一种氮杂黄酮类靶向蛋白嵌合体、合成方法及在抗肿瘤活性与降低细胞毒性药物中的应用

1.本发明属于药物化学技术领域，尤其是一种氮杂黄酮类靶向蛋白嵌合体(protacs)、合成方法及其在抗肿瘤活性与降低细胞毒性药物中的应用。


背景技术：

2.根据世界卫生组织国际癌症研究机构(iarc)近日发布的2020年全球最新癌症负担数据，中国已经成为了名副其实的“癌症大国”。2020年中国新发癌症病例457万例，其中男性248万例，女性209万例，2020年中国癌症死亡病例300万例，其中男性182万例，女性118万例。总体而言，我国整体癌症发病率仍持续上升，反映我国癌症实际负担沉重，这也迫切地推动了抗癌创新药物的发展。
3.研究表明，对天然黄酮化合物改造而得的氮杂黄酮类化合物不仅具有抗氧化、抗炎症、抗菌和抗病毒等生物功能，它们还具有潜在的抗肿瘤活性。但是，目前能够实际应用到临床治疗肿瘤的氮杂黄酮类化合物几乎没有，究其原因，化合物的活性较低，并且选择性差，损伤正常细胞，细胞毒性大。
4.蛋白水解靶向嵌合体(proteolysis targeting chimeras，protac)技术，可以同时结合靶蛋白和e3连接酶，从而拉近靶蛋白和e3连接酶之间的距离，诱导靶蛋白泛素化，从而被26s蛋白酶体识别并降解，使其丧失生物活性。
5.通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于克服现有技术上存在的问题，提供一种氮杂黄酮类靶向蛋白嵌合体(protacs)、合成方法及其在抗肿瘤活性与降低细胞毒性药物中的应用。
7.本发明解决技术问题所采用的技术方案是：
8.一种依据protac技术合成具有降低毒性与抗肿瘤活性的氮杂黄酮类靶向蛋白嵌合体，所述靶向蛋白嵌合体的结构式如下：
[0009][0010]
进一步地，所述氮杂黄酮类靶向蛋白嵌合体在细胞水平对活性进行评价，结果表明该化合物在体外水平有抗肿瘤活性与降低细胞毒性的效果。
[0011]
进一步地，所述抗肿瘤为治疗人肝癌细胞hepg2；所述降低细胞毒性为降低正常人脐静脉内皮细胞huvec。
[0012]
进一步地，所述氮杂黄酮类靶向蛋白嵌合体的核磁氢谱数据如下：
[0013]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ8.07(d,j＝8.4hz,1h),7.97(d,j＝8.8hz,1h),7.91(d,j＝8hz,2h),7.66(d,j＝6.8hz,1h),7.51-7.59(m,2h),7.42-7.49(m,3h),7.30-7.37(m,2h),7.10(d,j＝7.2hz,1h),6.92(s,1h),6.78(m,j＝8.0hz,1h),5.18(s,2h),5.01-5.06(m,1h),4.30-4.32(m,2h),4.05-4.18(m,2h),3.97(d,j＝3.2hz,2h),3.80-3.82(m,2h),3.72-3.77(m,8h),2.91-2.98(m,1h),2.73-2.86(m,2h),2.04-2.09(m,1h).。
[0014]
如上所述的氮杂黄酮类靶向蛋白嵌合体的制备方法，合成路线如下：
[0015][0016]
所述方法包括如下步骤：
[0017]
中间体4的合成：
[0018]
将化合物3溶于n,n-二甲基甲酰胺中，向反应液中加入k2co3、泊马度胺，化合物3：k2co3：泊马度胺的比例eq：eq：eq为0.9：3：1，加毕将反应液转移至90℃油浴中，反应6h；待tlc检测反应完毕，将反应液冷却至室温，加水淬灭，乙酸乙酯萃取3次，收集有机相，饱和nacl水溶液洗涤有机相3次，无水na2so4干燥；减压真空浓缩得粗品，经柱层析纯化得到化合物4；其中，柱层析纯化时的洗脱剂体系为体积比为150：1的二氯甲烷：甲醇；
[0019]
中间体5的合成：
[0020]
将化合物4溶于无水二氯甲烷中，在0℃条件下向反应液中加入对甲苯磺酰氯、三乙胺，化合物4：对甲苯磺酰氯：三乙胺的比例mg：mg：ml为300：115：0.5，加毕25℃反应2h；待tlc检测反应完毕，直接旋干拌样，柱层析纯化得到化合物5；其中，柱层析纯化时的洗脱剂体系为体积比为200：1的二氯甲烷、甲醇；
[0021]
中间体6的合成：
