提取硒代氨基酸的方法与流程

1.本发明涉及植物提取物技术领域，具体涉及一种提取硒代氨基酸的方法。


背景技术：

2.硒是人体必需的微量营养元素之一，人类至少40多种疾病的发病率与缺硒有关。以前人和动物补硒最主要的方法是在食品和饲料中添加亚硒酸钠、硒化卡拉胶、富硒酵母、富硒食用菌粉或富硒农产品。但是亚硒酸钠已经是人们公认的对人体的危害的物质。硒化卡拉胶为人工合成的一种多糖亚硒酸酯，富硒酵母含有约60％左右的以硒代蛋氨酸为主有机硒，但是其中一般还有40％左右的亚硒酸钠或硒酸钠。富硒食用菌粉与富硒酵母的硒化合物组成具有相似性，在食用安全性、生物利用度等方面都不太理想。基于上述现状，目前非常推崇植物有机硒在补硒食品中的应用，植物有机硒被评价为更加安全、生物利用度更高的硒源。然而，植物有机硒作为补硒食品的硒源，依然存在标准不统一、难以定性定量和硒化合物化学组成不明确或难以确定，从而难以实现质量可控、易于检测等作为食品原料的基本要求。
3.植物中的最安全和最具开发价值的有机硒组成是含硒蛋白、硒肽和硒代氨基酸。其中，最常见的硒代氨基酸主要包含硒代半胱氨酸(游离态时为一般硒代胱氨酸)、硒代蛋氨酸、硒甲基硒代半胱氨酸。其中，硒代半胱氨酸才是组成人体中通过uga密码子编码的多种硒代谷胱甘肽过氧化酶(简称硒酶)的核心氨基酸，一定量硒酶的存在又是人体中能显著降低多种疾病发病率的关键。硒代蛋氨酸和硒甲基硒代半胱氨酸也是相对更安全的硒代氨基酸单元。
4.堇叶碎米荠是十字花科碎米荠属植物，其聚硒能力超强。据报道，该植物含硒量最高可达8000mg/kg，且90％以上以硒代半胱氨酸形态存在，同时也含有一定量的硒代蛋氨酸和硒甲基硒代半胱氨酸。堇叶碎米荠被认为是目前为止最理想的可食用高聚硒植物。从堇叶碎米荠中提取分离植物硒代氨基酸，并应用于补硒食品、保健食品、特殊医疗用途食品或药品的制备，从而真正实现硒产品的化学组成更明确、定量更精准、品质更可控、安全性更高这一目标。目前，关于植物硒代氨基酸的提取分离技术报道很少，且基于目前已经报道的工艺技术，在产业化方面都还存在一定的技术局限性和可操作性。
5.201410361185.9公开了一种从聚硒植物碎米荠中提取硒代胱氨酸和硒代蛋氨酸的方法。该方法是将干燥的聚硒植物碎米荠原料粉碎后，通过加入盐酸提取硒代胱氨酸，加入氢氧化钠提取硒代蛋氨酸，滤液调节ph值到近中性后，采用高压制备柱进行分离，含硒代胱氨酸和硒代蛋氨酸的洗脱液分别用纤维素脂透析袋透去无机盐离子，再通过冷冻干燥得到硒代胱氨酸和硒代蛋氨酸精品。该方法从理论上推断，因为碎米荠中的大部分硒代氨基酸是以含硒蛋白的形式存在，因此该专利申请中的两步酸碱提取法(用盐酸提取硒代胱氨酸和氢氧化钠提取硒代蛋氨酸)是难以实现硒代氨基酸的高产率提取的。事实上，该方法的产品收率极低，两种硒代氨基酸的实际收率很难超过理论收率的20％。
6.202011549763.3公开了一种从壶瓶碎米荠中提取、分离纯化硒蛋氨酸的制备方
法，其公开了一种从壶瓶碎米荠中提取、分离纯化硒蛋氨酸的制备方法。壶瓶碎米荠干粉经过水提取，水提取液用乳酸菌发酵处理，发酵液过滤后低温干燥，得粗蛋白粉。然后粗蛋白粉用蒸馏水溶解，活性炭脱色，脱色后的粗蛋白水溶液调至壶瓶碎米荠蛋白的等电点，静置沉淀后高速离心分离，收集沉淀并真空冷冻干燥，得到脱色后的壶瓶碎米荠粗蛋白。脱色后的壶瓶碎米荠粗蛋白，使用凝胶柱层析和deae ff阴离子交换柱层析，经分级纯化得到壶瓶碎米荠初级蛋白。初级蛋白再经过中性蛋白酶水解，利用c18反相色谱柱，分离物进行水洗和冻干，即获得高纯度硒蛋氨酸。该方法的投资成本较高，且产品收率较低。
[0007]“李宝瑞，黄豆富硒特性及硒的形态分布研究，辽宁大学硕士学位论文，2015年5月”中公开了将研磨好的黄豆样品加入到30mmol/l tris-hcl(ph值7.5)中，于40℃浸提90min，常温低速离心取上清液，取上清液然后加入4倍体积丙酮于-20℃冰箱放置，4℃下高速离心弃上清吹干。将所得蛋白用5ml tris-hcl再次溶解，加入胰蛋白酶，50℃水浴振荡后加入同蛋白酶k振荡4h，最后用100℃水浴灭酶，离心上清液即为硒代氨基酸溶液。“hplc-icp-ms测定硒蛋白中硒代氨基酸的方法，中国卫生检验杂志，2015，25(5)：636-638”中公开了将tris-hcl提取的样品溶液，每隔12h依次加入胰蛋白酶、蛋白酶k及链霉蛋白，在37℃下振荡酶解，将分子量大于3kd的物质除去，获得硒代氨基酸溶液。上述关于硒代氨基酸的提取方法报道，均是基于实验室对植物中硒代氨基酸的形态和含量进行检测分析而进行的极小量实验方法，没有针对硒代氨基酸的提取生产的相关技术参数进行研究和报道，实际操作过程也均不具有产业化放大的可行性。
[0008]
因此，如何低成本、高收率、高含量的提纯分离硒代氨基酸仍然是人们关注的热点。


技术实现要素：

[0009]
本发明的目的是为了克服现有技术存在的技术问题，提供一种提取硒代氨基酸的方法。
[0010]
为了实现上述目的，本发明提供一种提取硒代氨基酸的方法，该方法包括：
[0011]
(1)在ph为2.0-5.0的条件下，将酸性蛋白酶与所述富硒植物接触，进行第一酶解，得到第一酶解产物；
[0012]
(2)在ph为5.5-8.5的条件下，将中性蛋白酶与所述第一酶解产物接触，进行第二酶解，得到第二酶解产物；
[0013]
(3)在ph为8-12的条件下，将碱性蛋白酶与所述第二酶解产物接触，进行第三酶解，得到第三酶解产物；
[0014]
(4)用大孔吸附树脂对第三酶解产物进行脱色，脱色后的产物；
[0015]
(5)用阴离子交换树脂、阳离子交换树脂依次处理脱色后的产物，得到硒代氨基酸粗品；
[0016]
(6)任选地，将硒代氨基酸粗品进行色谱分离。
[0017]
与现有技术相比，本发明提供的技术方案至少具有以下优势：
[0018]
(1)本发明提供的方法中采用蛋白酶处理富硒植物(采用一锅法酶解的方式)，设备要求更简单，提取操作过程也更加简单，利于工业化操作；
[0019]
(2)在本发明优选的实施方式中，脱色、去杂过程的操作通过大孔吸附树脂、阴离
子交换树脂和阳离子交换树脂的偶联吸附过程完成，分离过程以硒代胱氨酸、硒代蛋氨酸和硒甲基硒代半胱氨酸的纯品为对照品的薄层色谱检测进行监控，直观且易于操作和掌控；
[0020]
(3)本发明中，优选情况下整个提取分离过程只需要对分离纯化后的富含硒代氨基酸这一目标产物中包含的水溶液进行浓缩、干燥或喷雾干燥；整个提纯分离过程浓缩步骤少，成本和能耗低；且本发明分离得到的硒代氨基酸的产品收率高和纯度均较高。
附图说明
[0021]
图1是本发明中一种具体实施方式得到的硒代胱氨酸的hplc图谱；
[0022]
图2是本发明中一种具体实施方式得到的硒代胱氨酸的质谱图。
具体实施方式
[0023]
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
[0024]
在本发明中，在未作相反说明的情况下，使用的术语“酶活力单位”反应的是酶含量的多少，指在特定条件下，1分钟内转化1微摩尔底物或者底物中1微摩尔有关基团所需的酶量，称为一个酶活力单位(iu，又称u)。
[0025]
其中，酸性蛋白酶的酶活力单位的定义是：ph 3，55℃的反应条件下，1min内水解质量浓度为1％的酪蛋白溶液产生1μmol酪氨酸的酶量为一个酶活力单位(u)。
[0026]
中性蛋白酶的酶活力单位的定义是：ph 7，37℃的反应条件下，1min内水解质量浓度为1％的酪蛋白溶液产生1μmol酪氨酸的酶量为一个酶活力单位(u)。
[0027]
碱性蛋白酶的酶活力单位的定义是：ph 11，40℃的反应条件下，1min内水解质量浓度为1％的酪蛋白溶液产生1μmol酪氨酸的酶量为一个酶活力单位(u)。
[0028]
纤维素酶的酶活力单位的定义是：ph 5.5，70℃的反应条件下，1min内水解纤维素产生1μmol葡萄糖的酶量为一个酶活力单位(u)。
[0029]
干重的测试方法为《中华人民共和国药典》“水分测定法——第二法烘干法”。
[0030]
