一种使用烯还原酶及其突变体对潜手性碳碳双键的不对称还原方法与流程

1.本发明属于酶工程技术领域，特别涉及一种使用烯还原酶及其突变体对潜手性碳碳双键的不对称还原方法。


背景技术：

2.化合物(2r)-1-(1h-吲哚-3-基)丙烷-2-胺(7795-52-0)是临床上治疗晚期乳腺癌的等药物的关键手性中间体。目前的合成方法是用非手性的氢化铝锂还原，再依赖化学拆分得到。原子经济性较低、价格较高，收率非常低，且氢化铝锂储存、使用安全风险高。现有商业化酶以及天然酶，均不能产生所需的2r的构型，或产生该构型的立体特异性不够高 (通常《50％)。
3.现有技术是从3-[(2-nitroprop-1-enyl]-1h-indole出发，经过非手性的氢化铝锂还原形成立体构型混合的(1h-吲哚-3-基)丙烷-2-胺，在手性碱等拆分试剂的存在下，经过一次或多次重结晶，得到所需构型富集的(2r)-1-(1h-吲哚-3-基)丙烷-2-胺盐。现有工艺通过手性拆分获得所需的立体构型富集的产物，这个过程中反构型的产物被丢弃，理论分离收率低于50％，实际为了得到足够高立体纯度，收率往往低于30％。工艺中需要使用当量以上的手性拆分试剂，价格昂贵，原子经济性不够高；工艺需要严格控制温度，操作较为复杂；需要大量有机溶剂，不够环保。
[0004]
因此，本领域亟需一种立体选择性高的烯还原酶及使用其对潜手性碳碳双键的去对称方法。


技术实现要素：

[0005]
本发明所要解决的问题是现有技术中的烯还原酶在催化碳碳双键还原时选择性低和收率低。为此，本发明提供了一种烯还原酶或其突变体对潜手性碳碳双键的不对称还原方法。以本技术中的烯还原酶催化的碳碳双键还原反应，条件温和、选择性高、成本低、原料转化率高、收率高且产物手性纯度高。
[0006]
本发明提供了一种烯还原酶或其突变体对潜手性碳碳双键的不对称还原方法，其包括如下步骤：烯还原酶或其突变体和辅酶的存在下，将如化合物ii在有机溶剂中进行催化还原反应得化合物i即可；
[0007][0008]
r1为h；
[0009]
r2为甲基或乙基；
[0010]
r3为“杂原子选自n，杂原子个数为1个或2个”的9元杂芳基或被r
l
取代的“杂原子选
自n，杂原子个数为1个”的9元杂芳基；
[0011]
所述r
l
独立地为h、oh、ome、f、cl、br或nh2；
[0012]
所述烯还原酶为如seq id no:1所示的氨基酸序列或其突变体；
[0013]
所述的突变体的突变位点选自如seq id no:1所示的氨基酸序列的第4位、第9位、第10位、第11位、第12位、第13位、第14位、第19位、第20位、第21位、第23 位、第24位、第25位、第26位、第27位、第39位、第42位、第43位、第46位、第51位、第53位、第54位、第55位、第56位、第57位、第58位、第59位、第63 位、第64位、第65位、第66位、第67位、第69位、第70位、第73位、第95位、第96位、第97位、第98位、第99位、第100位、第101位、第102位、第103位、第104位、第105位、第106位、第114位、第123位、第124位、第125位、第126 位、第128位、第135位、第136位、第137位、第145位、第148位、第149位、第 151位、第152位、第153位、第154位、第155位、第156位、第157位、第158位、第159位、第160位、第161位、第162位、第167位、第168位、第169位、第170 位、第171位、第172位、第173位、第175位、第176位、第177位、第178位、第 179位、第180位、第181位、第184位、第207位、第208位、第209位、第210位、第211位、第212位、第213位、第214位、第215位、第216位、第217位、第218 位、第219位、第220位、第221位、第222位、第223位、第224位、第225位、第 226位、第227位、第228位、第229位、第230位、第231位、第232位、第233位、第234位、第235位、第243位、第254位、第255位、第256位、第257位、第258 位、第260位、第261位、第262位、第263位、第264位、第267位、第268位、第 269位、第270位、第277位、第289位、第290位、第291位、第293位、第294位、第295位、第296位、第299位、第300位、第303位、第309位、第311位、第312 位、第313位、第314位、第315位、第316位、第317位、第318位、第320位、第 321位、第324位、第328位、第334位、第335位、第336位、第337位、第338位、第339位、第340位、第341位、第342位、第343位、第344位、第345位、第349 位、第350位、第353位、第356位、第361位的一个或多个。
[0014]
在本发明某一方案中，所述的制备方法中的某些条件的定义可如下所述，其他条件的定义可如上任一方案所述(以下简称“在本发明某一方案中”)：所述“杂原子选自n，杂原子个数为1个或2个”的9元杂芳基可为吲哚基、吡咯并吡啶、吡咯并吡嗪、吡咯并哒嗪，吡咯并嘧啶，例如
[0015]
在本发明某一方案中，所述“杂原子选自n，杂原子个数为1个”的9元杂芳基可为吲哚基。
[0016]
在本发明某一方案中，所述化合物ii优选
[0017]
在本发明某一方案中，所述有机溶剂可为本领域该类反应常规，例如含硫类有机溶剂，又例如二甲基亚砜。
[0018]
在本发明某一方案中，所述化合物ii与所述有机溶剂中的质量体积比可为本领域
该类反应常规，例如33g/l～100g/l，又例如33g/l、67g/l或100g/l。
[0019]
在本发明某一方案中，所述烯还原酶或其突变体与化合物ii的质量比可为本领域该类反应常规，例如(0.25～2):1，又例如0.25:1，1:1或2:1。所述烯还原酶或其突变体可以以纯酶的形式存在，也可以以宿主菌培养并表达后的粗酶提取液或其浓缩液的形式存在。
[0020]
在本发明某一方案中，所述催化还原反应温度可为本领域该类反应常规，例如0～30℃，又例如4～27℃，还例如7～27℃，优选4℃、7℃、17℃或27℃。
[0021]
在本发明某一方案中，所述催化还原反应时间可为本领域该类反应常规，例如4～16 小时，还例如4小时、8小时或16小时。
[0022]
在本发明某一方案中，所述辅酶可为还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nad(p)h，即辅酶ii)，或还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nadh，即辅酶i)，所述nad(p)h或nadh 可为由d-葡萄糖与葡萄糖脱氢酶和nadp+或nad+在缓冲溶液中反应得到。
[0023]
在本发明某一方案中，所述d-葡萄糖与所述化合物ii的质量比可为本领域该类反应常规，例如0.5:1～2:1，又例如1:1。
[0024]
在本发明某一方案中，所述β-磷酸烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸二钠盐或β-磷酸烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐与所述化合物ii的质量比可为本领域该类反应常规，例如(0.01～0.05):1，又例如0.01：1或0.05:1。
[0025]
在本发明某一方案中，所述葡萄糖脱氢酶与所述化合物ii的质量比可为本领域该类反应常规，例如0.05～0.2:1，又例如0.05:1、0.1:1或0.2:1。
[0026]
在本发明某一方案中，所述缓冲溶液可为本领域该类反应常规，例如pbs缓冲溶液 (磷酸盐缓冲液)，teoa缓冲溶液(三乙醇胺盐缓冲液)或tris缓冲溶液(三羟甲基甲胺盐缓冲液)。
[0027]
在本发明某一方案中，所述d-葡萄糖与所述缓冲溶液的质量体积比可为本领域该类反应常规，例如5g/l～71.4g/l，又例如5g/l、28.5g/l或71.4g/l。
[0028]
在本发明某一方案中，所述缓冲溶液的ph值可为本领域该类反应常规，例如ph＝6.5， ph＝7或ph＝7.5。
[0029]
在本发明某一方案中，所述的突变体的突变位点选自如seq id no:1所示的氨基酸序列的第004位、第009位、第012位、第014位、第021位、第024位、第039位、第055位、第059位、第063位、第064位、第065位、第066位、第069位、第095 位、第096位、第103位、第114位、第124位、第125位、第126位、第136位、第 145位、第157位、第159位、第160位、第161位、第169位、第171位、第172位、第176位、第181位、第209位、第214位、第215位、第217位、第219位、第220 位、第224位、第228位、第229位、第231位、第232位、第234位、第263位、第 264位、第269位、第277位、第289位、第291位、第296位、第303位、第309位、第312位、第318位、第336位、第337位、第339位、第342位、第349位、第353 位、第356和361位的一种或多种。
