盐酸罗哌卡因脂质体混悬注射液细菌内毒素检测方法与流程

1.本发明涉及药物质量控制领域，具体涉及一种盐酸罗哌卡因脂质体混悬注射液细菌内毒素检测方法。


背景技术：

2.脂质体样品由于存在各种磷脂，磷脂的化学结构特性容易导致在内毒素检测过程中出现供阳样品不灵(供试品加阳性对照后检测显阴性)，通常情况采用高比例有机溶剂破坏，但高比例有机溶剂的存在会干扰鲎试剂检测；低比例有机溶剂又无法破坏脂质体，让内毒素释放出来，所以脂质体制剂通常采用热原检查法进行检查，不采用细菌内毒素检查方法。
3.盐酸罗哌卡因脂质体混悬注射液是我公司自主研究开发的新型脂质体制剂，根据中国药典2020版四部通则0102注射剂项下要求，本品应进行热原或细菌内毒素检查。但由于罗哌卡因是麻醉镇痛药，属于麻醉类皮下注射用注射剂，热原检查时给药后，会导致兔子麻醉昏迷，影响兔子体温，所以无法用热原检查法检查。


技术实现要素：

4.本发明的目的是克服现有技术存在的问题，提供一种盐酸罗哌卡因脂质体混悬注射液细菌内毒素检测方法。
5.本发明的目的可以通过以下措施达到：
6.一种盐酸罗哌卡因脂质体混悬注射液细菌内毒素检测方法，所述盐酸罗哌卡因脂质体混悬注射液经50～70℃加热8～12分钟破坏脂质体结构后再采用鲎试剂进行细菌内毒素检测。
7.在本发明的一些具体的实例中，加热温度为60℃。
8.在本发明的一些具体的实例中，加热时间为10min。
9.本发明的加热方式可以选用本领域常见的能够实现均匀加热的方法，例如水浴加热。
10.在本发明的一些具体的实例中，盐酸罗哌卡因脂质体混悬注射液在加热前，用bet水稀释至盐酸罗哌卡因浓度为2.5～3mg/ml；优选浓度为2.5mg/ml。
11.在本发明的一些具体的实例中，盐酸罗哌卡因脂质体混悬注射液在加热后，再用bet水稀释至0.625～1.25mg/ml。
12.本发明还提供一种更为具体的盐酸罗哌卡因脂质体混悬注射液细菌内毒素检测方法，所述盐酸罗哌卡因脂质体混悬注射液用bet水稀释至盐酸罗哌卡因浓度为2.5mg/ml，经60℃水浴加热10分钟后，再用bet水稀释至1.25mg/ml后再采用鲎试剂进行细菌内毒素检测。
13.本发明所述的方法在盐酸罗哌卡因脂质体混悬注射液质量控制中的应用。
14.本发明采用鲎试剂进行细菌内毒素检测的方法可以按照本领域的常规方法，例如
中国药典2020年版四部通则9251细菌内毒素检查法应用指导原则中，细菌内毒素检查法包括凝胶法和光度法共6种细菌内毒素检查方法。供试品检测时可以选用其中任何一种方法进行细菌内毒素检查。在本发明的一种具体的实例中，采用中国药典2020版四部通则1143方法1凝胶法，具有操作简便的优点，供试品在排除干扰作用后均可使用凝胶法进行检验。
15.本发明检测所用的鲎试剂可以按照本领域的常规方法进行选择，例如选择λ＝0.03～0.06eu/ml的鲎试剂，更具体的是选择λ＝0.06eu/ml的鲎试剂。
16.本发明的有益效果：
17.本发明采用合适的样品前处理，解决了罗哌卡因脂质体项目的样品无法进行有效的细胞内毒素检查的问题。通过合适的加热温度和时间既可以有效破乳，释放内毒素，又不破坏内毒素，创造性的采用内毒素的检查方法来检测样品，解决了该产品生化指标质控问题。该方法经过多批次检测及验证确认方法可行。
附图说明
18.图1是实施例3加热(60℃加热10min)前后样品形态图。
具体实施方式
19.以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
20.若无特别说明，以下实施例用到的试剂和仪器如下：
21.(1)样品：盐酸罗哌卡因脂质体混悬注射液，来源：南京绿叶制药有限公司；
22.(2)仪器与试剂，分别如表1和表2所示。
23.表1仪器
[0024][0025][0026]
表2试剂
[0027]