[0022]
将化合物5溶于丙酮中，向反应液中加入nai，化合物3：nai的比例eq：eq为1：5，加毕将反应液转移至55℃油浴中，回流反应2h；待tlc检测反应完毕，将反应液冷却至室温，直接旋干拌样；柱层析纯化得到化合物6；其中，柱层析纯化时的洗脱剂体系为体积比为200：1的二氯甲烷、甲醇；
[0023]
化合物7的合成：
[0024]
氩气保护下，将化合物compound 2溶于n,n-二甲基甲酰胺中，向反应液中加入k2co3、化合物6，化合物compound 2：k2co3：化合物6的比例eq：eq：eq为1：3：1，加毕将反应液转移至90℃油浴中，反应6h；待tlc检测反应完毕，将反应液冷却至室温，加水淬灭，乙酸乙
酯萃取3次，收集有机相，饱和nacl水溶液洗涤有机相3次，无水na2so4干燥；减压真空浓缩得粗品，经柱层析纯化得到化合物7，即得具有降低毒性与抗肿瘤活性的氮杂黄酮类靶向蛋白嵌合体；其中，柱层析纯化时的洗脱剂体系为体积比为50：1的二氯甲烷、甲醇。
[0025]
进一步地，化合物3的具体制备步骤如下：
[0026][0027]
在干燥圆底烧瓶中，将化合物1即四甘醇溶于无水二氯甲烷中，在0℃条件下加入对甲苯磺酰氯、三乙胺，化合物1：对甲苯磺酰氯的比例eq：eq为1：0.9，加毕25℃反应2h。待tlc检测反应完毕，将反应液直接旋干拌样，经柱层析纯化得到化合物2；其中，柱层析纯化时洗脱剂体系为：二氯甲烷：甲醇的体积比为300：1；
[0028]
在圆底烧瓶中，将化合物2溶于丙酮中，向反应液中加入碘化钠，化合物2：碘化钠的比例eq：eq为1：5，加毕将反应液转移至55℃油浴中，回流反应30min；待tlc检测反应完毕，将反应液冷却至室温，直接旋干拌样，经柱层析纯化得到化合物3；其中，柱层析纯化时洗脱剂体系为：二氯甲烷：甲醇的体积比为280：1；
[0029]
或者，的具体制备步骤如下：
[0030][0031]
在干燥圆底烧瓶中将碳酸二乙酯溶于甲苯中，向反应液中缓慢加入nah，常温搅拌30min，将反应体系转移至80℃油浴加热，使用恒压漏斗向反应液中滴加加入1-乙酰萘的甲苯溶液，加毕80℃反应1h；待tlc检测反应完毕，反应液冷却至室温，加水淬灭，乙酸乙酯萃取3次，收集有机相，饱和nacl水溶液洗涤有机相3次，无水na2so4干燥；减压真空浓缩得粗品，经柱层析纯化得到化合物b；其中，碳酸二乙酯：nah：1-乙酰萘的比例eq：eq：eq为2：2：1；
柱层析纯化时洗脱剂体系为：石油醚：乙酸乙酯的体积比为300：1；
[0032]
氩气保护下，在圆底烧瓶中将化合物b溶于乙酸中，向反应液中加入对甲氧基苯胺，化合物b：对甲氧基苯胺的比例eq：eq为1：1.5，加毕将反应液转移至80℃油浴中，回流反应48h；待tlc检测反应完毕，将反应液冷却至室温，加水淬灭，乙酸乙酯萃取3次，收集有机相，饱和nacl水溶液洗涤有机相3次，无水na2so4干燥；减压真空浓缩得粗品，经柱层析纯化得到化合物e；柱层析纯化时洗脱剂体系石油醚：乙酸乙酯的体积比为250：1；
[0033]
在圆底烧瓶中，将化合物e溶于二苯醚中，在250℃油浴中反应1h；待tlc检测反应完毕，将反应液冷却至室温，加入正己烷析出固体，抽滤，甲基叔丁基醚洗涤滤饼，干燥，得到化合物f；
[0034]
在干燥的圆底烧瓶中，将化合物f溶于无水二氯甲烷中，在0℃条件下向反应液中缓慢滴加三溴化硼，化合物f：三溴化硼的比例eq：eq为1：10，加毕25℃反应12h；待tlc检测反应完毕，向反应液中缓慢加入冰块，有固体析出，抽滤，得到化合物compound2。
[0035]
进一步地，所述中间体2和中间体5的合成时对甲苯磺酰氯分多次缓慢加入。
[0036]
如上所述的氮杂黄酮类靶向蛋白嵌合体在制备抗肿瘤与降低细胞毒性药物方面中的应用。
[0037]
进一步地，所述抗肿瘤药物为治疗人肝癌细胞hepg2药物。
[0038]
进一步地，所述降低细胞毒性药物为正常人脐静脉内皮细胞huvec药物。
[0039]
本发明取得的优点和有益效果
[0040]
1、本发明合成了一类全新结构的具有抗肿瘤与降低细胞毒性作用的靶向蛋白嵌合体，通过波谱和质谱数据分析表明合成得到的靶向蛋白嵌合体为新化合物，且经体外细胞活性研究证明，本发明提供的靶向蛋白嵌合体对人肝癌细胞hepg2具有很强的抗肿瘤活性，同时对正常人脐静脉内皮细胞huvec杀伤力减小，是一种优良的抗肿瘤新化合物，可望开发成新的抗肿瘤药物。
