肌红蛋白稳定剂及其应用的制作方法

1.本发明及生物医药领域，特别涉及肌红蛋白稳定剂及其应用。


背景技术：

2.肌红蛋白(myo)是一种小分子蛋白，由珠蛋白与正铁血红素(heme)结合而成。它能可逆地与氧结合，在肌细胞内起着转运和贮存氧的作用。哺乳动物细胞的肌细胞利用其储存和分配氧。
3.在免疫荧光定量检测肌红蛋白(myo)的过程中，需要用到标准肌红蛋白质控品。但肌红蛋白质控品极易降解，保存困难。现有技术中，采用低温保存的方法缓解肌红蛋白降解，但这种方式需要反复冻存解冻，反复冻融可能使抗体变性，导致抗体形成聚集体，从而降低其结合能力，容易使其降解。采用高浓度保存肌红蛋白也可以缓解肌红蛋白降解，但操作过程中需要高浓度浓缩的肌红蛋白质控品的纯化步骤与稀释蛋白质的纯化步骤进行交替，操作繁琐，耗时长，可能使折叠在分子内部的疏水氨基酸暴露在分子表面，从而造成蛋白质分子通过疏水表面与其他分子结合，导致蛋白质分子的变性。采用加入蛋白酶抑制剂的方法利用破碎细胞提取蛋白质的同时可释放出蛋白酶，这些蛋白酶需要迅速的被抑制以保持蛋白质不被降解的原理，操作较为简便，能有效缓解肌红蛋白的降解过程，但蛋白酶抑制剂普遍具有毒性，危害健康，不宜大量使用。
4.因此，本领域尚需寻找一种可以安全有效地缓解肌红蛋白降解的方法，以保证肌红蛋白质控品得以长期稳定的储存。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种肌红蛋白稳定剂。
6.本发明的另一目的在于提供一种稳定肌红蛋白的方法。
7.本发明的另一目的在于提供一种含有肌红蛋白稳定剂的肌红蛋白制剂。
8.为解决上述技术问题，本发明第一方面提供了一种肌红蛋白稳定剂，所述肌红蛋白稳定剂包括：
9.牛血清白蛋白、增稠剂、c
1-4
多元醇、防腐剂、缓冲剂和水。
10.所述缓冲剂用于调节体系ph。
11.在一些优选的方法中，肌红蛋白稳定剂的ph为6.5-7.5。
12.在一些优选的方案中，所述牛血清白蛋白的质量百分含量为1-10％。
13.在一些优选的方案中，所述增稠剂选自聚乙烯醇、海藻酸钠、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素和聚维酮中至少一种，例如聚乙烯醇。
14.在一些优选的方案中，所述增稠剂的质量百分含量为0.05-2％。
15.在一些优选的方案中，所述c
1-4
多元醇选自甘油和丙二醇中至少一种，例如甘油。
16.在一些优选的方案中，所述c
1-4
多元醇的质量百分含量为20-40％。
17.在一些优选的方案中，所述防腐剂选自苯甲酸及其盐、山梨酸及其盐、三氯叔丁醇
和羟基苯甲酸乙酯中至少一种，例如羟基苯甲酸乙酯。
18.在一些优选的方案中，所述防腐剂的质量百分含量为0.02-0.3％。
19.在一些优选的方案中，所述缓冲剂为磷酸盐缓冲液。
20.在一些优选的方案中，所述磷酸盐缓冲液的质量百分含量为47.7-78.93％。
21.在一些优选的方案中，所述肌红蛋白稳定剂包括：
22.牛血清白蛋白
ꢀꢀ
1-10％；
23.增稠剂
ꢀꢀ
0.05-2％；
24.c
1-4
多元醇
ꢀꢀ
20-40％；
25.防腐剂
ꢀꢀ
0.02-0.3％；
26.缓冲剂；
27.和水；
28.且使用缓冲剂将体系ph调节至6.5-7.5。
29.在一些优选的方案中，所述肌红蛋白稳定剂包括：
30.牛血清白蛋白
ꢀꢀ
1-10％；
31.聚乙烯醇
ꢀꢀ
0.05-2％；
32.甘油
ꢀꢀ
20-40％；
33.羟基苯甲酸乙酯
ꢀꢀ
0.02-0.3％；
34.缓冲剂；
35.和水；
36.且使用所述缓冲剂将体系ph调节至6.5-7.5。
37.本发明的第二方面提供了一种稳定肌红蛋白的方法，所述方法包括步骤：
38.将本发明第一方面所述的肌红蛋白稳定剂与肌红蛋白混合。
39.在一些优选的方案中，每毫升所述肌红蛋白稳定剂中含有肌红蛋白0.1-0.8μg。
40.本发明的第三方面提供了一种含有本发明第一方面所述的肌红蛋白稳定剂的肌红蛋白制剂。
41.本发明相对于现有技术而言，至少具有下述优点：
