后转化入待测衣藻细胞中，转化藻株稳定表达目标蛋白，从而筛选出阳性转化藻株；所述筛选过程包括配制tap液体培养基；hyg
+
抗性筛选平板；限制性内切酶酶切重组质粒获得线性化片段；培养待转化的衣藻细胞，收集细胞和方波电击转化；转化子的筛选与鉴定。
[0018]
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
[0019]
(1)本发明成功构建了一种莱茵衣藻通用表达质粒phyg-p2a-3ha载体，将所需表达的片段插入phyg-p2a-3ha中构建新的质粒，然后将质粒转化至感受态细胞dh5α后进行菌液培养、提质粒，利用合适的限制性内切酶将质粒酶切获得线性化片段，然后通过电击转化插入实验藻株中，该方法通过抗性基因hyg
+
、自剪切多肽p2a、目的基因插入位点ecorv和蛋白标签3
×
ha能够高效筛选阳性转化株，并且外源基因能够不依赖蛋白酶，进行自行切割处理，从而获得能够稳定目的蛋白表达，有利于研究目标蛋白的蛋白结构、定位与功能的相关分子机制。
[0020]
(2)本发明通过在phyg-3ha的抗性基因后面中加入p2a序列，然后加入目的基因和终止子，从而实现了在莱茵衣藻中进行目的基因蛋白质表达时，在单一载体上同时表达抗性筛选基因和目的基因，使抗性筛选基因与目的基因的表达相偶联，提高阳性转化子的获得率，最后通过2a肽末端甘氨酸与脯氨酸之间的的自切割机制，使得hyg+抗性目标蛋白在翻译后会进行与抗性蛋白分离，从而排除同一阅读框内抗性蛋白的干扰，进而方便研究目的蛋白的结构、定位与功能。
附图说明
[0021]
图1是模板质粒phyg-3ha序列结构示意图；
[0022]
图2是bamh i和ecor i酶切phyg-3ha载体(4777bp)的1％琼脂糖凝胶电泳图；
[0023]
图3是莱茵衣藻通用表达质粒phyg-p2a-3ha载体序列结构示意图。
具体实施方式
[0024]
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明。下述方法中，若无特殊说明，则为常规方法。
[0025]
一种莱茵衣藻通用表达质粒phyg-p2a-3ha载体，包括tub2启动子、潮霉素b(hyg
+
)筛选基因、自剪切多肽p2a、3’末端的3
×
ha标签和rbcs2终止子；其中，tub2启动子的核苷酸序列如seq id no.2所示，潮霉素b(hyg
+
)筛选基因的核苷酸序列如seq id no.3所示，自剪切多肽p2a的核苷酸序列如seq id no.4所示，目的基因插入位点ecorv的核苷酸序列如seq id no.5所示，3’末端的3
×
ha标签的核苷酸序列如seq id no.6所示，rbcs2终止子的核苷酸序列如seq id no.7所示，所述莱茵衣藻通用表达质粒phyg-p2a-3ha载体的核苷酸序列如seq id no.1所示。
[0026]
一种莱茵衣藻通用表达质粒phyg-p2a-3ha载体的构建方法，包括以下步骤：
[0027]
(1)构建该表达质粒的载体骨架：以质粒phyg-3ha为模板，如图1所示，质粒phyg-3ha的核苷酸序列如seq id no.8所示，用bamh i和ecor i进行双酶切，如图2所示，可获得
四段不同大小的核苷酸序列，分别为2899bp、1072bp、642bp、164bp；对酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳分析，利用胶回收试剂盒，将2899bp片段进行回收，检测dna浓度后待用；
[0028]
(2)构建含自剪切多肽p2a的序列片段：以质粒phyg-3ha为模板，分别扩增649-2101bp片段，此为片段一，合成该片段时上游引物(phyg-3ha-f1，seq id no.9)加ecor i酶切位点序列(gaattc)，下游引物(phyg-3ha-r1，seq id no.10)带p2a序列，进行后续搭桥；继续以质粒phyg-3ha为模板，扩增236-361bp片段，此为片段二，合成该片段时上游引物(phyg-3ha-f2，seq id no.11)带p2a序列进行搭桥，下游引物(phyg-3ha-r2，seq id no.12)带终止密码子(tga)和bamh i酶切位点序列(ggatcc)；将片段一和片段二使用两端的引物phyg-3ha-f1和phyg-3ha-r2进行搭桥pcr连接得到自剪切多肽p2a的序列片段；
[0029]
pcr体系为：
[0030][0031][0032]
(3)将所得自剪切多肽p2a的序列片段进行胶回收，测定片段的浓度，并通过同源重组法将片段整合进入上述步骤(1)得到的质粒骨架结构片段2899bp，即成表达质粒phyg-p2a-3ha载体，全长为4556bp，如图3所示；所述同源重组法就是将自剪切多肽p2a的序列片段通过同源重组酶与质粒骨架结构片段2899bp于50℃反应1h进行重组。