本发明提供一种提取硒代氨基酸的方法，该方法包括：
[0031]
(1)在ph为2.0-5.0的条件下，将酸性蛋白酶与所述富硒植物接触，进行第一酶解，得到第一酶解产物；
[0032]
(2)在ph为5.5-8.5的条件下，将中性蛋白酶与所述第一酶解产物接触，进行第二酶解，得到第二酶解产物；
[0033]
(3)在ph为8-12的条件下，将碱性蛋白酶与所述第二酶解产物接触，进行第三酶解，得到第三酶解产物；
[0034]
(4)用大孔吸附树脂对第三酶解产物进行脱色，脱色后的产物；
[0035]
(5)用阴离子交换树脂、阳离子交换树脂依次处理脱色后的产物，得到硒代氨基酸粗品；
[0036]
(6)任选地，将硒代氨基酸粗品进行色谱分离。
[0037]
优选地，步骤(1)、步骤(2)和步骤(3)中酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶的酶活力单位之间的比值为1：(1-10)：(8-50)，优选1：(1-8)：(8-30)。
[0038]
更优选地，所述酸性蛋白酶和中性蛋白酶的酶活力单位之间的比值为1：(1.5-5)(如1:1.5、1:2、1:2.5、1:3、1:4、1:5或以上比值之间的任意值)。
[0039]
优选地，所述酸性蛋白酶和碱性蛋白酶的酶活力单位之间的比值为1：(9-20)(如1:9、1:9.5、1:10、1:11、1:12、1:15、1:18、1:20或以上比值之间的任意值)。
[0040]
本发明对不同的蛋白酶处理富硒植物的先后顺序不做特别的限制，任何一种处理顺序(例如，依次选用所述酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶处理富硒植物，或者依次选用所述碱性蛋白酶、中性蛋白酶和酸性蛋白酶处理富硒植物等)均能满足本发明的需求，但是从简化流程、降低成本(如降低酸碱用量)、能耗、以及为了获得含量和收率更高的硒代氨基酸的角度考虑，优选采用依次选用所述酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶处理富硒植物的方式。
[0041]
因此，根据本发明优选的实施方式，采用酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶处理富硒植物的方式为：
[0042]
(s1)在ph为2.5-4.0优选3.0-3.5的条件下，将酸性蛋白酶与所述富硒植物接触，进行第一酶解，得到第一酶解产物；
[0043]
(s2)在ph为6.5-7.5优选6.8-7.2的条件下，将中性蛋白酶与所述第一酶解产物接触，进行第二酶解，得到第二酶解产物；
[0044]
(s3)在ph为9-11优选9.5-10.5的条件下，将碱性蛋白酶与所述第二酶解产物接触，进行第三酶解，得到第三酶解产物。
[0045]
本发明中，对步骤(s1)中的ph值的控制不做特别的限制，只要能够满足本发明的需求即可，例如可以采用1-20wt％的盐酸进行调控。对步骤(s2)和(s3)中ph的控制也不做特别的限制，只要能够满足本发明的需求即可，例如可以采用1-20wt％的氢氧化钠溶液进行调控。
[0046]
根据本发明的一些实施方式，所述第一酶解的条件还可以包括：温度为30-70℃，时间为24-48h。
[0047]
根据本发明的一些实施方式，相对于每千克以干重计的富硒植物，所述酸性蛋白酶的用量大于40万u，可以为40万-200万u，优选100万-180万u。
[0048]
根据本发明的一些实施方式，所述第二酶解的条件还可以包括：温度为30-55℃，优选为40-50℃；时间为24-48h。
[0049]
根据本发明的一些实施方式，相对于每千克以干重计的富硒植物，所述中性蛋白酶的用量大于90万u，可以为90万-300万u，优选200万-280万u。
[0050]
根据本发明的一些实施方式，所述第三酶解的条件还包括：温度为30-60℃，优选为45-50℃；时间为24-48h。
[0051]
根据本发明的一些实施方式，相对于每千克以干重计的富硒植物，所述碱性蛋白酶的用量为400万-2000万u，优选1400万-1800万u。
[0052]
根据本发明的一些实施方式，所述第一酶解、第二酶解和第三酶解在溶剂的存在下进行，所述溶剂优选为水。
[0053]
根据本发明，所述各步酶解(第一酶解、第二酶解和第三酶解)之间无需进行其他
操作，而可以直接将前一酶解步骤的所有产物直接与下一步酶解所使用的蛋白酶接触进行下一步的酶解，也就是说，根据本发明的优选实施方式，前一蛋白酶处理的产物直接全部进行下一步的蛋白酶处理操作，也即在不同蛋白酶处理步骤之间不包括进行其他操作(特别是分离操作)的步骤。
[0054]
根据本发明的一些实施方式，相对于每千克以干重计的富硒植物，所述第一酶解、第二酶解和第三酶解过程中溶剂的用量各自独立地为15-50kg。
[0055]
本发明对所述酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶的具体种类没有特别的限制，可以为本领域常见的符合gb 1886.174食品工业用酶制剂中的各种选择。
[0056]
本发明中，所述酸性蛋白酶能够有效切开多种氨基酸构成的肽键，优先切开两端是芳香族或疏水性氨基酸残基之间的肽键，得到小肽和氨基酸。所述酸性蛋白酶可以选自由第一微生物(如黑曲霉、米曲霉、根霉、青霉、毛霉、芽孢杆菌等)产生的酸性蛋白酶和/或动物产生的胃蛋白酶，例如可以选自宁夏夏盛实业公司的黑曲霉菌株发酵产生的酸性蛋白酶fdy-2205和fdg-2237以及宜昌安琪酵母公司的黑曲霉菌株发酵产生的酸性蛋白酶ap-5和ap-10中的至少一种。
[0057]
本发明中，所述中性蛋白酶能够有效作用于蛋白质分子中的肽键，将蛋白质水解成低聚肽和氨基酸。优选情况下，所述中性蛋白酶主要含有内肽酶活性。所述中性蛋白酶的作用点位于蛋白质的内部，远离n端和c端。所述中性蛋白酶可以选自由第二微生物(如芽孢杆菌、米曲霉、毛霉、栗疫霉、栖木曲霉等)产生的中性蛋白酶和/或植物产生的木瓜蛋白酶，例如可以选自宁夏夏盛实业公司的枯草芽孢杆菌菌株发酵生产的中性蛋白酶fdg-2209和/或fdg-2230。
[0058]
本发明中，所述碱性蛋白酶的酶活性中心含丝氨酸，能够水解蛋白质分子的肽链生成多肽和氨基酸。优选地，所述碱性蛋白酶为丝氨酸内切蛋白酶。所述碱性蛋白酶可以选自由第三微生物(如地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜碱性芽孢杆菌、灰色链霉菌、费氏链霉菌、米曲霉、栖木曲霉、冠状耳霉等)产生的碱性蛋白酶和/或动物产生的胰蛋白酶，例如可以选自宁夏夏盛实业公司的枯草芽孢杆菌菌株发酵产生的碱性蛋白酶fdg-2227、fdg-2202和fdy-2241以及宜昌安琪酵母公司的地衣芽孢杆菌发酵所生产的碱性蛋白酶ap-200a和ap-20中的至少一种。
[0059]
本发明中，在步骤(5)的离子交换树脂处理过程中，所述离子交换树脂可以为本领域常见的各种离子交换树脂，但优选地，所述离子交换树脂选自阴离子交换树脂和/或阳离子交换树脂。
[0060]
根据本发明的一些实施方式，所述阴离子交换树脂为食品工业中允许使用的强碱性阴离子交换树脂；所述强碱性阴离子交换树脂选自大孔型和/或凝胶型离子交换树脂，优选大孔型离子交换树脂(如苯乙烯系交换树脂等)，具体型号可以为d201强碱性阴离子交换树脂等。
[0061]
根据本发明的一些实施方式，所述阳离子交换树脂为强酸性阳离子交换树脂；所述强酸性阳离子交换树脂选自大孔型和/或凝胶型离子交换树脂，优选大孔型离子交换树脂(如磺酸基阳离子交换树脂，具体如苯乙烯
·
二乙烯共聚体上带有磺酸基(-so3h)的阳离子交换树脂等)，具体型号可以为732型强酸性阳离子交换树脂。
[0062]
本发明中，当采用阴离子交换树脂和阳离子交换树脂对脱色后的第三酶解产物进