42.(1)本发明提供的肌红蛋白稳定剂可以有效维持肌红蛋白的稳定性(uncle检测证实了蛋白质精细结构维持高度一致)，尤其适宜添加在肌红蛋白质控品中维持肌红蛋白质控品的高度稳定。添加本发明的肌红蛋白稳定剂的肌红蛋白可以在常温下长时间储存，无须冻存，节约成本，避免反复冻融造成的变性。
43.(2)本发明提供的肌红蛋白稳定剂成分安全，存取使用方便。
44.应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
45.一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定。
46.图1是根据本发明实施例中肌红蛋白抗原混合本发明肌红蛋白稳定剂和市售蛋白
稳定剂静态光散射值随温度的变化图；
47.图2是根据本发明实施例中高温存储本发明肌红蛋白稳定剂和市售蛋白稳定剂中混合有肌红蛋白抗原(肌红蛋白的浓度为0.01μg/ml)时静态光散射值随温度的变化图；
48.图3是根据本发明实施例中高温存储本发明肌红蛋白稳定剂和市售蛋白稳定剂中混合有肌红蛋白抗原(肌红蛋白的浓度为0.08μg/ml)时静态光散射值随温度的变化图。
具体实施方式
49.现有技术中，肌红蛋白常温稳定性很差，反复冻存经常使其变性，无法用作质控品。为解决这一问题，本发明人开发了一种肌红蛋白稳定剂，这种肌红蛋白稳定剂组成简单，各组分之间相互配合，可以出乎意料地使得肌红蛋白常温下保持长时间高度稳定，适用于肌红蛋白质控品。
50.本发明实施方式提供了一种肌红蛋白稳定剂，所述肌红蛋白稳定剂包括：
51.牛血清白蛋白、增稠剂、c
1-4
多元醇、防腐剂、缓冲剂和水。
52.所述缓冲剂用于调节体系ph。
53.在一些优选的方案中，所述牛血清白蛋白的质量百分含量为1-10％。
54.在一些优选的方案中，所述增稠剂选自聚乙烯醇、海藻酸钠、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素和聚维酮中至少一种，例如聚乙烯醇。
55.在一些优选的方案中，所述增稠剂的质量百分含量为0.05-2％。
56.在一些优选的方案中，所述c
1-4
多元醇选自甘油和丙二醇中至少一种，例如甘油。
57.在一些优选的方案中，所述c
1-4
多元醇的质量百分含量为20-40％。
58.在一些优选的方案中，所述防腐剂选自苯甲酸及其盐、山梨酸及其盐、三氯叔丁醇和羟基苯甲酸乙酯中至少一种，例如羟基苯甲酸乙酯。
59.在一些优选的方案中，所述防腐剂的质量百分含量为0.02-0.3％。
60.在一些优选的方案中，所述缓冲剂为磷酸盐缓冲液。
61.在一些优选的方案中，所述磷酸盐缓冲液的质量百分含量为47.7-78.93％。
62.在一些优选的方案中，所述肌红蛋白稳定剂包括：
63.牛血清白蛋白
ꢀꢀ
1-10％；
64.增稠剂
ꢀꢀ
0.05-2％；
65.c
1-4
多元醇
ꢀꢀ
20-40％；
66.防腐剂
ꢀꢀ
0.02-0.3％；
67.缓冲剂；
68.和水；
69.且使用缓冲剂将体系ph调节至6.5-7.5。
70.在一些优选的方案中，所述肌红蛋白稳定剂包括：
71.牛血清白蛋白
ꢀꢀ
1-10％；
72.聚乙烯醇
ꢀꢀ
0.05-2％；
73.甘油
ꢀꢀ
20-40％；
74.羟基苯甲酸乙酯
ꢀꢀ
0.02-0.3％；
75.缓冲剂；
76.和水；
77.且使用所述缓冲剂将体系ph调节至6.5-7.5。
78.在本发明最优选的实施例中，所述肌红蛋白稳定剂包括：
79.牛血清白蛋白
ꢀꢀ
5％；
80.聚乙烯醇
ꢀꢀ
0.1％；
81.甘油
ꢀꢀ
30％；
82.羟基苯甲酸乙酯
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0.15％；
83.其余水，后用磷酸盐缓冲液将体系ph调整至6.5-7.5。
84.本发明的实施方式提供了一种稳定肌红蛋白的方法，所述方法包括步骤：
85.将本发明第一方面所述的肌红蛋白稳定剂与肌红蛋白混合。
86.在一些优选的方案中，每毫升所述肌红蛋白稳定剂中含有肌红蛋白0.1-0.8μg。
87.本发明的实施方式提供了一种含有本发明第一方面所述的肌红蛋白稳定剂的肌红蛋白制剂。