[0041]
2、本发明的目的是利用protac技术，以一种氮杂黄酮类化合物作为与细胞中目标靶蛋白结合的配体，泊马度胺作为e3连接酶配体，两配体采用四甘醇作为linker连接，对该氮杂黄酮类化合物进行化学改造，得到一个高效低毒的抗肿瘤药物。
[0042]
3、本发明氮杂黄酮类靶向蛋白嵌合体具有抗肿瘤活性与降低细胞毒性作用，可用于抗肿瘤药物治疗，抗肿瘤药物为治疗人肝癌细胞hepg2药物，降低毒性药物为正常人脐静脉内皮细胞huvec药物。
附图说明
[0043]
图1为本发明中化合物4在氘代chcl3中的核磁氢谱图；
[0044]
图2为本发明中化合物5在氘代chcl3中的核磁氢谱图；
[0045]
图3为本发明中化合物6在氘代chcl3中的核磁氢谱图；
[0046]
图4为本发明中化合物7在氘代chcl3中的核磁氢谱图。
具体实施方式
[0047]
为更好理解本发明，下面结合实施例对本发明做进一步地详细说明，但是本发明要求保护的范围并不局限于实施例所表示的范围。
[0048]
本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规市售产品，本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法，本发明所使用的各物质质量均为常规使用质量。
[0049]
一种依据protac技术合成具有降低毒性与抗肿瘤活性的氮杂黄酮类靶向蛋白嵌合体，所述靶向蛋白嵌合体的结构式如下：
[0050][0051]
较优地，所述氮杂黄酮类靶向蛋白嵌合体的核磁氢谱数据如下：
[0052]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ8.07(d,j＝8.4hz,1h),7.97(d,j＝8.8hz,1h),7.91(d,j＝8hz,2h),7.66(d,j＝6.8hz,1h),7.51-7.59(m,2h),7.42-7.49(m,3h),7.30-7.37(m,2h),7.10(d,j＝7.2hz,1h),6.92(s,1h),6.78(m,j＝8.0hz,1h),5.18(s,2h),5.01-5.06(m,1h),4.30-4.32(m,2h),4.05-4.18(m,2h),3.97(d,j＝3.2hz,2h),3.80-3.82(m,2h),3.72-3.77(m,8h),2.91-2.98(m,1h),2.73-2.86(m,2h),2.04-2.09(m,1h).。
[0053]
如上所述的氮杂黄酮类靶向蛋白嵌合体的制备方法，合成路线如下：
[0054][0055]
较优地，所述方法包括如下步骤：
[0056]
中间体4的合成：
[0057]
将化合物3溶于n,n-二甲基甲酰胺中，向反应液中加入k2co3、泊马度胺，化合物3：k2co3：泊马度胺的比例eq：eq：eq为0.9：3：1，加毕将反应液转移至90℃油浴中，反应6h；待tlc检测反应完毕，将反应液冷却至室温，加水淬灭，乙酸乙酯萃取3次，收集有机相，饱和nacl水溶液洗涤有机相3次，无水na2so4干燥；减压真空浓缩得粗品，经柱层析纯化得到化合物4；其中，柱层析纯化时的洗脱剂体系为体积比为150：1的二氯甲烷：甲醇；
[0058]
中间体5的合成：
[0059]
将化合物4溶于无水二氯甲烷中，在0℃条件下向反应液中加入对甲苯磺酰氯、三乙胺，化合物4：对甲苯磺酰氯：三乙胺的比例mg：mg：ml为300：115：0.5，加毕25℃反应2h；待tlc检测反应完毕，直接旋干拌样，柱层析纯化得到化合物5；其中，柱层析纯化时的洗脱剂体系为体积比为200：1的二氯甲烷、甲醇；
[0060]
中间体6的合成：
[0061]
将化合物5溶于丙酮中，向反应液中加入nai，化合物3：nai的比例eq：eq为1：5，加毕将反应液转移至55℃油浴中，回流反应2h；待tlc检测反应完毕，将反应液冷却至室温，直接旋干拌样；柱层析纯化得到化合物6；其中，柱层析纯化时的洗脱剂体系为体积比为200：1的二氯甲烷、甲醇；
[0062]
化合物7的合成：
[0063]