细菌内毒素检查用水(bet水) 湛江安度斯生物有限公司鲎试剂(λ＝0.25eu/ml)批号：2003112湛江安度斯生物有限公司鲎试剂(λ＝0.25eu/ml)批号：2006121湛江博康海洋生物有限公司鲎试剂(λ＝0.06eu/ml)批号：2002212湛江安度斯生物有限公司鲎试剂(λ＝0.06eu/ml)批号：2007242湛江博康海洋生物有限公司细菌内毒素工作标准品60eu/支中国食品药品检定研究院
[0028]
本实施例所用的鲎试剂经灵敏度复核，具体如下：
[0029]
分别取鲎试剂18支，每支加0.1mlbet水复溶后分别加入2λ、1λ、0.5λ、0.25λ的内毒
素溶液0.1ml，每支浓度平行4支；另取鲎试剂2支，加入bet水0.1ml，作为阴性对照。置于37℃反应60
±
2分钟，取出观察结果，试验结果见表3～6。
[0030]
表3安度斯鲎试剂(λ＝0.25eu/ml)灵敏度复核结果
[0031][0032]
表4博康海洋鲎试剂(λ＝0.25eu/ml)灵敏度复核结果
[0033][0034][0035]
表5安度斯鲎试剂(λ＝0.06eu/ml)灵敏度复核结果
[0036][0037]
表6博康海洋鲎试剂(λ＝0.06eu/ml)灵敏度复核结果
[0038][0039]
试验结果表明：4批鲎试剂灵敏度均符合规定。
[0040]
实施例1不同温度的前处理条件对细菌内毒素检查的干扰
[0041]
取细菌内毒素工作标准品，用bet水溶解稀释至含细菌内毒素λ、2λ浓度的溶液，经不同温度条件加热后，使用灵敏度0.25eu/ml的鲎试剂进行干扰试验。试验结果见表7-表8。
[0042]
表7安度斯鲎试剂(λ＝0.25eu/ml)测定结果
[0043][0044][0045]
表8博康海洋鲎试剂(λ＝0.25eu/ml)测定结果
[0046][0047]
试验结果表明：本发明所选用的水浴温度在70℃及低于70℃条件下加热10分钟，对细菌内毒素检查无明显干扰作用，而超过该范围则会具有干扰作用。
[0048]
实施例2供试品浓度对内毒素和鲎试剂的反应的干扰
[0049]
取样品用bet水进行稀释至不同浓度(2.5、1.25、0.625mg/ml)后，置60℃水浴加热10分钟，根据凝胶限度试验方法，取灵敏度为0.25eu/ml的鲎试剂，分别与上述不同稀释倍
数的供试品溶液及供试品阳性对照进行反应。试验结果见表9。
[0050]
表9干扰试验预试验结果
[0051][0052][0053]
试验结果表明：本发明所述范围内的1.25mg/ml、0.625mg/ml的浓度下经60℃水浴加热10min前处理后，对2个厂家(安度斯、博康海洋)的鲎试剂与细菌内毒素的反应均无干扰作用，而超过该范围则会存在干扰作用。
[0054]
实施例3温度对样品形态的影响
[0055]
取样品用bet水稀释至1.25mg/ml的浓度后，通过显微镜观察经60℃水浴加热10min前后对多囊脂质体破坏的情况，发现加热后多囊结构的脂质体明显减少，说明该加热条件可破坏本品脂质体结构，使包裹于脂质体内部的细菌内毒素释放出来。结果如图1(左图为加热前样品，右图为60℃水浴加热10min后的样品)所示。
[0056]
实施例4本发明所述方法的方法学验证
[0057]
1、细菌内毒素回收试验
[0058]
取细菌内毒素工作标准品，用bet水溶解稀释至含细菌内毒素2λ、λ、0.5λ、0.25λ浓度的溶液，经60℃水浴加热10min后，进行干扰试验。试验结果表10～11。
[0059]
表10安度斯鲎试剂(λ＝0.06eu/ml)测定结果
[0060]
细菌内毒素浓度(eu/ml)未加热60℃10min2λ(0.125)++++++++λ(0.0625)++++++++0.5λ(0.0312)++++++++0.25λ(0.0156)
‑‑‑‑‑‑‑‑
阴性对照
‑‑‑‑