88.本发明中，缓冲剂添加在体系中用于调节体系ph，缓冲剂可以为磷酸盐缓冲液，缓冲剂的添加量根据测定的体系的ph变化，使用ph计测量体系的ph并同时加入缓冲剂，以此控制缓冲剂的加入量。
89.本发明中，术语“c
2-4
多元醇”指的是碳原子数为4的直链或支链烷基中至少两个氢原子被羟基取代的化合物，所述碳原子数为4的直链或支链烷基为乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基。c
2-4
多元醇的非限制性的例子可以是乙二醇、丙二醇、丙三醇，优选为丙二醇和丙三醇(甘油)。
90.本发明中，uncle稳定性测试通过加热检测蛋白变性温度来考察蛋白热稳定性，对蛋白变性重新折叠(refolding)的分析，uncle稳定新测试考察样品变性重新折叠的能力，通过控制样品升温、降温，同时检测荧光信号和sls信号，来反映蛋白变性和再折叠的程度。在uncle 稳定性测试中，使用tagg660检测大蛋白聚集体开始形成的温度，使用tagg266检测小的蛋白聚集开始形成的温度(tagg660，通过检测660nm散射光强变化反应蛋白聚集温度；tagg266，通过检测266nm散射光强变化反应蛋白聚集温度)，因此可以根据tagg值表示蛋白聚集稳定性。
91.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
92.除非另有指明，本文所用的技术和科学术语具有与本技术所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义，需要注意的是，本文所用的术语仅为了描述具体实施方式，而非意图限制本技术的示例性实施方式。
93.实施例1、肌红蛋白稳定剂的制备
94.将牛血清白蛋白、聚乙烯醇、甘油、羟基苯甲酸乙酯和磷酸盐缓冲液按照下述质量百分含量混合，制备成肌红蛋白稳定剂。
95.牛血清白蛋白
ꢀꢀ
10％；
稳定剂按0.5％比例稀释)混合，每毫升ccd稳定剂含有0.1μg肌红蛋白。
127.对比例3
128.将实施例4步骤(1)制备的肌红蛋白抗原与市售产品hp稳定剂(使用1x pbs将hp 稳定剂按3％比例稀释)混合，每毫升hp稳定剂含有0.1μg肌红蛋白。
129.对比例4
130.将实施例4步骤(1)制备的肌红蛋白抗原与市售产品gh稳定剂(使用1x pbs将gh 稳定剂按3％比例稀释)混合，每毫升gh稳定剂含有0.1μg肌红蛋白。
131.对比例5
132.将实施例4步骤(1)制备的肌红蛋白抗原与市售产品ppcd稳定剂(使用1x pbs将ppcd 稳定剂按3％比例稀释)混合，每毫升ppcd稳定剂含有0.1μg肌红蛋白。
133.测试例1、加速稳定性实验(与添加pbs的肌红蛋白抗原比较)
134.使用酶标仪分别测定添加了本发明肌红蛋白稳定剂和不添加稳定剂的肌红蛋白的发光值。结果见表1。
135.表1
[0136][0137]
根据表1，不含本发明制备的肌红蛋白稳定剂的肌红蛋白抗原在-20℃放3天的发光值相对偏差在
±
10％内，而含实施例制备的肌红蛋白稳定剂的肌红蛋白抗原在-20℃放3天的发光值相对偏差在
±
3％内。不含本发明制备的肌红蛋白稳定剂的肌红蛋白抗原在37℃放3天的发光值相对偏差在
±
10％内，而含实施例制备的肌红蛋白稳定剂的肌红蛋白抗原在37℃放3天的发光值相对偏差在
±
3％内，可见实施例制备的肌红蛋白稳定剂能有效稳定肌红蛋白，防止其变质。
[0138]
测试例2、uncle稳定性实验(与添加市售蛋白稳定剂的肌红蛋白抗原比较)
[0139]
使用uncle测试使用本发明制备的肌红蛋白稳定剂和常用的市售蛋白稳定剂稳定肌红蛋白的效果。结果见表2和图1。
[0140]
表2
[0141]
myo添加稳定剂名称tagg266(℃)myo原液47.4gh稳定剂78.1ppcd稳定剂86.6
ccd稳定剂88.0hp稳定剂89.9实施例稳定剂90.6
[0142]
根据表2和图1，肌红蛋白抗原使用本发明制备的肌红蛋白稳定剂与使用市售稳定剂稀释相比，含实施例1稳定剂的肌红蛋白抗原稳定性最好，稳定性由大到小的顺序为:实施例1 稳定剂＞hp稳定剂＞ccd稳定剂＞ppcd稳定剂＞gh稳定剂＞原液。