氩气保护下，将化合物compound 2溶于n,n-二甲基甲酰胺中，向反应液中加入k2co3、化合物4，化合物compound 2：k2co3：化合物6的比例eq：eq：eq为1：3：1，加毕将反应液转移至90℃油浴中，反应6h；待tlc检测反应完毕，将反应液冷却至室温，加水淬灭，乙酸乙酯萃取3次，收集有机相，饱和nacl水溶液洗涤有机相3次，无水na2so4干燥；减压真空浓缩得粗品，经柱层析纯化得到化合物7，即得具有降低毒性与抗肿瘤活性的氮杂黄酮类靶向蛋白嵌合体；其中，柱层析纯化时的洗脱剂体系为体积比为50：1的二氯甲烷、甲醇。
[0064]
较优地，化合物3的具体制备步骤如下：
[0065][0066]
在干燥圆底烧瓶中，将化合物1即四甘醇溶于无水二氯甲烷中，在0℃条件下加入对甲苯磺酰氯、三乙胺，化合物1：对甲苯磺酰氯的比例eq：eq为1：0.9，加毕25℃反应2h。待tlc检测反应完毕，将反应液直接旋干拌样，经柱层析纯化得到化合物2；其中，柱层析纯化时洗脱剂体系为：二氯甲烷：甲醇的体积比为300：1；
[0067]
在圆底烧瓶中，将化合物2溶于丙酮中，向反应液中加入碘化钠，化合物2：碘化钠的比例eq：eq为1：5，加毕将反应液转移至55℃油浴中，回流反应30min；待tlc检测反应完毕，将反应液冷却至室温，直接旋干拌样，经柱层析纯化得到化合物3；其中，柱层析纯化时洗脱剂体系为：二氯甲烷：甲醇的体积比为280：1；
[0068]
或者，的具体制备步骤如下：
[0069][0070]
在干燥圆底烧瓶中将碳酸二乙酯溶于甲苯中，向反应液中缓慢加入nah，常温搅拌30min，将反应体系转移至80℃油浴加热，使用恒压漏斗向反应液中滴加加入1-乙酰萘的甲苯溶液，加毕80℃反应1h；待tlc检测反应完毕，反应液冷却至室温，加水淬灭，乙酸乙酯萃取3次，收集有机相，饱和nacl水溶液洗涤有机相3次，无水na2so4干燥；减压真空浓缩得粗品，经柱层析纯化得到化合物b；其中，碳酸二乙酯：nah：1-乙酰萘的比例eq：eq：eq为2：2：1；柱层析纯化时洗脱剂体系为：石油醚：乙酸乙酯的体积比为300：1；
[0071]
氩气保护下，在圆底烧瓶中将化合物b溶于乙酸中，向反应液中加入对甲氧基苯胺，化合物b：对甲氧基苯胺的比例eq：eq为1：1.5，加毕将反应液转移至80℃油浴中，回流反应48h；待tlc检测反应完毕，将反应液冷却至室温，加水淬灭，乙酸乙酯萃取3次，收集有机相，饱和nacl水溶液洗涤有机相3次，无水na2so4干燥；减压真空浓缩得粗品，经柱层析纯化得到化合物e；柱层析纯化时洗脱剂体系石油醚：乙酸乙酯的体积比为250：1；
[0072]
在圆底烧瓶中，将化合物e溶于二苯醚中，在250℃油浴中反应1h；待tlc检测反应完毕，将反应液冷却至室温，加入正己烷析出固体，抽滤，甲基叔丁基醚洗涤滤饼，干燥，得到化合物f；
[0073]
在干燥的圆底烧瓶中，将化合物f溶于无水二氯甲烷中，在0℃条件下向反应液中缓慢滴加三溴化硼，化合物f：三溴化硼的比例eq：eq为1：10，加毕25℃反应12h；待tlc检测反应完毕，向反应液中缓慢加入冰块，有固体析出，抽滤，得到化合物compound 2。
[0074]
较优地，所述中间体2与中间体5的合成时对甲苯磺酰氯分多次缓慢加入。
[0075]
如上所述的氮杂黄酮类靶向蛋白嵌合体在制备抗肿瘤与降低细胞毒性药物方面中的应用。
[0076]
较优地，所述抗肿瘤药物为治疗人肝癌细胞hepg2药物。
[0077]
较优地，所述降低细胞毒性药物为正常人脐静脉内皮细胞huvec药物。
[0078]
具体地，相关制备及检测如下：
[0079]
一种依据protac技术合成具有降低毒性与抗肿瘤活性的氮杂黄酮类靶向蛋白嵌合体，其结构式如下：
[0080][0081]
所述氮杂黄酮类靶向蛋白嵌合体在细胞水平对活性进行评价，结果表明该化合物在体外水平有抗肿瘤活性与降低细胞毒性的效果，所述抗肿瘤药物为人肝癌细胞hepg2药物；所述降低细胞毒性药物为正常人脐静脉内皮细胞huvec药物。
[0082]
如上所述的一种氮杂黄酮类靶向蛋白嵌合体的合成方法，合成路线如下：
[0083][0084]
较优地，具体步骤如下：
[0085]
compound 2具体步骤如下：
[0086][0087]