行初步纯化时，对阴离子交换树脂和阳离子交换树脂处理第三酶解产物的先后顺序不做特别的限制，任何一种处理顺序(如，先使用阴离子交换树脂后使用阳离子交换树脂处理第三酶解产物，或者，先使用阳离子交换树脂后使用阴离子交换树脂第三酶解产物)均能满足本发明的需求，但是从简化流程、降低成本(如降低酸碱用量)、能耗、以及为了获得含量和收率更高的硒代氨基酸的角度考虑，优选采用先使用阴离子交换树脂后使用阳离子交换树脂处理第三酶解产物的方式。其中，“交换饱和”是指薄层色谱法监测流出液中有硒代胱氨酸开始泄露时即为交换饱和。
[0063]
因此，根据本发明优选的实施方式，步骤(5)中，采用所述阴离子交换树脂处理蛋白酶处理后的产物(即第一纯化)，得到交换饱和后的阴离子交换树脂，并用酸性溶液对交换饱和后的阴离子交换树脂进行第一梯度洗脱，得到第一洗脱液；之后，采用所述阳离子交换树脂处理所述第一洗脱液(即第二纯化)，并用碱性溶液对交换饱和后的阳离子交换树脂进行第二梯度洗脱，得到第二洗脱液。
[0064]
本发明对离子交换树脂的用量没有特别的限制，只要能够满足本发明的需求即可。
[0065]
根据本发明的一些实施方式，所述阴离子交换树脂可以为强碱性阴离子交换树脂。所述强碱性阴离子交换树脂选自大孔型和/或凝胶型离子交换树脂，优选大孔型离子交换树脂。
[0066]
根据本发明的一些实施方式，所述阳离子交换树脂可以为强酸性阳离子交换树脂。所述强酸性阳离子交换树脂选自大孔型和/或凝胶型离子交换树脂，优选大孔型离子交换树脂。
[0067]
本发明中，所述酸性溶液的ph值可以为1.5-6(如1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6或以上数值之间的任意值)；所述第一梯度洗脱的方式为采用ph值由高到低的酸性溶液依次洗脱交换饱和后的阴离子交换树。
[0068]
本发明中，为了获得更好的效果，相邻两次洗脱使用的酸性溶液之间的ph差值可以为0.5-1。
[0069]
本发明中，所述酸性溶液可以选自盐酸溶液、醋酸溶液、卤代醋酸(如氟代羧酸、氯代羧酸、溴代羧酸等)和酸性缓冲溶液中的至少一种。
[0070]
本发明对所述酸性溶液的用量不做特别的限制，只要能够满足本发明的需求即可。
[0071]
本发明中，所述碱性溶液的ph值可以为6-10.5(如6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5或以上数值之间的任意值)；所述第二梯度洗脱的方式为采用ph值由低到高的碱性溶液依次洗脱交换饱和后的阳离子交换树脂。优选地，相邻两次洗脱使用的洗脱液之间的差值为0.5-1。
[0072]
本发明中，所述碱性溶液可以选自氨水溶液、氨水与氢氧化钠水溶液和碱性缓冲溶液中的至少一种。
[0073]
本发明对所述碱性溶液的用量不做特别的限制，只要能够满足本发明的需求即可。
[0074]
本发明中，在步骤(5)的离子交换树脂处理的过程中，以硒代胱氨酸、硒甲基硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸的纯品为对照品进行薄层色谱检测，用以监控纯化过程和梯度洗脱
的程度。其中，薄层色谱检测可以在硅胶薄层板上进行。其中，对薄层色谱检测用的展开剂没有特别的限制，可以为本领域的常规选择，例如，所述展开剂可以选自正丁醇、乙酸和水。优选地，正丁醇：乙酸：水＝(2-4)：(0.8-1.2)：1；薄层色谱检测用的显色剂可以为茚三酮溶液。
[0075]
本发明中，可以将第一纯化得到的含有硒代胱氨酸、硒甲基硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸第一洗脱液，用调节ph为1.5-2(例如用盐酸调ph)，无需浓缩，直接进行第二纯化。
[0076]
本发明中，经步骤(5)的离子交换树脂处理，可以获得含硒代胱氨酸、硒甲基硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸的硒代氨基酸粗品。
[0077]
本发明中，步骤(6)中，所述色谱分离法优选为加压制备色谱分离(优选为中压制备色谱分离)。
[0078]
优选地，所述加压制备色谱分离的参考条件可以包括：
[0079]
所述色谱分离压力可以根据加压制备色谱系统的不同、色谱填料的粒径和机械强度而定，例如可以为3-70bar，优选为3-20bar；
[0080]
检测波长可以为235-240nm；
[0081]
本发明所采用的流动相：体积比为(2-5)：(95-98)的3-8mmol/ml的磷酸二氢钾溶液和甲醇；其中，流动相优选采用等度洗脱的方式；其中，流动相的选择也不需要做特别的限制，只需要能够达到相似的分离效果即可；
[0082]
相对于规格为φ50mm*500mm的色谱柱，所述流动相的流速可以为40-60ml/min。
[0083]
本发明中，对所述色谱填料的种类没有特别的限制，可以为本领域的常规选择，但是为了获得更好的分离效果，所述色谱分离的填料选自强酸性阳离子交换树脂或强碱性阴离子交换树脂。
[0084]
本发明中，所述色谱分离用的色谱填料可以选自c1填料、c4填料、c8填料和c18填料中的至少一种。为了更好地适应中压制备色谱系统，优选地，相对于色谱分离的压力为3-20bar时，色谱填料的粒径可以为20-80μm，优选25-45μm。
[0085]
本发明中，对色谱分离用的色谱柱的类型和柱高没有特别的限制，可以为本领域的常规选择。例如，所述色谱柱可以为不锈钢静态压缩柱；柱床高≥350mm。
[0086]
本发明中，在所述色谱分离过程中，对于上样的次数没有特别的限制，只要能够满足本发明的需求即可，例如可以为2-6次(如2、3、4、4、5、6次等)。
[0087]
本发明中，对所述大孔吸附树脂的具体种类没有特别的限制，可以为本领域常见的各种选择(优选考虑再生能力好的低极性或中低极性大孔吸附树脂)。
[0088]
本发明对所述大孔吸附树脂的用量不做特别的限制，只要能够满足本发明的需求即可。
[0089]
本发明中，所述大孔吸附树脂可以为各种常见的非极性、低极性或中极性大孔吸附树脂，优选地，所述大孔吸附树脂选自聚苯乙烯型吸附树脂。所述大孔吸附树脂的型号可以选自ab-8、lsa-33、sp825、sp207、ads-5、ads-8、d101-1、hp10、lsa-10、lsa-20、lsa-21、lsa-26、lsa-30、xda-6等。
[0090]
本发明中，所述脱色优选在大孔吸附树脂柱中进行，其中，对所述大孔吸附树脂柱的规格不做特别的限制，可以根据大孔吸附树脂的用量进行适应性选择，例如，所述大孔吸附树脂柱的柱床直径可以为10-100cm)，柱床高可以为150-300cm(如柱床径高组合可以为
c8 4.6
×
150mm.5μm；流动相为5mmol/ml磷酸二氢钾溶液：甲醇等度洗脱2：98(v/v)等度洗脱；二级管阵列检测器(dad)，检测波长235nm；柱温25℃；进样体积20μl；流速0.5ml/min；运行时间12min。
[0107]
以下实施例中，折合干燥原料计算硒代氨基酸的产品得率计算公式如下：
[0108][0109]
实施例1
[0110]
堇叶碎米荠地上部分新鲜材料50kg，为湖北恩施海拔1112m高富硒地区自行大田露天种植，采收时为花期，植株平均高66cm，包含茎、叶、花和少量幼果。经检测，含水量为88.96％，总硒含量为287mg/kg干重；
[0111]
(1)一锅法梯度酶解：新鲜材料，洗净，加入250升纯净水打浆，在搅拌下用10wt％盐酸调ph值为3.3，按40万u酶活性酸性蛋白酶/每公斤干重计的堇叶碎米荠的剂量加入食品级酸性蛋白酶(酶的厂家及型号：宁夏夏盛食品级酶活15万u/g酸性蛋白酶fdy-2205)，50℃下搅拌酶解(第一酶解)24小时后再用10wt％的氢氧化钠水溶液调ph值至7.0，按90万u酶活性中性蛋白酶/每公斤干重计的堇叶碎米荠的剂量加入食品级中性蛋白酶(宁夏夏盛食品级酶活5万u/g中性蛋白酶fdg-2209)，45℃下搅拌酶解(第二酶解)24小时后再用10wt％的氢氧化钠水溶液调ph值至9.8，按400万u酶活性碱性蛋白酶/每公斤干重计的堇叶碎米荠的剂量加入食品级碱性蛋白酶(宁夏夏盛食品级酶活45万u/g碱性蛋白酶fdg-2227)，45℃下搅拌酶解(第三酶解)24小时。冷却至室温，过滤，得到的残渣再用250升纯净水搅拌提取1次，过滤。合并滤液得485升堇叶碎米荠酶解提取液(第三酶解产物)；