[0143]
测试例3、uncle加速稳定性实验(与添加市售蛋白稳定剂的肌红蛋白抗原比较)
[0144]
取实施例5、对比例2-5所得产品，37℃放置7天，分别在第3天与第7天取样测其稳定性。结果见表3、图2和图3。
[0145]
表3
[0146]
myo样品(0.1μg/ml)tagg266(℃)myo样品(0.8μg/ml)tagg266(℃)原液(37℃、0d)82.4原液(37℃、0d)45.4原液(37℃、3d)79.4原液(37℃、3d)42.4原液(37℃、7d)76.7原液(37℃、7d)39.3含实施例1稳定剂(37℃、0d)84.3含实施例1稳定剂(37℃、0d)90.9含实施例1稳定剂(37℃、3d)82.9含实施例1稳定剂(37℃、3d)89.7含实施例1稳定剂(37℃、7d)81.5含实施例1稳定剂(37℃、7d)88.7
[0147]
根据表3和图2，置于37℃抗原原液稳定性由大到小的顺序为：第3天原液＞第7天原液。置于37℃含实施例稳定剂肌红蛋白抗原稳定性由大到小的顺序为：第3天含实施例稳定剂＞第7天含实施例稳定剂。添加稳定剂的肌红蛋白抗原均比不添加稳定剂抗原稳定性高，加入本发明实施例1的肌红蛋白稳定剂后，37℃下0天、3天和7天tagg值大幅提升，表明加入本发明实施例1的肌红蛋白稳定剂后肌红蛋白抗原的稳定性均大幅增强。
[0148]
本领域的普通技术人员可以理解，上述各实施方式是实现本发明的具体实施例，而在实际应用中，可以在形式上和细节上对其作各种改变，而不偏离本发明的精神和范围。

技术特征：
1.一种肌红蛋白稳定剂，其特征在于，所述肌红蛋白稳定剂包括：牛血清白蛋白、增稠剂、c
1-4
多元醇、防腐剂、缓冲剂和水。2.根据权利要求1所述的肌红蛋白稳定剂，其特征在于，所述增稠剂选自聚乙烯醇、海藻酸钠、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素和聚维酮中至少一种；和/或，所述c
1-4
多元醇选自甘油和丙二醇中至少一种；和/或，所述防腐剂选自苯甲酸及其盐、山梨酸及其盐、三氯叔丁醇和羟基苯甲酸乙酯中至少一种；和/或，所述缓冲剂为磷酸盐缓冲液。3.根据权利要求1所述的肌红蛋白稳定剂，其特征在于，所述牛血清白蛋白的质量百分含量为1-10％。4.根据权利要求1所述的肌红蛋白稳定剂，其特征在于，所述增稠剂的质量百分含量为0.05-2％。5.根据权利要求1所述的肌红蛋白稳定剂，其特征在于，所述c
1-4
多元醇的质量百分含量为20-40％。6.根据权利要求1所述的肌红蛋白稳定剂，其特征在于，所述防腐剂的质量百分含量为0.02-0.3％。7.根据权利要求1所述的肌红蛋白稳定剂，其特征在于，在一些优选的方案中，所述肌红蛋白稳定剂包括：缓冲剂；和水；且使用缓冲剂将体系ph调节至6.5-7.5。8.根据权利要求1所述的肌红蛋白稳定剂，其特征在于，所述肌红蛋白稳定剂包括：所述肌红蛋白稳定剂包括：缓冲剂；和水；且使用所述缓冲剂将体系ph调节至6.5-7.5。9.一种稳定肌红蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：将权利要求1至8任一项所述的肌红蛋白稳定剂与肌红蛋白混合。10.一种含有权利要求1至8任一项所述的肌红蛋白稳定剂的肌红蛋白制剂。

技术总结
本申请公开了一种肌红蛋白稳定剂及其应用。本申请中，所述肌红蛋白稳定剂包括：牛血清白蛋白、聚乙烯醇、甘油、防腐剂、缓冲剂和水。本申请提供的肌红蛋白稳定剂可以有效维持肌红蛋白的稳定性(Uncle检测证实了蛋白质精细结构维持高度一致)，尤其适宜添加在肌红蛋白质控品中维持肌红蛋白质控品的高度稳定。添加本发明的肌红蛋白稳定剂的肌红蛋白可以在常温下长时间储存，无须冻存，节约成本，避免反复冻融造成的变性。融造成的变性。融造成的变性。


技术研发人员：蒋析文 黄黉 张盈盈 何祖强 梁国立 卢杰锋
受保护的技术使用者：广州达安基因股份有限公司
技术研发日：2021.12.29
技术公布日：2023/7/13