在干燥圆底烧瓶中将碳酸二乙酯(2eq)溶于甲苯中，向反应液中缓慢加入nah(2eq),常温搅拌30min，将反应体系转移至80℃油浴加热，使用恒压漏斗向反应液中滴加加入1-乙酰萘(1eq)的甲苯溶液，加毕80℃反应1h。待tlc检测反应完毕，反应液冷却至室温，加水淬灭，乙酸乙酯萃取3次，收集有机相，饱和nacl水溶液洗涤有机相3次，无水na2so4干燥。减压真空浓缩得粗品，经柱层析纯化(洗脱剂体系石油醚：乙酸乙酯＝300：1)得到化合物b。
[0088]
氩气保护下，在圆底烧瓶中将化合物b(1eq)溶于乙酸中，向反应液中加入对甲氧基苯胺(1.5eq)，加毕将反应液转移至80℃油浴中，回流反应48h。待tlc检测反应完毕，将反应液冷却至室温，加水淬灭，乙酸乙酯萃取3次，收集有机相，饱和nacl水溶液洗涤有机相3次，无水na2so4干燥。减压真空浓缩得粗品，经柱层析纯化(洗脱剂体系石油醚：乙酸乙酯＝250：1)得到化合物e。
[0089]
在圆底烧瓶中，将化合物e溶于二苯醚中，在250℃油浴中反应1h。待tlc检测反应完毕，将反应液冷却至室温，加入正己烷析出固体，抽滤，甲基叔丁基醚洗涤滤饼，干燥，得到化合物f。
[0090]
在干燥的圆底烧瓶中,将化合物f(1eq)溶于无水二氯甲烷中，在0℃条件下向反应液中缓慢滴加三溴化硼(10eq),加毕25℃反应12h。待tlc检测反应完毕，向反应液中缓慢加入冰块，有固体析出，抽滤，得到化合物compound 2。
[0091]
化合物3制备的具体步骤如下：
[0092][0093]
在干燥圆底烧瓶中，将化合物1四甘醇(1eq)溶于无水二氯甲烷中，在0℃条件下加入对对甲苯磺酰氯(0.9eq)(需分多次缓慢加入)、三乙胺,加毕25℃反应2h。待tlc检测反应完毕，将反应液直接旋干拌样，经柱层析纯化(洗脱剂体系二氯甲烷：甲醇＝300：1)得到化合物2。
[0094]
在圆底烧瓶中，将化合物2(1eq)溶于丙酮中，向反应液中加入碘化钠(5eq),加毕将反应液转移至55℃油浴中，回流反应30min。待tlc检测反应完毕，将反应液冷却至室温，直接旋干拌样，经柱层析纯化(洗脱剂体系二氯甲烷：甲醇＝280：1)得到化合物3。
[0095]
中间体4的合成：
[0096]
在圆底烧瓶中，将化合物3(199.8mg,0.657mmol,0.9eq)溶于n,n-二甲基甲酰胺中，向反应液中加入k2co3(303mg,2.19mmol,3eq)、泊马度胺(200mg,0.73mmol,1eq)，加毕将反应液转移至90℃油浴中，反应6h。待tlc检测反应完毕，将反应液冷却至室温，加水淬灭，乙酸乙酯萃取3次，收集有机相，饱和nacl水溶液洗涤有机相3次，无水na2so4干燥。减压真空浓缩得粗品，经柱层析纯化(洗脱剂体系二氯甲烷：甲醇＝150：1)得到化合物4，收率80％。
[0097]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.40-7.44(m,1h),7.15(d,j＝6.8hz,1h),6.87(d,j＝8.4hz,1h),5.26(s,2h),4.96-5.01(m,1h),3.99-4.13(m,2h),3.71(d,j＝4.0hz,2h),3.59-3.67(m,12h),2.90-2.97(m,1h),2.74-2.84(m,2h),2.05-2.10(m,1h).如图1所示。
[0098]
中间体5的合成：
[0099]
在圆底烧瓶中，将化合物4(300mg,0.67mmol,1eq)溶于无水二氯甲烷中，在0℃条件下向反应液中加入对甲苯磺酰氯(115mg,0.6mmol,0.9eq)(需分多次缓慢加入)、三乙胺(0.5ml),加毕25℃反应2h。待tlc检测反应完毕，直接旋干拌样。柱层析纯化(洗脱剂体系二
氯甲烷：甲醇＝200：1)得到化合物5，收率65％。
[0100]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.79(d,j＝8.0hz,2h),7.41-7.45(m,1h),7.33(d,j＝8.0hz,2h),7.16(d,j＝6.8hz,1h),6.88(d,j＝8.4hz,1h),4.91-4.96(m,1h),4.14-4.17(m,2h),4.00-4.10(m,2h),3.67-3.69(m,2h),3.62(d,j＝6.0hz,4h),3.56-3.60(m,6h),2.93-2.97(m,1h),2.75-2.79(m,2h),2.43(s,3h),2.04-2.12(m,1h).如图2所示。