[0112]
(2)大孔吸附树脂脱色：将上述堇叶碎米荠酶解提取液经过再生好的ab-8大孔吸附树脂柱(柱径10cm，柱床高162cm)，提取液上样完(也即大孔吸附树脂柱中色素开始检测到有泄漏时，该柱停止上样)时再用1bv的纯净水置换出全部提取液，得脱色提取液约500升；
[0113]
(3)阴离子交换树脂纯化(第一纯化)：上述脱色后的提取液，无需浓缩，直接上样，经过再生好的d201强碱性阴离子交换树脂柱，柱径20cm，柱床高186cm)。交换饱和后的阴离子交换树脂柱依次用2bvph6.0、2bv ph4.5、3bv ph3.0、3bv ph1.5的稀盐酸水溶液梯度洗脱，以硒代胱氨酸、硒甲基硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸为对照品进行薄层检测。收集含有硒代胱氨酸、硒甲基硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸部分的洗脱液，合并洗脱液。薄层检测：硅胶薄层板，展开剂为正丁醇：乙酸：水＝3：1：1，显色剂为茚三酮溶液；
[0114]
(4)阳离子交换树脂纯化(第二纯化)：将上述含有硒代胱氨酸、硒甲基硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸部分的洗脱液用盐酸调节ph为2.0后，无需浓缩，直接上样，经过再生好的732型强酸性阳离子交换树脂柱(柱径20cm，柱床高185cm)。交换饱和后的阳离子交换树脂柱依次用2bv ph 6.0的水、2bv ph7.5和3bv ph9.0的氨水溶液、3bv ph10.5的氢氧化钠水溶液梯度洗脱，以硒代胱氨酸、硒甲基硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸为对照品进行薄层检测。收集富含硒代胱氨酸、硒甲基硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸部分的洗脱液；富含硒代氨基酸的洗脱液用10wt％的盐酸调ph5.8。减压浓缩、真空干燥，得浅黄棕色堇叶碎米荠硒代氨基酸产品15.24克。
[0115]
以折合干燥原料计算硒代氨基酸的产品得率为0.276％。经检测总硒含量为
65.02mg/g，其中含有硒代胱氨酸11.27％、硒代蛋氨酸1.15％、硒甲基硒代半胱氨酸0.78％。以原料中硒的总含量和产品中硒的总含量计算硒的收率为62.55％。
[0116]
实施例2
[0117]
堇叶碎米荠地上部分新鲜材料50kg，为发明申请人在湖北恩施海拔1112m高富硒地区自行规范化大棚种植。采收时为花蕾期，植株平均高39cm，包含茎、叶和花蕾。经检测，含水量为90.94％，总硒含量为1021mg/kg干重。
[0118]
(1)一锅法梯度酶解：新鲜材料，洗净，加入400升纯净水打浆，在搅拌下用10wt％盐酸调ph值为3.3，按110万u酶活性酸性蛋白酶/每公斤干重计的堇叶碎米荠的剂量加入食品级酸性蛋白酶(宁夏夏盛食品级酶活15万u/g酸性蛋白酶fdy-2205)，50℃下搅拌酶解(第一酶解)36小时后再用10wt％氢氧化钠水溶液调ph值至7.0，按180万u酶活性中性蛋白酶/每公斤干重计的堇叶碎米荠的剂量加入食品级中性蛋白酶(宁夏夏盛食品级中性蛋白酶(植物提取专用酶spe-008，型号为ffg-0657)，45℃下搅拌酶解(第二酶解)36小时后再用10wt％氢氧化钠水溶液调ph值至9.8，按1020万u酶活性碱性蛋白酶/每公斤干重计的堇叶碎米荠的剂量加入食品级碱性蛋白酶(宁夏夏盛食品级酶活45万u/g碱性蛋白酶fdg-2227)，45℃下搅拌酶解(第三酶解)36小时。冷却至室温，过滤，得到的残渣再用250升纯净水搅拌提取1次，过滤。合并滤液得641升堇叶碎米荠酶解提取液(第三酶解产物)；
[0119]
(2)大孔吸附树脂脱色：堇叶碎米荠酶解提取液经过再生好的lsa-33大孔吸附树脂柱(柱径10cm，柱床高157cm)，提取液上样完时再用1bv的纯净水置换出全部提取液，得脱色提取液约650升；
[0120]
(3)阴离子交换树脂纯化(第一纯化)：脱色后的提取液，无需浓缩，直接上样，经过再生好的d201强碱性阴离子交换树脂柱(柱径20cm，柱床高186cm)。交换饱和后的阴离子交换树脂柱依次用2bv ph6.0、2bv ph4.5、3.5bv ph3.0、3.5bv ph1.5的稀盐酸水溶液梯度洗脱，以硒代胱氨酸、硒甲基硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸为对照品进行薄层检测。收集含有硒代胱氨酸、硒甲基硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸部分的洗脱液，合并洗脱液。薄层检测同实施例1；
[0121]
(4)阳离子交换树脂纯化(第二纯化)：含有硒代胱氨酸、硒甲基硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸部分的洗脱液用盐酸调节ph为1.5后，无需浓缩，直接上样，经过再生好的732型强酸性阳离子交换树脂柱(柱径20cm，柱床高185cm。交换饱和后的阳离子交换树脂柱依次用2bv ph 6.0的水、2.5bv ph7.5和3.5bv ph9.0的氨水溶液、3bv ph10.5的氢氧化钠水溶液梯度洗脱，以硒代胱氨酸、硒甲基硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸为对照品进行薄层检测。收集富含硒代胱氨酸、硒甲基硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸部分的洗脱液。富含硒代氨基酸的洗脱液用10wt％盐酸调ph5.8。减压浓缩、真空干燥，得浅黄棕色堇叶碎米荠硒代氨基酸产品18.37克；
[0122]
以折合干燥原料计算硒代氨基酸的产品得率为0.400％。经检测总硒含量为196.28mg/g，其中含有硒代胱氨酸37.77％、硒代蛋氨酸2.09％、硒甲基硒代半胱氨酸1.08％。以原料中硒的总含量和产品中硒的总含量计算硒的收率为77.96％。
[0123]
实施例3
[0124]
堇叶碎米荠新鲜叶片50kg，为发明申请人在湖北恩施海拔1112m高富硒地区自行规范化大棚种植。采收时为花期，植株平均高65cm。经检测，含水量为91.22％，总硒含量为
1699mg/kg干重。
[0125]
(1)一锅法梯度酶解：新鲜材料，洗净，加入400升纯净水打浆，在搅拌下用10wt％的盐酸调ph值为3.3，按160万u酶活性酸性蛋白酶/每公斤干重计的堇叶碎米荠的剂量加入食品级酸性蛋白酶(宁夏夏盛食品级酶活15万u/g酸性蛋白酶fdy-2205)，50℃下搅拌酶解(第一酶解)24小时后再用10wt％的氢氧化钠水溶液调ph值至7.0，按270万u酶活性中性蛋白酶/每公斤干重计的堇叶碎米荠的剂量加入食品级中性蛋白酶(宁夏夏盛食品级中性蛋白酶(植物提取专用酶spe-008，型号为ffg-0657)，45℃下搅拌酶解(第二酶解)36小时后再用10wt％的氢氧化钠水溶液调ph值至10.0，按1600万u酶活性碱性蛋白酶/每公斤干重计的堇叶碎米荠的剂量加入食品级碱性蛋白酶(宁夏夏盛食品级酶活45万u/g碱性蛋白酶fdg-2227)，43℃下搅拌酶解(第三酶解)48小时。冷却至室温，过滤，得到的残渣再用250升纯净水搅拌提取1次，过滤。合并滤液得738升堇叶碎米荠酶解提取液(第三酶解产物)；
[0126]
(2)大孔吸附树脂脱色：堇叶碎米荠酶解提取液经过再生好的lsa-33大孔吸附树脂柱(柱径10cm，柱床高157cm)，提取液上样完时再用1bv的纯净水置换出全部提取液，得脱色提取液约750升。