[0030]
在本发明某一方案中，所述的突变体的为如seq id no:1所示的氨基酸序列的第4 位的氨基酸残基突变为i、n、p、q或w，和/或，第9位的氨基酸残基突变为a、c、 k、n、q、s或w，和/或，第10位的氨基酸残基突变为a、f、h、n、p、q、s或t，和/或，第11位的氨基酸残基突变为a、c、h、l或m，和/或，第12位的氨基酸残基突变为a、d、f、g、k、m、r或s，和/或，第13位的氨基酸残基突变为t，和/或，第 14位的氨基酸残基突变为m、p、t或y，和/或，第19位的氨基酸残基突变为p或r，和/或，第20位的氨基酸残基突变为a、d、e、g或i，和/或，第21位的氨基酸残
基突变为h、i、k、n、q或t，和/或，第23位的氨基酸残基突变为s，和/或，第24位的氨基酸残基突变为a、c、f、g、i、n、s或y，和/或，第25位的氨基酸残基突变为e、 p、s、v或w，和/或，第26位的氨基酸残基突变为a、c、g、n或v，和/或，第27 位的氨基酸残基突变为a、n、r或s，和/或，第39位的氨基酸残基突变为a、c、f、 n、r或t，和/或，第42位的氨基酸残基突变为d或w，和/或，第43位的氨基酸残基突变为k或n，和/或，第46位的氨基酸残基突变为d、h、m、p或y，和/或，第51 位的氨基酸残基突变为a、f、g、k或m，和/或，第53位的氨基酸残基突变为i、r、 v或y，和/或，第54位的氨基酸残基突变为d、g、i、r、s或w，和/或，第55位的氨基酸残基突变为h、m或n，和/或，第56位的氨基酸残基突变为a、i、k、n或r，和/或，第57位的氨基酸残基突变为a、g、l、m、q、t或y，和/或，第58位的氨基酸残基突变为f、g或y，和/或，第59位的氨基酸残基突变为c、e、h、s、v或y，和/或，第63位的氨基酸残基突变为a、d、h、m、n、p、r、或y，和/或，第64位的氨基酸残基突变为a、c、e、i、q、或t，和/或，第65位的氨基酸残基突变为f、n、 p、s、t、或w，和/或，第66位的氨基酸残基突变为w、a、f、h、l、r、或y，和/ 或，第67位的氨基酸残基突变为e、h、k、l、或w，和/或，第69位的氨基酸残基突变为f、n、s、t、或w，和/或，第70位的氨基酸残基突变为k或r，和/或，第73位的氨基酸残基突变为a、c、e、g、l、m、或q，和/或，第95位的氨基酸残基突变为 a、e、i、m、p、q、或r，和/或，第96位的氨基酸残基突变为f、h、p、q、s或w，和/或，第97位的氨基酸残基突变为c、f、k、l、m、s或t，和/或，第98位的氨基酸残基突变为h、k、l、p、s或v，和/或，第99位的氨基酸残基突变为v、d、g或i，和/或，第100位的氨基酸残基突变为f、t或w，和/或，第101位的氨基酸残基突变为 i、n、p、或q，和/或，第102位的氨基酸残基突变为a、i、m、q、r、s或t，和/或，第103位的氨基酸残基突变为f、g、h、n或y，和/或，第104位的氨基酸残基突变为 c、l、r、或v，和/或，第105位的氨基酸残基突变为g、m、n或t，和/或，第106 位的氨基酸残基突变为f、l、m、q、w或y，和/或，第114位的氨基酸残基突变为f、 h、i、m、p、w或y，和/或，第123位的氨基酸残基突变为h、k、v、w、或y，和/ 或，第124位的氨基酸残基突变为e、g、h、m、n、p、q、v或y，和/或，第125位的氨基酸残基突变为a、f、k、r、s、或v，和/或，第126位的氨基酸残基突变为f、 g、h、p、q、s或y，和/或，第128位的氨基酸残基突变为c、e、g、q、t或y，和 /或，第135位的氨基酸残基突变为d、g或q，和/或，第136位的氨基酸残基突变为a、 c、e、g、s或t，和/或，第137位的氨基酸残基突变为a、c、e、f、n或v，和/或，第145位的氨基酸残基突变为a、e、k、s或m，和/或，第148位的氨基酸残基突变为 c、h、l、p、r、t或w，和/或，第149位的氨基酸残基突变为a、d、f、g、h、m、 n或y，和/或，第151位的氨基酸残基突变为n，和/或，第152位的氨基酸残基突变为 d、h、i或m，和/或，第153位的氨基酸残基突变为a、v、或w，和/或，第154位的氨基酸残基突变为e、f、h、p、或t，和/或，第155位的氨基酸残基突变为a、e、g、 i、p、t、w或y，和/或，第156位的氨基酸残基突变为g、k、m或w，和/或，第157 位的氨基酸残基突变为d、n、r、s、或v，和/或，第158位的氨基酸残基突变为d、 g、i、k、p、r或s，和/或，第159位的氨基酸残基突变为c、e、f或m，和/或，第 160位的氨基酸残基突变为a、d、e、f或m、，和/或，第161位的氨基酸残基突变为 a、e、f、k、l、n或y，和/或，第162位的氨基酸残基突变为g或t，和/或，第167 位的氨基酸残基突变为n或v，和/或，第168位的氨基酸残基突变为c、d、f、k、n、 r或s，和/或，第169位的氨基酸残基突变为a、c、p、s或t，和/或，第170位的氨基酸残基突变为c、e、f、g、i或v，和/或，第171位的氨基酸残基突变为a、f、l、 p、s、v或y，和/或，第172位的氨基酸残基突变为f、h、i、k、s或w，和/或，第 173位的氨基酸残基突变为h、r、s、t、v或w，和/或，第175位的氨基酸残基突变为h、l、m、n、p、r、s或t，和/或，第176位
的氨基酸残基突变为a、d、h、n或 y，和/或，第177位的氨基酸残基突变为d、f、n或w，和/或，第178位的氨基酸残基突变k、p或v，和/或，第179位的氨基酸残基突变为a、h或w，和/或，第180位的氨基酸残基突变为a、d、e、f、i或y，和/或，第181位的氨基酸残基突变为c、h、 k、n、q、s、t或w，和/或，第184位的氨基酸残基突变为e、g、h、m、q或y，和/或，第207位的氨基酸残基突变为d、l或p，和/或，第208位的氨基酸残基突变为 k、l或w，和/或，第209位的氨基酸残基突变为f、k、q、t或v，和/或，第210位的氨基酸残基突变为c、d、f、g、l、n、q或t，和/或，第211位的氨基酸残基突变为a、c或f，和/或，第212位的氨基酸残基突变为c、h、m、v或w，和/或，第213 位的氨基酸残基突变为a、g、n、q、s或v，和/或，第214位的氨基酸残基突变为f、i、n、p、q、w或y，和/或，第215位的氨基酸残基突变为e、i、k、n、p、q或v，和/或，第216位的氨基酸残基突变为a、c、g、h、i、k、q、t或y，和/或，第217 位的氨基酸残基突变为g、k、n、r或s，和/或，第218位的氨基酸残基突变为f、g、 n、r、s、t或v，和/或，第219位的氨基酸残基突变为f、h、q、t或y，和/或，第 220位的氨基酸残基突变为a、h、n、q、v或w，和/或，第221位的氨基酸残基突变为a、r或v，和/或，第222位的氨基酸残基突变为a、c、f、l、q、s或w，和/或，第223位的氨基酸残基突变为a、e、p或y，和/或，第224位的氨基酸残基突变为a、 k、l、m、n、p或y，和/或，第225位的氨基酸残基突变为d、g、k或m，和/或，第226位的氨基酸残基突变为a、c、e或m，和/或，第227位的氨基酸残基突变为e、 g、i、q、s、t、v或w，和/或，第228位的氨基酸残基突变为d、e、g、i、k或l，和/或，第229位的氨基酸残基突变为h或s，和/或，第230位的氨基酸残基突变为y，和/或，第231位的氨基酸残基突变为a、d、h、i、k、p、r、s或t，和/或，第232位的氨基酸残基突变为a、c、d、h、m或t，和/或，第233位的氨基酸残基突变为i、l、n、p或s，和/或，第234位的氨基酸残基突变为a、l或w，和/或，第235位的氨基酸残基突变为l，和/或，第243位的氨基酸残基突变为a、h、p、r或v，和/或，第 254位的氨基酸残基突变为s或w，和/或，第255位的氨基酸残基突变为c、h、p，和 /或，第256位的氨基酸残基突变为k、l、n、r或y，和/或，第257位的氨基酸残基突变为f、g、i、l、p、r、s或t，和/或，第258位的氨基酸残基突变为c、i、q、t、 