[0101]
中间体6的合成：
[0102]
在圆底烧瓶中，将化合物5(200mg,0.33mmol,1eq)溶于丙酮中，向反应液中加入nai(273.9mg,1.65mmol,5eq)，加毕将反应液转移至55℃油浴中，回流反应2h。待tlc检测反应完毕，将反应液冷却至室温，直接旋干拌样。柱层析纯化(洗脱剂体系二氯甲烷：甲醇＝200：1)得到化合物6，收率95％。
[0103]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.41-7.45(m,1h),7.16(d,j＝7.2hz,1h),6.88(d,j＝8.4hz,1h),4.93-4.97(m,1h),4.00-4.13(m,2h),3.73-3.77(m,2h),3.61-3.65(m,10h),3.24-3.27(m,2h),2.90-2.98(m,1h),2.71-2.84(m,2h),2.05-2.12(m,1h).如图3所示。
[0104]
化合物7的合成：
[0105]
氩气保护下，在干燥的圆底烧瓶中，将化合物compound 2(103mg,0.36mmol,1eq)溶于n,n-二甲基甲酰胺中，向反应液中加入k2co3(149.25mg,1.08mmol,3eq)、化合物6(200mg,0.36mmol,1eq),加毕将反应液转移至90℃油浴中，反应6h。待tlc检测反应完毕，将反应液冷却至室温，加水淬灭，乙酸乙酯萃取3次，收集有机相，饱和nacl水溶液洗涤有机相3次，无水na2so4干燥。减压真空浓缩得粗品，经柱层析纯化(洗脱剂体系二氯甲烷：甲醇＝50：1)得到化合物7，收率40％。
[0106]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ8.07(d,j＝8.4hz,1h),7.97(d,j＝8.8hz,1h),7.91(d,j＝8hz,2h),7.66(d,j＝6.8hz,1h),7.51-7.59(m,2h),7.42-7.49(m,3h),7.30-7.37(m,2h),7.10(d,j＝7.2hz,1h),6.92(s,1h),6.78(m,j＝8.0hz,1h),5.18(s,2h),5.01-5.06(m,1h),4.30-4.32(m,2h),4.05-4.18(m,2h),3.97(d,j＝3.2hz,2h),3.80-3.82(m,2h),3.72-3.77(m,8h),2.91-2.98(m,1h),2.73-2.86(m,2h),2.04-2.09(m,1h).如图4所示。
[0107]
本发明化合物及靶向蛋白嵌合体的细胞增殖抑制率的测定：
[0108]
溶液的配制：
[0109]
dmem低糖培养液的配制：购买dmem低糖培养基，每瓶500ml，加入10％的胎牛血清和1％的青链霉素溶液，即每瓶培养基加入50ml的胎牛血清和5ml的青链霉素，培养基的配置在超净工作台中进行，后放置冰箱4℃保存。
[0110]
pbs缓冲液的配制：在1000ml锥形瓶中，称取氯化钠8g，氯化钾0.2g，十二水磷酸氢二钠2.9g，磷酸二氢钾0.2g，加入800ml纯净水充分搅拌溶解后定容至1000ml，高压灭菌后放置冰箱4℃保存。
[0111]
mtt溶液的配制：称取mtt干粉0.5g，溶于100ml pbs缓冲液中，用0.22μm滤膜过滤除菌后，放置冰箱-12℃保存。
[0112]
细胞增殖抑制率的测定具体步骤：
[0113]
本发明细胞增殖抑制率的测定所用细胞：人肝癌细胞hepg2、人脐静脉上皮细胞huvec。
[0114]
hepg2细胞或huvec细胞使用的培养液为含1％的青霉素-链霉素溶液，10％的胎牛
血清的dmem低糖培养液，培养条件为37℃、含5％co2的恒温培养箱。
[0115]
具体步骤：
[0116]
(1)用血球计数板对细胞进行计数后，用培养液将其稀释至5x104个/ml；
[0117]
(2)在96孔板的每个孔里加入100μl细胞悬液，在37℃培养箱中培养hepg2，细胞24h；