[0033]
一种莱茵衣藻通用表达质粒phyg-p2a-3ha载体在筛选阳性转化藻株中的应用，具体应用过程为：将所需表达的目标基因片段通过同源重组或者酶切连接插入至phyg-p2a-3ha质粒的ecorv位点，构建成最终的目标基因表达质粒。进一步的，将最终的目标基因表达
质粒线性化后转化入待测衣藻细胞中，转化藻株稳定表达目标蛋白，从而筛选出阳性转化藻株；所述筛选过程包括配制tap液体培养基；hyg
+
抗性筛选平板；限制性内切酶酶切重组质粒获得线性化片段；培养待转化的衣藻细胞，收集细胞和方波电击转化；转化子的筛选与鉴定；具体过程如下所示。
[0034]
a.配制tap液体培养基：
[0035]
tap盐溶液配方：
[0036][0037]
磷酸盐溶液：
[0038][0039]
hutner微量元素：
[0040][0041]
tap液体培养基配方：
[0042][0043][0044]
b.hyg
+
抗性筛选平板：
[0045]
按上述方式配制tap液体培养基后，加入琼脂粉15g/l，再121℃高压蒸汽灭菌20min；培养基冷却至不烫手后在超净工作台向里加潮霉素b(hyg
+
，50mg/ml的储液，2500
×
稀释)，使培养基中hyg+终浓度为20μg/ml，摇匀后倒平板，凝固后备用；
[0046]
c.制备重组质粒线性化片段：
[0047]
将重组质粒用限制性内切酶进行酶切，获得线性化片段，用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，胶回收纯化后测浓度，待用；
[0048]
d.培养待转化的衣藻细胞：
[0049]
在超净工作台中，用接种环挑取新鲜的实验藻株接种到灭过菌tap液体培养基吹气瓶中，在23
±
0.5℃，8000lx光强的条件下连续光照通气，培养3-4天至细胞浓度为1-2
×
107个细胞/ml，进行细胞转接到新鲜的灭过菌的tap液体吹气瓶中，浓度稀释成1
×
106个细胞/ml，继续连续光照培养20h，使其终浓度达4
×
106个细胞/ml，即可用来电击转化。
[0050]
e.收集细胞和方波电击转化：
[0051]
①
收集细胞：在超净工作台中取少量培养好的细胞用血球计数板计数，根据每次转化所需250μl浓度为1
×
108个/ml的细胞，计算每次转化需要取的细胞体积数，将取出的细胞于2500rpm条件下离心3min后去上清，再用预冷的无菌1
×
tap+60mm山梨醇进行重悬，于2500rpm条件下离心3min后去上清，最后用预冷的无菌1
×
tap+60mm山梨醇将细胞重悬至转化所需积体，在冰上静置10min；
[0052]
②
方波电击转化：首先在超净工作台内对0.4cm的电击杯进行预冷处理，每个电击杯先用1ml的无水乙醇洗一遍，再用无菌的1
×
tap+60mm山梨醇溶液洗一遍，每次清洗后均需要晾干，最后放至-20℃冰箱预冷。然后在预冷的电击杯中加入250μl的1
×
108个/ml藻液和约500ng的重组质粒线性化片段，手指轻弹混匀后迅速转移至冰上，使用btx ecm830电击仪，设置参数为500v、4ms、6波段、电击间隔时间为100ms，每次电击前需将电击杯杯侧水迹吸干，点击完毕后于冰上放置5-10min。最后将电击完毕后细胞转入含有10ml无菌的1
×
tap+60mm山梨醇溶液的50ml灭菌离心管中，在弱光条件下摇床慢速过夜恢复；
[0053]
③
涂板
[0054]
配制20％淀粉溶液，将其用水乙醇洗一遍，再用蒸馏水洗两次，每次清洗条件为1000rpm离心2min，清洗完后去上清，用70％乙醇定体积后室温放置。在超净工作台中将20％淀粉溶液混匀，按照每个转化需要2ml量取所需体积，取相应体积的淀粉，先用tap洗两次，再用无菌的1
×
tap+60mm山梨醇溶液洗一次，每次清洗条件为1000rpm离心2min，清洗完后去上清，然后用无菌的1
×
tap+60mm山梨醇重悬至相应体积，最后加入无菌的20％peg 6000使最终浓度为0.4％。将过夜恢复的细胞在2500rpm条件下离心3min，去上清，每管加入2ml上述制备好的20％淀粉溶液重悬混匀，在每个抗性平板上加入1ml混匀液后摇晃混匀液将其均匀铺开，晾干后用封口膜封口倒置于光照培养箱中，23
±
0.5℃、14/10小时明暗光周期、8000lx条件下培养4-7天。
[0055]
f.转化子筛选与鉴定
[0056]
在超净工作台中挑取hyg
+
抗性筛选平板上长出的转化子，涂抹在tap平板上，在23
±
0.5℃、14/10小时明暗光周期、8000lx条件下培养3-4天。然后在超净台向24孔板中每个孔加入1.2ml液体tap，做好标记，挑取藻进相对应的孔中，封口置于光照培养箱，23
±