v或y，和/或，第260位的氨基酸残基突变为m、n、p、r或s，和/或，第261位的氨基酸残基突变为m，和/或，第262位的氨基酸残基突变为f、q、s，和/或，第263位的氨基酸残基突变为a、e、g、m、p、q、r、s或t，和/或，第264位的氨基酸残基突变为t或y，和/或，第267位的氨基酸残基突变为i、n、或s，和/或，第268位的氨基酸残基突变为e、f、l、n、p，和/或，第269位的氨基酸残基突变为d、f、l、m、t 或y，和/或，第270位的氨基酸残基突变为d、e、n、v或w，和/或，第277位的氨基酸残基突变为q，和/或，第289位的氨基酸残基突变为c、e、f、m、t或y，和/或，第290位的氨基酸残基突变为h、s或v，和/或，第291位的氨基酸残基突变为c、d、 g、i或k，和/或，第293位的氨基酸残基突变为c、e、f、k或p，和/或，第294位的氨基酸残基突变为d、f、h、m或w，和/或，第295位的氨基酸残基突变为f，和/或，第296位的氨基酸残基突变为c、e、g、s、v或y，和/或，第299位的氨基酸残基突变为a、g、p、r或w，和/或，第300位的氨基酸残基突变f、g、h、k、n或v，和 /或，第303位的氨基酸残基突变为g、h、i、l、q、r、v或w，和/或，第309位的氨基酸残基突变为e、g、l、m、s或y，和/或，第311位的氨基酸残基突变为d、f、i、 l、v或y，和/或，第312位的氨基酸残基突变为g、h、k、r、s或v，和/或，第313 位的氨基酸残基突变为d、i、m、p、q或s，和/或，第314位的氨基酸残基突变为e、 i、r、或s，和/或，第315位的氨基酸残基突变为c、d、h、q、w或y，和/或，第316 位的氨基酸残基突变为g、l、q或y，和/或，第317位的氨基酸残基突变为k或t，和/或，第318位的氨基酸残基突变为i、l、p、v或w，和/或，第320位的
氨基酸残基突变为a、f、g、m、t或v，和/或，第321位的氨基酸残基突变为c、k、r、v或w，和/或，第324位的氨基酸残基突变c、d、m、n、p或v，和/或，第328位的氨基酸残基突变为a、i、k、l、q或y，和/或，第334位的氨基酸残基突变为e、p、q、s、或 w，和/或，第335位的氨基酸残基突变为a、c、e、h或l，和/或，第336位的氨基酸残基突变为g、c、n、q、或t，和/或，第337位的氨基酸残基突变为g、m、p、q、 r、s、t或v，和/或，第338位的氨基酸残基突变为d、w或y，和/或，第339位的氨基酸残基突变为e、i、n、p或q，和/或，第340位的氨基酸残基突变为e、g、k、l、 m、p、q、r、s、v或w，和/或，第341位的氨基酸残基突变为i或v，和/或，第342 位的氨基酸残基突变为a、f、h、k、l或t，和/或，第343位的氨基酸残基突变为e、 f、g、l、m或s，和/或，第344位的氨基酸残基突变为e、h、q、s或y，和/或，第 345位的氨基酸残基突变为r，和/或，第349位的氨基酸残基突变为c、k、n、p、v或 y，和/或，第350位的氨基酸残基突变为h、i、k、m、m、v或w，和/或，第353位的氨基酸残基突变为f、i、n、p或t，和/或，第356位的氨基酸残基突变为i、l、t、 v或y，和/或，第361位的氨基酸残基突变为t。
[0031]
在本发明某一方案中，所述的突变体的优选为如seq id no:1所示的氨基酸序列的第4位的氨基酸残基突变为w，和/或，第9位的氨基酸残基突变为c、s或w，和/或，第10位的氨基酸残基突变为a、f、h、n、p、q、s或t，和/或，第11位的氨基酸残基突变为a、c、h、l或m，和/或，第12位的氨基酸残基突变为k或s，和/或，第14 位的氨基酸残基突变为m或p，和/或，第21位的氨基酸残基突变为k，和/或，第24位的氨基酸残基突变为i，和/或，第39位的氨基酸残基突变为f，第55位的氨基酸残基突变为n，和/或第57位的氨基酸残基突变为g，和/或，第59位的氨基酸残基突变为v，和/或，第63位的氨基酸残基突变为d，和/或，第64位的氨基酸残基突变为t，和/或，第65位的氨基酸残基突变为t，和/或，第66位的氨基酸残基突变为f，和/或，第69位的氨基酸残基突变为t，和/或，第95位的氨基酸残基突变为r，和/或，第96位的氨基酸残基突变为h，和/或，第103位的氨基酸残基突变为h，和/或，第114位的氨基酸残基突变为p，和/或，第124位的氨基酸残基突变为h，和/或，第125位的氨基酸残基突变为k，和/或，第126位的氨基酸残基突变为f或h，和/或，第136位的氨基酸残基突变为t，和/或，第145位的氨基酸残基突变为e，和/或，第157位的氨基酸残基突变为 d，和/或，第159位的氨基酸残基突变为m，和/或，第160位的氨基酸残基突变为a，和/或，第161位的氨基酸残基突变为n，和/或，第169位的氨基酸残基突变为t，和/ 或，第171位的氨基酸残基突变为l，和/或，第172位的氨基酸残基突变为k，和/或，第176位的氨基酸残基突变为h，和/或，第181位的氨基酸残基突变为q，和/或，第209 位的氨基酸残基突变为t，和/或，第214位的氨基酸残基突变为w，和/或，第215位的氨基酸残基突变为k或p，和/或，第217位的氨基酸残基突变为s，和/或，第219位的氨基酸残基突变为h，和/或，第220位的氨基酸残基突变为a，和/或，第224位的氨基酸残基突变为n，和/或，第228位的氨基酸残基突变为g，和/或，第229位的氨基酸残基突变为s，和/或，第231位的氨基酸残基突变为r或s，和/或，第232位的氨基酸残基突变为m，和/或，第234位的氨基酸残基突变为a，和/或，第263位的氨基酸残基突变为s，和/或，第264位的氨基酸残基突变为t，和/或，第269位的氨基酸残基突变为 y，和/或，第277位的氨基酸残基突变为q，和/或，第289位的氨基酸残基突变为m，和/或，第291位的氨基酸残基突变为i，和/或，第296位的氨基酸残基突变为s，和/或，第303位的氨基酸残基突变为g或r，和/或，第309位的氨基酸残基突变为s，和/或，第312位的氨基酸残基突变为h，和/或，第318位的氨基酸残基突变为v，和/或，第336 位的氨基酸残基突变为g，和/或，第337位的氨
基酸残基突变为q或r，和/或，第339 位的氨基酸残基突变为e，和/或，第342位的氨基酸残基突变为h，和/或，第349位的氨基酸残基突变为y，和/或，第356位的氨基酸残基突变为l，和/或，第361位的氨基酸残基突变为t。
[0032]
在本发明某一方案中，所述的突变体的突变位置和种类如表1所示：
[0033]
表1
[0034]
[0035]
[0036]
[0037]
[0038]
[0039]
[0040]
[0041]
[0042]
[0043]
[0044]
[0045][0046]
[0047]
本发明还提供了一种烯还原酶或其突变体，其中所述烯还原酶为如上所述的氨基酸序列，所述的突变体为如上所述的突变体。
[0048]
本发明还提供了一种分离的核酸，其中所述核酸编码如上所述的烯还原酶或其突变体。
[0049]
本发明还提供了一种重组表达载体，其中所述重组表达载体包含如上所述的核酸。
[0050]
本发明还提供了一种转化体，其中所述转化体包含如上所述的重组表达载体。
[0051]
本发明还提供了一种制备烯还原酶突变体的方法，其培养如上所述的转化体并获得含烯还原酶突变体的培养物，即得。
[0052]
本发明还提供了一种如上所述的烯还原酶或其突变体在制备潜手性碳碳双键还原剂中的应用。
[0053]
在本发明某一方案中，化合物1在式i所示化合物范围内。
[0054]
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
[0055]
本发明所用试剂和原料均市售可得。
[0056]
本发明中的氨基酸简写符号如无特殊说明均为本领域常规，具体简写符号对应的氨基酸如表2所示。
[0057]
表2
[0058][0059]
[0060]
术语
[0061]
术语“烷基”是指具有指定的碳原子数的直链或支链烷基。烷基的实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、正戊基、正己基、正庚基、正辛基及其类似烷基。若非特别指明取代基，否则烷基是非取代的。
[0062]
术语“杂芳基”是指含有杂原子的芳香基团，优选含有1个、2个或3个独立选自氮、氧和硫的芳族9-10元双环，例如苯并咪唑基、吲哚基、吲唑基、苯并噻唑基、苯并异噻唑基、苯并唑基、苯并异唑基、喹啉基、异喹啉基等。
[0063]
本发明的积极进步效果在于：以本技术中的烯还原酶催化的碳碳双键还原反应，条件温和、选择性高、成本低、原料转化率高、收率高且产物手性纯度高。
具体实施方式
[0064]
下面结合具体实施例本发明做进一步的详细说明，以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。本发明的烯还原酶可通过重组表达技术表达纯化，也可以通过全人工合成制备，这些方法都是本领域熟知的获取酶蛋白的常规手段。