[0127]
(3)阴离子交换树脂纯化(第一纯化)：脱色后的提取液，无需浓缩，直接上样，经过再生好的d201强碱性阴离子交换树脂柱(柱径20cm，柱床高186cm)。交换饱和后的阴离子交换树脂柱依次用2bv ph6.0、2bv ph4.5、4.0bv ph3.0、3.5bv ph1.5的稀盐酸水溶液梯度洗脱，以硒代胱氨酸、硒甲基硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸为对照品进行薄层检测。收集含有硒代胱氨酸、硒甲基硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸部分的洗脱液，合并洗脱液。薄层检测结果也表明，杂质很多，进一步的分离纯化是必要的。
[0128]
(4)阳离子交换树脂纯化(第二纯化)：含有硒代胱氨酸、硒甲基硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸部分的洗脱液调节ph为1.5后，无需浓缩，直接上样，经过再生好的732型强酸性阳离子交换树脂柱(柱径20cm，柱床高185cm。交换饱和后的阳离子交换树脂柱依次用2bv ph6.0的水、2.5bv ph7.5和4.0bv ph9.0的氨水溶液、3bv ph10.5的氢氧化钠水溶液梯度洗脱，以硒代胱氨酸、硒甲基硒代胱氨酸和硒代蛋氨酸为对照品进行薄层检测。收集富含硒代胱氨酸、硒甲基硒代胱氨酸和硒代蛋氨酸部分的洗脱液。富含硒代氨基酸的洗脱液用10wt％的盐酸调ph5.8。减压浓缩、真空干燥，得浅黄棕色堇叶碎米荠硒代氨基酸产品26.20克。
[0129]
以折合干燥原料计算硒代氨基酸的产品得率为0.597％。经检测总硒含量为239.63mg/g，其中含有硒代胱氨酸42.42％、硒代蛋氨酸3.56％、硒甲基硒代半胱氨酸4.49％。以原料中硒的总含量和产品中硒的总含量计算硒的收率为84.18％。
[0130]
实施例4
[0131]
堇叶碎米荠干燥叶片4.5kg，为发明申请人在湖北恩施海拔1112m高富硒地区自行规范化大棚种植。采收时为花期，植株平均高65cm。凉棚中自然阴干。经检测，总硒含量为1582mg/kg。
[0132]
干燥材料经粉碎后，加入15倍体积的水，其余的操作步骤与实施例3相同。
[0133]
结果：获得浅黄棕色堇叶碎米荠硒代氨基酸产品23.29克。硒代氨基酸的产品得率为0.517％。经检测总硒含量为201.35mg/g，其中含有硒代胱氨酸36.01％、硒代蛋氨酸3.09％、硒甲基硒代半胱氨酸3.11％。以原料中硒的总含量和产品中硒的总含量计算硒的
收率为65.87％。
[0134]
实施例5
[0135]
堇叶碎米荠干燥叶片4.5kg，为发明申请人在湖北恩施海拔1112m高富硒地区自行规范化大棚种植。采收时为花期，植株平均高65cm。凉棚中自然阴干。经检测，总硒含量为1582mg/kg。
[0136]
干燥材料经粉碎后，加入15倍体积的水，盐酸调ph值为5.0，并按照每公斤干重计的堇叶碎米荠中加入2.2万u的内切纤维素酶(宁夏夏盛食品级酶活1.1万u/g纤维素酶(内切型)fdg-2225)和28万u的β-葡聚糖酶(宁夏夏盛食品级酶活14万u/g的β-葡聚糖酶fdg-2219)，48-50℃下搅拌酶解(初步酶解)18小时后。其余的步骤与实施例3相同。
[0137]
结果：获得浅黄棕色堇叶碎米荠硒代氨基酸产品25.93克。硒代氨基酸的产品得率为0.596％。经检测总硒含量为219.11mg/g，其中含有硒代胱氨酸39.49％、硒代蛋氨酸3.14％、硒甲基硒代半胱氨酸3.29％。以原料中硒的总含量和产品中硒的总含量计算硒的收率为79.81％。
[0138]
实施例6
[0139]
按照实施例3的方式进行，不同的是，第(1)步的一锅法梯度酶解过程中，将酸性蛋白酶和碱性蛋白酶的酶解顺序进行替换(也即，先用碱性蛋白酶进行第一酶解、再用中性蛋白酶进行第二酶解，最后用酸性蛋白酶进行第三酶解)。
[0140]
最终，硒代氨基酸产品18.71克；以折合干燥原料计算硒代氨基酸的产品得率为0.426％。
[0141]
经检测总硒含量为225.93mg/g，其中含有硒代胱氨酸31.02％、硒代蛋氨酸1.89％、硒甲基硒代半胱氨酸1.97％。以原料中硒的总含量和产品中硒的总含量计算硒的收率为56.67％。
[0142]
实施例7
[0143]
按照实施例3的方式进行，不同的是，第(3)步和第(4)步的顺序进行替换(也即，先用阳离子交换树脂进行第一纯化、再用阴离子交换树脂进行第二纯化)。
[0144]
最终，硒代氨基酸产品22.63克；以折合干燥原料计算硒代氨基酸的产品得率为0.515％。经检测总硒含量为231.55mg/g，其中含有硒代胱氨酸37.21％、硒代蛋氨酸2.10％、硒甲基硒代半胱氨酸2.96％。以原料中硒的总含量和产品中硒的总含量计算硒的收率为70.25％。
[0145]
实施例8
[0146]
堇叶碎米荠地上部分新鲜材料50kg，为发明申请人在湖北恩施海拔1112m高富硒地区自行大田露天种植，采收时为花期，植株平均高66cm，包含茎、叶、花和少量幼果。经检测，含水量为88.98％，总硒含量为628mg/kg干重。
[0147]
(1)一锅法梯度酶解：新鲜材料，洗净，加入400升纯净水打浆。在搅拌下用10wt％的盐酸调ph值为3.3，按160万u酶活性酸性蛋白酶/每公斤干重计的堇叶碎米荠的剂量加入食品级酸性蛋白酶(宁夏夏盛食品级酶活15万u/g酸性蛋白酶fdy-2205)，50℃下搅拌酶解(第一酶解)24小时后再用10wt％的氢氧化钠水溶液调ph值至7.0，按270万u酶活性中性蛋白酶/每公斤干重计的堇叶碎米荠的剂量加入食品级中性蛋白酶(宁夏夏盛食品级中性蛋白酶(植物提取专用酶spe-008，型号为ffg-0657)，45℃下搅拌酶解(第二酶解)36小时后再
用10wt％的氢氧化钠水溶液调ph值至10.0，按1600万u酶活性碱性蛋白酶/每公斤干重计的堇叶碎米荠的剂量加入食品级碱性蛋白酶(宁夏夏盛食品级酶活45万u/g碱性蛋白酶fdg-2227)，43℃下搅拌酶解(第三酶解)48小时。冷却至室温，过滤，过滤后的残渣再用250升纯净水搅拌提取1次，过滤。合并滤液得738升堇叶碎米荠酶解提取液(第三酶解产物)；
[0148]
(2)大孔吸附树脂脱色：堇叶碎米荠酶解提取液经过再生好的lsa-33大孔吸附树脂柱(柱径10cm，柱床高157cm)，提取液上样完时再用1bv的纯净水置换出全部提取液，得脱色提取液约750升；
[0149]
(3)阴离子交换树脂纯化(第一纯化)：脱色后的提取液，无需浓缩，直接上样，经过再生好的d201强碱性阴离子交换树脂柱(柱径20cm，柱床高186cm)。交换饱和后的阴离子交换树脂柱依次用2bv ph6.0、2bv ph4.5、4.0bv ph3.0、3.5bv ph1.5的稀盐酸水溶液梯度洗脱，以硒代胱氨酸为对照品进行薄层检测。收集含有硒代胱氨酸部分的洗脱液，合并洗脱液；
[0150]
(4)阳离子交换树脂纯化(第二纯化)：含有硒代胱氨酸部分的洗脱液调节ph为1.5后，无需浓缩，直接上样，经过再生好的732型强酸性阳离子交换树脂柱(柱径20cm，柱床高185cm。交换饱和后的阳离子交换树脂柱依次用2bv ph 6.0、2.5bv ph7.5、4.0bv ph9.0、3bv ph10.5的氨水和氨水-氢氧化钠水溶液或其它碱性水溶液梯度洗脱，以硒代胱氨酸为对照品进行薄层检测。收集富含硒代胱氨酸的洗脱液。洗脱液调ph5.8。浓缩、真空干燥，得浅黄棕色堇叶碎米荠硒代胱氨酸粗品19.44克；
[0151]