[0118]
(3)将所需测试化合物溶于二甲基亚砜，按照浓度依次加药0.5μl/孔，药物終浓度为1或10μm，培养箱37℃温育48h；
[0119]
(4)加入浓度为20μl 5mg/ml的mtt，培养箱37℃温育4h；
[0120]
(5)弃去培养基，加入100μl dmso溶解细胞，37℃孵育10分钟，用酶标仪测定492和630nm的od值；
[0121]
(6)处理数据，根据od值计算存活率。
[0122]
结果如表1所示：
[0123]
表1氮杂黄酮靶向嵌合体存活率
[0124][0125]
实验结果显示：相对于原药化合物compound 2来说，化合物7活性虽未有部分下降，却依然对人肝癌细胞hepg2有抑制作用。但是，通过多对正常细胞的增殖抑制实验，化合物7对正常细胞的毒性显著下降，尤其在10μmol/l时，其安全性增加了一倍。氮杂黄酮靶向嵌合体细胞毒性降低，安全性提升，具有研发新型抗肿瘤药物的潜力。
[0126]
尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。

技术特征：
1.一种依据protac技术合成具有降低毒性与抗肿瘤活性的氮杂黄酮类靶向蛋白嵌合体，其特征在于：所述靶向蛋白嵌合体的结构式如下：2.根据权利要求1所述的氮杂黄酮类靶向蛋白嵌合体，其特征在于：所述氮杂黄酮类靶向蛋白嵌合体在细胞水平对活性进行评价，结果表明该化合物在体外水平有抗肿瘤活性与降低细胞毒性的效果。3.根据权利要求2所述的氮杂黄酮类靶向蛋白嵌合体，其特征在于：所述抗肿瘤为治疗人肝癌细胞hepg2；所述降低细胞毒性为降低正常人脐静脉内皮细胞huvec。4.根据权利要求1至3任一项所述的氮杂黄酮类靶向蛋白嵌合体，其特征在于：所述氮杂黄酮类靶向蛋白嵌合体的核磁氢谱数据如下：1h nmr(400mhz,cdcl3)δ8.07(d,j＝8.4hz,1h),7.97(d,j＝8.8hz,1h),7.91(d,j＝8hz,2h),7.66(d,j＝6.8hz,1h),7.51-7.59(m,2h),7.42-7.49(m,3h),7.30-7.37(m,2h),7.10(d,j＝7.2hz,1h),6.92(s,1h),6.78(m,j＝8.0hz,1h),5.18(s,2h),5.01-5.06(m,1h),4.30-4.32(m,2h),4.05-4.18(m,2h),3.97(d,j＝3.2hz,2h),3.80-3.82(m,2h),3.72-3.77(m,8h),2.91-2.98(m,1h),2.73-2.86(m,2h),2.04-2.09(m,1h).。5.如权利要求书1至4任一项所述的氮杂黄酮类靶向蛋白嵌合体的制备方法，其特征在于：合成路线如下：所述方法包括如下步骤：中间体4的合成：将化合物3溶于n,n-二甲基甲酰胺中，向反应液中加入k2co3、泊马度胺，化合物3：k2co3：泊马度胺的比例eq：eq：eq为0.9：3：1，加毕将反应液转移至90℃油浴中，反应6h；待tlc检测反应完毕，将反应液冷却至室温，加水淬灭，乙酸乙酯萃取3次，收集有机相，饱和nacl水溶液洗涤有机相3次，无水na2so4干燥；减压真空浓缩得粗品，经柱层析纯化得到化合物4；其
中，柱层析纯化时的洗脱剂体系为体积比为150：1的二氯甲烷：甲醇；中间体5的合成：将化合物4溶于无水二氯甲烷中，在0℃条件下向反应液中加入对甲苯磺酰氯、三乙胺，化合物4：对甲苯磺酰氯：三乙胺的比例mg：mg：ml为300：115：0.5，加毕25℃反应2h；待tlc检测反应完毕，直接旋干拌样，柱层析纯化得到化合物5；其中，柱层析纯化时的洗脱剂体系为体积比为200：1的二氯甲烷、甲醇；中间体6的合成：将化合物5溶于丙酮中，向反应液中加入nai，化合物3：nai的比例eq：eq为1：5，加毕将反应液转移至55℃油浴中，回流反应2h；待tlc检测反应完毕，将反应液冷却至室温，直接旋干拌样；柱层析纯化得到化合物6；其中，柱层析纯化时的洗脱剂体系为体积比为200：1的二氯甲烷、甲醇；化合物7的合成：氩气保护下，将化合物compound 2溶于n,n-二甲基甲酰胺中，向反应液中加入k2co3、化合物6，化合物compound 2：k2co3：化合物6的比例eq：eq：eq为1：3：1，加毕将反应液转移至90℃油浴中，反应6h；待tlc检测反应完毕，将反应液冷却至室温，加水淬灭，乙酸乙酯萃取3次，收集有机相，饱和nacl水溶液洗涤有机相3次，无水na2so4干燥；减压真空浓缩得粗品，经柱层析纯化得到化合物7，即得具有降低毒性与抗肿瘤活性的氮杂黄酮类靶向蛋白嵌合体；其中，柱层析纯化时的洗脱剂体系为体积比为50：1的二氯甲烷、甲醇。