[0065]
确认质量为0.1x～2x烯还原酶加入到10-30v体积的缓冲液中，加入00.05x～0.1x 的葡萄糖脱氢酶、0.05x～0.1x的nadp和1x的葡萄糖，加0.01-1g底物持续搅拌反应 16h-24h。
[0066]
实施例1在pbs缓冲液中烯还原酶催化化合物2为化合物1。
[0067]
突变体269通过全人工合成并将其用于以下实验(突变体的具体序列详见表1)。
[0068]
向50ml的夹套瓶中加入0.25g的烯还原酶突变体269、0.2g葡萄糖脱氢酶、0.05 gβ-磷酸烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐、1g d-葡萄糖和35ml的pbs(ph＝7.0)缓冲液，利用磁力搅拌直到酶全部溶解得到均匀的溶液。在7℃条件下加1g的化合物2(15mldmso溶解)反应8h。
[0069][0070]
将反应液离心，下层沉淀用50.0ml的二甲基四氢呋喃进行萃取，萃取之后取出有机相加入无水硫酸钠以除去水分，之后过滤得到滤液，在-0.09mpa(表压)的真空度下减压蒸馏，最终得到产物0.973g，得率为97.3％，ee值为91.6％，产物经核磁检测，结果显示，产物的纯度》98％。1h-nmr(400mhz,dmso-d6)δ10.85-11.01(m,1h),7.54
‑ꢀ
7.59(m,1h),7.33-7.39(m,1h),7.14-7.17(m,1h),7.07-7.09(m,1h),7.06-7.12(m,1h),6.97
‑ꢀ
7.04(m,1h),6.29(s,2h),6.23-6.32(m,1h),4.92-5.04(m,1h),3.29-3.38(m,1h),3.24-3.30 (m,1h),3.17-3.26(m,1h),2.49-2.55(m,2h),1.48-1.53(m,3h)。
[0071]
实施例2在teoa缓冲液中烯还原酶催化化合物2为化合物1。
[0072]
向50ml的夹套瓶中加入0.25g的烯还原酶突变体242、0.2g葡萄糖脱氢酶、0.05 g
β-磷酸烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐、1g d-葡萄糖和35ml的teoa(100ml去离子水中加入10g teoa和10g异丙胺，ph＝7.0)缓冲液，利用磁力搅拌直到酶全部溶解得到均匀的溶液。在7℃条件下加1g的化合物2(15ml dmso溶解)反应8h。将反应液离心，下层沉淀用50.0ml的二甲基四氢呋喃进行萃取，萃取之后取出有机相加入无水硫酸钠以除去水分，之后过滤得到滤液，在-0.09mpa(表压)的真空度下减压蒸馏，最终得到产物0.956g，得率为95.6％，ee值为93.6％，产物经核磁检测，结果显示，产物的纯度》98％。产物的核磁数据如实施例1所示。
[0073]
实施例3在tris缓冲液中烯还原酶催化化合物2为化合物1。
[0074]
向50ml的夹套瓶中加入0.25g的烯还原酶突变体205、0.2g葡萄糖脱氢酶、0.05 gβ-磷酸烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐、1g d-葡萄糖和35ml的tris(ph＝7.0)缓冲液，利用磁力搅拌直到酶全部溶解得到均匀的溶液。在7℃条件下加1g的化合物2(15mldmso溶解)反应8h。将反应液离心，下层沉淀用50.0ml的二甲基四氢呋喃进行萃取，萃取之后取出有机相加入无水硫酸钠以除去水分，之后过滤得到滤液，在-0.09mpa(表压)的真空度下减压蒸馏，最终得到产物0.951g，得率为95.1％，ee值为95％，产物经核磁检测，结果显示，产物的纯度》98％。产物的核磁数据如实施例1所示。
[0075]
实施例4在ph＝6.5条件下烯还原酶催化化合物2为化合物1。
[0076]
向50ml的夹套瓶中加入0.25g的烯还原酶突变体027、0.2g葡萄糖脱氢酶、0.05 gβ-磷酸烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐、1g d-葡萄糖和35ml的pbs(ph＝6.5)缓冲液，利用磁力搅拌直到酶全部溶解得到均匀的溶液。在7℃条件下加1g的化合物2(15mldmso溶解)反应8h。将反应液离心，下层沉淀用50.0ml的二甲基四氢呋喃进行萃取，萃取之后取出有机相加入无水硫酸钠以除去水分，之后过滤得到滤液，在-0.09mpa(表压)的真空度下减压蒸馏，最终得到产物0.96g，得率为96％，ee值为94.5％，产物经核磁检测，结果显示，产物的纯度》98％。产物的核磁数据如实施例1所示。
[0077]
实施例5在ph＝7.5条件下烯还原酶催化化合物2为化合物1。
[0078]
向50ml的夹套瓶中加入0.25g的烯还原酶突变体088、0.2g葡萄糖脱氢酶、0.05 gβ-磷酸烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐、1g d-葡萄糖和35ml的pbs(ph＝7.5)缓冲液，利用磁力搅拌直到酶全部溶解得到均匀的溶液。在7℃条件下加1g的化合物2(15mldmso溶解)反应8h。将反应液离心，下层沉淀用50.0ml的二甲基四氢呋喃进行萃取，萃取之后取出有机相加入无水硫酸钠以除去水分，之后过滤得到滤液，在-0.09mpa(表压)的真空度下减压蒸馏，最终得到产物0.974g，得率为97.4％，ee值为94.0％，产物经核磁检测，结果显示，产物的纯度》98％。产物的核磁数据如实施例1所示。
[0079]
实施例6在ph＝8.5条件下烯还原酶催化化合物2为化合物1。
[0080]
向50ml的夹套瓶中加入0.25g的烯还原酶突变体020、0.2g葡萄糖脱氢酶、0.05 gβ-磷酸烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐、1g d-葡萄糖和35ml的pbs(ph＝8.5)缓冲液，利用磁力搅拌直到酶全部溶解得到均匀的溶液。在7℃条件下加1g的化合物2(15mldmso溶解)反应8h。将反应液离心，下层沉淀用50.0ml的二甲基四氢呋喃进行萃取，萃取之后取出有机相加入无水硫酸钠以除去水分，之后过滤得到滤液，在-0.09mpa(表压)的真空度下减压蒸馏，最终得到产物0.962g，得率为96.2％，ee值为93.4％，产物经核磁检测，结果显示，产物的纯度》98％。产物的核磁数据如实施例1所示。
[0081]
实施例7在助溶剂dmso与化合物1的体积比例为10的条件下烯还原酶催化化合物2为化合物1。
[0082]
向50ml的夹套瓶中加入025g的烯还原酶突变体206、02g葡萄糖脱氢酶、005 gβ-磷酸烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐、1g d-葡萄糖和35ml的pbs(ph＝7.5)缓冲液，利用磁力搅拌直到酶全部溶解得到均匀的溶液。在7℃条件下加1g的化合物2(10mldmso溶解)反应8h。将反应液离心，下层沉淀用50.0ml的二甲基四氢呋喃进行萃取，萃取之后取出有机相加入无水硫酸钠以除去水分，之后过滤得到滤液，在-0.09mpa(表压)的真空度下减压蒸馏，最终得到产物0.974g，得率为97.4％，ee值为94.3％，产物经核磁检测，结果显示，产物的纯度》98％。产物的核磁数据如实施例1所示。
[0083]
实施例8在助溶剂dmso与化合物1的体积比例为30的条件下烯还原酶催化化合物2为化合物1。
[0084]
向100ml的夹套瓶中加入0.25g的烯还原酶突变体099、0.2g葡萄糖脱氢酶、0.05 gβ-磷酸烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐、1g d-葡萄糖和35ml的pbs(ph＝7.5)缓冲液，利用磁力搅拌直到酶全部溶解得到均匀的溶液。在7℃条件下加1g的化合物2(30mldmso溶解)反应8h。将反应液离心，下层沉淀用50.0ml的二甲基四氢呋喃进行萃取，萃取之后取出有机相加入无水硫酸钠以除去水分，之后过滤得到滤液，在-0.09mpa(表压)的真空度下减压蒸馏，最终得到产物0.951g，得率为95.1％，ee值为94.1％，产物经核磁检测，结果显示，产物的纯度》98％。产物的核磁数据如实施例1所示。
[0085]
实施例9烯还原酶与化合物1的质量比为0.5:1条件下烯还原酶催化化合物2为化合物1。
[0086]