(5)加压制备色谱分离：设备为北京北分的p3050中压制备色谱系统，分离柱为的不锈钢静态压缩柱，色谱填料采用平均粒径40μm的toyopearl c8。柱床高375mm；流动相为5mmol/ml磷酸二氢钾溶液：甲醇等度洗脱5：95(v/v)等度洗脱；检测波长235nm；流速50ml/min。19.44克粗品用最少量6m盐酸完全溶解后再用2000毫升流动相溶液稀释，过滤。样品液平均分成3等分，分3次上样进行分离。薄层色谱检测硒代胱氨酸对应保留时间峰。准确收集硒代胱氨酸对应峰的洗脱液。3次硒代胱氨酸洗脱液合并，调ph5.8，浓缩、真空干燥，得黄色堇叶碎米荠硒代胱氨酸精品4.915克。经检测，产品中硒代胱氨酸含量为90.56％。以原料中硒的总含量和产品中硒的总含量计算硒的收率为60.8％。
[0152]
实施例9
[0153]
堇叶碎米荠新鲜叶片50kg，为发明申请人在湖北恩施海拔1112m高富硒地区自行规范化大棚种植。采收时为花期，植株平均高65cm。经检测，含水量为91.22％，总硒含量为1699mg/kg干重。
[0154]
提取步骤与操作过程与实施例8相同。不同的是第(5)步中，上样次数改为4次。4次硒代胱氨酸洗脱液合并，调ph5.8，浓缩、真空干燥，得黄色堇叶碎米荠硒代胱氨酸精品10.979克。经检测，产品中硒代胱氨酸含量为98.06％。以原料中硒的总含量和产品中硒的总含量计算硒的收率为68.23％。
[0155]
实施例10
[0156]
堇叶碎米荠新鲜叶片50kg，为发明申请人在湖北恩施海拔1112m高富硒地区自行规范化大棚种植。采收时为花期，植株平均高65cm。经检测，含水量为91.22％，总硒含量为1699mg/kg干重。
[0157]
提取步骤与操作过程与实施例9相同。不同的是第(5)步中，加压制备色谱分离：色
谱填料采用平均粒径30μm的toyopearl sp-650s强酸性阳离子交换树脂。柱床高415mm；流动相为ph 8.5的氨水等度洗脱；粗品用1000毫升3m盐酸完全溶解后，过滤。样品液平均分5次上样。其余操作与实施例2相应步骤相同。
[0158]
5次硒代胱氨酸洗脱液合并，调ph5.8，浓缩、真空干燥，得黄色堇叶碎米荠硒代胱氨酸精品10.666克。经检测，产品中硒代胱氨酸含量为98.22％。以原料中硒的总含量和产品中硒的总含量计算硒的收率为66.39％。
[0159]
实施例11
[0160]
堇叶碎米荠新鲜叶片50kg，为发明申请人在湖北恩施海拔1112m高富硒地区自行规范化大棚种植。采收时为花期，植株平均高65cm。经检测，含水量为91.22％，总硒含量为1699mg/kg干重。
[0161]
提取步骤与操作过程与实施例8相同。不同的是第5步中填料改为平均粒径40μm的toyopearl c4，上样次数改为4次。4次硒代胱氨酸洗脱液合并，调ph5.8，浓缩、真空干燥，得黄色堇叶碎米荠硒代胱氨酸精品11.202克。经检测，产品中硒代胱氨酸含量为98.83％。以原料中硒的总含量和产品中硒的总含量计算硒的收率为70.16％。
[0162]
对该实施例得到的产品进行结构确认见图1-2：
[0163]
hplc图谱对比确认(图1)；质谱测试与确认(见图2)。
[0164]
实施例12
[0165]
堇叶碎米荠干燥叶片4.5kg，为发明申请人在湖北恩施海拔1112m高富硒地区自行规范化大棚种植。采收时为花期，植株平均高65cm。凉棚中自然阴干。经检测，总硒含量为1582mg/kg。
[0166]
干燥材料经粉碎后，加入15倍体积的水，调ph值为5.0，并按照每公斤干重计的堇叶碎米荠中加入2.2万u的内切纤维素酶(宁夏夏盛食品级酶活1.1万u/g纤维素酶(内切型)fdg-2225)和28万u的β-葡聚糖酶(宁夏夏盛食品级酶活14万u/g的β-葡聚糖酶fdg-2219)，48-50℃下搅拌酶解(初步酶解)18小时后。后面的操作步骤与实施例11相同。得黄色堇叶碎米荠硒代胱氨酸精品10.000克。经检测，产品中硒代胱氨酸含量为98.39％。以原料中硒的总含量和产品中硒的总含量计算硒的收率为65.33％。
[0167]
实施例13
[0168]
堇叶碎米荠干燥叶片4.5kg，为发明申请人在湖北恩施海拔1112m高富硒地区自行规范化大棚种植。采收时为花期，植株平均高65cm。凉棚中自然阴干。经检测，总硒含量为516mg/kg。
[0169]
操作步骤与实施例12相同。得黄色堇叶碎米荠硒代胱氨酸精品3.220克。经检测，产品中硒代胱氨酸含量为88.93％。以原料中硒的总含量和产品中硒的总含量计算硒的收率为58.29％。
[0170]
实施例14
[0171]
堇叶碎米荠干燥叶片4.5kg，为发明申请人在湖北恩施海拔1112m高富硒地区自行规范化大棚种植。采收时为花期，植株平均高65cm。凉棚中自然阴干。经检测，总硒含量为287mg/kg。
[0172]
操作步骤与实施例12相同。得黄色堇叶碎米荠硒代胱氨酸精品1.369克。经检测，产品中硒代胱氨酸含量为87.14％。以原料中硒的总含量和产品中硒的总含量计算硒的收
率为43.65％。
[0173]
实施例15
[0174]
堇叶碎米荠干燥叶片4.5kg，为发明申请人在湖北恩施海拔1112m高富硒地区自行规范化大棚种植。采收时为花期，植株平均高65cm。凉棚中自然阴干。经检测，总硒含量为1582mg/kg。
[0175]
(1)一锅法梯度酶解：干燥材料经粉碎后，加入15倍体积的水，调ph值为5.0，并按照每公斤干重计的堇叶碎米荠中加入2.2万u的内切纤维素酶(宁夏夏盛食品级酶活1.1万u/g纤维素酶(内切型)fdg-2225)和28万u的β-葡聚糖酶(宁夏夏盛食品级酶活14万u/g的β-葡聚糖酶fdg-2219)，48-50℃下搅拌酶解(初步酶解)18小时后再用10wt％的盐酸调ph值为3.3，按160万u酶活性酸性蛋白酶/每公斤干重计的堇叶碎米荠的剂量加入食品级酸性蛋白酶(宁夏夏盛食品级酶活15万u/g酸性蛋白酶fdy-2205)，50℃下搅拌酶解(第一酶解)24小时后再用10wt％的氢氧化钠水溶液调ph值至7.0，按270万u酶活性中性蛋白酶/每公斤干重计的堇叶碎米荠的剂量加入食品级中性蛋白酶(宁夏夏盛食品级中性蛋白酶(植物提取专用酶spe-008，型号为ffg-0657)，45℃下搅拌酶解(第二酶解)36小时后再用10wt％的氢氧化钠水溶液调ph值至10.0，按1600万u酶活性碱性蛋白酶/每公斤干重计的堇叶碎米荠的剂量加入食品级碱性蛋白酶(宁夏夏盛食品级酶活45万u/g碱性蛋白酶fdg-2227)，43℃下搅拌酶解(第三酶解)48小时。冷却至室温，过滤，过滤后的残渣再用250升纯净水搅拌提取1次，过滤。合并滤液得738升堇叶碎米荠酶解提取液(第三酶解产物)；
[0176]
(2)大孔吸附树脂脱色：堇叶碎米荠酶解提取液经过再生好的lsa-33大孔吸附树脂柱(柱径10cm，柱床高157cm)，提取液上样完时再用1bv的纯净水置换出全部提取液，得脱色提取液约750升；
[0177]
(3)阴离子交换树脂纯化(第一纯化)：脱色后的提取液，无需浓缩，直接上样，经过再生好的d201强碱性阴离子交换树脂柱(柱径20cm，柱床高186cm)。交换饱和后的阴离子交换树脂柱依次用2bv ph6.0、2bv ph4.5、4.0bv ph3.0、3.5bv ph1.5的稀盐酸水溶液梯度洗脱，以硒代胱氨酸和硒代蛋氨酸为对照品进行薄层检测。收集含有硒代胱氨酸、硒甲基硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸部分的洗脱液，合并洗脱液。薄层检测结果也表明，杂质很多，进一步的分离纯化是必要的；
[0178]
(4)阳离子交换树脂纯化(第二纯化)：含有硒代胱氨酸和硒代蛋氨酸部分的洗脱液调节ph为1.5后，无需浓缩，直接上样，经过再生好的732型强酸性阳离子交换树脂柱(柱径20cm，柱床高185cm。交换饱和后的阳离子交换树脂柱依次用2bv ph 6.0、2.5bv ph7.5、4.0bv ph9.0、3bv ph10.5的氨水和氨水-氢氧化钠水溶液或其它碱性水溶液梯度洗脱，以硒代胱氨酸和硒代蛋氨酸为对照品进行薄层检测。收集富含硒代胱氨酸和硒代蛋氨酸部分的洗脱液；富含硒代氨基酸的洗脱液调ph5.8。浓缩、真空干燥，得浅黄棕色堇叶碎米荠硒代氨基酸产品26.20克；
[0179]