6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：化合物3的具体制备步骤如下：在干燥圆底烧瓶中，将化合物1即四甘醇溶于无水二氯甲烷中，在0℃条件下加入对甲苯磺酰氯、三乙胺，化合物1：对甲苯磺酰氯的比例eq：eq为1：0.9，加毕25℃反应2h。待tlc检测反应完毕，将反应液直接旋干拌样，经柱层析纯化得到化合物2；其中，柱层析纯化时洗脱剂体系为：二氯甲烷：甲醇的体积比为300：1；在圆底烧瓶中，将化合物2溶于丙酮中，向反应液中加入碘化钠，化合物2：碘化钠的比例eq：eq为1：5，加毕将反应液转移至55℃油浴中，回流反应30min；待tlc检测反应完毕，将反应液冷却至室温，直接旋干拌样，经柱层析纯化得到化合物3；其中，柱层析纯化时洗脱剂体系为：二氯甲烷：甲醇的体积比为280：1；或者，的具体制备步骤如下：
在干燥圆底烧瓶中将碳酸二乙酯溶于甲苯中，向反应液中缓慢加入nah，常温搅拌30min，将反应体系转移至80℃油浴加热，使用恒压漏斗向反应液中滴加加入1-乙酰萘的甲苯溶液，加毕80℃反应1h；待tlc检测反应完毕，反应液冷却至室温，加水淬灭，乙酸乙酯萃取3次，收集有机相，饱和nacl水溶液洗涤有机相3次，无水na2so4干燥；减压真空浓缩得粗品，经柱层析纯化得到化合物b；其中，碳酸二乙酯：nah：1-乙酰萘的比例eq：eq：eq为2：2：1；柱层析纯化时洗脱剂体系为：石油醚：乙酸乙酯的体积比为300：1；氩气保护下，在圆底烧瓶中将化合物b溶于乙酸中，向反应液中加入对甲氧基苯胺，化合物b：对甲氧基苯胺的比例eq：eq为1：1.5，加毕将反应液转移至80℃油浴中，回流反应48h；待tlc检测反应完毕，将反应液冷却至室温，加水淬灭，乙酸乙酯萃取3次，收集有机相，饱和nacl水溶液洗涤有机相3次，无水na2so4干燥；减压真空浓缩得粗品，经柱层析纯化得到化合物e；柱层析纯化时洗脱剂体系石油醚：乙酸乙酯的体积比为250：1；在圆底烧瓶中，将化合物e溶于二苯醚中，在250℃油浴中反应1h；待tlc检测反应完毕，将反应液冷却至室温，加入正己烷析出固体，抽滤，甲基叔丁基醚洗涤滤饼，干燥，得到化合物f；在干燥的圆底烧瓶中，将化合物f溶于无水二氯甲烷中，在0℃条件下向反应液中缓慢滴加三溴化硼，化合物f：三溴化硼的比例eq：eq为1：10，加毕25℃反应12h；待tlc检测反应完毕，向反应液中缓慢加入冰块，有固体析出，抽滤，得到化合物compound 2。7.根据权利要求5或6所述的制备方法，其特征在于：所述中间体2和中间体5的合成时对甲苯磺酰氯分多次缓慢加入。8.如权利要求书1至4任一项所述的氮杂黄酮类靶向蛋白嵌合体在制备抗肿瘤与降低细胞毒性药物方面中的应用。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述抗肿瘤药物为治疗人肝癌细胞hepg2药物。10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述降低细胞毒性药物为正常人脐静脉内皮细胞huvec药物。

技术总结
本发明公开了一种依据PROTAC技术合成具有降低毒性与抗肿瘤活性的氮杂黄酮类靶向蛋白嵌合体，所述靶向蛋白嵌合体的结构式如下：本发明合成了一类全新结构的具有抗肿瘤与降低细胞毒性作用的靶向蛋白嵌合体，通过波谱和质谱数据分析表明合成得到的靶向蛋白嵌合体为新化合物，且经体外细胞活性研究证明，本发明提供的靶向蛋白嵌合体对人肝癌细胞HepG2具有很强的抗肿瘤活性，同时对正常人脐静脉内皮细胞HUVEC杀伤力减小，是一种优良的抗肿瘤新化合物，可望开发成新的抗肿瘤药物。成新的抗肿瘤药物。成新的抗肿瘤药物。


技术研发人员：向岑 魏玲玲 徐雪萍 黄梓豪 李佳莉 滕玉鸥 刘江 郁彭
受保护的技术使用者：天津科技大学
技术研发日：2022.12.21
技术公布日：2023/7/13