向50ml的夹套瓶中加入0.5g的烯还原酶突变体293、0.2g葡萄糖脱氢酶、0.05g β-磷酸烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐、1g d-葡萄糖和35ml的pbs(ph＝7.5)缓冲液，利用磁力搅拌直到酶全部溶解得到均匀的溶液。在7℃条件下加1g的化合物2(15mldmso溶解)反应8h。将反应液离心，下层沉淀用50.0ml的二甲基四氢呋喃进行萃取，萃取之后取出有机相加入无水硫酸钠以除去水分，之后过滤得到滤液，在-0.09mpa(表压)的真空度下减压蒸馏，最终得到产物0.96g，得率为96.0％，ee值为》93.5％，产物经核磁检测，结果显示，产物的纯度》98％。产物的核磁数据如实施例1所示。
[0087]
实施例10烯还原酶与化合物1的质量比为1:1条件下烯还原酶催化化合物2为化合物1。
[0088]
向50ml的夹套瓶中加入1g的烯还原酶突变体081、0.2g葡萄糖脱氢酶、0.05gβ
‑ꢀ
磷酸烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐、1g d-葡萄糖和35ml的pbs(ph＝7.5)缓冲液，利用磁力搅拌直到酶全部溶解得到均匀的溶液。在7℃条件下加1g的化合物2(15mldmso溶解)反应8h。将反应液离心，下层沉淀用50.0ml的二甲基四氢呋喃进行萃取，萃取之后取出有机相加入无水硫酸钠以除去水分，之后过滤得到滤液，在-0.09mpa(表压)的真空度下减压蒸馏，最终得到产物0.974g，得率为97.4％，ee值为94.6％，产物经核磁检测，结果显示，产物的纯度》98％。产物的核磁数据如实施例1所示。
[0089]
实施例11烯还原酶与化合物1的质量比为2:1条件下烯还原酶催化化合物2为化合物1。
[0090]
向50ml的夹套瓶中加入2g的烯还原酶突变体280、0.2g葡萄糖脱氢酶、0.05gβ
‑ꢀ
磷
酸烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐、1g d-葡萄糖和35ml的pbs(ph＝7.5)缓冲液，利用磁力搅拌直到酶全部溶解得到均匀的溶液。在7℃条件下加1g的化合物2(15mldmso溶解)反应8h。将反应液离心，下层沉淀用50.0ml的二甲基四氢呋喃进行萃取，萃取之后取出有机相加入无水硫酸钠以除去水分，之后过滤得到滤液，在-0.09mpa(表压)的真空度下减压蒸馏，最终得到产物0.978g，得率为97.8％，ee值为94.2％，产物经核磁检测，结果显示，产物的纯度》98％。产物的核磁数据如实施例1所示。
[0091]
实施例12葡萄糖脱氢酶与化合物1的质量比为0.05:1条件下烯还原酶催化化合物 2为化合物1。
[0092]
向50ml的夹套瓶中加入0.25g的烯还原酶突变体300、0.05g葡萄糖脱氢酶、0.05 gβ-磷酸烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐、1g d-葡萄糖和35ml的pbs(ph＝7.5)缓冲液，利用磁力搅拌直到酶全部溶解得到均匀的溶液。在7℃条件下加1g的化合物2(15mldmso溶解)反应8h。将反应液离心，下层沉淀用50.0ml的二甲基四氢呋喃进行萃取，萃取之后取出有机相加入无水硫酸钠以除去水分，之后过滤得到滤液，在-0.09mpa(表压)的真空度下减压蒸馏，最终得到产物0.964g，得率为96.4％，ee值为94.4％，产物经核磁检测，结果显示，产物的纯度》98％。产物的核磁数据如实施例1所示。
[0093]
实施例13葡萄糖脱氢酶与化合物1的质量比为0.1:1条件下烯还原酶催化化合物 2为化合物1。
[0094]
向50ml的夹套瓶中加入0.25g的烯还原酶突变体216、0.1g葡萄糖脱氢酶、0.05 gβ-磷酸烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐、1g d-葡萄糖和35ml的pbs(ph＝7.5)缓冲液，利用磁力搅拌直到酶全部溶解得到均匀的溶液。在7℃条件下加1g的化合物2(15mldmso溶解)反应8h。将反应液离心，下层沉淀用50.0ml的二甲基四氢呋喃进行萃取，萃取之后取出有机相加入无水硫酸钠以除去水分，之后过滤得到滤液，在-0.09mpa(表压)的真空度下减压蒸馏，最终得到产物0.967，率为为96.7％，ee值为94.0％，产物经核磁检测，结果显示，产物的纯度》98％。产物的核磁数据如实施例1所示。
[0095]
实施例14β-磷酸烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐与化合物1的质量比为0.01:1条件下烯还原酶催化化合物2为化合物1。
[0096]
向50ml的夹套瓶中加入0.25g的烯还原酶突变体032、0.2g葡萄糖脱氢酶、0.01 gβ-磷酸烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐、1g d-葡萄糖和35ml的pbs(ph＝7.5)缓冲液，利用磁力搅拌直到酶全部溶解得到均匀的溶液。在7℃条件下加1g的化合物2(15mldmso溶解)反应8h。将反应液离心，下层沉淀用50.0ml的二甲基四氢呋喃进行萃取，萃取之后取出有机相加入无水硫酸钠以除去水分，之后过滤得到滤液，在-0.09mpa(表压)的真空度下减压蒸馏，最终得到产物0.971g，得率为97.1％，ee值为94.8％，产物经核磁检测，结果显示，产物的纯度》98％。产物的核磁数据如实施例1所示。
[0097]
实施例15化合物1与缓冲液的质量体积比为1:14g/ml条件下烯还原酶催化化合物2为化合物1。
[0098]
向50ml的夹套瓶中加入0.25g的烯还原酶突变体241、0.2g葡萄糖脱氢酶、0.05 gβ-磷酸烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐、1g d-葡萄糖和14ml的pbs(ph＝7.5)缓冲液，利用磁力搅拌直到酶全部溶解得到均匀的溶液。在7℃条件下加1g的化合物2(15mldmso溶解)反应8h。将反应液离心，下层沉淀用50.0ml的二甲基四氢呋喃进行萃取，萃取之后取出有机相
加入无水硫酸钠以除去水分，之后过滤得到滤液，在-0.09mpa(表压)的真空度下减压蒸馏，最终得到产物0.942g，得率为94.2％，ee值为93.0％，产物经核磁检测，结果显示，产物的纯度》98％。产物的核磁数据如实施例1所示。
[0099]
实施例16化合物1与缓冲液的质量体积比为1:200g/ml条件下烯还原酶催化化合物2为化合物1。
[0100]
向250ml的夹套瓶中加入0.25g的烯还原酶突变体188、0.2g葡萄糖脱氢酶、0.05 gβ-磷酸烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐、1g d-葡萄糖和200ml的pbs(ph＝7.5)缓冲液，利用磁力搅拌直到酶全部溶解得到均匀的溶液。在7℃条件下加1g的化合物2(15 ml dmso溶解)反应8h。将反应液离心，下层沉淀用50.0ml的二甲基四氢呋喃进行萃取，萃取之后取出有机相加入无水硫酸钠以除去水分，之后过滤得到滤液，在-0.09mpa (表压)的真空度下减压蒸馏，最终得到产物0.979g，得率为97.9％，ee值为94.6％，产物经核磁检测，结果显示，产物的纯度》98％。产物的核磁数据如实施例1所示。
[0101]
实施例17在反应温度可为4℃条件下烯还原酶催化化合物2为化合物1。
[0102]
向50ml的夹套瓶中加入0.25g的烯还原酶突变体236、0.2g葡萄糖脱氢酶、0.05 gβ-磷酸烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐、1g d-葡萄糖和35ml的pbs(ph＝7.0)缓冲液，利用磁力搅拌直到酶全部溶解得到均匀的溶液。在4℃条件下加1g的化合物2(15mldmso溶解)反应8h。将反应液离心，下层沉淀用50.0ml的二甲基四氢呋喃进行萃取，萃取之后取出有机相加入无水硫酸钠以除去水分，之后过滤得到滤液，在-0.09mpa(表压)的真空度下减压蒸馏，最终得到产物0.918g，得率为91.8％，ee值为94.5％，产物经核磁检测，结果显示，产物的纯度》98％。产物的核磁数据如实施例1所示。
[0103]
实施例18在反应温度可为17℃条件下烯还原酶催化化合物2为化合物1。
[0104]
向50ml的夹套瓶中加入0.25g的烯还原酶突变体090、0.2g葡萄糖脱氢酶、0.05 gβ-磷酸烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐、1g d-葡萄糖和35ml的pbs(ph＝7.0)缓冲液，利用磁力搅拌直到酶全部溶解得到均匀的溶液。在17℃条件下加1g的化合物2(15mldmso溶解)反应8h。将反应液离心，下层沉淀用50.0ml的二甲基四氢呋喃进行萃取，萃取之后取出有机相加入无水硫酸钠以除去水分，之后过滤得到滤液，在-0.09mpa(表压)的真空度下减压蒸馏，最终得到产物0.977g，得率为97.7％，ee值为92.8％，产物经核磁检测，结果显示，产物的纯度》98％。产物的核磁数据如实施例1所示。