获得浅黄棕色堇叶碎米荠硒代氨基酸产品25.93克。硒代氨基酸的产品得率为0.596％。经检测总硒含量为219.11mg/g，其中含有硒代胱氨酸39.49％、硒代蛋氨酸3.14％、硒甲基硒代半胱氨酸3.29％。以原料中硒的总含量和产品中硒的总含量计算硒的收率为79.81％；
[0180]
(5)加压制备色谱分离：取该实施例得到的堇叶碎米荠硒代氨基酸产品6.0克，进
行加压制备色谱分离。设备为北京北分的p3050中压制备色谱系统，分离柱为的不锈钢静态压缩柱，色谱填料采用平均粒径40μm的toyopearl c8。柱床高375mm；流动相为5mmol/ml磷酸二氢钾溶液：甲醇等度洗脱5：95(v/v)等度洗脱；检测波长235nm；流速50ml/min。6.0克硒代氨基酸产品用最少量6m盐酸完全溶解后再用600毫升左右流动相溶液稀释，过滤。滤液上样进行制备色谱分离。结合薄层色谱检测硒代胱氨酸、硒代蛋氨酸和硒甲基硒代半胱氨酸对应保留时间峰。准确收集各对应峰的洗脱液。各洗脱液分别调ph5.8，浓缩、真空干燥。得黄色硒代胱氨酸2156.0mg、黄白色硒代蛋氨酸155.4mg和浅黄色硒甲基硒代半胱氨酸167.2mg。经检测，产品中硒代胱氨酸纯度为98.06％、硒代蛋氨酸纯度为91.15％、硒甲基硒代半胱氨酸纯度为92.34％。
[0181]
实施例16
[0182]
按照实施例15的方式进行，不同的是，第(5)步中，取该实施例得到的堇叶碎米荠硒代氨基酸产品6.0克，进行加压制备色谱分离。色谱填料采用平均粒径40μm的toyopearl c4。其余操作方案同实施例1。得黄色硒代胱氨酸2195.9mg、黄白色硒代蛋氨酸160.2mg和浅黄色硒甲基硒代半胱氨酸170.4mg。经检测，产品中硒代胱氨酸纯度为98.46％、硒代蛋氨酸纯度为92.04％、硒甲基硒代半胱氨酸纯度为92.66％。
[0183]
实施例17
[0184]
按照实施例15的方式进行，不同的是，第(5)步中，取实施例1所得到的堇叶碎米荠硒代氨基酸产品6.0克，进行加压制备色谱分离；其中，色谱填料采用平均粒径30μm的toyopearl sp-650s强酸性阳离子交换树脂。柱床高415mm；流动相为ph 8.5的氨水等度洗脱；6.0克硒代氨基酸产品用250毫升3m盐酸完全溶解后，过滤。其余操作步骤同实施例1。得黄色硒代胱氨酸2147.7mg、黄白色硒代蛋氨酸158.4mg和浅黄色硒甲基硒代半胱氨酸162.5mg。经检测，产品中硒代胱氨酸纯度为98.09％、硒代蛋氨酸纯度为90.51％、硒甲基硒代半胱氨酸纯度为91.17％。
[0185]
实施例18
[0186]
按照实施例15的方式进行，不同的是，第(5)步中，取实施例1所得到的堇叶碎米荠硒代氨基酸产品6.0克，进行加压制备色谱分离；其中，色谱填料采用平均粒径30μm的toyopearl super q-650s强碱性阴离子离子交换树脂。柱床高412mm；流动相为ph 3.5的醋酸溶液等度洗脱；6.0克硒代氨基酸产品用250毫升流动相完全溶解后，过滤。其余操作步骤同实施例1。
[0187]
得黄色硒代胱氨酸2102.5mg、黄白色硒代蛋氨酸155.6mg和浅黄色硒甲基硒代半胱氨酸161.3mg。经检测，产品中硒代胱氨酸纯度为98.18％、硒代蛋氨酸纯度为90.67％、硒甲基硒代半胱氨酸纯度为90.88％。
[0188]
实施例19
[0189]
干燥黄芪根1kg，为发明申请人在湖北恩施海拔1160m高富硒地区自行种植三年根，采收期10月中旬，晒干。经检测，总硒含量为866mg/kg。
[0190]
采用实施例15相同的提取分离步骤。
[0191]
结果：获得淡黄棕色黄芪硒代氨基酸产品3.373克。硒代氨基酸的产品得率为0.337％。经检测总硒含量为169.12mg/g，其中含有硒代胱氨酸7.28％、硒代蛋氨酸4.02％、硒甲基硒代半胱氨酸26.93％。以原料中硒的总含量和产品中硒的总含量计算硒的收率为
65.87％。
[0192]
实施例20
[0193]
干燥黄芪根1kg，为发明申请人在湖北恩施海拔1160m高富硒地区自行种植三年根，采收期10月中旬，晒干。经检测，总硒含量为866mg/kg。
[0194]
一锅法梯度酶解：干燥材料经粉碎后，加入15倍体积的水，调ph值为5.0，并按照每公斤干重计的堇叶碎米荠中加入5.5万u的内切纤维素酶(宁夏夏盛食品级酶活1.1万u/g纤维素酶(内切型)fdg-2225)和70万u的β-葡聚糖酶(宁夏夏盛食品级酶活14万u/g的β-葡聚糖酶fdg-2219)，48-50℃下搅拌酶解24小时后再调ph值为3.3。其余操作采用与实施例1相同的提取分离步骤。
[0195]
结果：获得淡黄棕色黄芪硒代氨基酸产品3.605克。硒代氨基酸的产品得率为0.361％。经检测总硒含量为171.49mg/g，其中含有硒代胱氨酸7.92％、硒代蛋氨酸5.01％、硒甲基硒代半胱氨酸28.27％。以原料中硒的总含量和产品中硒的总含量计算硒的收率为71.39％；
[0196]
取上述得到的黄芪硒代氨基酸产品3.0克，进行加压制备色谱分离。分离操作同实施例19。得黄色硒代胱氨酸220.2mg、黄白色硒代蛋氨酸134.6mg和浅黄色硒甲基硒代半胱氨酸792.9mg。经检测，产品中硒代胱氨酸纯度为94.03％、硒代蛋氨酸纯度为95.17％、硒甲基硒代半胱氨酸纯度为98.52％。
[0197]
实施例21
[0198]
干燥半边莲全草5.0kg，为发明申请人在湖北恩施海拔1112m高富硒地区自行规范化大棚种植堇叶碎米荠时的伴生植物，采收期6-7月，晒干。经检测，总硒含量为22.7mg/kg。
[0199]
采用实施例15相同的提取分离步骤。
[0200]
结果：获得浅棕色半边莲硒代氨基酸产品0.690克。硒代氨基酸的产品得率为0.014％。经检测总硒含量为86.25mg/g，其中含有硒代胱氨酸6.45％、硒代蛋氨酸4.61％、硒甲基硒代半胱氨酸7.47％。以原料中硒的总含量和产品中硒的总含量计算硒的收率为51.83％。
[0201]
实施例22
[0202]
干燥荠菜全草5.0kg，为发明申请人在湖北恩施海拔1112m高富硒地区自行规范化大棚种植堇叶碎米荠时的伴生植物，采收期为花果期，晒干。经检测，总硒含量为126.08mg/kg。
[0203]
采用实施例15相同的提取分离步骤。
[0204]
结果：获得浅棕色荠菜硒代氨基酸产品3.919克。硒代氨基酸的产品得率为0.078％。经检测总硒含量为95.34mg/g，其中含有硒代胱氨酸13.06％、硒代蛋氨酸3.27％、硒甲基硒代半胱氨酸4.19％。以原料中硒的总含量和产品中硒的总含量计算硒的收率为59.27％。
[0205]
对比例1
[0206]
堇叶碎米荠干燥叶片1kg，为发明申请人在湖北恩施海拔1112m高富硒地区自行规范化大棚种植。采收时为花期，植株平均高65cm。凉棚中自然阴干。经检测，总硒含量为1582mg/kg。
[0207]
按201410361185.9的技术方案的收率最高的实施例(实施例4)的步骤实施。为了
便于与本发明进行提取率的对比研究，故只做到加压制备色谱之前的步骤。
[0208]
1kg干燥材料，加入5000ml的6mol/l的hcl，90℃下振荡提取60min，滤渣再提取2次，洗涤残渣，合并滤液，用naoh溶液调节ph值至6～7，浓缩至干，得墨绿色至黑褐色粘稠状固体39.45克。经检测总硒含量为8.28mg/g，以原料中硒的总含量和产品中硒的总含量计算硒的收率为20.65％。
[0209]
对比例2
[0210]
堇叶碎米荠干燥叶片4.5kg，为发明申请人在湖北恩施海拔1112m高富硒地区自行规范化大棚种植。采收时为花期，植株平均高65cm。凉棚中自然阴干。经检测，总硒含量为1582mg/kg。
[0211]
按实施例5的步骤实施，但在“一锅法酶解过程中”不加酸性蛋白酶。
[0212]
结果：获得浅黄棕色堇叶碎米荠硒代氨基酸产品25.35克。硒代氨基酸的产品得率为0.563％。经检测总硒含量为199.27mg/g，其中含有硒代胱氨酸3643％、硒代蛋氨酸2.91％、硒甲基硒代半胱氨酸2.36％。以原料中硒的总含量和产品中硒的总含量计算硒的收率为71.01％。