0.5℃、14/10小时明暗光周期、8000lx条件下摇床培养2-3天。收集细胞，将每个转化藻株细胞离心，每个1.5mlep管1
×
107个细胞，置于-80℃冻存。使用westernblot方法进行目标基因表达的鉴定。
[0057]
通过以上步骤，可以高效筛得含目标蛋白的藻株，从而进一步研究目的蛋白结构、定位与功能。

技术特征：
1.一种莱茵衣藻通用表达质粒phyg-p2a-3ha载体，其特征在于，包括tub2启动子、潮霉素b(hyg
+
)筛选基因、自剪切多肽p2a、目的基因插入位点ecor v、3’末端的3
×
ha标签和rbcs2终止子；其中，tub2启动子的核苷酸序列如seq id no.2所示，潮霉素b(hyg
+
)筛选基因的核苷酸序列如seq id no.3所示，自剪切多肽p2a的核苷酸序列如seq id no.4所示，目的基因插入位点ecor v的核苷酸序列如seq id no.5所示，3’末端的3
×
ha标签的核苷酸序列如seq id no.6所示，rbcs2终止子的核苷酸序列如seq id no.7所示，所述莱茵衣藻通用表达质粒phyg-p2a-3ha载体的核苷酸序列如seq id no.1所示。2.一种如权利要求1所述的莱茵衣藻通用表达质粒phyg-p2a-3ha载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)构建表达质粒phyg-p2a-3ha载体的骨架：以质粒phyg-3ha为模板，质粒phyg-3ha的核苷酸序列如seq id no.8所示，用bamh i和ecor i进行双酶切，可获得四段不同大小的核苷酸序列，分别为2899bp、1072bp、642bp、164bp；对酶切产物进行电泳分析，将2899bp片段进行回收，检测dna浓度后待用；(2)构建含自剪切多肽p2a的序列片段：以质粒phyg-3ha为模板，分别扩增649-2101bp片段和236-361bp片段即为片段一和片段二；合成片段一时，上游引物(phyg-3ha-f1，seq id no.9)加ecor i酶切位点序列(gaattc)，下游引物(phyg-3ha-r1，seq id no.10)带p2a序列，进行后续搭桥；合成片段二时上游引物(phyg-3ha-f2，seq id no.11)带p2a序列进行搭桥，下游引物(phyg-3ha-r2，seq id no.12)带终止密码子(tga)和bamh i酶切位点序列(ggatcc)；将片段一和片段二使用两端的引物phyg-3ha-f1和phyg-3ha-r2进行搭桥pcr连接得到自剪切多肽p2a的序列片段；(3)将所得自剪切多肽p2a的序列片段进行胶回收，测定片段的浓度，并通过同源重组法将片段整合进入步骤(1)得到的质粒骨架结构片段2899bp，即成表达质粒phyg-p2a-3ha载体，全长为4556bp。3.根据权利要求2所述的一种莱茵衣藻通用表达质粒phyg-p2a-3ha载体的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，pcr的体系为：pcr的程序为：
4.根据权利要求2所述的一种莱茵衣藻通用表达质粒phyg-p2a-3ha载体的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，电泳分析是利用1％琼脂糖凝胶电泳分离目的片段，纯化回收是使用胶回收试剂盒纯化。5.根据权利要求2所述的一种莱茵衣藻通用表达质粒phyg-p2a-3ha载体的构建方法，其特征在于，步骤(3)中，所述同源重组法就是将自剪切多肽p2a的序列片段通过同源重组酶与质粒骨架结构片段2899bp于50℃反应1h进行重组。6.一种如权利要求1所述的莱茵衣藻通用表达质粒phyg-p2a-3ha载体在筛选阳性转化藻株中的应用，具体应用过程为：将所需表达的目标基因片段通过同源重组或者酶切连接插入至表达质粒phyg-p2a-3ha载体的ecorv位点，构建成最终的目标基因表达质粒；将最终的目标基因表达质粒线性化后转化入待测衣藻细胞中，转化藻株稳定表达目标蛋白，从而筛选出阳性转化藻株；所述筛选过程包括配制tap液体培养基；hyg+抗性筛选平板；限制性内切酶酶切重组质粒获得线性化片段；培养待转化的衣藻细胞，收集细胞和方波电击转化；转化子的筛选与鉴定。

技术总结
一种莱茵衣藻通用表达质粒pHyg-P2A-3HA载体及其构建方法和应用，其核苷酸序列如SEQID.No.1所示；pHyg-P2A-3HA载体包括TUB2启动子、潮霉素B(Hyg+)筛选基因、自剪切多肽P2A、目的基因插入位点EcoRV、3’末端的3


技术研发人员：王亮 郁慧敏 周慧琳 徐闯 蒋林 芮雪 李宇涵 程一非
受保护的技术使用者：江苏师范大学
技术研发日：2023.01.06
技术公布日：2023/7/13