[0105]
实施例19在反应温度可为27℃条件下烯还原酶催化化合物2为化合物1。
[0106]
向50ml的夹套瓶中加入0.25g的烯还原酶突变体262、0.2g葡萄糖脱氢酶、0.05 gβ-磷酸烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐、1g d-葡萄糖和35ml的pbs(ph＝7.0)缓冲液，利用磁力搅拌直到酶全部溶解得到均匀的溶液。在27℃条件下加1g的化合物2(15mldmso溶解)反应8h。将反应液离心，下层沉淀用50.0ml的二甲基四氢呋喃进行萃取，萃取之后取出有机相加入无水硫酸钠以除去水分，之后过滤得到滤液，在-0.09mpa(表压)的真空度下减压蒸馏，最终得到产物0.972g，得率为97.2％，ee值为90.4％，产物经核磁检测，结果显示，产物的纯度》98％。产物的核磁数据如实施例1所示。
[0107]
实施例20在反应时间为4h条件下烯还原酶催化化合物2为化合物1。
[0108]
向50ml的夹套瓶中加入0.25g的烯还原酶突变体098、0.2g葡萄糖脱氢酶、0.05 gβ-磷酸烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐、1g d-葡萄糖和35ml的pbs(ph＝7.0)缓冲液，利用磁
力搅拌直到酶全部溶解得到均匀的溶液。在7℃条件下加1g的化合物2(15mldmso溶解)反应4h。将反应液离心，下层沉淀用50.0ml的二甲基四氢呋喃进行萃取，萃取之后取出有机相加入无水硫酸钠以除去水分，之后过滤得到滤液，在-0.09mpa(表压)的真空度下减压蒸馏，最终得到产物0.924g，得率为92.4％，ee值为92.2％，产物经核磁检测，结果显示，产物的纯度》98％。产物的核磁数据如实施例1所示。
[0109]
实施例21在反应时间为24h条件下烯还原酶催化化合物2为化合物1。
[0110]
向50ml的夹套瓶中加入0.25g的烯还原酶突变体240、0.2g葡萄糖脱氢酶、0.05 gβ-磷酸烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐、1g d-葡萄糖和35ml的pbs(ph＝7.0)缓冲液，利用磁力搅拌直到酶全部溶解得到均匀的溶液。在7℃条件下加1g的化合物2(15mldmso溶解)反应24h。将反应液离心，下层沉淀用50.0ml的二甲基四氢呋喃进行萃取，萃取之后取出有机相加入无水硫酸钠以除去水分，之后过滤得到滤液，在-0.09mpa (表压)的真空度下减压蒸馏，最终得到产物0.975g，得率为97.5％，ee值为94.5％，产物经核磁检测，结果显示，产物的纯度》98％。产物的核磁数据如实施例1所示。
[0111]
实施例22
[0112]
反应条件如实施例1所示，仅将上述的烯还原酶突变体269替换为突变体2-突变体 306和野生型烯还原酶，其结果如下表1所示：
[0113]
表1烯还原酶及其突变体的性能参数
[0114]
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[0128]
[0129]
[0130]
[0131]
[0132]
[0133][0134]
上述实施例含本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内
[0135]
本技术中seq id no:1的序列如下所示：
[0136]
mptlfdpidfgpihaknrivmspltrgradkeavptpimaeyyaqrasagliiteat gisreglgwpfap
[0137]
giwsdaqveawkpivagvhakggkivcqlwhmgrmvhssvtgtqpvsssattap gevhtyegkkpfeqar
[0138]
aidaadisrilndyenaarnairagfdgvqihaangylideflrngtnhrtdeyg gvpenrirflkevte
[0139]
rviaaigadrtgvrlspngdtqgcidsapetvfvpaakllqdlgvawlelrepgpn gtfgktdqpklspq
[0140]
irkvflrplvlnqdytfeaaqtalaegkadaiafgrkfisnpdlperfargialqpd dmktwysqgpegy
[0141]
tdypsatsgpn。

技术特征：
1.一种烯还原酶或其突变体对潜手性碳碳双键的不对称还原方法，其包括如下步骤：烯还原酶或其突变体和辅酶的存在下，将如化合物ii在有机溶剂中进行催化还原反应得化合物i即可；r1为h；r2为甲基或乙基；r3为“杂原子选自n，杂原子个数为1个或2个”的9元杂芳基或被r
l
取代的“杂原子选自n，杂原子个数为1个”的9元杂芳基；所述r
l
独立地为h、oh、ome、f、cl、br或nh2；所述烯还原酶为如seq id no:1所示的氨基酸序列或其突变体；所述的突变体的突变位点选自如seq id no:1所示的氨基酸序列的第4位、第9位、第10位、第11位、第12位、第13位、第14位、第19位、第20位、第21位、第23位、第24位、第25位、第26位、第27位、第39位、第42位、第43位、第46位、第51位、第53位、第54位、第55位、第56位、第57位、第58位、第59位、第63位、第64位、第65位、第66位、第67位、第69位、第70位、第73位、第95位、第96位、第97位、第98位、第99位、第100位、第101位、第102位、第103位、第104位、第105位、第106位、第114位、第123位、第124位、第125位、第126位、第128位、第135位、第136位、第137位、第145位、第148位、第149位、第151位、第152位、第153位、第154位、第155位、第156位、第157位、第158位、第159位、第160位、第161位、第162位、第167位、第168位、第169位、第170位、第171位、第172位、第173位、第175位、第176位、第177位、第178位、第179位、第180位、第181位、第184位、第207位、第208位、第209位、第210位、第211位、第212位、第213位、第214位、第215位、第216位、第217位、第218位、第219位、第220位、第221位、第222位、第223位、第224位、第225位、第226位、第227位、第228位、第229位、第230位、第231位、第232位、第233位、第234位、第235位、第243位、第254位、第255位、第256位、第257位、第258位、第260位、第261位、第262位、第263位、第264位、第267位、第268位、第269位、第270位、第277位、第289位、第290位、第291位、第293位、第294位、第295位、第296位、第299位、第300位、第303位、第309位、第311位、第312位、第313位、第314位、第315位、第316位、第317位、第318位、第320位、第321位、第324位、第328位、第334位、第335位、第336位、第337位、第338位、第339位、第340位、第341位、第342位、第343位、第344位、第345位、第349位、第350位、第353位、第356位、第361位的一个或多个。2.如权利要求1所述的还原方法，其特征在于，其满足下述条件的一种或多种：(1)所述“杂原子选自n，杂原子个数为1个或2个”的9元杂芳基可为吲哚基、吡咯并吡啶、吡咯并吡嗪、吡咯并哒嗪，吡咯并嘧啶，例如