λc＝antilg(∑x/n)0.0312eu/ml0.0312eu/ml
[0061]
表11博康海洋鲎试剂(λ＝0.06eu/ml)测定结果
[0062]
细菌内毒素浓度(eu/ml)未加热60℃10min2λ(0.125)++++++++λ(0.0625)++++++++0.5λ(0.0312)++++++++0.25λ(0.0156)
‑‑‑‑‑‑‑‑
阴性对照
‑‑‑‑
λc＝antilg(∑x/n)0.0312eu/ml0.0312eu/ml
[0063]
试验结果表明，细菌内毒素在60℃水浴加热10min前处理条件下，效价未发生变化。
[0064]
2、供试品加样回收试验
[0065]
分别取样品用bet水稀释至2.5mg/ml后经60℃水浴加热10min处理，再用bet水稀释至1.25mg/ml作为供试品溶液；取2.5mg/ml供试品溶液与0.25eu/ml内毒素溶液等体积混匀后经60℃水浴加热10min处理，作为供阳回收溶液。用灵敏度0.06eu/ml的鲎试剂测定，考察供试品溶液中的细菌内毒素经前处理后中的回收率。试验结果见表12。
[0066]
表12供试品加样回收测定结果
[0067][0068]
试验结果表明：本品加内毒素溶液经前处理后，与鲎试剂反应呈阳性，说明60℃加热10min对于细菌内毒素无破坏，该前处理条件对本品内毒素检测无影响。
[0069]
3、干扰试验
[0070]
分别取样品用bet水稀释至2.5mg/ml后经60℃水浴加热10min处理，再用bet水稀释至1.25mg/ml作为供试品溶液，用灵敏度0.06eu/ml的鲎试剂，照中国药典2020版通则1143细菌内毒素检查法干扰试验项下要求进行干扰试验，试验结果见表13～14。
[0071]
表13安度斯鲎试剂(λ＝0.06eu/ml)干扰试验结果
[0072][0073][0074]
表14博康海洋鲎试剂(λ＝0.06eu/ml)干扰试验结果
[0075][0076]
试验结果表明，本品在2.5mg/ml的浓度下，经60℃水浴加热10分钟后，再稀释至1.25mg/ml的浓度，对灵敏度为0.06eu/ml的鲎试剂(安度斯、博康海洋)与细菌内毒素的反应无干扰作用。
[0077]
上述试验结果表明：本品用bet水稀释至盐酸罗哌卡因浓度为2.5mg/ml，经60℃水浴加热10分钟后，再用bet水稀释至1.25mg/ml后，可排除对细菌内毒素与鲎试剂反应的干扰作用。
[0078]
实施例5样品细菌内毒素检测方法
[0079]
照细菌内毒素检查法(中国药典2020版四部通则1143方法1凝胶法)，分别取本品1.0ml，加入bet水3.0ml，涡旋混匀，置60℃水浴中加热10分钟后混匀，得2.5mg/ml供试品溶液；再取0.5ml加入0.5mlbet水，涡旋混匀，得1.25mg/ml供试品溶液。
[0080]
a供试品溶液：取复溶后鲎试剂加入1.25mg/ml供试品溶液0.1ml；
[0081]
b供试品阳性对照：取2.5mg/ml供试品溶液0.5ml与0.25eu/ml内毒素溶液0.5ml混
匀，取复溶后的鲎试剂加入该混合液0.1ml；
[0082]
c阳性对照：取复溶后的鲎试剂加入0.125eu/ml的内毒素溶液0.1ml；
[0083]
d阴性对照：取复溶后的鲎试剂加入bet水0.1ml；
[0084]
限度：每1mg盐酸罗哌卡因中含内毒素的量应小于0.05eu
[0085]
以上各组均平行2支，置于37℃反应60
±
2分钟，取出观察结果。
[0086]
根据上述细菌内毒素检查方法，使用安度斯、博康海洋鲎试剂(λ＝0.06eu/ml)对5批自制样品中的细菌内毒素进行了检测。结果见表15～16。
[0087]
表15安度斯鲎试剂(λ＝0.06eu/ml)自制样品检测结果
[0088][0089]
表16博康海洋鲎试剂(λ＝0.06eu/ml)自制样品检测结果
[0090]