[0213]
对比例3
[0214]
堇叶碎米荠干燥叶片4.5kg，为发明申请人在湖北恩施海拔1112m高富硒地区自行规范化大棚种植。采收时为花期，植株平均高65cm。凉棚中自然阴干。经检测，总硒含量为1582mg/kg。
[0215]
按实施例5的步骤实施，但在“一锅法酶解过程中”不加中性蛋白酶。
[0216]
结果：获得浅黄棕色堇叶碎米荠硒代氨基酸产品25.96克。硒代氨基酸的产品得率为0.577％。经检测总硒含量为205.52mg/g，其中含有硒代胱氨酸37.35％、硒代蛋氨酸3.03％、硒甲基硒代半胱氨酸2.38％。以原料中硒的总含量和产品中硒的总含量计算硒的收率为74.94％。
[0217]
对比例4
[0218]
堇叶碎米荠干燥叶片4.5kg，为发明申请人在湖北恩施海拔1112m高富硒地区自行规范化大棚种植。采收时为花期，植株平均高65cm。凉棚中自然阴干。经检测，总硒含量为1582mg/kg。
[0219]
按实施例5的步骤实施，但在“一锅法酶解过程中”不加碱性蛋白酶。
[0220]
结果：获得浅黄棕色堇叶碎米荠硒代氨基酸产品25.14克。硒代氨基酸的产品得率为0.559％。经检测总硒含量为187.66mg/g，其中含有硒代胱氨酸34.56％、硒代蛋氨酸2.23％、硒甲基硒代半胱氨酸2.29％。以原料中硒的总含量和产品中硒的总含量计算硒的收率为66.27％。
[0221]
通过以上结果可以看出，本发明提供的具有提取硒代氨基酸功能的试剂盒以及利用该试剂盒提取硒代氨基酸的方法，实现了从富硒植物中高收率、高纯度地提取硒代氨基酸。例如，相比于对比例1，实施例1-22获得的硒的收率明显较高。进一步地，更优的方案能够获得更优的效果，例如，相比于实施例6和7，实施例3的效果也明显较好，表明优选的酸性蛋白酶和碱性蛋白酶的酶解顺序尤为重要。相比于实施例4，实施例5中先加入纤维素酶处理富硒植物的方案，能够获得更高的硒代氨基酸的收率。另外，相比于对比例2-4，实施例5中硒代氨基酸的收率明显较高，表明在酸性、中性或碱性蛋白酶均存在的情况下，获得的效
果较好。
[0222]
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种提取硒代氨基酸的方法，其特征在于，该方法包括：(1)在ph为2.0-5.0的条件下，将酸性蛋白酶与所述富硒植物接触，进行第一酶解，得到第一酶解产物；(2)在ph为5.5-8.5的条件下，将中性蛋白酶与所述第一酶解产物接触，进行第二酶解，得到第二酶解产物；(3)在ph为8-12的条件下，将碱性蛋白酶与所述第二酶解产物接触，进行第三酶解，得到第三酶解产物；(4)用大孔吸附树脂对第三酶解产物进行脱色，脱色后的产物；(5)用阴离子交换树脂、阳离子交换树脂依次处理脱色后的产物，得到硒代氨基酸粗品；(6)任选地，将硒代氨基酸粗品进行色谱分离。2.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(1)中，所述第一酶解的条件还包括：温度为30-70℃，时间为24-48h；和/或，相对于每千克以干重计的富硒植物，所述酸性蛋白酶的用量为40万-200万u；和/或，步骤(2)中，所述第二酶解的条件还包括：温度为30-55℃，时间为24-48h；和/或，相对于每千克以干重计的富硒植物，所述中性蛋白酶的用量为90万-300万u；和/或，步骤(3)中，所述第三酶解的条件还包括：温度为30-60℃，时间为24-48h；和/或，相对于每千克以干重计的富硒植物，所述碱性蛋白酶的用量为400万-2000万u；和/或，前一蛋白酶处理的产物直接全部进行下一步的蛋白酶处理操作。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述第一酶解、第二酶解和第三酶解在溶剂的存在下进行，所述溶剂优选为水；优选地，相对于每千克以干重计的富硒植物，所述第一酶解、第二酶解和第三酶解过程中溶剂的用量各自独立地为15-50kg。4.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述酸性蛋白酶选自由第一微生物产生的酸性蛋白酶和/或动物产生的胃蛋白酶；优选地，所述第一微生物选自黑曲霉、米曲霉、根霉、青霉、毛霉和芽孢杆菌中的至少一种；和/或，所述中性蛋白酶选自由第二微生物产生的中性蛋白酶和/或植物产生的木瓜蛋白酶；优选地，所述第二微生物选自芽孢杆菌、米曲霉、毛霉、栗疫霉和栖木曲霉中的至少一种；和/或，所述碱性蛋白酶选自由第三微生物产生的碱性蛋白酶和/或动物产生的胰蛋白酶；优选地，所述第三微生物选自地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜碱性芽孢杆菌、灰色链霉菌、费氏链霉菌、米曲霉、栖木曲霉和冠状耳霉中的至少一种。5.根据权利要求1或2所述的方法，其中，步骤(5)中，采用所述阴离子交换树脂处理蛋白酶处理后的产物，得到交换饱和后的阴离子交换树脂，并用酸性溶液对交换饱和后的阴离子交换树脂进行第一梯度洗脱，得到第一洗脱液；之后采用所述阳离子交换树脂处理所述第一洗脱液，并用碱性溶液对交换饱和后的阳离子交换树脂进行第二梯度洗脱，得到第
二洗脱液。6.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述阴离子交换树脂为强碱性阴离子交换树脂；所述强碱性阴离子交换树脂选自大孔型和/或凝胶型离子交换树脂，优选大孔型离子交换树脂；优选地，所述阳离子交换树脂为强酸性阳离子交换树脂；所述强酸性阳离子交换树脂选自大孔型和/或凝胶型离子交换树脂，优选大孔型离子交换树脂。7.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述富硒植物为新鲜的富硒植物或干燥的富硒植物；和/或，所述富硒植物选自十字花科、豆科、车前科、桔梗科、禾本科和小球藻科植物中的一种；优选地，所述富硒植物选自碎米荠属、荠属、芸苔属、车前属、玉蜀黍属、紫云英属、大豆属、党参属、桔梗属、半边莲属和小球藻属植物中的至少一种；更优选地，所述富硒植物选自富硒堇叶碎米荠、富硒黄芪、富硒荠菜、富硒西蓝花、富硒车前草、富硒半边莲、富硒玉米、富硒蛋白核小球藻、富硒椭圆小球藻和富硒小球藻中的至少一种；优选地，所述富硒植物中，硒含量不低于20mg/kg干重；优选地，所述富硒植物中，硒含量不低于600mg/kg干重。8.根据权利要求1或2所述的方法，其中，当所述富硒植物为干燥的富硒植物时，所述方法还包括在蛋白酶处理之前先采用纤维素酶对干燥的富硒植物进行初步酶解的步骤；优选地，所述纤维素酶选自内切纤维素酶和/或β-葡聚糖酶；优选地，所述内切纤维素酶和β-葡聚糖酶的酶活力单位比值为1:(10-15)。9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述初步酶解的条件包括：ph为4.5-5.5，温度为48-50℃，时间为12-24h。10.根据权利要求8或9所述的方法，其中，相对于每千克以干重计的富硒植物，所述纤维素酶的用量为30万-80万u。

技术总结
本发明涉及植物提取物技术领域，公开了一种提取硒代氨基酸的方法。该方法包括：(1)在pH为2.0-5.0的条件下，将酸性蛋白酶与所述富硒植物接触，进行第一酶解，得到第一酶解产物；(2)在pH为5.5-8.5的条件下，将中性蛋白酶与所述第一酶解产物接触，进行第二酶解，得到第二酶解产物；(3)在pH为8-12的条件下，将碱性蛋白酶与所述第二酶解产物接触，进行第三酶解，得到第三酶解产物；(4)用大孔吸附树脂对第三酶解产物进行脱色，脱色后的产物；(5)用阴离子交换树脂、阳离子交换树脂依次处理脱色后的产物，得到硒代氨基酸粗品。本发明提供的方法提取操作过程更加简单，设备要求更简单，利于工业化。业化。业化。


技术研发人员：王发松 向家桂
受保护的技术使用者：恩施市鸿汲康润生物医药科技有限责任公司
技术研发日：2021.12.31
技术公布日：2023/7/13