(2)所述“杂原子选自n，杂原子个数为1个”的9元杂芳基为吲哚基；优选地，所述化合物ii优选为3.如权利要求1所述的还原方法，其特征在于，其满足下述条件的一种或多种：(1)所述有机溶剂为含硫类有机溶剂，例如二甲基亚砜；(2)所述化合物ii与所述有机溶剂中的质量体积比为33g/l～100g/l，例如33g/l、67g/l或100g/l；(3)所述烯还原酶或其突变体与化合物ii的质量为(0.25～2):1，例如0.25:1，1:1或2:1；(4)所述催化还原反应温度为0～30℃，例如4～27℃，还例如7～27℃，优选4℃、7℃、17℃或27℃；(5)所述催化还原反应时间为4～16小时，例如4小时、8小时或16小时；(6)所述辅酶为nadph，或nadh，所述nadph或nadh可由d-葡萄糖与葡萄糖脱氢酶和nadp+或nad+在缓冲溶液中反应得到；所述d-葡萄糖与所述化合物ii的质量比可为0.5:1～2:1，例如1:1；所述nadph或nadh与所述化合物ii的质量比可为(0.01～0.05):1，例如0.01：1或0.05:1；所述葡萄糖脱氢酶与所述化合物ii的质量比可为0.05～0.2:1，又例如0.05:1、0.1:1或0.2:1；所述缓冲溶液可为pbs缓冲溶液、teoa缓冲溶液或tris缓冲溶液；所述d-葡萄糖与所述缓冲溶液的质量体积比可为5g/l～71.4g/l，又例如5g/l、28.5g/l或71.4g/l；所述缓冲溶液的ph值可为ph＝6.5，ph＝7或ph＝7.5。4.如权利要求1所述的还原方法，其特征在于，所述的突变体的突变位点选自如seq id no:1所示的氨基酸序列的第004位、第009位、第012位、第014位、第021位、第024位、第039位、第055位、第059位、第063位、第064位、第065位、第066位、第069位、第095位、第096位、第103位、第114位、第124位、第125位、第126位、第136位、第145位、第157位、第159位、第160位、第161位、第169位、第171位、第172位、第176位、第181位、第209位、第214位、第215位、第217位、第219位、第220位、第224位、第228位、第229位、第231位、第232位、第234位、第263位、第264位、第269位、第277位、第289位、第291位、第296位、第303位、第309位、第312位、第318位、第336位、第337位、第339位、第342位、第349位、第353位、第356和361位的一种或多种。5.如权利要求1所述的还原方法，其特征在于，所述的突变体的为如seq id no:1所示的氨基酸序列的第4位的氨基酸残基突变为i、n、p、q或w，和/或，第9位的氨基酸残基突变为a、c、k、n、q、s或w，和/或，第10位的氨基酸残基突变为a、f、h、n、p、q、s或t，和/或，第11位的氨基酸残基突变为a、c、h、l或m，和/或，第12位的氨基酸残基突变为a、d、f、g、k、m、r或s，和/或，第13位的氨基酸残基突变为t，和/或，第14位的氨基酸残基突变为m、p、t或y，和/或，第19位的氨基酸残基突变为p或r，和/或，第20位的氨基酸残基突变为a、d、e、g或i，和/或，第21位的氨基酸残基突变为h、i、k、n、q或t，和/或，第23位的氨基酸残基突变为s，和/或，第24位的氨基酸残基突变为a、c、f、g、i、n、s或y，和/或，第25位的氨基酸残基突变为e、p、s、v或
w，和/或，第26位的氨基酸残基突变为a、c、g、n或v，和/或，第27位的氨基酸残基突变为a、n、r或s，和/或，第39位的氨基酸残基突变为a、c、f、n、r或t，和/或，第42位的氨基酸残基突变为d或w，和/或，第43位的氨基酸残基突变为k或n，和/或，第46位的氨基酸残基突变为d、h、m、p或y，和/或，第51位的氨基酸残基突变为a、f、g、k或m，和/或，第53位的氨基酸残基突变为i、r、v或y，和/或，第54位的氨基酸残基突变为d、g、i、r、s或w，和/或，第55位的氨基酸残基突变为h、m或n，和/或，第56位的氨基酸残基突变为a、i、k、n或r，和/或，第57位的氨基酸残基突变为a、g、l、m、q、t或y，和/或，第58位的氨基酸残基突变为f、g或y，和/或，第59位的氨基酸残基突变为c、e、h、s、v或y，和/或，第63位的氨基酸残基突变为a、d、h、m、n、p、r、或y，和/或，第64位的氨基酸残基突变为a、c、e、i、q、或t，和/或，第65位的氨基酸残基突变为f、n、p、s、t、或w，和/或，第66位的氨基酸残基突变为w、a、f、h、l、r、或y，和/或，第67位的氨基酸残基突变为e、h、k、l、或w，和/或，第69位的氨基酸残基突变为f、n、s、t、或w，和/或，第70位的氨基酸残基突变为k或r，和/或，第73位的氨基酸残基突变为a、c、e、g、l、m、或q，和/或，第95位的氨基酸残基突变为a、e、i、m、p、q、或r，和/或，第96位的氨基酸残基突变为f、h、p、q、s或w，和/或，第97位的氨基酸残基突变为c、f、k、l、m、s或t，和/或，第98位的氨基酸残基突变为h、k、l、p、s或v，和/或，第99位的氨基酸残基突变为v、d、g或i，和/或，第100位的氨基酸残基突变为f、t或w，和/或，第101位的氨基酸残基突变为i、n、p、或q，和/或，第102位的氨基酸残基突变为a、i、m、q、r、s或t，和/或，第103位的氨基酸残基突变为f、g、h、n或y，和/或，第104位的氨基酸残基突变为c、l、r、或v，和/或，第105位的氨基酸残基突变为g、m、n或t，和/或，第106位的氨基酸残基突变为f、l、m、q、w或y，和/或，第114位的氨基酸残基突变为f、h、i、m、p、w或y，和/或，第123位的氨基酸残基突变为h、k、v、w、或y，和/或，第124位的氨基酸残基突变为e、g、h、m、n、p、q、v或y，和/或，第125位的氨基酸残基突变为a、f、k、r、s、或v，和/或，第126位的氨基酸残基突变为f、g、h、p、q、s或y，和/或，第128位的氨基酸残基突变为c、e、g、q、t或y，和/或，第135位的氨基酸残基突变为d、g或q，和/或，第136位的氨基酸残基突变为a、c、e、g、s或t，和/或，第137位的氨基酸残基突变为a、c、e、f、n或v，和/或，第145位的氨基酸残基突变为a、e、k、s或m，和/或，第148位的氨基酸残基突变为c、h、l、p、r、t或w，和/或，第149位的氨基酸残基突变为a、d、f、g、h、m、n或y，和/或，第151位的氨基酸残基突变为n，和/或，第152位的氨基酸残基突变为d、h、i或m，和/或，第153位的氨基酸残基突变为a、v、或w，和/或，第154位的氨基酸残基突变为e、f、h、p、或t，和/或，第155位的氨基酸残基突变为a、e、g、i、p、t、w或y，和/或，第156位的氨基酸残基突变为g、k、m或w，和/或，第157位的氨基酸残基突变为d、n、r、s、或v，和/或，第158位的氨基酸残基突变为d、g、i、k、p、r或s，和/或，第159位的氨基酸残基突变为c、e、f或m，和/或，第160位的氨基酸残基突变为a、d、e、f或m、，和/或，第161位的氨基酸残基突变为a、e、f、k、l、n或y，和/或，第162位的氨基酸残基突变为g或t，和/或，第167位的氨基酸残基突变为n或v，和/或，第168位的氨基酸残基突变为c、d、f、k、n、r或s，和/或，第169位的氨基酸残基突变为a、c、p、s或t，和/或，第170位的氨基酸残基突变为c、e、f、g、i或v，和/或，第171位的氨基酸残基突变为a、f、l、p、s、v或y，和/或，第172位的氨基酸残基突变为f、h、i、k、s或w，和/或，第173位的氨基酸残基突变为h、r、s、t、v或w，和/或，第175位的氨基酸残基突变为h、l、m、n、p、r、s或t，和/或，第176位的氨基酸残基突变为a、d、h、n或y，和/或，第177位的氨基酸残基突变为d、f、n或w，和/或，第178位的氨基酸残基突变k、p或v，和/或，第179位的氨基酸残基突变为a、h或w，和/或，第180位的氨基
酸残基突变为a、d、e、f、i或y，和/或，第181位的氨基酸残基突变为c、h、k、n、q、s、t或w，和/或，第184位的氨基酸残基突变为e、g、h、m、q或y，和/或，第207位的氨基酸残基突变为d、l或p，和/或，第208位的氨基酸残基突变为k、l或w，和/或，第209位的氨基酸残基突变为f、k、q、t或v，和/或，第210位的氨基酸残基突变为c、d、f、g、l、n、q或t，和/或，第211位的氨基酸残基突变为a、c或f、，和/或，第212位的氨基酸残基突变为c、h、m、v或w，和/或，第213位的氨基酸残基突变为a、g、n、q、s或v，和/或，第214位的氨基酸残基突变为f、i、n、p、q、w或y，和/或，第215位的氨基酸残基突变为e、i、k、n、p、q或v，和/或，第216位的氨基酸残基突变为a、c、g、h、i、k、q、t或y，和/或，第217位的氨基酸残基突变为g、k、n、r或s，和/或，第218位的氨基酸残基突变为f、g、n、r、s、t或v，和/或，第219位的氨基酸残基突变为f、h、q、t或y，和/或，第220位的氨基酸残基突变为a、h、n、q、v或w，和/或，第221位的氨基酸残基突变为a、r或v，和/或，第222位的氨基酸残基突变为a、c、f、f、l、q、s或w，和/或，第223位的氨基酸残基突变为a、e、p或y，和/或，第224位的氨基酸残基突变为a、k、l、m、n、p或y，和/或，第225位的氨基酸残基突变为d、g、k或m，和/或，第226位的氨基酸残基突变为a、c、e或m，和/或，第227位的氨基酸残基突变为e、g、i、q、s、t、v或w，和/或，第228位的氨基酸残基突变为d、e、g、i、k或l，和/或，第229位的氨基酸残基突变为h或s，和/或，第230位的