技术特征：
1.一种盐酸罗哌卡因脂质体混悬注射液细菌内毒素检测方法，其特征在于，所述盐酸罗哌卡因脂质体混悬注射液经50～70℃加热8～12分钟破坏脂质体结构后再采用鲎试剂进行细菌内毒素检测。2.根据权利要求1所述的盐酸罗哌卡因脂质体混悬注射液细菌内毒素检测方法，其特征在于，加热温度为60℃。3.根据权利要求1所述的盐酸罗哌卡因脂质体混悬注射液细菌内毒素检测方法，其特征在于，加热时间为10min。4.根据权利要求1所述的盐酸罗哌卡因脂质体混悬注射液细菌内毒素检测方法，其特征在于，加热方式为水浴加热。5.根据权利要求1所述的盐酸罗哌卡因脂质体混悬注射液细菌内毒素检测方法，其特征在于，盐酸罗哌卡因脂质体混悬注射液在加热前，用bet水稀释至盐酸罗哌卡因浓度为2.5～3mg/ml。6.根据权利要求1所述的盐酸罗哌卡因脂质体混悬注射液细菌内毒素检测方法，其特征在于，盐酸罗哌卡因脂质体混悬注射液在加热前，用bet水稀释至盐酸罗哌卡因浓度为2.5mg/ml。7.根据权利要求1所述的盐酸罗哌卡因脂质体混悬注射液细菌内毒素检测方法，其特征在于，盐酸罗哌卡因脂质体混悬注射液在加热后，再用bet水稀释至0.625～1.25mg/ml。8.一种盐酸罗哌卡因脂质体混悬注射液细菌内毒素检测方法，其特征在于，所述盐酸罗哌卡因脂质体混悬注射液用bet水稀释至盐酸罗哌卡因浓度为2.5mg/ml，经60℃水浴加热10分钟后，再用bet水稀释至1.25mg/ml后再采用鲎试剂进行细菌内毒素检测。9.根据权利要求1～8任一项所述的盐酸罗哌卡因脂质体混悬注射液细菌内毒素检测方法，其特征在于，选择λ＝0.03～0.06eu/ml的鲎试剂进行检测，优选的，选择λ＝0.06eu/ml的鲎试剂进行检测。10.权利要求1～9任一项所述的方法在盐酸罗哌卡因脂质体混悬注射液质量控制中的应用。

技术总结
本发明公开一种盐酸罗哌卡因脂质体混悬注射液细菌内毒素检测方法，该方法采用合适的样品前处理，解决了罗哌卡因脂质体样品无法进行有效的细胞内毒素检查的问题。通过合适的加热温度和时间既可以有效破乳，释放内毒素，又不破坏内毒素，创造性的采用内毒素的检查方法来检测样品，解决了该产品生化指标质控问题。该方法经过多批次检测及验证确认方法可行。该方法经过多批次检测及验证确认方法可行。


技术研发人员：王佩香 刘小苗 葛正祥 刘宁 陈文忠
受保护的技术使用者：南京绿叶制药有限公司
技术研发日：2021.12.31
技术公布日：2023/7/13