氨基酸残基突变为y，和/或，第231位的氨基酸残基突变为a、d、h、i、k、p、r、s或t，和/或，第232位的氨基酸残基突变为a、c、d、h、m或t，和/或，第233位的氨基酸残基突变为i、l、n、p或s，和/或，第234位的氨基酸残基突变为a、l或w，和/或，第235位的氨基酸残基突变为l，和/或，第243位的氨基酸残基突变为a、h、p、r或v，和/或，第254位的氨基酸残基突变为s或w，和/或，第255位的氨基酸残基突变为c、h、p，和/或，第256位的氨基酸残基突变为k、l、n、r或y，和/或，第257位的氨基酸残基突变为f、g、i、l、p、r、s或t，和/或，第258位的氨基酸残基突变为c、i、q、t、v或y，和/或，第260位的氨基酸残基突变为m、n、p、r或s，和/或，第261位的氨基酸残基突变为m，和/或，第262位的氨基酸残基突变为f、q、s、，和/或，第263位的氨基酸残基突变为a、e、g、m、p、q、r、s或t，和/或，第264位的氨基酸残基突变为t或y，和/或，第267位的氨基酸残基突变为i、n、或s，和/或，第268位的氨基酸残基突变为e、f、l、n、p，和/或，第269位的氨基酸残基突变为d、f、l、m、t或y，和/或，第270位的氨基酸残基突变为d、e、n、v或w，和/或，第277位的氨基酸残基突变为q，和/或，第289位的氨基酸残基突变为c、e、f、m、t或y，和/或，第290位的氨基酸残基突变为h、s或v，和/或，第291位的氨基酸残基突变为c、d、g、i或k，和/或，第293位的氨基酸残基突变为c、e、f、k或p，和/或，第294位的氨基酸残基突变为d、f、h、m或w，和/或，第295位的氨基酸残基突变为f，和/或，第296位的氨基酸残基突变为c、e、g、s、v或y，和/或，第299位的氨基酸残基突变为a、g、p、r或w，和/或，第300位的氨基酸残基突变f、g、h、k、n或v，和/或，第303位的氨基酸残基突变为g、h、i、l、q、r、v或w，和/或，第309位的氨基酸残基突变为e、g、l、m、s或y，和/或，第311位的氨基酸残基突变为d、f、i、l、v或y，和/或，第312位的氨基酸残基突变为g、h、k、r、s或v，和/或，第313位的氨基酸残基突变为d、i、m、p、q或s，和/或，第314位的氨基酸残基突变为e、i、r、或s，和/或，第315位的氨基酸残基突变为c、d、h、q、w或y，和/或，第316位的氨基酸残基突变为g、l、q或y，和/或，第317位的氨基酸残基突变为k或t，和/或，第318位的氨基酸残基突变为i、l、p、v或w，和/或，第320位的氨基酸残基突变为a、f、g、m、t或v，和/或，第321位的氨基酸残基突变为c、k、r、v或w，和/或，第324位的氨基酸残基突变c、d、m、n、p或v，和/或，第328位的氨基酸残基突变为a、i、k、l、q或y，和/或，第334位的氨
基酸残基突变为e、p、q、s、或w，和/或，第335位的氨基酸残基突变为a、c、e、h或l，和/或，第336位的氨基酸残基突变为g、c、n、q、或t，和/或，第337位的氨基酸残基突变为g、m、p、q、r、s、t或v，和/或，第338位的氨基酸残基突变为d、w或y，和/或，第339位的氨基酸残基突变为e、i、n、p或q，和/或，第340位的氨基酸残基突变为e、g、k、l、m、p、q、r、s、v或w，和/或，第341位的氨基酸残基突变为i或v，和/或，第342位的氨基酸残基突变为a、f、h、k、l或t，和/或，第343位的氨基酸残基突变为e、f、g、l、m或s，和/或，第344位的氨基酸残基突变为e、h、q、s或y，和/或，第345位的氨基酸残基突变为r，和/或，第349位的氨基酸残基突变为c、k、n、p、v或y，和/或，第350位的氨基酸残基突变为h、i、k、m、m、v或w，和/或，第353位的氨基酸残基突变为f、i、n、p或t，和/或，第356位的氨基酸残基突变为i、l、t、v或y，和/或，第361位的氨基酸残基突变为t；所述的突变体的优选为如seq id no:1所示的氨基酸序列的第4位的氨基酸残基突变为w，和/或，第9位的氨基酸残基突变为c、s或w，和/或，第10位的氨基酸残基突变为a、f、h、n、p、q、s或t，和/或，第11位的氨基酸残基突变为a、c、h、l或m，和/或，第12位的氨基酸残基突变为k或s，和/或，第14位的氨基酸残基突变为m或p，和/或，第21位的氨基酸残基突变为k，和/或，第24位的氨基酸残基突变为i，和/或，第39位的氨基酸残基突变为f，第55位的氨基酸残基突变为n，和/或第57位的氨基酸残基突变为g，和/或，第59位的氨基酸残基突变为v，和/或，第63位的氨基酸残基突变为d，和/或，第64位的氨基酸残基突变为t，和/或，第65位的氨基酸残基突变为t，和/或，第66位的氨基酸残基突变为f，和/或，第69位的氨基酸残基突变为t，和/或，第95位的氨基酸残基突变为r，和/或，第96位的氨基酸残基突变为h，和/或，第103位的氨基酸残基突变为h，和/或，第114位的氨基酸残基突变为p，和/或，第124位的氨基酸残基突变为h，和/或，第125位的氨基酸残基突变为k，和/或，第126位的氨基酸残基突变为f或h，和/或，第136位的氨基酸残基突变为t，和/或，第145位的氨基酸残基突变为e，和/或，第157位的氨基酸残基突变为d，和/或，第159位的氨基酸残基突变为m，和/或，第160位的氨基酸残基突变为a，和/或，第161位的氨基酸残基突变为n，和/或，第169位的氨基酸残基突变为t，和/或，第171位的氨基酸残基突变为l，和/或，第172位的氨基酸残基突变为k，和/或，第176位的氨基酸残基突变为h，和/或，第181位的氨基酸残基突变为q，和/或，第209位的氨基酸残基突变为t，和/或，第214位的氨基酸残基突变为w，和/或，第215位的氨基酸残基突变为k或p，和/或，第217位的氨基酸残基突变为s，和/或，第219位的氨基酸残基突变为h，和/或，第220位的氨基酸残基突变为a，和/或，第224位的氨基酸残基突变为n，和/或，第228位的氨基酸残基突变为g，和/或，第229位的氨基酸残基突变为s，和/或，第231位的氨基酸残基突变为r或s，和/或，第232位的氨基酸残基突变为m，和/或，第234位的氨基酸残基突变为a，和/或，第263位的氨基酸残基突变为s，和/或，第264位的氨基酸残基突变为t，和/或，第269位的氨基酸残基突变为y，和/或，第277位的氨基酸残基突变为q，和/或，第289位的氨基酸残基突变为m，和/或，第291位的氨基酸残基突变为i，和/或，第296位的氨基酸残基突变为s，和/或，第303位的氨基酸残基突变为g或r，和/或，第309位的氨基酸残基突变为s，和/或，第312位的氨基酸残基突变为h，和/或，第318位的氨基酸残基突变为v，和/或，第336位的氨基酸残基突变为g，和/或，第337位的氨基酸残基突变为q或r，和/或，第339位的氨基酸残基突变为e，和/或，第342位的氨基酸残基突变为h，和/或，第349位的氨基酸残基突变为y，和/或，第356位的氨基酸残基突变为l，和/或，第361位的氨基酸残基突变为
t。6.如权利要求1所述的还原方法，其特征在于，所述的突变体的突变位置和种类如表1所示：表1
7.一种烯还原酶或其突变体，其中所述烯还原酶为如权利要求1所述的氨基酸序列，所述的突变体为如权利要求1～6中任一项所述的烯还原酶的突变体。8.一种分离的核酸，其中所述核酸编码如权利要求7所述的氨基转移酶或其突变体。9.一种重组表达载体，其中所述重组表达载体包含如权利要求8所述的核酸。10.一种转化体，其中所述转化体包含如权利要求9所述的重组表达载体。11.一种制备如权利要求9所述转化体方法，其培养如如权利要求10所述的转化体并获得含烯还原酶突变体的培养物，即得。12.一种如权利要求7所述烯还原酶或其突变体在制备潜手性碳碳双键还原剂中的应用。

技术总结
本发明公开了一种使用烯还原酶及其突变体对潜手性碳碳双键的不对称还原方法。具体地，本发明公开了一种烯还原酶或其突变体对潜手性碳碳双键的不对称还原方法，其包括如下步骤：烯还原酶或其突变体和辅酶的存在下，将如化合物II在有机溶剂中进行催化还原反应得化合物I即可；所述烯还原酶为如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或其突变体。本发明的积极进步效果在于：以本申请中的烯还原酶催化的碳碳双键还原反应，条件温和、选择性高、成本低、原料转化率高、收率高且产物手性纯度高。收率高且产物手性纯度高。收率高且产物手性纯度高。


技术研发人员：张亚楠 孟枭 程鹏飞 朱景仰 戴匡初 陶海军 胡秋平 金明 王晓炜 汪有初 傅小勇 陈民章
受保护的技术使用者：上海合全药物研发有限公司 常州合全药业有限公司
技术研发日：2021.12.31
技术公布日：2023/7/13